Thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học là gì? Nguồn gốc và ý nghĩa ứng dụng.

Tiểu luận Sinh học phân tử Đề tài: Thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học là gì? Nguồn gốc và ý nghĩa ứng dụng. Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Quốc Trung Lớp: K57CNSHB Các thành viên trong nhóm: Nguyễn Thị Kiều Duyên_570868 Lưu Thị Minh Nguyệt _570914 Đinh Thị Quỳnh_570921 Đỗ Thị Thảo _570931 I.ĐẶT VẤN ĐỀ Hằng năm sản lượng lương thực, rau quả trên thế giới bị mất do sâu bệnh vào khoảng 20-35% trong đó các nước Châu Âu mất trung bình khoảng 20%, các nước Châu Á mất khoảng 35%. Từ năm 1960 đến nay nhiều nước trên thế giới đã sử dụng ồ ạt các chất hóa học để diệt trừ sâu bệnh.Việc sử dụng các loại thuốc hóa học ở thời kì đầu đem lại lợi ich rất lớn là khả năng tiêu diệt sâu bệnh rất nhanh và rất có hiệu quả. Sau 40 năm thế giới sử dụng thuốc trừ sâu hóa học đã cho thấy những nhược điểm khó chấp nhận được. Bao gồm: Gây ra hiện tượng ô nhiễm nước và ô nhiễm đất. Các chất diệt sâu bệnh thường rất ít bị phân hủy trong điều kiện thiên nhiên trong thời gian ngắn, chúng tồn tại trong nước, trong đất và làm thay đổi khu hệ vi sinh vật có ích trong đất,trong nước, từ đó làm giảm hoặc triệt tiêu khả năng tự làm sạch của vi sinh vật trong tự nhiên, ngoài ra các chất này còn làm ngưng trệ nhiều quá trình chuyển hóa vật chất trong nước, trong đất do vi sinh vật tiến hành có lợi cho cây trồng (một trong những chất được sử dụng ở thời gian đầu những năm 60 là DDT). Chất này tồn tại khá lâu trong tự nhiên khi ta phun chúng vào môi trường khoảng sau hai năm chúng mới phân hủy hết. Việc sử dụng thuốc hóa học không theo một chỉ dẫn cụ thể sẽ tạo ra sự dư thừa. Thuốc trừ sâu dư thừa không chỉ tồn tại trong đất, trong nước mà còn bám vào rau, quả và nông sản và dẫn đến hiện tượng ngộ độc càng nhiều. Do đó nhiều quốc gia trên thế giới cảnh báo và cấm sử dụng rất nhiều loại thuốc hóa học. Một trong những tiến bộ của ngành công nghệ sinh học là tạo ra được thuốc trừ sâu sinh học, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học dựa trên nền tảng khoa học là sự đấu tranh sinh tồn trong giới sinh vật . Các vi sinh vật muốn tồn tại phải tạo ra những vũ khí, ngoài khả năng thích nghi, khả năng sinh sản phát triển mạnh ra, vũ khí đó chính là những độc tố hay kháng sinh được tổng hợp bởi những vi sinh vật trong suốt quá trình phát triển của mình. Người ta đã biết lợi dụng quy luật này của thiên nhiên. Các nhà khoa học đã tiến hành phân lập, cải tạo, nâng cao khả năng sinh học tổng hợp những chất độc, kháng sinh của vi sinh vật. Từ đó nâng lên một bước nữa là sản xuất hàng loạt theo qui mô công nghiệp và như vậy công nghệ sản xuất thuốc từ sâu sinh học thay thế thuốc trừ sâu hóa học. Xuất phát từ những vấn đề trên nhóm em sẽ đi nghiên cứu về vấn đề: “thuốc trừ sâu sinh học”. II.NỘI DUNG 1.THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC LÀ GÌ? Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học sản xuất ra từ các loại thảo dược hay các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng khác nhau theo phương pháp thủ công, bán thủ công hoặc phương pháp lên men trong công nghiệp để tạo những chế phẩm có chất lượng cao, có khả năng phòng trừ các loại sâu, bọ gây hại cây trồng nông, lâm nghiệp. Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) và các chất do vi sinh vật tiết ra (thường là các chất kháng sinh), các chất có trong cây cỏ (là chất độc hoặc dầu thực vật). Với các thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học có thể chia thành hai nhóm chính là: Nhóm thuốc vi sinh: Thành phần giết sâu là các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, virus. Nhóm thuốc thảo mộc: Thành phần giết sâu là các chất độc có trong cây cỏ hoặc dầu thực vật. 2.CÁC LOẠI THUỐC TRỪ SÂU (Nguồn gốc) Hiện nay trên thế giới, người ta sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn, nấm sợi, virus Chế phẩm thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Các chế phẩm thuốc trừ sâu từ vi khuẩn được sản xuất nhiều nhất trong số thuốc trừ sâu sinh học được sản xuất hiện nay trên thế giới. Các chế phẩm này thường chứa khoảng 2-5 tỷ tế bào/1 gam. Ta có thể tóm tắt các chế phẩm được sản xuất từ vi khuẩn. STT Sản xuất từ vi khuẩn va tên chế phẩm Hãng và nước sản xuất 1 Các chế phẩm từ bacillus thuringiesis Agritol Bakthane L.69 Baktospeine Bakthurin Biospon 2802 Dendrobacillin Dipet Parasporin Enterobacterin Thurieide Merch-Mỹ Rolim and hass.Mỹ Roger bellon-Pháp Biokrma-Tiệp Khắc Hoechst-Đức Zavodbakt-Nga Abbotttlad-Mỹ Grain processing corp- Mỹ Nga 2 Bacillus morita Nhật 3 Bacillus cereusvar galleriae Trung quốc 4 Bacillus cereus var furoi Nhật 5 Bacillus entimorbus Ditman-Mỹ 6 Bacillus popilliae Mỹ 7 Bacillus sphaericus Mỹ 8 Bacillus insectus Nga 9 Bacillus pulvifaciens Nhật Các chế phẩm từ nấm sợi So với thuốc trừ sâu từ vi khuẩn, các chế phẩm thuốc trừ sâu từ nấm sợi ít hơn. Các chế phẩm đó bao gồm: + beauuveria bassiana: chế phẩm từ nấm sợi này được sản xuất nhiều ở Trung quốc, Nga, Pháp, Mỹ. Chế phẩm này có tên là boverin. Số lượng bào tử trong mỗi gam của chế phẩm khoảng 1.5 tỷ. Độc tố của nấm này có tên là beauverixin và một loại enzym proteinase. + metharrhizium anisopliae: nấm này sinh độc tố destrucxin A và B +trichoderma-chế phẩm trichodermin Chế phẩm từ virut Nhiều loại virut được sản xuất như chế phẩm diệt côn trùng, trong số này đáng lưu ý nhất là các loại sau: Stt Vi sinh vật và chế phẩm Hãng và nước sản xuất 1 Biostol Nutrilite products inc- Mỹ 2 Viron International Minerals And Chemicals Carp-Mỹ 3 Palyvirocizde Mỹ 4 Spodoptera Mỹ 5 Chế phẩm tuyến trung biotrol NCS Mỹ Chế phẩm diệt côn trùng từ virut 3.ƯU ĐIỂM, NHƯỢC ĐIỂM. Như chúng ta đã biết, các thuốc trừ sâu hóa học có ưu điểm rõ rệt là hiệu quả diệt sâu nhanh nhưng có nhược điểm quan trọng là có độ độc cao với người và các động vật có ích (trong đó có các loài thiên địch), gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy, do yêu cầu bảo vệ sức khỏe con người và sự trong sạch của môi trường, các thuốc trừ sâu hóa học cần được hạn chế sử dụng dần và thay vào đó là các thuốc trừ sâu sinh học.   Ưu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học là ít độc với người và môi trường. Các chế phẩm vi sinh vật dùng trừ sâu và dầu thực vật hầu như không độc với người và các sinh vật có ích, tạo ra các sản phẩm sạch cho người dùng. Do ít độc với các loài thiên địch nên thuốc sinh học bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát sâu hại. Do ít độc với người và mau phân hủy trong tự nhiên, các thuốc sinh học ít để lại dư lượng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè… Muốn có nông sản sạch và an toàn, một biện pháp quan trọng là sử dụng các thuốc sinh học trừ sâu. Ngoài ra, các yếu tố sinh học trừ sâu như các vi sinh vật và thực vật thường có sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc, vì