Tiểu luận Vi khuẩn gây bệnh côn trùng và chuột

Nhóm 4: Nguyễn Thành Luân Nguyễn Thị Tuyết Mai Trần Xuân Lâm Huỳnh Đức Khanh A. Khái quát Vi khuẩn có ở mọi nơi, có thể xâm nhập vào tất cả các phần của cơ thể sinh vật. Là nhóm sinh vật gặp phổ biến nhất trên cơ thể bị bệnh của côn trùng và chuột. Bệnh do vi khuẩn gây ra được nghiên cứu đầu tiên trên cơ thể tằm, vào cuối thế kỷ XX. Có nhiều cách phân chia các nhóm vi khuẩn có quan hệ với côn trùng. + Steinhaus (1959) đã chia chúng thành 6 nhóm: Vk không gây bệnh, thường xuyên có trong môi trường sống của côn trùng. Vk có trong ống tiêu hóa của côn trùng khỏe. Vk gây bệnh không hình thành bào tử, ký sinh không bắt buộc. Vk gây bệnh có hình thành bào tử, ký sinh không bắt buộc. Vk có hình thành bào tử, ký sinh bắt buộc. Vk gây bênh có hình thành bào tử và thể độc tố, ký sinh bắt buộc. + Bucher (1960) lại chia vk gây bệnh côn trùng thành 4 nhóm. Những vk gây bệnh bắt buộc. Vk gây bệnh không bắt buộc. Vk có tiềm năng gây bệnh. Vk hình thành bào tử. + Falcon (1971) chia vi khuẩn gây bệnh côn trùng thành : -Vk hình thành bào tử .- Vk không hình thành bào tử. B. Phân loại vk gây bệnh cho côn trùng và chuột. Có hơn 100 loài vk gây bệnh cho côn trùng và chuột, đều thuộc bộ Enterobacteriales và một số giống thuộc họ Pseudomonadaceae (bộ Pseudomonadales), sau đây giới thiệu các họ chủ yếu: - Họ Enterobacteriaceae có các giống chính: Microccaceae: + Bao gồm các loại: ký sinh bắt buộc, không bắt buộc và hoại sinh + Sống ở ruột côn trùng + Hình que, gram âm + Không hình thành bào tử + Phát triển tốt trên môi trường dinh dưỡng - Bacillaceae : + Hình que, gram dương + Hình thành bào tử Đại diện: Bacillus, Clostridium - Họ Pseudomonadeceae: + Vk hình que, gram âm + Không hình thành bào tử + Có tiềm năng gây bệnh cho côn trùng Đại diện: Pseudomonas aeruginosa, P. chlororaphis,P. fluorescens C. Một số vi khuẩn được ứng dụng hiện nay 1.Vi khuẩn Bacillus popiliae (gây bệnh sữa cho ấu trùng bọ hung Nhật Bản) - Bào tử hình que dài, không di chuyển, mọc đơn, mọc chuỗi đôi, thỉnh thoảng có chuỗi 4. - Bào tử mới nảy mầm, không có chiết quang. Chồi càng phát triển, khả năng chiết quang càng lớn – nhìn rõ mầm tế bào, tế bào có hình thoi, hình quả lê. - Thời gian sinh trưởng: 16-20 giờ hình thành hàng lọat bào tử (2x109bt). - Có tính ký sinh mạnh- sinh sản trong cơ thể sâu non bọ hung. - Thời gian sống lâu: 42 tháng (trong cơ thể sâu non bọ hung chết khô). Đặc điểm bệnh lý - Bào tử vi khuẩn xâm nhập qua đường tiêu hóa của bọ hung. - Nảy mầm thành thể dinh dưỡng xuyên qua vách ruột vào trong xoang cơ thể. - Sinh sản hàng lọat trong xoang máu, sâu non bọ hung có màu trắng sữa, họat động giảm, phản ứng chậm , sâu bệnh và chết. - Tùy theo giai đọan nhiễm bệnh, số lượng tế bào vi khuẩn từ 20-30%, 40-80% và đạt tối đa 5x109bt/ml. - Nhiệt độ thích hợp: 16-360C, nhiệt độ thấp dưới 160C không gây bệnh. - Phần lớn sâu non nhiễm bệnh chết ở tuổi 2, 3, tuổi 4 tỷ lệ sống sốt khoảng 30% . 