Thực hành hóa sinh

ThỰc hành Hóa Sinh MỤC LỤC Chương I: PROTEIN Bài 1: PHẢN ỨNG BIURE Nguyên tắc: Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide (CO-NH-) Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ. Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide Phản ứng này thường thường đượcứng dụng để định lượng protein Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch lòng trắng trứng 1% Ure tinh thể Dung dịch NaOH 10% Dung dịch CuSO4 1% Cách tiến hành & kết quả: Điều chế biure: cho vào ống nghiệm khô một ít tinh thể urê, đung trên ngọn lửa yếu. Lúc đầu urê nóng chảy, đến khi bắt đầu cứng lại thì ngừng đun. Quá trình này tạo ra biure, acide cianuric và amoniac Dùng 2 ống nghiệm: Ống nghiệm Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dd NaOH 10% và 1-2 giọt CuSO4 1% Ống 1 (Đựng biure) PTPỨ: (CO-NH-)+ Cu(OH)2 Dung dịch tím đỏ Ống 2 (3ml dd lòng trắng trứng 1%) Dung dịch màu tím Chú ý không cho quá nhiều CuSO4 vì màu xanh của Cu(OH)2 được tạo thành Giải thích: Thuốc thử của phản ứng màu biure là dung dịch NaOH và CuSO4, đôi khi nó còn được gọi là tác chất biure Tuy nhiên chữ biure ở đây không phải là thuốc thử có chứa biure mà là vì cả biure và protein đều cho phản ứng màu giống nhau với NaOH và CuSO4, Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide Phản ứng so màu Biure, liên kết peptide với Cu2+ trong MT kiềm, là phản ứng đặc trưng để nhận biết protein Nguyên tắc các phản ứng màu khác của protein: Phản ứng xantoproteic: đặc trưng với các axit amin vòng thơm. Các gốc amino acid Tyr,Trp,Phe trong protein tác dụng với HNO3 đặc tạo thành màu vàng và sau khi thêm kiềm sẽ chuyển thành da cam Phản ứng ninhydrin: đặc trưng với các a- axit amin. Phản ứng Pholia: đặc trưng với các axit amin chứa lưu huỳnh Phản ứng Millon : phát hiện Tyrosin. gốc Tyr tác dụng với thủy ngân nitrate trong HNO3 đặc tạo thành kết tủa màu nâu đất Phản ứng Folin: phát hiện Tyrosin, Tryptophan. Phản ứng Sakaguchi: phát hiện Arginin. Gốc Arg tác dụng với dung dịch kiềm của α-naphtol và hypobromite cho màu đỏ anh đào Bài 2: KẾT TỦA THUẬN NGHỊCH BẰNG MUỐI TRUNG TÍNH Nguyên tắc: Các muối của kim loại kiềm và kiềm thổ (thường dùng là (NH4)2SO4 , Na2SO4, NaCl, MgSO4) có tác dụng gây kết tủa thuận nghịch protein. Sau đó nếu loại bỏ nhanh các yếu tố gây kết tủa ,protein trở về trạng thái dung dịch keo bền. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa vơí các nồng độ muối khác nhau,vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch lòng trắng trứng không pha loãng. Dung dịch (NH4)2SO4 bảo hòa . Tinh thể NaCl. Nước cất. Cách tiến hành & kết quả: 1) Cho vào ống nghiệm 3ml lòng trắng trứng + 3ml dd (NH4)2SO4 bảo hoà, lắc đều đến khi dung dịch bán bảo hoà và xuất hiện kết tủa globulin. Để 5 phút, lọc bỏ kết tuả ( thấm ướt giấy lọc bằng dd (NH4)2SO4) vào một ống nghiệm khác . Cho vào dịch lọc 3g tinh thể (NH4)2SO4 (nếu dịch lọc là 4ml) cho đến khi dung dịch bảo hoà, lắc, albumin kết tủa,lọc, thu kết tủa Cho riêng kết tủa globulin và albumin vào 2 ống nghiệm tương ứng, thêm vào 2 ống từ 2-3ml nước cất, lắc đều. Kết quả: Ống 1: tức là ống chứa kết tủa globulin ,sau khi cho nước cất vào thì kết tủa tan từ từ trong nước cất . Do Globunlin vẫn ở dạng kết tủa ,đó là do Globulin đã bị biến tính ,không quay về trạng thái dung dịch keo ngay được ( hiện tượng kết tủa không thuận nghịch ). Ống 2 : tức là ống chứa kết tủa albumin,sau khi cho nước cất vào thì kết tủa tan ngay trong nước cất. Do Albumin trở về trạng thái dung dịch keo như ban đầu, kết tủa tan hoàn toàn (hiện tượng kết tủa thuận nghịch). 