vậy nguồn khai thác rất dễ dàng và hầu như vô tận. Đồng thời với các chế phẩm được sản xuất theo quy mô công nghiệp, hiện nay người ta vẫn có thể dùng các phương pháp chế biến thô sơ để sử dụng. Có thể ra đồng thu thập các sâu bị chết vì nấm bệnh, nghiền nát trong nước rồi phun lên cây để trừ sâu. Các cây thuốc lá, thuốc lào, hạt xoan, rễ dây thuốc cá… băm nhỏ và đập nát ngâm lọc trong nước để phun cũng rất có hiệu quả. Tuy vậy, một số thuốc sinh học, như các thuốc vi sinh thường thể hiện hiệu quả diệt sâu chưa thật cao, tương đối chậm hơn so với thuốc hóa học. Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thường yêu cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn. Giá thành còn cao. Khó cân đong ngoài đồng ruộng, thời gian bảo quản ngắn thường 1-2 năm, trong những điều kiện lạnh, khô. Nhưng so với các ưu điểm to lớn thì các nhược điểm trên đây của thuốc sinh học là rất nhỏ và hoàn toàn có thể khắc phục được. Vì vậy, thuốc trừ sâu sinh học ngày càng được khai thác sử dụng nhiều. Ở nước ta, ngoài các chế phẩm Bt đã được biết đến tương đối lâu, hiện nay có nhiều chế phẩm mới đã được đăng ký sử dụng. Yêu cầu ngày càng có nhiều nông sản và thực phẩm an toàn phục vụ đời sống cũng là điều kiện quan trọng thúc đẩy sự phát triển của các thuốc sinh học. Thuốc trừ sâu sinh học được sản xuất và áp dụng thực tế nhiều năm qua cho ta thấy nhiều ưu điểm chính sau: Thuốc trừ sâu sinh học không ảnh hưởng đến cây trồng. Thuốc trừ sâu sinh học không làm thay đổi hệ sinh thái. Thuốc trừ sâu sinh học dễ phân hủy, không tạo ra dư lượng độc hại cho sản phẩm. Thuốc trừ sâu sinh học làm tăng số lượng các loài thiên địch có ích. Tuy nhiên so với thuốc trừ sâu hóa học thì thuốc trừ sâu sinh học tiêu diệt sâu bệnh chậm hơn. 4. KĨ THUẬT SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU TỪ BACILLUS THURINGGUENSIS Đặc điểm vi khuẩn bacillus thringgiensis(BT): vi khuẩn BT là vi khuẩn hình que và có những đặc điểm: Kích thước 3-6 x 0.8-1.3 μm Thuộc vi khuẩn gram(+). Tế bào thường đứng riêng rẽ hay xếp thanh chuỗi. Có tiên mao mọc xung quanh tế bào(tiên mao dài khoảng 6-8 μm) Khi trưởng thành tạo một bao tử ở giữa (kich thước bao tử: 11.8x0.8-0.9 μm). Chứa một tinh thể độc hình quả trám có bản chất protein. Một số sản phẩm BT Độc tố BT: BT có khả năng tạo ra 4 loại độc tố trong quá trình phát triển của chúng: Ngoại độc tố α (α-extoxin) hay con gọi là photpholipase-c Ngoại độc tố β (β- extoxin) hay con gọi là ngoại độc tố bền nhiệt. Nội độc tố ¥(¥-endotoxin) hay còn gọi là tinh thể độc. Độc tố tan trong nước. Trong 4 loại tộc tố BT, người ta quan tâm nhất đến độc tố tan trong nước và tinh thể độc. Độc tố tan trong nước được P.G fast tìm ra năm 1971. Độc tố này có phân tử lượng là 30.000, gây ra nhiều bệnh lý ở côn trùng. Ngoại độc tố β la độc tố bền nhiệt (ở 120oC sau 15 phút vẫn giữ được hoạt tính). Độc tố này có trọng lượng phân tử 707-850. Ngoại độc tố β có chứa aderrin, photphat, ribose, glucose, và axit allomuxic. Ngoại độc tố α, còn gọi là photpholipase C hay loxitinase C. Enzym này đầu tiên liên kết với tế bào, sau đó được tách ra và bị hoạt hóa bởi chất không bền nhiệt, có trọng lượng phân tử thấp. Tinh thể độc: nhà khoa học E.berliner tìm ra đầu tiên vào năm 1915, sau đó năm 1927, nhà khoa học O.mattes đã tìm ra được 1 loại tinh thể được tạo ra trong cơ thể BT khi BT bắt đầu tạo bao tử. Mãi đến năm 1955 người ta mới biết được tinh thể này là chất có bản