2. Vi khuẩn phòng trừ chuột (Salmonella enteridis) Vi khuẩn Salmonella lần đầu tiên được phát hiện bởi một nhà khoa học Mỹ, Tiến sĩ Daniel E.Salmon vào năm 1884. Là trực khuẩn thuộc gram âm Thuộc họ Eterobecteriaceace Kị khí tùy ý Không sinh bào tử Có thể gây bệnh cho gia súc, vật nuôi,chuột,và cả con người. Đến nay có khoảng 2500 kiểu huyết thanh của Salmonella đã được xác định, nhưng chỉ có một số ít mới có khả năng gây bệnh và làm chết chuột, đó là Salmonella enteridis var Salmonella enteridis var có Kích thước tế bào vào khoảng 0,5 - 3 μm, có tiêm mao Chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 60C – 420C, thích hợp nhất ở 350C – 370C pH từ 6 – 9 và thích hợp nhất ở pH = 7,2 Là một loại vi khuẩn không thể tồn tại được ở trong cơ thể của các con vật không phải là chuột, Kém đề kháng với thế giới bên ngoài Hình. Salmonella Enterica Serotipo enteritdis var.I7F4 Quy trình sản xuất thuốc diệt chuột Biorat Chủng VSV Kiểm tra hoạt tính Nhân giống sản xuất Chất mang Xử lí Sinh khối vsv Bảo quản và sử dụng Lên men Tiệt trùng a. Nguyên liệu. Chất mang Chủng vi sinh vật Salmonela enteritidis 1 -7 F-4 đã qua nhân giống cấp 2. Chất làm suy giảm miễn dịch (muối Cumarin 0,06%) làm giảm khả năng tự vệ của chuột. Nước sữa đậu nành sử dụng cho lên men vi sinh vật. Chất mang cho chế phẩm phải đảm bảo sao cho vi khuẩn có thể tồn tại tốt không gây ảnh hưởng xấu đến môi trường và là nguồn thức ăn mà chuột ưa thích Tại Việt Nam, qua nghiên cứu thóc đồ được lựa chọn là nguyên liệu làm chất mang cho chế phẩm. Thóc đồ có ưu điểm dễ chế biến, có mùi thơm hấp dẫn chuột cao, bảo đảm cho vi khuẩn sinh trưởng, phát triển tốt và tồn tại trong thời gian dài. Chất mang? - Giống vi khuẩn là Salmonella enteridis - Để Salmonella enteridis có thể gây bệnh và làm chết chuột thì phải đảm bảo các yếu tố sau: + Vi khuẩn Salmonella enteridis phải xâm nhập được vào cơ thể chuột (gan, lá lách, ruột…) với số lượng lượng hoạt tính lớn hơn hoắc bằng lượng vừa đủ để gây bệnh và làm chuột chết + Salmonella enteridis phải có khả năng kháng lại các nhân tố H202 , khả năng kháng acid cao Giống vi khuẩn ? Vi khuẩn sau khi phân lập có thể bảo quản: + Trên thạch nghiêng dưới điều kiện lạnh trong thời gian 3-4 tuần. + Bảo quản trong môi trường lòng trắng trứng trong thời gian 6-12 tháng + Bảo quản đông khô trong thời gian 3-5 năm. + Để duy trì hoạt động của vi khuẩn cần thiết phải thường xuyên đưa vi khuẩn vào cơ thể chuột và tái phân lập từ mẫu bệnh tích. Salmonella enteridis trên môi trường thạch đĩa. b. Các bước tiến hành Bước 1: Nhân giống vi sinh vật