Tìm hiểu enzyme glucose iomerase và enzyme glucose oxidase

thứ tự của các gen được xy- lR ( T )- xylA-xylB (138).lR (T) - xylA-xylB. Những kết quả này hỗ trợ mạnh mẽ một chất kìm hãm điều hành cơ chế cho các quy định của biểu hiện xylAB và giả thiết có một mô hình phối hợp (tích cực) kiểm soát của xylA, xylB, gen xylT bởi các sản phẩm gen xylR. Trong trường hợp không có xylose, sản phẩm xylR hoạt động như một chất kìm hãm, trong khi nó hoạt động như một kích hoạt trong sự hiện diện của xylose, tương tự hoạt động của gen araC của arabinose regulon. Các β – galactosidase sản phẩm hoạt động của phản ứng tổng hợp gây ra bởi xylose nhưng không phải bởi arabinose và được ngăn chặng bởi glucose. Klebsiella pneumoniae : Feldmann et al. have suggested theđã đề nghị presence of a regulatory gene in the 5 upstream region of thesự hiện diện của một gen quy định ở khu vực ngược dòng của 5 gen xylA của Klebsiella pneumoniae, chịu trách nhiệm về xyl phủ định kiểu hình trong việc tái tổ hợp E. coli đột biến. Các loài Bacillus : Quy định của operon xyl trong Bacillus spp.spp has been studied by constructing a xyl-lacZ fusion geneđã được nghiên cứu bằng cách xây dựng một gen tổng hợpxyl-lacZ và tích hợp nó vào gen amy của B. subtilis 168 (71).subtilis 168. Tăng biểu hiện của sản phẩm nhiệt hạch xyl-lacZ, khi chuẩn độ với xyl điều khiển DNA trong trans, đã đề nghị phủ định sự điều khiển của operon trong B. subtilis , in contrast tosubtilis trái ngược với các cơ chế kiểm soát tích cực được mô tả cho các operon xyl của E. coli và S. typhimurium , suggesting that regulation occurs attyphimurium, cho thấy rằng quy định xảy ra tại mức độ phiên mã. Một chuỗi 25-bp, ở 10 bp phần xuống của xyl xúc tác , được xác định là một xyl điều khiển trong B. subtilis 23 (99)subtilis 23. Các loài staphylcoccus Các gen xyl từ S. xylosus được nhân bản vô tính S. carnosus bằng cách bổ sung xylose sử dụng. XylR, xylA, và xylB khung đọc mở được đặt với phân cực tương tự. Hai đơn vị phiên mã, xylR và xylA, được ngăn cách bởi một kết thúc phiên mã giữa gen, và sự hiện diện của các trình tự giống như chất xúc tác liên tục được quan sát ngược dòng của cả hai transcriptional bắt đầu hoạt động. xylA và xylB được phân cách bởi chỉ có 5 nucleotide giữa dừng lại và bắt đầu codon tương ứng. Điều này quan sát, cùng với không có cấu trúc giống như kết thúc giữa xylA và xylB, đề nghị mạnh mẽ rằng nó là cotranscribed. Cotranslation của hai gen này cũng được chỉ định bởi sự hiện diện của một điện thế Shine-Dalgarno trình tự xylB (AAGGA) trùng lặp với codon cuối cùng của xylA. Những kết quả này ủng hộ mạnh mẽ repressor điều hành cơ chế cho các quy định của xylAB. Một phương pháp mới liên quan đến sự hợp nhất của các luxA và luxB gen của biển vi khuẩn gram âm Vibrio harveyi MAV để operon xyl từ S. xylosus được sử dụng cho định lượng cảm ứng và áp catabolite của operon xyl S.carnosus TM 300. Streptomyces species: Đột biến của Streptomyces violaceoniger thiếu isomerase xylose hoặc xylulosekinase được phân lập. Mảnh vỡ nhiễm sắc thể với khả năng để bổ sung cho tất cả ba lớp khác nhau của âm xyl đột biến đã được nhân bản vô tính trên một plasmid. Nội địa hóa của các genchỉ ra rằng gen xylulosekinase giả định nằm gần gen glucose isomerase, mà là phù