2)Cho vào ống nghiệm 3ml lòng trắng trứng , cho tiếp NaCl vào ,dùng đũa thuỷ tinh khuấy cho đến khi dung dịch bảo hoà. Để yên 5 phút thì thấy xuất hiện kết tủa a . Lọc kết tủa sau đó acid hoá phần dịch lọc đó bằng cách thêm vào 1 giọt CH3COOH 1% ,thì thấy xuất hiện kết tủa b. Kết quả: Kết tủa a là Globulin. Kết tủa b là Albumin. Giải thích : Mỗi loại protein kết tủa ở các nồng độ khác nhau .Khi cho NaCl vào ,đầu tiên Globulin kết tủa trước .Sau đó đó lọc hết kêt tủa ,cho vào dịch lọc CH3COOH 1%, pH giảm làm xuất hiện kết tủa Albumin. Bài 3: PHƯƠNG PHÁP SORENSEN (Phương pháp xác định đạm formol) Nguyên tắc: Các amino acide có thể phản ứng với formol trung tính để tạo thành dẫn xuất metylenic.Kết quả là nhóm amin mất tính chất cơ bản của nó ,ngược lại nhóm cacboxyl trong amino acide tồn tại dạng metylen tự do có thể chuẩn độ với NaOH . Phương pháp được ứng dụng trong trường hợp nhóm cacboxyl và nhóm amin tự do bằng nhau. Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch formol ½ (pha formol : nước cất tỉ lệ 1:1 và chỉ chuẩn bị trước khi dùng). Nước mắm,nước cất. Dung dịch NaOH 0,1N. Thuốc thử Phenolphtalein 3%. Cách tiến hành & kết quả: Lấy 2 bình nón và đánh dấu bình 1 và bình 2 Bình 1 : Dùng làm bình kiểm tra. Cho vào 50ml dd formol ½ và thêm vào đó 3 giọt phenolphthalein 3%.Sau đó dùng dd NaOH 0,1N để hiệu chỉnh màu trong bình cho đến khi chỉ còn màu hồng nhạt. Ta được formon ½ trung hòa Bình 2 : Dùng làm bình thí nghiệm. Cho vào 10ml dịch mẫu (đã được pha loãng từ 5 đến 20 lần ), thêm 10ml dd formol ½ đã trung hoà và 3 giọt phenolphthalein 3%, lắc đều cho phản ứng xảy ra hoàn toàn. Sau đó chuẩn độ bằng dd NaOH 0,1N cho đến khi dd trong bình 2 có màu hồng (đậm hơn màu ở bình 1) Thực hiện 3 thử thật và 3 thử không(thay dd đạm bằng nước cất), lấy trị số trung bình: Thử không Thử thật Lần 1 0,4 10,6 Lần 2 0,5 10,7 Lần 3 0,4 10,5 Trung bình V1= 0,45ml = 0,00045 l V2= 10,6ml = 0,0106 l Lượng đạm formol có trong 1l nguyên liệu : M(g/l) = 1,4 ( V2 – V1 )/a Trong đó : V1 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử không V2 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử thật a là lượng mẫu (ml) ứng với 10ml dịch mẫu pha loãng x lần (a= 1 ml = 0,001 l). Þ M(g/l) = 1,4 (0,0 106 – 0,00045 )/0.001 = 14,21 Bài 4: ĐỊNH LƯỢNGPROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL (Giảng trên mô hình) Nguyên tắc: Dưới tác dụng cùa H2SO4 đặc ở nhiệt độ cáo ,các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ bị phân hủy và bị oxy hóa đến CO2 và H2O ,còn nitơ chuyển thành ammoniac và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulphate . Quá trình được tiến hành theo các bước sau : Vô cơ hóa mẫu : R-CHNH2 – COOH + H2SO4 à CO2 + H2O + (NH4)2SO4 Cất đạm : (NH4)2SO4 + 2 NaOH à Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O Sau đó lượng NH3 được hơi nước lôi cuốn bằng một dụng cụ là máy Parnas –Wargner (máy chưng cất đạm )và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thời H2SO4.Từ đây cho phép chúng ta xác định được lượng NH3 phóng thích ra ,có nghĩa là xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu : NH3 + H2SO4 à (NH4)2SO4 + H2SO4dư Chuẩn độ H2SO4 dư ở bình hứng bằng dung dịch NaOH 0,01N Nguyên liệu và hóa chất: Vật phẩm có chứa Nitơ ( nước mắm ,đậu hũ ,các loại thực phẩm ) H2SO4đậm đặc. K2SO4 tinh khiết. CuSO4 tinh khiết. Se. NaOH 40%. H2SO4 0,1N : 2,8ml H2SO4 đậm đặc (d=1,84/lít). NaOH 0,1N : 4g NaOH tinh thể/lít. Phenolphtalein 1% trong cồn . HCl loãng . (Nên dùng ống chuẩn để chuẩn bị H2SO4 và NaOH 0,1N) Cách tiến hành & kết quả: Đầu tiên hút 1ml (đối với nguyên liệu lỏng ) hay cân chính xác 1g (đối với nguyên liệu khô đã nghiền nhuyễn ) cho vào bình Kjendanl ,cho thêm 10ml H2SO4 đậm đặc (d=1,84).