cấp 3 Bước 2: Tạo sinh khối cho sản xuất Bước 3: Ủ sinh khối (lên men) Bước 1:Nhân giống vi sinh vật cấp 3  Môi trường nuôi cấy nước chiết đậu 20% +3g pepton pH môi trường :6-7 Cấy vi sinh vật cấp 2 từ đĩa Peteri cấy sang bình tam giác đựng sữa đậu nành nuôi ở tủ ấm 37OC trong thời gian 24 giờ, cứ 3 tiếng lắc bình 1 lần. Bước 2: Tạo sinh khối cho sản xuất Nhiệt độ nhân sinh khối : 30 - 32oC Thời gian nhân sinh khối : 36-48h Mức độ cấp khí :5 lít/phút Vi sinh vật đã nhân ở bình tam giác cho vào bình sục khí có 10 lít sữa đậu nành đã khử trùng Sục khí trong 24 giờ ở 37OC. Không khí đã được lọc vô trùng. Bước 3: Ủ sinh khối (lên men) Nhiệt độ lên men lên men 30-370C pH :7,2 - 7,4 Thời gian nuôi cấy khoảng 10-12h Lượng giống vi khuẩn được bổ sung vào phải phù hợp với lượng chât mang Lên men là giai đoạn nuôi vi sinh vật để chúng tạo ra sinh khối vi sinh vật. Đây là khâu quan trọng trong sản xuất chế phẩm phòng trừ chuột c. Bảo quản và sử dụng - Sản phẩm sau khi lên men đưa ra đóng gói và đưa vào phòng bảo quản - Cần có điều kiện bảo quản tốt sản phẩm, phải đảm bảo: Vi khuẩn có trong sản phẩm không được mất hoạt tính Không được sinh trưởng và phát triển, chúng chỉ có thể ở trạng thái bất hoạt. Khi chuột ăn vào thì nó mới bắt đầu sinh trưởng- phát triển. Hiệu lực thuốc được duy trì khi bảo quản BIORAT: Ở nhiệt độ 0°C - 15°C : 6 tháng Ở nơi thoáng mát (<30°C): 28 ngày Chất lượng và hiệu quả của thuốc chỉ được đảm bảo khi thực hiện đúng cách Khi mở gói ra thì nến dùng hết một lần. Không để dành vì thuốc sẽ mất hiệu lực Dùng muỗng để lấy thuốc. Tránh dùng tay vì hơi người có thể lưu lại trên thuốc Không trộn lẫn BIORAT với các bã khác. 3. Cơ chế tác động chế phẩm vi sinh vật phòng trừ chuột (Biorat) Quá trình gây bệnh được thực hiện chủ yếu qua đường tiêu hoá do thức ăn, chủ yếu gây bệnh bằng nội độc tố . - Sản sinh ra 1 δ- endotoxin có bản chất lipopolysaccharide vốn có khả năng tác động đến nhiều mô khác nhau, đến các chức năng của mô . Từ khi thuốc bắt đầu tác động đến khi chuột có triệu chứng bệnh, thời kỳ ủ bệnh và chết đối với chuột cái từ 5 đến 10 ngày và chuột đực từ 3 đến 6 ngày. Thời gian phát triển bệnh đối với chuột cái từ 2 đến 3 ngày và chuột đực từ 1 đến 3 ngày. Sau đó chúng sẽ chết. . Sau khi ăn BIORAT, chuột sẽ có triệu chứng sốt thương hàn. Chậm chạp hoặc có khi nằm tại chỗ. Da sần, lông không bóng và xù dựng. Chuột mất hết tính ranh mãnh và cảnh giác đặc trưng của chúng và mất cả tính phản xạ. Vi khuẩn Dạ dày, ruột non ngấm qua thành ruột hệ tuần hoàn máu bạch cầu lách thận gan Làm xuất huyết vi mạch (từng chấm đỏ nhỏ li ti) đến xuất huyết toàn phần ở màng (màng da và màng thành các cơ quan nội tạng) của dạ dày và ruột. Qua quan sát, ta còn thấy gan sưng to, lách có nhiều chỗ bầm đen và thận bị