chất protein và có liên quan đến độc tính BT. Tinh thể độc có kích thước khá dài và rộng (dài khoảng 1μm và rộng khoảng 0.5μm). Chúng chiếm khoảng 30% toàn bộ khối lượng tế bào và biểu hiện tính độc của BT. Tinh thể độc thường làm chết các ấu trùng bộ canh vẩy. Trong thành phần tinh thể độc có hai loại axit amin, có số lượng nhiều nhất là axit glutamic và axit asparaginic. Người ta xem tinh thể độc như một tiền độc tố (protoxin). Nó chỉ trở thành độc tố thực sự khi có mặt trong ruột của một số côn trùng. Khi đó sẽ hình thành những phân tử độc tố với trọng lượng phân tử vào khoảng 5000. Tinh thể độc thuộc loại bền nhiệt, thường gây ra sự hủy hoại đường tiêu hóa của sâu bệnh . Khi đường ruột bị tê liệt bởi tinh thể độc ,tế bào thượng bì của ruột bị biến đổi. Tinh thể độc của BT chỉ gây độc với đường ruột sâu bệnh côn trùng còn với người và động vật tinh thể độc hoàn toàn vô hại. Nhiều nghiên cứu cho thấy ở động vật có vú, pepsin trong đường tiêu hóa đã làm biến đổi trạng thái độc của tinh thể sang trạng thái không độc. Khi tinh thể độc vào được đường ruột côn trùng, có hai yếu tố tạo ra tính độc đối với côn trùng: pH của đường ruột côn trùng, pH ở ruột giữa và ở ruột trước của côn trùng nằm trong vùng pH kiềm (>8.9). Khi pH ở giá trị này,tinh thể bị vỡ ra và gây nhiễm độc cho máu của côn trùng. Một số côn trùng tạo ra protease trong đường ruột. Các enzym này sẽ chuyển tiền độc tố của tinh thể thành độc tố. BT giết rất nhiều sâu bệnh và côn trùng.Trên 200 loại côn trùng. Những loại sâu bị BT giết hại Sâu đo acrobat (acrobasis) Bướm hại gai (albaiis urtiene) Sâu xám hại rau(agrotis ypsilon) Ong kén nhỏ(apanteles glomeratris) Sâu đo rau vàng(apochemia brisoidaria) Sâu cuốn lá cây ăn quả(argyroplose variegana) Sâu non đục củ khoai tây Sâu hại ngô(heliotthis zeae0 Mọt lúa mì(sitophilus granarius) \(timetocera acellassa).. .v.v...... KỸ THUẬT SẢN XUẤT BT Phương pháp nuôi cấy trên con lắc Môi trường nuôi cấy: ta có thể sử dụng một trong những loại môi trường nuôi cấy sau đây để sản xuất BT qui mô nhỏ. Môi trường 1: Glucose 1.5g Cao ngô 4.5g K2HPO4 3.5g NaOH 0.43g CaCl2 0.1g Nước 1000ml Cam nấm men 6.0 g Môi trường 2: Rỉ đường 10g Cao ngô 8.5g 1.0g Nước 1000ml Môi trường 3: Rỉ đường 18.6g Bột khô dầu bông 17g CaCO3 1.0g Nước 1000ml Môi trường 4: Tinh bột ngô 68g Saccharose 64g Cazein 19.4g Nấm men khô 6g Dung dịch đệm photphat 60ml Nước 1000ml Môi trường 6: Pepton 10g Glucose 10g Cao ngô 2g 0.3g FeSO4.7H2O 0.02g K2SO4.7H2O 0.02g CaCO3 1g Nước 1000ml Môi trường 7: Bột đậu tương 15g Glucose 5g Tinh bột ngô 5g MgSO4 0.3g FeSO4.7H2O 0.02g ZnSO4.7H2O 0.02g CaCO3 1g Nước 1000ml Môi trường 8: Pepton 6g Dịch thủy phân cazein 4g Cao ngô 4g Cao thịt 1.5g Glucose 1g Nước 1000ml Môi trường 9: Saccharose 2g Pepton 7.5g MgSO4 0.00223g Fe2(SO4)3 0.02g CaCl2.4H2O 0.183g Nước 1000ml Môi trường 10: Đậu tương ngô 10g Pepton 2g CaCO3 1g (NH4)2SO4 0.3g MgSO4 0.3g K2HPO4 2g Dầu đậu tương 4ml Nước 1000ml Dextrin 4g Môi trường 11: Khô lạc 5g Bột cá 5g Cao ngô 5g Glucose 3g Dầu đậu tương 2.5g Nước 1000ml Môi tường 12: Khô lạc 20g Bột cá 5g Cao ngô 18g CaCO3 5g MgSO4 0.075g Dextrin 5g K2HPO4 0.4g Dầu đậu tương 3ml Nước 1000ml Điều kiện nuôi cấy chìm Máy lắc có tần số lắc 100-200 lượt/phút. Khi lắc không khí qua nút bông và vào môi trường. Nhu cầu oxy trong nuôi cấy BT rất cao (khoảng 1-5% hay-250 mol/m2) Thời gian nuôi < 2 ngày (thường là 18-20 giờ) Nhiệt độ nuôi 30oC ± 2; pH = 6.5-7.2 Sau khi nuôi