Để tăng quá trình vô cơ hóa (đốt cháy) cần cho thêm chất xúc tác.Tốt nhất là dùng 0,5g hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 : Se (100:10 :1). Có thể dùng một mình Se kim loại 0,05g hoặc dùng hỗn hợp CuSO4 và K2SO4 hoặc acid perchloric. Hỗn hợp xúc tác có tác dụng làm tăng nhiệt độ sôi,do đó làm tăng vận tốc của quá tình phản ứng. Sau khi thêm các chất xúc tác đun nhẹ hợp cho đến khi dunh dịch hoàn toàn mất màu. Chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dịch lỏng. Trong quá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ,tráng khéo léo sau cho không còn một vết đen nào của mẫu nguyên liệu thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình .Đun cho tới khi dung dịch hoàn toàn trắng. Sau đó chuyển toàn bộ dung dịch sau khi đã vô cơ hóa xong ở bình Kjendahl vào bình định mức 100ml ,thêm nước cất cho đến ngấn chia,lắc đều .Dụng cụ cất trước khi sử dụng phải rửa sạch : lấy vào bình tam giác 10ml H2SO4 0,1N ,thêm vài giọt chỉ thị phenolphthalein và lắp vào máy cất như mô hình . Đun sôi nước trong bình cầu tạo hơi nước ,mở nước và ống sinh hàn .Sau đó qua phễu cho vào bình cất 10ml dd thí nghiệm từ bình định mức và tiếp đó 8-10ml dung dịch NaOH 40% .Tráng phễu bằng một lượng nhỏ nước cất ,rồi đóng khóa .Hơi nước từ bình cầu sục qua bình phản ứng và kéo theo NH3 sang bình hấp phụ . Quá trình cất kết thúc sau 15 phút .Định phân lượng H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N. Sau khi đã lấy bình hấp phụ đặt bình nước cất vào ,đóng khóa,đồng thời mở khóa ở bình rửa .Dung dịch chuyển từ bình cất sang bình rửa ,tháo bỏ dung dịch bẩn đi .Sau khi thí nghiệm xong phải rửa sạch máy cất vi lượng 1 lần bằng HCl loãng và nhiều lần bằng nước cất . Tính kết quả : Hàm lượng nitơ tính theo công thức sau : X: hàm lượng nitơ (g/l) a: số mol H2SO4 0,1N đem hấp thụ NH3 b: số mol NaOH 0,1N tiêu xchuẩn tiêu tốn cho chuẩn sđộ V: số ml phẩm vật đem vô cơ hóa 0,0014: lượng g nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N Chương II: ENZYME Bài 1: ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME Nguyên tắc: Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến tốc độ phản ứng của enzyme. Sự tăng tốc độ phản ứng của enzyme bằng cách nân nhiệt độ chỉ có hiệu quả trong một khoảng nhiệt độ tương đối hẹp Nhiệt độ tối thích của phần lớn các enzyme là trong khoảng 40-600C. Ở nhiệt độ trên 800C hầu hết các enzyme bị biến tính không thuận nghịch Cách tiến hành & kết quả: Chuẩn bị 4 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2ml dd tinh bột 1% Ống 1 : gia nhiệt ở 85-900C Ống 2 : cho vào nước đá Ống 3 : để ở tủ ấm 45-500C Ống 4 : để ở nhiệt độ phòng Giữ các ống trong 15 phút để dd trong ống đạt đến các nhiệt độ tương ứng Tiếp tục cho vào mỗi ống 0,5ml dd amylase cũng đã đạt các nhiệt độ trên và đặt các ống nghiệm ở các nhiệt độ cũ Sau 1, 2, 4, 6, 8 và 12 phút lấy từ mỗi ống 1 giọt, nhỏ vào các giọt thuốc thử Lugol đã chuẩn bị sẵn trên bản kính. Quan sát màu tạo thành Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 1 phút Xanh đen Tím đen Đen Đen đậm 2 phút Xanh đen Đen nhạt Tím đen Nâu đất 4 phút Xanh đen Nâu đen Nâu nhạt Nâu đất nhạt 6 phút Xanh đen Nâu đen Nâu nhạt nhạt Nâu đất nhạt 8 phút Xanh đen Nâu đất Nâu nhạt hơn Nâu đất nhạt hơn 12 phút Xanh đen Nâu đen Nâu rất nhạt Màu của lugol Qua bảng trên ta thấy : trong ống 1 và ống 2 thì màu dd tinh bột thay đổi không đáng kể, trong ống 3 và ống 4 màu của dd tinh bột thay đổi nhờ enzyme đã thủy phân Giải thích : Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến tốc độ phản ứng của enzyme. Nhiệt độ tối thích của phản ứng enzyme nằm trong phạm vi 40-500C và có thể biển đổi phụ thuộc vào nhiều yếu tố như độ sạch của enzyme, thời gian phản ứng…Nhiệt độ mà enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt độ tới hạn, thường vào khoảng trên 700C. Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bị biến tính, ít khi có khả năng được hồi phục lại hoạt độ. Ngược lại, dưới 00C, hoạt độ enzyme tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường Bài 2: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT HOẠT HÓA VÀ KÌM HÃM ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME Nguyên tắc: Chất hoạt hóa có khả năng làm tăng cường tác dụng của enzyme. Chất kìm hám là giảm ái lực của enzyme với cơ chất hay làm enyme mất khả năng kết hợp với cơ chất Cách tiến hành & kết quả: Chuẩn bị 3 ống nghiệm: Ống nghiệm Sau cho vào mỗi ống 1ml nước bọt và 1ml dd tinh bột, lắc đều. Sau vài phút, thêm vào mỗi ống vài giọt thuốc thử Lugol, lắc đều Ống 1 1ml nước cất Màu vàng hơi đậm Ống 2 1ml dd NaCl 1% Màu vàng nhạt hơn Ống 3 1ml dd CuSO4 Màu xanh đen Kết quả: Ta thấy enzyme hòa tan tốt trong nước, trong dung dịch muối loãng nhưng không tan trong dung môi không phân cực Bài 3: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ a -AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH Nguyên tắc: Các amylase là các enzyme thủy phân tinh bột, có 2 loại là a-amylase và b-amylase. Sự tác dụng của hỗn hợp a-amylase và b-amylase trên tinh bột cho ta hỗn hợp càng lúc càng nhiều glucose, maltose và dextrin đơn giản Để xác định hoạt độ của enzyme, ta xác định nồng độ enzyme thấp nhất có khả năng gây thủy phân hoàn toàn tinh bột cho các sản phầm không đổi màu dd iode. Đó là nguyên tắc của phương pháp Wohlgemouth Đơn vị Wohlgemouth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 1mg tinh bột ở 37oC sau 30 phút có Cl- làm chất hoạt hóa Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch amylase (dd nước bọt pha loãng 10 lần) => nước bọt của bạn nữ Dung dịch tnh bột 0,1% Dung dịch NaCl 0,9% Dung dịch Iode 0,02N Nước cất Cách tiến hành & kết quả: Chuẩn bị 10 ống nghiệm, đánh số từ 1-10,cho vào mỗi ống 1ml dd NaCl 0,9%. Trong ống nghiệm 1 cho vào 1ml dịch enzyme, lắc đều. Sau đó lấy 1ml từ ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2, lắc kỹ và lặp lại cho tới ống nghiệm 10 thì hút 1ml và bỏ đi. Trong mỗi ống nghiệm cho vào 2ml dd tinh bột 0,1%, lắc đều và để vào tủ ấm ổn nhiệt ở 37oC trong 30phút. Khi thời gian hết, làm nguội các ống đến nhiệt độ phòng và cho vào mỗi ống 2 giọt dd Iode 0,02N và lắc đều Kết quả: Ta thấy 6 ống nghiệm đầu thủy phân hoàn toàn. Ống 7 phân hủy được ½, còn 3 ống còn lại hoàn toàn không bị phân hủy Hoạt độ enzyme: X= 2n *2 (trong đó n là số thứ tự ống nghiệm có nồng độ enzyme thấp nhất và đã được thủy phân hoàn toàn) X= 26 *2=128 Giải thích: Khi chúng ta pha loãng nước bọt 10 lần và dịch enzyme trong nước bọt lại được pha loãng đến 10 lần tiếp theo (qua 10 ống nghiệm) thì đến ống nghiệm 7, lượng tinh bột còn rất ít nên chỉ thủy phân được ½. Đến 3 ống nghiệm cuối (ống nghiệm 8,9,10), lượng enzyme không còn nên không thể thủy phân được tinh bột Vai trò của NaCl trong thí nghiệm: Cl- trong NaCl làm chất hoạt hóa enzyme Chương III: GLUCIDE Bài 1: PHẢN ỨNG VỚI THUỐC THỬ FEHLING Nguyên tắc: Do có chứa chức aldehyde hoặc ceton cho nên các monosaccharide có tính khử và được gọi là đường khử. Nếu 2 