hợp với tổ chức của locus trong Salmonella typhimurium, E. coli, và vi khuẩn Bacillus subtilis Chất xúc tác khác nhau Các nghiên cứu về gen xylA của Streptomyces violaceoniger có chỉ ra rằng xylA và xylB thúc đẩy phiên mã ở đối diện hướng. Sự tồn tại của các chất xúc tác khác nhau trong Streptomyces spp. và prokaryote khác đã được báo cáo trước đây. Trình tự phân tích đã chỉ ra sự hiện diện của 1/3 đọc khung hình, trong đó mã hóa một protein điều. Hai gen được ngăn cách bởi một khu vực ngắn (195 bp), trong đó tiết lộ sự hiện diện của một phần tử đối xứng với palindromic đặc trưng của các nhà khai thác vi khuẩn. Hai gen được phiên mã divergently từ trong một chuỗi 114-bp tách hai vùng mã hóa, trái ngược với trước đó quan sát gen xylA và xylB là một phần của một operon. Sao chép các phạm vi hoạt động bắt đầu là 40 và 20 bp phần xuống của các phạm vi hoạt động bắt đầu dịch của xylA và xylB tương ứng. Xúc tác của các gen chia sẻ 33 bp phủ lên nhau trình tự trong các khu vực untranscribed giữa hai gen. Phiên mã của gen xyl S. rubiginosus gây ra bởi xylose và bị ức chế bởi glucose. Người ta tin rằng 114-bp khu vực intergenic nucleotide cung cấp các ràng buộc về hoạt động cho các protein điều hòa. Sự ức chế catabolite Sự biểu hiện của operons xyl trong Salmonella typhimurium và E. coli dường như được quy định bởi một cơ chế kiểm soát tích cực và ức chế catabolite tác dụng bởi glucose. Ngoài ra, một tác dụng điều tiết của xylose isomerase chính nó đã được mô tả cho E. Coli. Trong E. coli, ức chế catabolite thông qua kích hoạt phiên mã bởi catabolite gen hoạt hóa protein và cyclic AMP (cAMP). Bacillus subtilis, operon xyl phủ định sự gối lên nhau bởi repressor xyl và cảm ứng bởi xylose. Các cAMP-cAMP cơ chế trung gian thụ thể quan sát thấy ở vi khuẩn E. Coli không chức năng B. subtilis, bằng chứng là các quan sát như vậy nồng độ cAMP là không bị ảnh hưởng bởi nồng độ của chất ức chế catabolite, các protein thụ thể cAMP đã không được phát hiện trong các vi khuẩn gram dương và ức chế catabolite trong B. Subtilis là tiêu cực tại các mức độ phiên mã. Jacob et al. đã chứng minh rằng glucose ức chế xảy ra ở mức độ phiên mã, là độc lập của một gen điều khiển chức năng cảm ứng xylose và phụ thuộc trên một trình tự cis trong khung đọc dịch của xylA. Các nghiên cứu của Kraus et al. Chứng tỏ rằng glucose cho thấy một loại trừ cảm ứng bổ sung loại áp xylA độc lập của cis-hành động yếu tố nhưng đòi hỏi một xylR chức năng và phụ thuộc vào nồng độ glucose và inducer (xylose). Trong kết luận, tổ chức của xylA và xylB dường như được bảo tồn cao độ trong tất cả các vi khuẩn. Hai gen luôn liền kề với nhau, nhưng kiểm tra kỹ hơn cho thấy đánh dấu sự khác biệt trong tổ chức của nó, như trong hính dưới: Trong Bacillus subtilis, các gen xylR có một phân cực ngược lại đến các gen xylA không giống như trong Staphylococcus xylosus và Lactobacillus spp. Trong Streptomyces spp, các gen được phiên mã xylA và xylB divergently sợi khác nhau, trong khi ở vi khuẩn E. coli, Lactobacillus spp. Và Bacillus spp. Đã ược phiên mã từ cùng một sợi. Các phân tích gen xyl từ một loạt các sinh vật sẽ giúp hình thành một ý kiến đồng thuận về việc tổ chức di truyền và các quy định của các gen xyl. Cải thiện di truyền của glucose isomerase bằng