BT trong các môi trường có thành phần dinh dưỡng tối ưu, người ta thu nhận BT bằng cách lọc ép. Sau khi thu sinh khối, người ta tiến hành sấy chân không và thu được thành phẩm . Chất lượng sinh khối phải đạt như sau; - Kết thúc quá trình lên men phải đạt 2.44 tỷ tế bào trong 1 ml. - Sau khi sấy chân không (thường sấy ở 60oC trong 14 giờ) số lượng bào tử sống phải đạt 12.1-17.8 tỷ/gam chế phẩm. Nuôi cấy trên môi trường đặc. Ta cũng có thể nuôi cấy BT trên môi trường đặc: Môi trường nuôi cấy Bột ngô dầu đậu tương 15-20% Cam 70% Trấu 9-14% CaCO3 1% MgSO4 0.1% K2HPO4 0.15% NaOH 1% Môi trường được thanh trùng, làm nguội và được gieo cấy giống vào. Quá trình lên men: toàn bộ môi trường sau khi trộn giống được tải ra khay với chiều dày môi trường 3-5 cm. Nuôi trong phòng vô trùng, ở nhiệt độ 28-32oC trong thời gian 24-36 giờ. Kết thúc quá trình lên men, đem chế phẩm BT thô đi sấy khô, sau đó nghiền mịn và vô bao gói. Chất lượng chế phẩm được qui định là 5-10 tỷ tế bào trong 1 gam, ngoài ra ta cũng có thể nuôi trong môi trường bán rắn với thành phần môi trường sau: Cam 545g Perlit 380g Bột đậu tương 62g Glucose 36g Vôi 306g NaCl 0.9g CaCl2 0.29g Nước 160ml Sau khi khử trùng và làm nguội ta trộn môi trường trên với dịch nhân giống đã chứa BT; cứ 1Kg môi trường trộn với 400ml dịch giống ( hỗn hợp này có pH=6.9) rồi đưa vào thiết bị lên men. Thổi không khí có độ ẩm 95-100%, nuôi ở nhiệt độ 30-34o C trong thời gian 36 giờ. Sau khi kết thúc quá trình lên men tiến hành sấy để sản phẩm cuối có độ ẩm 4% w. Nuôi BT theo qui mô công nghiệp Trong công nghiệp, BT thường được nuôi trong những thiết bị lên men có dung tích rất lớn và kiểm soát chặt chẽ chế độ thổi khí , pH và lượng các chất dinh dưỡng.Thông thường, người ta dùng các thiết bị có dung tích 5000-10.000 lit với hệ thanh trùng, làm nguội, điều hòa oxy, pH hoàn toàn tự động,.. Nhiệt độ lên men luôn duy trì ở 28-32oC, pH= 6.5-7.2, chế độ thổi khí đảm bảo 5% dung tích môi trường (hay 250 mol oxy/m3 môi trường).Thời gian lên men 24-30 giờ. Kết thúc quá trình lên men người ta tách sinh khối và sấy thăng hoa để thu nhận sản phẩm. 5. Kỹ thuật sản xuất thuốc trừ sâu từ nấm bạch cương. Nấm bạch cương(beauveria) : là loại nấm gây bệnh bạch cương ở tằm. Loại nấm này phát triển rất nhanh trên cơ thể tằm . Các sợi nấm nhanh chóng phủ đầy tạo ra một màu trắng ở tằm. Nấm bạch cương có khả năng tạo ra bao tử trần, không màu hình cầu hoặc hình trứng. Bao tử có kích thước 1.5-5.5x1.3μm. Sợi nấm có chiều ngang 3-5μm. Khi phát triển trên tằm , chúng phá hủy lớp kitin của tằm, ăn sâu vào trong cơ thể và phát triển trong cơ thể tằm. Khi nấm bạch cương mới phát triển trên cơ thể tằm, cơ thể tằm huy động hệ bạch tuyết chống lại sự xâm nhập này. Nấm bạch cương khi đó sẽ tổng hợp độc tố có tên là bovexirin(beauvericin). Độc tố này phá vỡ các tế bào bạch tuyết . Khi toàn bộ tế bào bạch tuyết bị chết cũng là lúc con tằm bị tiêu diệt. Vai trò của nấm bạch cương trong bảo vệ thực vật Ngoài tằm ra, nấm bạch cương có khả năng giết hàng loạt các sâu bệnh. Lần đầu tiên vào năm 1892, F.Tang đã nuôi cấy thành công nấm bạch cương trên môi trường nhân tạo và dùng bao tử của nấm bạch cương để tiêu diệt sâu róm (porthetria disper). Sau đó 1 năm, vào năm 1893, S.A.forbers và năm 1896, F.H snow đã thành công trong công việc sử dụng bao tử nấm bạch cương để tiêu diệt loại rệp (biissus leucopteus). Trên thực tế, từ lâu người ta đã biết khả năng tiêu diệt nhiều sâu