monosaccharid kết hợp với nhau bằng 2 hydroxyl glucoside thì disacccharide tạo thành bị mất tính khử. Còn nếu nhóm OH glucoside của nhóm này liên kết với nhóm OH alcol của monosaccharid kia thì disaccharid tạo thành vẫn còn tính khử Khi đun đường khử với dd thuốc thử Fehling thì kết tủa đỏ của Cu2O hình thành ( do đường khử đã khử Cu(OH)2 có trong Fehling thành CuO2) Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch Glucose 1% Dung dịch Mantose 1% Dung dịch Saccharide 1% Thuốc thử Fehling A (CuSO4) Thuốc thử Fehling B (Seignet + NaOH) Cách tiến hành & kết quả: Lấy 3 ống nghiệm, đánh số từ 1-3 như sau : Ống 1 : cho 2ml glucose 1% + 1ml Fehling A + 1ml Fehling B + đun trong 5 phút Kết quả: có kết tủa đỏ gạch tươi ( Cu2O ) PTPỨ: Ống 2 : cho 2ml maltose 1% + 1ml Fehling A + 1ml Fehling B + đun trong 5 phút Kết quả: có kết tủa đỏ gạch tươi ( Cu2O ) PTPỨ: Ống 3 : cho 2ml saccharide 1% + 1ml Fehling A + 1ml Fehling B + đun trong 5 phút Kết quả: không hiện tượng PTPỨ: Giải thích: Thuốc thử Fehling là hỗn hợp 2dd : dd CuSO4 và dd muối Seignet với NaOH. Khi trộn 2 dd trên với nhau thì xảy ra phản ứng : CuSO4 + 2 NaOH ® Cu(OH)2 + Na2SO4 Sau đó dd CuSO4 tác dụng với muối seignet tạo muối phức hòa tan, dd có màu xanh thẫm Muối phức trên là hợp chất không bền Trong môi trường kiềm, các mono và 1 số dixacarit khử Cu2+ dưới dạng alcolat đồng thành Cu2+, chức aldehit bị oxi hóa thành axit hoặc muối tương ứng Do glucose và maltose có tính khử nên khi đun với dd thuốc thử Fehling thì kết tủa đỏ của Cu2O hình thành ( do đường đã khử Cu(OH )2 có trong Fehling thành CuO2 ) Bài 2: PHẢN ỨNG SELIWANOFF Nguyên tắc: Khi trộn dd acid ascorbic với dd xanh metylen thì dd sẽ mất màu. Phản ứng xảy ra do acid ascorbic bị oxi hóa thành acid dehidro ascorbic và xanh metylen trở thành dạng không màu Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch fructose 1% Dung dịch glutose 1% Dung dịch NaCl 1% Thuốc thử Seliwanoff Cách tiến hành & kết quả: Cho vào mỗi ống nghiệm 2ml thuốc thử Seliwanoff và thêm vào : Ống 1 : 2ml dd fructose 1% Ống 2 : 2ml dd glucose 1% Ống 3 : 2ml nước cất Tất cả đun cách thủy trong 5 phút Kết quả Ống 1 Có màu đỏ anh đào tươi Ống 2 Màu đỏ vàng nhạt Ống 3 Không hiện tượng Giải thích : Phản ứng seliwanoff đặc trưng đối với các fructose và các cetohexose nhưng không nhạy đối với các aldohexoz Bài 3: XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ Nguyên tắc: Các loại đường khử có khả năng khử Ferricyanur (Fe3+) thành Ferrocyanur (Fe2+) ion này có màu xanh đậm (xanh prusse). Do đó ta có thể dùng phương pháp so màu để định lượng đường Chuẩn bị mẫu: 1g nguyên liệu thơm + H2SO4 10% (ngập mẫu), đun cách thủy khoảng 1h, lấy ra cho NaOH vào để trung hòa đến pH=7, lọc nếu có cặn ta được dung dịch mẫu Lấy 1ml dd mẫu pha loãng thành 30-100ml dd dùng để xác định đường khử Chuẩn bị mẫu: 1g nguyên liệu thơm + H2SO4 10% (ngập mẫu), đun cách thủy khoảng 1h, lấy ra cho NaOH vào để trung hòa đến pH=7, lọc nếu có cặn ta được dung dịch mẫu Lấy 1ml dd mẫu pha loãng thành 30-100ml dd dùng để xác định đường khử Cách tiến hành & kết quả: Thực hiện 9 ống nghiệm theo mẫu sau: Số ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ml glucose 0,02mg/ml 0 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 ml nước cất 1 1 0,95 0,9 0,8 0,6 0,4 ml đường định nồng độ 1 2 Nồng độ trong mỗi ống chuẩn (mg/ml) 0 0 1 2 4 8 12 17,994 20,337 Cho vào mỗi ống 1ml thuốc thử A (Na2CO3 + KCN/H2Ocất) và 1ml thuốc thử B(K3Fe(CN)6/ H2Ocất), lắc đều, đun sôi cách thủy 15 phút Làm lạnh, thêm 5ml thuốc thử C (Fe[NH4(SO4)2] + Lauryl