đột biến có định hướng phạm vi hoat động Những tiến bộ trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép thành công cách ly gen của protein. Kỹ thuật protein bởi thao tác của các gen của họ là trình bày một cách tiếp cận khả thi trong đó bổ sung cho cấu trúc chức năng nghiên cứu thực hiện bởi phương pháp tồn tại từ trước và cho phép sản xuất protein thích hợp thực hiện với những đặc tính mong muốn để cho một cái nhìn đầy đủ về cơ chế của enzyme. Những nghiên cứu này dẫn đến một giả thuyết mà có thể được xác định bởi kỹ thuật protein. Đột biến có định hướng phạm vi hoạt động (SDM) của GI đã được thực hiện với một số mục tiêu của tầm quan trọng học tập và công nghiệp, chẳng hạn như tăng sự ổn định nhiệt, giảm pH tối ưu, thay đổi ưa thích chất nền, suy luậnvai trò chức năng của dư lượng axit amin thiết yếu, vànghiên cứu sự tương tác tiểu đơn vị. Những nghiên cứu này đã góp phần đáng kể vào hiểu biết của chúng ta về cơ chế phân tử GI và đã tạo ra khả năng mới của sản xuất một enzyme với tính chất phù hợp hơn cho các ứng dụng trong công nghệ sinh học. Một vài ví dụ về cách đã giúp SDM nâng cao kiến ​​thức về cơ chế hoạt động của enzyme và đã sản xuất một loại enzyme với những đặc tính được cải thiện được ghi nhận dưới đây. Ổn định nhiệt độ Hầu hết các chế phẩm thương mại của GI có một nhiệt độ tối ưu từ 60 đến 650C. Hoạt động của GI suy giảm là một kết quả của việc nhiệt của nó ngừng hoạt động. Điều này ban một giới hạn về thời gian hoạt động của lò phản ứng. Một vài cơ chế được biết là có tham gia vào bất hoạt không thể đảo ngược của GI, chẳng hạn như mở ra không thể đảo ngược, glycation, và / hoặc deamidation của ASN hoặc GLN. Trong điều kiện thực tế, GI được tiếp xúc với nồng độ đường cao có thể dẫn đến glycation nonenzymaticdư lượng lysine và bất hoạt tiếp theo của GI. Thiết kế thí nghiệm kỹ thuật protein trên GI từ Actinoplanes missouriensis đã cho thấy rằng một đột biến GI có chứa một sự thay thế arginine cho lysine ở vị trí 253 tại giao diện dimer-dimer tăng một nửa sự tồn tại của enzyme 30% . Việc đạt được sự ổn định lớn nhất là đạt được trong một trong ba đột biến (G70S/A73S/G74T) của enzyme, cho cả hai hòa tan và bất động chuẩn bị. Tương tác kỵ nước trong số các acid amin thơm có mặt trong các hoạt động của GI là mặc nhiên công nhận là một trong những yếu tố quan trọng là giúp duy trì sự liên kết của monome vào hoạt động dimers. Sự gia tăng trong chịu nhiệt do đó có thể đạt được bằng cách tăng cường sự tương tác giao diện của các hoạt động dimers. Tăng cường tính chịu nhiệt của GI được thu thập từ Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes như là một hậu quả của việc giảm kỵ nước có thể tiếp cận được bề mặt bằng cách đột biến có định hướng phạm vi hoạt động của axit amin thơm trong các phạm vi hoạt động. Thay thế W139 với F, M, hoặc dẫn đến hiệu quả xúc tác làm tăng tỷ lệ thuận với giảm sợ nước của chuỗi bên của các thay thế amino acid. Ảnh hưởng của thay đổi dư lượng tại các giao diện tiểu đơn vị về hoạt động và chịu nhiệt của GI từ Arthrobacter spp. đã được nghiên cứu bởi Varsani et al. Giới thiệu một hoặc hai mối liên kết disulfide, cầu muối tại giao diện tiểu đơn vị không kết quả trong bất kỳ sự thay đổi trong hoạt động của enzyme hay sự ổn định. Một phân tích