bệnh của nấm bạch cương. Song do điều kiện kỹ thuật và những kiến thức trước thế kỷ XX và những năm đầu thế kỷ XX, do hạn chế về kiến thức và gây độc của nấm Bạch Cương, mãi đến năm 1969 R.LHamil và các cộng tác viên mới kết tinh được độc tố của nấm bạch cương. Họ đặt tên cho độc tố này là boverixin. Sau đó, 1971, Y.A.ovchinikov đã tổng hợp được độc tố này và đến nay, người ta đã biết được rõ về độc tố này. Công thức hóa học của độc tố bovexirin: C45H57O9N3 Tên danh pháp: xiclo (N.metyl L phenilalanin-D-X hydroxyzovaleryl) Là một depxipeptit vòng Điểm soi 93-94 oC Kỹ thuật sản xuất Trong trường hợp chưa có giống nấm bạch cương, ta có thể phân lập chúng từ những con tằm bị bệnh bạch cương. Môi trường dùng để phân lập là một trong những loại môi trường sau: Môi trường 1: Pepton 10g Nước mắm 20ml Nước 1000ml Môi trường 2: Glucose 40g Pepton 10g Nước cất 1000ml pH 5.6 Môi trường mạch nha: Dùng nước mạch nha 10.8oBix Môi trường 4 (môi trường Crapex-Dox): Saccharose 30g NaNO3 2g K2HPO4 1g MgSO4.7H2O 0.5g KCl 0.5g FeSO4 0.01g Nước 1000ml Để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn, người ta cho thêm vào môi trường NaCNS(0.24-0.4 M/l), hồng bengal (70 mg/l), cloromixelin (5mg/l), neomixin, polimixin, baxitraxi(50 mg/l). Khi phát triển môi trường thạch sabuoraund, chúng tạo sắc tố màu đỏ sẫm, sợi nấm có màu lông tơ dày và phủ kín bề mặt môi trường. Ta có thể nuôi nấm bạch cương bằng phương pháp bề mặt hoặc phương pháp chìm. Trong cả hai phương pháp đều phải duy trì nhiệt độ nuôi cấy ở 28-32 oC thời gian nuôi cấy thường dài hơn so với nuôi cấy BT cần khoảng thời gian nuôi là 16-24 giờ. Nấm bạch cương cần thời gian nuôi là 5-7 ngày thì bao tử mới tạo ra nhiều. Sau khi thu nhận được sinh khối (thường qua lọc đối với môi trường lỏng, hoặc thu nhận toàn bộ sinh khối nếu nuôi ở môi trường rắn) người ta tiến hành sấy khô ở nhiệt độ thấp < 40oC, cho đến khi độ ẩm <10%, thu được bao tử sống. 6. Kỹ thuật sản xuất thuốc trừ sâu từ virut Có rất nhiều loại virut khi kí sinh trong cơ thể sâu bệnh sẽ tiêu diệt sâu bệnh theo cơ chế sinh sản và làm tan tế bào chủ. Virut có đặc điểm là thường kí sinh trong những cơ thể chủ đặc hiệu , có nghĩa là chúng chỉ có thể phát triển trong một số vật chủ nhất định. Dựa vào đặc hiệu này, các nhà khoa học mới tiến hành phân lập, nuôi cấy các loại virut để tạo ra những loại thuốc trừ sâu từ virut. Các loại virut sử dụng trong việc phòng trừ sâu bệnh cho cây trồng thuộc 4 loại: Virut đa diện dạng nhân (nuclear polyhedrosis virus) Virut thể hạt(granulosis virus) Virut đa diện dạng tế bào chất(citoplasmic polyhedrosis virus) Virut đa diện dạng nhân và virut thể hạt được xếp vào giống baculovirus. Đây là những virus chứa DNA, DNA loại này có phân tử lượng 80x106. Tỷ lệ guamin + sytozin vào khoảng 35-39% Virut đa diện dạng tế bào chất là virut chứa RNA. Trọng lượng phân tử 12.7x106 để sản xuất virut người ta không thể nuôi chúng trong một loại môi trường nhân tạo nào vì virut chỉ có thể sinh sản và phát triển trong cơ thể chủ. Do đó, muốn có virut để trừ sâu bệnh với mật độ virut nhiều, ta chỉ có cách nhiễm virut vào một loại sâu bệnh nhờ đó mà chúng kí sinh , virut sẽ phát triển trong cơ thể sâu nang mà ta mong muốn, để thu nhận sinh khối virut, sau đó nhiễm virut này sang sâu bệnh trên có trên cây.Virut sẽ xâm nhập vào sâu bệnh và bắt đầu phá hủy cơ thể sâu bệnh, nhờ đó cây trồng được bảo vệ khỏi sự phá hủy của sâu bệnh. Biện pháp này tỏ ra