sulfat/H2SO4), lắc đều, để yên 15phút Đo ở Mode “Absorbance” với độ dài sóng 690nm Đồ thị theo nồng độ đường và độ hấp thu Chương IV: VITAMIN Bài 1: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN A Nguyên tắc: Dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc , Vitamin A bị mất nước và tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu không bền .Sau đó biến đổi nhanh thành màu đặc trưng của liporom (nâu đen). Cách tiến hành & kết quả: Nhỏ 1 giọt dầu cá hòa tan trong 25 giọt Cloroform, sau đó cho 1 giọt H2SO4đđ vào rồi lắc đều Do khi tác dụng với H2SO4đđ, vitamin A trong dầu cá bị mất nước tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu hồng không bền, sau đó biến đổi nhanh thành màu nâu đen Bài 2: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN C Nguyên tắc: Khi trộn dd acid ascorbic với dd xanh metylen thì dd sẽ mất màu .Phản ứng xảy ra do acid ascorbic bị oxy hoá thành acid dehydro ascorbic và xanh metylen trở thành dạng không màu Nguyên liệu và hóa chất: Dd Vitamin C. Xanh metylen 0,01%, Dd NaOH 5%. Cách tiến hành & kết quả: Chuẩn bị 2 ống nghiệm: Ống 1: 1ml dd Vitamin C Thêm vào 2 giọt xanh metylen, lắc đều Từ màu xanh à trong suốt Ống 2: 1ml nước cất Thêm vào 3 giọt NaOH 5%, lắc đều Vẫn giữ nguyên màu trong suốt Giải thích: Do Vitamin C làm mất màu dd xanh metylen Bài 3: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C Nguyên tắc: Để xác định hàm lượng Vitamin C (Acid ascorbic) trong nguyên liệu bằng phương pháp chuẩn độ iod người ta cho tất cả acid ascorbic bị oxy hoá bởi iod , phần iod còn thừa sẽ cho màu xanh với dung dịch tinh bột . Điều đó nói lên phản ứng đã kết thúc Nguyên liệu và hóa chất: dd HCl 5%. dd I2 0,01N. dd tinh bột 1% . Chanh trái ,bưởi ,cam. Cách tiến hành & kết quả: Lấy 10g thịt trái chanh và 20ml HCl 5% vào cối sứ để giã ,nghiền nhỏ cho đến khi dung dịch có dạng đồng thể, dùng nước cất để chuyển toàn bộ dịch chiết đồng thể vào trong bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch 100ml. Lắc đều cho lượng axit ascorbic có trong nguyên liệu được hoà tan hoàn toàn, lọc cặn vào trong bình tam giác 250ml, ta có dung dịch mẫu hay dd nguyên liệu Hút 20ml dd nguyên liệu đã được lọc cặn vào trong bình nón, thêm5-10 giọt hồ tinh bột 1% Dùng I2 0,01N chuẩn độ cho đến khi dung dịch bắt đầu xuất hiện màu xanh lam nhạt là được Lặp lại chuẩn độ 3 lần, lấy kết quả trung bình ta được V(ml) dd I2 0,01N dùng để chuẩn độ Vitamin C Chuẩn độ bằng dd I2 0,01N Lần 1 0,5 Lần 2 0,5 Lần 3 0,6 Trung bình V= 0,533ml Hàm lượng Vitamin C : X(%) = Trong đó : m : lượng mẫu thí nghiệm (5gr) 0,00088 : số gram acid ascorbic ứng với 1ml dd I2 0,01N. V1 : thể tích dd mẫu (50ml). V2 : thể tích dịch mẫu lấy để xác định ( 20ml). V: số ml Iode 0,01N dùng để chuẩn độ Þ X(%) Phản ứng oxy hoá acide ascorbic : Iốt tương đối không tan trong nước, nhưng điều này có thể cải thiện bằng cách pha trộn iốt với iođua và hình thành triiođua: I2 + I - « I3 – Triiođua oxy hóa vitamin C tạo acid dehydroascorbic: C6H8O6 + I3 – + H2O ® C6H6O6 + 3I - + 2H + Chương V: LIPIDE Bài 1: SỰ NHŨ TƯƠNG HÓA LIPIDE Nguyên tắc: Sự nhũ tương hoá lipide trong cơ thể là giai đoạn đầu của sự hấp thụ chung. Để giữ sự cân bằng giữa môi trường phân hoá ( H2O ) với pha phân tán (lipide) thì phải cần có chất gây nhũ tương ( natri carbonat , protein, xà phòng , muối mật,….) Nguyên liệu và hóa chất: Dầu lạc ( dầu đậu phụng ). Gelatin 2%. Rỉ đường Cách tiến hành & kết quả: Chuẩn bị 2 ống nghiệm sạch ,, lau khô , và tiến hành đánh dấu ống nghiệm thành ống 1 và ống 2. Tiếp theo cho vào cả 2 ống 0,5ml dầu lạc . Sau đó cho vào mỗi ống : Ống 1 : 0,5ml gelatin 2% . Ống 2 : 0,5ml nước mật rỉ đường . Lắc mạnh cả 2 ống . * Kết quả : Kết quả Giải thích Ống 1 Tạo thành 2 lớp ,lớp dầu nổi lên trên.