xuất huyết nội. Bệnh có tính lây lan cao giữa những con bệnh và những con khỏe dẫn đến chứng dịch bệnh ở cả đàn chuột Sự diệt vong đạt 100% đối với những con ăn bả và 40% đối với những con khỏe tiếp xúc với những con bệnh. 3. Sản xuất chế phẩm Bacillus thuringiensis (B.t) Các dạng chế phẩm vi khuẩn B.t • B.t var. kurstaki - Thuricide: trừ sâu bộ cánh vẩy Lepidoptera • B.t var. azawai – Xentari, Selectzin: trừ sâu bộ cánh vẩy Lepidoptera • B.t. var. thurngiensis – Dipel: trừ sâu bộ cánh vẩy Lepidoptera • B.t. var. popilliae – Japidemic: bọ cánh cứng • B.t. var. israelensis – Vectobac: trừ muỗi Qui trình sản xuất B.t đang áp dụng hiện nay: Chủng B.t nhân giống cấp 1 trên máy lắc nhân giống cấp 2 trên nồi lên men kích thích lên men lọc ly tâm thu sinh khối thêm chất phụ gia sấy Đóng chai bảo quản Đóng gói, bảo quản sử dụng Phương pháp lên men trên môi trường bán đặc Từ môi trường thạch nghiêng ta nuôi cấy trên máy lắc để nhân giống ở nhiệt độ 300C/16 giờ sau đó nhân giống trên nồi lên men trên môi trường (Glucoza 15g, bột ngô 4,5g, cao nấm men 6g, K2HPO4 3,5g, NaOH 0,43g, CaCl2 0,1g) Tiếp theo ta lên men trên môi trường bán đặc (cám 545g, bột đậu tương 62g, glucoza 36g, vôi 3,6g, NaCl 0,9g, CaCl2 0,29g). Sau đó khử trùng ướt trong 60 phút rồi trộn với môi trường đã lên men (1kg môi trường: 400ml dịch lên men) - pH hỗn hợp: 6,9 - Đưa môi trường vào thiết bị lên men (có các lổ nhỏ dưới đáy) đem thổi khí nén qua các lổ nhỏ - Ẩm độ: 95-100% - Nhiệt độ 30-34 0C - Thời gian nuôi 36 giờ, ph tăng 7,5 - Nuôi tiếp 36 giờ - nhiệt độ 50-55 0C - Lượng nước giảm còn 53% - Đưa qua máy nghiền nhỏ - Rây – đóng gói - bảo quản - pH sản phẩm 7,0 Các chỉ tiêu cơ bản của chế phẩm Bt - Số lượng bào tử và số lượng nội độc tố δ-endotoxin được biểu thị và xác định bằng đơn vị quốc tế IU (interntional unit): 16000 IU hoặc 32000 IU. Tiêu chuẩn của Việt Nam: 3-10 tỷ bào tử/1g chế phẩm - Hàm lượng chất khô: 7 – 10% - pH trung tính 7-7,5 - Hiệu lực trừ sâu 70-90% sau 7 ngày - Thời gian bảo quản 12 tháng Ứng dụng chế phẩm B.t phòng trừ sâu hại - Phát triển nhanh - Làm sâu chết nhanh An toàn cho người và gia súc Tác dụng đề kháng của sâu chậm Hiệu quả kéo dài Phạm vi diệt sâu rộng: - Có gần 525 loài thuộc 13 bộ côn trùng bị nhiễm. - Tác dụng diệt sâu ở các mức độ khác nhau, nhiều loài trong bộ cánh vẩy rất nhạy cảm với B.t gây bệnh nhanh cho một số loài thuộc họ ngài độc, ngài đêm - Hiệu quả trừ ruồi, muỗi cao Hiệu quả phòng trừ Ít gây dịch cho sâu là do khả năng khuếch tán thấp Phương pháp sử dụng chế phẩm - Giống thuốc trừ sâu: phun mù, phun bột, tưới, rắc bột. - Phải tuân theo nguyên tắc cơ bản: phun đều khắp, lượng dùng ít, phương pháp rắc bột phải chọn lúc có ẩm độ cao - Có thể thêm thuốc hóa học khi cần thiết Thanks for your attention!!!