rất hữu hiệu khi ta thực hiện thuốc trừ sâu từ virut với mật độ virut cao. Phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật rất cao, nếu không hiện tượng nhiễm sẽ khó tránh khỏi. 7. Kĩ thuật sản xuất thuốc trừ sâu từ thảo mộc: Sử dụng cây cỏ làm thuốc trừ sâu có từ lâu đời, phổ biến nhất là cây xoan Ấn Độ hay cây neem có tên khoa học Melia azedarach. Cây này gần giống cây xoan miền Bắc có tên khoa học là Melia Toosendam có lá, thân và quả xoan đều độc. Cây có hoạt chất Azadirachtin được ly trích để diệt rầy nâu, sâu cuốn lá nhỏ, sâu đục thân trên lúa; bọ trĩ, rầy xanh trên trà; rệp sáp sâu tơ trên bắp cải; sâu xanh trên rau cải; nhện đỏ, sâu đục quả trên ớt; rệp, sâu xanh trên cải xanh; nhện đỏ trên ớt; sâu tơ trên bắp cải; rệp sáp trên thuốc lá; nhện đỏ trên hoa hồng; sâu xanh da láng trên đậu tương; rệp trên cà pháo... Hạt neem Dây thuốc cá (Derris elliptica)   với hoat chất rotenone  có công thức hóa học  là C23 H22 O6 dùng để diệt cá tạp và các loại sâu như: sâu tơ, sâu xanh da láng, dòi đục lá, bọ trĩ trên dưa hấu; rệp đào trên thuốc lá; nhện đỏ trên cam; rầy xanh, bọ cánh tơ trên trà; sâu ăn hoa trên xoài. Tuy nhiên là một loại thuốc sát trùng mạnh và độc hại cho con người, đã được Cơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ EPA (Environmental Protection Agency) xếp vào loại hóa chất gây mầm bệnh ung thư. Nhưng cũng có trường hợp thuốc trừ sâu gốc thảo mộc lại là gia vị và dược phẩm như tỏi, lá lốt, gừng nghệ… Đối với cây dưa leo và dưa hấu, bọ tri có tên khoa học là Thrips palm là loại côn trùng phổ biến và gây hại nhiều nhất. Nó còn truyền bệnh khảm dưa (watermelon bud necrosis virus - WBNV). Để phòng trừ, nông dân chủ yếu sử dụng các loại thuốc trừ sâu bệnh gốc lân hữu cơ như Dimethoate (với tên thương mại là Arriphos 40 EC, Bai 58 40 EC, Bi - 58 40 EC, Bian 40EC, 50EC, By 90 40 EC), Karate 2.5 EC để phun xịt dẫn đến côn trùng kháng thuốc, lưu tồn trong nông sản và ô nhiễm môi trường. Các nhà khoa học thấy tỏi có tác dụng xua đuổi, gây ngán chích hút và ức chế đẻ trứng của bọ tri. Tỏi được cho vào cối xay sinh tố xay nhuyễn, lược lấy nước trong, 3 kg tòi tươi cần 20 lít nước. Phun chỉ mình tỏi tươi không chỉ giết được 60-70% lượng bọ tri, nhưng nếu pha thêm thuốc trừ sâu như Kartodim 315EC hay Dimethoate 30 EC với liều lượng bằng phân nửa lượng khuyến cáo thì hiệu quả lên đến 90-95% và tỷ lệ tái nhiễm rất thấp (Burubai, W.. Etekpe, G. W; Ambah, B..; Angaye, P. E. 2011), Năng suất đậu trắng và đậu nành giảm đáng kể do côn trùng tấn công suốt từ xuống giống đến trái chín. Khi đậu còn nhỏ có sâu ăn lá, cà cào châu chấu (Grasshopper, Ootheca  mutabilis ), sau đó đến sâu ăn bông, sâu đục trái, bọ xít hôi, bọ tri  và nhện đỏ. Do đó các nghiên cứu về thuốc thảo mộc được sử dụng luân phiên với thuốc hóa học để tăng hiệu quả phòng trừ. Những loại thuốc thảo mộc thường có phổ tác dụng rộng, phân hũy sinh học, rẽ tiền, dễ tìm, áp dụng đơn giản do không sợ quá liều. Tỏi và gừng đều có chất tinh dầu tạo mùi cay nồng có tác dụng xua đuổi côn trùng, chúng được mua ở chợ, xay và pha trong nước với tỷ lệ 6 g/lít nước pha thêm 2 muổng dầu. Sau đó lước lấy nước trong pha một ít xà bông. Cả tỏi và gừng đều giảm số lá bị thiệt hại do sâu ăn lá, sâu đuc bông và sâu đục trái, trong đó tỏi hiệu quả hơn gừng (Alphonsus Mbonu Oparaeke, 2010) Trên đậu trắng còn có bọ tri Megalurothrips ijostedti còn gây hại cây bông, đậu phộng. Ngoài thuốc trị bọ tri, người ta còn sử dụng tiêu đen, do trong tiêu có các chất như piperine, chavicine, myristicin (sarisan, safrole, elemeicin và 51-mono-sesquiterpenoid) có đặc tính diệt côn trùng được phân lập thành dạng tinh khiết để diệt côn trùng mà không ảnh hưởng đến người và gia súc. Tại các nước châu Phi nông dân lấy tiêu đen rang ở 80oC trong 4 giờ để ổn định ẩm độ, sau đó đem xay pha với nước theo tỷ lệ 15% phun 4 tuần/ lần trị bọ tri rất hiệu quả (Alphonsus Mbonu Oparaeke, 2010).  