(là những hạt dầu không nhập vào nhau nỗi lên trên). Bản chất là protein à nhũ tương mạnh hơn rỉ đường Ống 2 Chuyển thành trắng đục ,để một thời gian sẽ phân lớp . Cho mật rỉ đường vào thì do trong rỉ đường do có muối mật là chất gây nhũ tương nên xảy ra hiện tương nhũ tương nhưng yếu hơn ống 1 Bài 2: PHẢN ỨNG XÀ PHÒNG HÓA Nguyên tắc: Chỉ số savon hóa là lượng mg KOH cần để trung hòa acide béo tự do cũng như liên kết có trong 1g chất béo Dưới tác dụng của kiềm, glyxerit bị thủy phân tạo thành glyxerin và xà phòng ( muối Natri hoặc Kali của acid béo ) Cách tiến hành & kết quả: Cho vào cốc sứ 0,5ml dầu lạc + 10 ml KOH 30% Khấy đều và đun cách thủy cho đến khi quánh lại thì ta được xà phòng, nếu cho nước vào lắc lên sẽ thấy xuất hiện bọt xà phòng Giải thích: Dưới tác dụng của enzyme, axit hoặc kiềm, đun nóng, mỡ bị thủy phân tạo thành glixerin và axit béo hoặc muối của axit béo bậc cao gọi là xà phòng Phản ứng như sau : Bài 3: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ IOD CỦA CHẤT BÉO Nguyên tắc: Chỉ số iod của chất béo là số gram iod kết hợp với 100gr chất béo Xác định chỉ số iod là dựa trên khả năng của iod kết hợp được với acide béo ở chỗ nhựng liên kết đôi, vì mỗi nối đôi của lipit sẽ cho phản ứng cộng với 2 nguyên tử của nhóm halogen. Do đó, nếu ta cho chất béo tác dụng với một lượng thừa iod và xác định lượng thừa ấy giúp ta suy ra chỉ số iod Như vậy chỉ số iod xác định tổng quát các acid béo không no trong chất béo Nguyên liệu và hóa chất: Dầu ăn Cồn 96o Dd I2 0,1N Dd Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ Dd tinh bột 1% Cách tiến hành & kết quả: Lấy 6 bình tam giác: Bình 1,2,3 (mẫu trắng):1ml nước cất Bình 4,5,6 (mẫu nguyên liệu): 1®2g dầu ăn Thêm vào mỗi bình 10ml cồn 96o lắc đều, thêm 10ml I2 0,1N. Sau đó dùng giấy bịt kín miệng bình tam giác để tránh bay hơi I2 1ml H2O cất 2g Dầu ăn Bình (1) (2) (3) (4) (5) (6) Để yên trong tối từ 10 – 15 phút, rồi sau đó chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,1N đến khi dung dịch có màu vàng nhạt Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ (ml) 9,7 9,7 9,8 9,7 9,6 9,7 Thêm vào mỗi bình 1ml dung dịch tinh bột 1%, và tiếp tục chuẩn độ đến khi mất màu xanh Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ (ml) 0,4 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 Tính chỉ số iod: a: số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ mẫu trắng a (ml) b: số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ mẫu nguyên liệu b (ml) m: trọng lượng mẫu tính bằng gram 0,0127: số gram iod ứng với 1ml Na2S2O3 0,1N Þ Chỉ số I2 = Giải thích : Chỉ số iod cho ta biết mức độ chưa no của các acid béo có trong thành phần của chất béo Dựa vào phương pháp thừa trừ, tức là cho 1 lượng dư iod phản ứng cộng với dầu béo, rồi đi chuẩn độ iod còn lại nhờ vào Na2S2O3, suy ra lượng iod đã cộng vào dầu béo. Chỉ số iod càng cao chứng tỏ chất béo càng lỏng và khả năng bị oxi hóa càng nhanh Bài 4: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ ACIDE CỦA CHẤT BÉO Nguyên tắc: Chỉ số acide của chất béo là số milligram KOH cần thiết để trung hoà hết những acid béo tự do chứa trong 1g chất béo. Dùng KOH 0,1N để trung hoà các acide béo tự do trong nguyên liệu với phenolphtlein làm chất chỉ thị màu . Nguyên liệu và hóa chất: Dầu ăn tinh luyện , Cồn tuyệt đối 980 . Dd KOH 0,1N chuẩn . Chỉ thị phenolphthalein 1% Cách tiến hành & kết quả: Trong bình tam giác 250ml, cân khoảng 5g dầu ăn và thêm vào đó 50ml cồn 980 để hoà tan dầu ăn .Sau đó đem đi đun nhẹ ở 600C Chuẩn độ nhanh với dd KOH 0,1N khi dd trong bình tam giác còn hơi ấm , thêm 3 giọt chỉ thị phenolphthalein, chuẩn độ đến khi dd trong bình tam giác có màu hồng nhạt bền trong 30 giây Làm lập lại thí nghiệm 3 lần lấy thể tích trung bình Chuẩn độ bằng dd KOH 0,1N Lần 1 34,5 Lần 2 35 Lần 3 34 Trung bình V= 34,5ml Ta có: 5,61 là số mg KOH ứng với 1ml KOH 0,1N V : số ml KOH 0,1N dùng để chuẩn độ . m : trọng lượng chất béo đã cân (5000mg) Chỉ số Acid = Giải thích : Chỉ số acid: là số mg KOH cần thiết để trung hòa các acid béo tự do có trong 1g chất béo. Chỉ số acid cho biết được chất lượng chất béo, chỉ số acid càng cao chứng tỏ chất béo không tươi, đã bị phân hủy và bị oxi hóa một phần Bài 5: XÁC ĐỊNH LIPIT TỔNG SỐ (Giảng trên mô hình) Nguyên tắc: Dùng dung môi kị nước trích li hoàn toàn lipide từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ. Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích li theo, bao gồm sắc tố, các vitamin tan trong chất béo, các chất mùi… tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp. do có lẫn tạp chất, phần trích li được gọi là lipide Có 2 phương pháp để xác định : Phương pháp xác định trực tiếp : chiết xuất lipide ra khỏi nguyên liệu và cân trực tiếp Phương pháp xác định gián tiếp : chiết xuất lipide ra khỏi nguyên liệu và cân lại nguyên liệu Nguyên liệu và hóa chất: Dung môi chiết xuất lipide thường dùng là ether etylic Nguyên liệu được nghiền nhỏ ,sấy khô đến khối lượng không đổi. Thiết bị Soxhlet : Cách tiến hành & kết quả: Chuẩn bị túi bằng giấy lọc để đựng nguyên liệu hoặc dùng ống hình trụ đựng mẫu có sẵn ( túi giấy lọc được cắt hình chữ nhật, chiều dài gấp 2,5 lần chiều rộng, gấp thành túi trụ có đường kính bé hơn trụ chiết). Túi được sấy khô đến khối lượng không đổi và được cân trên cân phân tích ( nếu xác định theo phương pháp gián tiếp ) Cân chính xác 2-5 g rồi cho mẫu vào túi giấy, gấp kín mép túi, đặt túi có mẫu phân tích vào trụ chiết Phương pháp xác định trực tiếp Trước khi chiết, bình cầu được sấy khô đến khố lượng không đổi Đặt bình cầu lên nồi cách thủy và cho ete vào ½ thể tích bình Cho túi nguyên liệu vào trụ chiết Lắp trụ chiết vào bình cầu Cho dung môi vào trụ chiết đến ngập túi nguyên liệu. Mức dung môi đến phần trên ống xifon trụ chiết Lắp ông sinh hàn, ngâm nguyên liệu trong dung môi một vài giờ Đặt máy Soxhlet vào nồi cách thủy sao cho số lần dung môi rút từ trụ chiết xuống bình cầu khoảng 10-15 lần trong 1 giờ Thử lipide đã chiết hết chưa bằng cách lấy một vài giọt ete từ đầu cuối trụ chiết cho lên đĩa kính đồng hồ sạch, cho bay hơi hết ete, nếu không có lipide trên đĩa kính, xem như lipide đã được chiết hoàn toàn Khi chiết xong, lấy bình cầu ra, lắp ống sinh hàn vào và cất lấy ete Sấy bình cầu có chứa lipide ( 60-700C trong 30 phút ) đến khối lượng không đổi rồi đem cân Tính kết quả Hàm lượng lipide có trong 100g mẫu nguyên liệu: X : hàm lượng lipide tính theo % a : khối lượng bình và lipide (g) b : khối lượng bình (g) c : khối lượng mẫu đã tách lipide (g) Phương pháp xác định gián tiếp : Sau khi kết thúc thí nghiệm như trên, lấy túi mẫu nguyên liệu ra khỏi bình chiết, cho bay hơi hết dung môi, sấy khô đến trọng lượng không đổi Tính kết quả Hàm lượng lipide có trong 100g mẫu nguyên liệu : X : hàm lượng lipide tính theo % a : khối lượng túi mẫu nguyên liệu trước khi chiết (g) b : khối lượng túi mẫu nguyên liệu sau khi đã chiết (g) c : khối lượng nguyên liệu lấy để xác định các chỉ số của chất béo