các kết quả chỉ ra rằng tiểu đơn vị phân ly không phải là trên con đường ngừng hoạt động, nhiệt nhưng đó chuyển động của nhóm hoạt động, phạm vi hoạt động có thể gây ra những thay đổi conformational mà có thể chịu trách nhiệm về việc bắt đầu diễn tiến của protein. Tìm hiểu vai trò của các ion kim loại Phân tích được các vai trò của các ion kim loại có liên quan đến tính chịu nhiệtvà xúc tác là khó khăn. Các đặc tính sinh hóa của GIA. missouriensis điều tra sau khi các chuỗi bên tham gia vào các liên kết kim loại được thay thế bởi SDM. Các kết quả chứng minh rằng hai ion kim loại đóng một vai trò quan trọng trong liên kết và ổn định các hình thức mở bề mặt và hydride xúc tác trong việc chuyển giao giữa vị trí C-1 và C-2. Vai trò riêng biệt của hai ion magiê cần thiết cho hoạt động GI olivochromogenes Streptomyces được xác định phân tích kích hoạt neutron và SDM. Một trong những phạm vi liên kết kim loại, M-1, đã được gỡ bỏ thay thế của Glu-180 bởi Lys. Mở vòng thử nghiệm với các E180K đột biến với 1 thioglucose như bề mặt cho thấy rằng Glu-180 thiết yếu cho đồng phân nhưng không cho mở vòng. Sự thay đổi đặc trưng của cơ chất GI hiển thị ái lực cao hơn cho xylose hơn cho glucose. Tuy nhiên, tăng ái lực đối với glucose là mong muốn của mình ứng dụng trong sản xuất HFCS. Những nỗ lực nhằm làm thay đổi chất nền ưu đãi của GI ưa nhiệt từ Clostridium thermosulfurogenes đã được thực hiện bằng cách thiết kế lại các axit amin nằm trong túi chất nền ràng buộc. W-139F thay thế giảm Km và tăng Kcat. đột biến đối với glucose, trong khi hiệu ứng ngược lại đối với xylose được quan sát thấy. Đột biến tăng gấp đôi (W-139  F/V-186  TW-139 và W-139  F/V-186  S) có năm và gấp đôi cao hơn hiệu quả sử dụng xúc tác, tương ứng, so với các loại tự nhiên. Những kết quả này cung cấp bằng chứng rằng các đặc trưng chất nền có thể được thay đổi bằng cách giảm các khó khăn steric và tăng cường năng lực liên kết hydro cho glucose trong túi substratebinding của các phạm vi hoạt động. Vai trò chức năng của lượng dư acid amin thiết yếu Các phạm vi cần thiết lượng dư histidine hoạt động trong GI Clostridium thermosulfurogenes đã được xác định bằng cách thay thế dư lượng histidine ở bốn vị trí khác nhau. Thay thế của His-101 bởi phenylalanine bãi bỏ các hoạt động của enzyme, trong khi đó thay thế dư lượng histidine khác không có tác dụng. His-101 và His-271 được chứng minh là thành phần thiết yếu của phạm vi hoạt động của GI từ E. coli bằng cách thay thế chọn lọc của mỗi acid amin. Đó là suy đoán rằng His-101 là cơ sở trung gian xúc tác phản ứng trong khi His-271 vận hành hư là một phối tử cho một trong các ion kim loại trong các phạm vi hoạt động của GI. SDM được sử dụng để đánh giá vai trò cấu trúc và chức năng dư lượng axit amin cụ thể trong GI từ Actinoplanes missouriensis. His-220 và His-54 là quan trọng nhưng không cần thiết cho xúc tác. His-54 là ngụ ý đến chi phối đặc trưng anomeric. Lys-183 đã được giả định để đóng một vai trò quan trọng trong các bước đồng phân bằng cách hỗ trợ chuyển động qua lải của proton. Lys-294 là gián tiếp liên quan đến việc ràng buộc các cation kích hoạt, trong khi TRP-16 và TRP-137 góp phần duy trì kiến trúc chung của phạm vi ràng buộc chất nền. SDM của lượng dư tryptophan được bảo tồn