Trên cây nghệ Curcuma domestica có loại bọ trỉ Panchaetothrips indicus tấn công lá non, nước trích nồng độ 20% cây ngũ trảo Vitex negundo (tỷ lệ chết 87.34%), cây cúc hoa Chrysanthemum cinearifolium (80,67) và xoan Ấn Độ (77,67%) diệt bọ tri khá hiệu quả (R. Arutselvi; P. Ponmurugan; T. Bala Saravanan và R. Suresh 2012). Một số loại cây thảo mộc Nhện đỏ 2 chấm Tetranychus urticae gây hạt trên bông vải, đậu phộng, hoa hồng cũng được phòng trừ từ cây hạt cỏ mạch đen   Lolium  perenne (tỷ lệ chết 91,43%), cây cần độc Conium maculatum (tỷ lệ chết 96,18%), cây ngải cứu Anthemis vulgaris (tỷ lệ chết 2,37%), cây rau muối Chenopodium album (tỷ lệ chết 96.99%) có hiệu quả hơn azadirachtin của cây xoan Ấn Độ (tỷ lệ chết chỉ có 46.66%) (Dürdane Yanar, Izzet Kadıolu và Ayhan Gökçe, 2011 Rầy xanh 2 chấm Amrasca biguttula và bọ trỉ Thrips tabaci là 2 đối tượng dịch hại trên cây bông vải, ngay cả giống mang gene Bt. Qua thử nghiệm dầu hạt chanh , nước trích lá cây xoan Azadirachta indica, dầu hạt và nước trích lá xoan Ấn Độ Melia azedarach, lá khổ qua (mướp đắng Momordica charantia). Đối với rầy xanh 2 chấm dầu chanh có hiệu quả nhất (tỷ lệ chết 55,24% sau khi phun 24 giờ), tiếp theo đó là dầu xoan Ấn Độ (48,5%), xoan ta (53,5%), mướp đắng (54,32%). Riêng bọ trỉ, cây xoan ta có hiệu quả nhất (38% sau 24 giờ, kế đến là dầu và lá xoan Ấn Độ (39,99 và 37,74%) Thuốc trừ sâu được làm bằng thảo mộc III.KẾT LUẬN Đem lại hiệu quả tốt và không ảnh hưởng đến môi trường nên ngày càng được sử dụng rộng rãi. Việc nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học ở Việt Nam chủ yếu ở trong phòng thí nghiệm và quy mô sản xuất thử nên giá thành còn cao. Khó khăn trong việc bảo quản, lưu thông, phân phối và sử dụng. IV.LIÊN HỆ THỰC TIỄN Điểm sang trong việc nghiên cứu ứng dụng thuốc trừ sâu sinh học ở nước ta gần đây chính là việc thực hiện thành công đề tài khoa học cấp nhà nước “Nghiên cứu sản xuất sử dụng thuốc trừ sâu sinh học đa chức năng cho một số loại cây trồng bằng kĩ thuật CNSH” của Viện Bảo Vệ Thực Vật và đã được đưa vào áp dụng thực tế trên gần 300ha sản xuất ở nhiều tỉnh. Nông dân áp dụng CNSH trong sản xuất Và các sinh viên trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cũng đã và đang thực hiện trồng rau sử dụng các biện pháp sinh học để tạo ra sản phẩm an toàn như Câu lạc bộ True Action. Họ dùng các loại thuốc trừ sâu từ thảo mộc (chủ yếu là các loại gia vị như: tỏi, ớt,…) bởi đây là nguyên liệu dễ tìm, giá thành rẻ, hiệu quả tốt,… Bên cạnh việc ngừa sâu bằng phun trực tiếp thuốc trừ sâu sinh học đó thì CLB True Action đã biết kết với các phương pháp khác như: trồng xen cây họ đậu với cây khác, xen luống các loại cây, dùng phân sinh học compost để diệt nhộng, ấu trùng của sâu, … Và hi vọng trong tương lai không chỉ có 1 CLB mà sẽ có nhiều CLB, nhiều sinh viên trường Nông nghiệp Hà Nội chúng ta sẽ tạo ra chuỗi sản phẩm xanh, bảo đảm an toàn thực phẩm, bảo vệ môi trường xanh. Vườn rau của CLB True Action