trong enzyme E. coli (Trp-49 và Trp-188) cho thấy huỳnh quang dập tắt những dư lượng xảy ra trong quá trình liên kết của xylose bởi các enzyme tự nhiên. Các phạm vi hoạt động thay thế tại His-101, mà kết quả bất hoạt các men tiêu hóa, cho thấy thay đổi đặc điểm quang phổ. Thay đổi trong pH tối ưu Ứng dụng thương mại của GI đòi hỏi một điểm pH tối ưu có tính axit để cho phép hóa lỏng tinh bột và đồng phân glucose được thực hiện trong một bước duy nhất. Glu-186 là một bảo tồn dư lượng nằm gần vị trí hoạt động của GI từ A.missouriensis nhưng không tham gia vào các chất nền hoặc ion kim loại ràng buộc. Các điện tích âm từ nhóm này đã được gỡ bỏ do đột biến glutamine, kết quả trong việc giảm pH tối ưu của nó đến 6.25 và thay đổi xu thế từ Mg2+ sang Mn2+. Nghiên cứu này cho biết thêm thông tin mới về các cơ chế xúc tác của đồng phân aldose-ketose GI và chứng minh thay thế một amino acid có thể thay đổi pH tối ưu hơn 1 đơn vị pH. Xác định vấn đề quan trong và giải pháp mang lại hiệu quá tiềm năng Giới thiệu về đồng phân enzyme glucose sản xuất HFCS là gặp phải một số vấn đề. Trong số các vấn đề lớn là bất hoạt của GI ở nhiệt độ cao, pH cao tối ưu của nhiều các chế phẩm GI, yêu cầu của Co2+ cho các hoạt động của enzyme, các mối quan hệ thấp hơn của GI glucose hơn xylose, và nồng độ tối ưu của sản phẩm. Chuyên sâu nghiên cứu cách khắc phục những vấn đề này có kết quả trong sự phát triển của cải tiến đáng kể quy trình. Tuy nhiên, có phạm vi để tiếp tục cải thiện trong tất cả các lĩnh vực nói trên để phát triển một quá trình thương mại khả thi về mặt kinh tế để thay thế cho glucose bởi HFCS. Một trong số những vấn đề quan trọng phải đối mặt trong công nghiệp ứng dụng của GI và các giải pháp chính đáng, chúng sẽ được thảo luận dưới đây. Tăng cường tính chịu nhiệt Việc chuyển đổi trạng thái cân bằng của đường fructose dưới điều kiện quá trình công nghiệp là khoảng 50%, và các entanpy của phản ứng là 5 kJ /mol. Các ứng dụng thương mại của HFCS yêu cầu sử dụng fructose nồng độ cao. Các nồng độ fructose mong muốn cho nhiều ứng dụng trong ngành công nghiệp cao hơn 50%. Sản lượng đồng phân cao hơn có thể được đạt được bằng cách tăng nhiệt độ phản ứng. Hiệu quả của nhiệt độ trên nồng độ fructose ở trạng thái cân bằng là được hiển thị trong bảng sau: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến nồng độ fructose Hơn nữa, nhiệt độ cần thiết cho chuyển đổi phụ thuộc vào dung lượng dẫn liệu glucose của xi-rô. Bảng Mối quan hệ giữa dung lượng syrup và nhiệt độ trong sản xuất HFCS Sử dụng nồng độ dung lượng xi-rô cao hơn và nhiệt độ gia tăng của hoạt động giữ cho thời gian phản ứng cần thiết cho các quá trình đồng phân từ trở thành quá mức. Nhiệt độ đồng phân bình thường từ 55 đến 600C. Nhiệt độ thấp hơn dẫn đến nguy cơ gia tăng nhiễm trùng vi khuẩn. Nhiệt độ cao làm tăng tỷ lệ đồng phân nhưng giảm enzyme và sự ổn định monosaccharide. Thiệt hại về enzyme hoạt động gặp phải trong quá trình hoạt động được do sự biến tính nhiệt. Enzyme trưng bày một hàm mũ phân rã như một hàm của thời gian. Một enzyme chịu nhiệt, ổn định tại pH có tính axit, có thể làm tăng hiệu quả của quá trình và làm giảm khả năng hình thành các sản phẩm. Báo cáo GI chịu nhiệt từ một vài vi sinh vật. Tăng fructose Các ứng dụng chính của HFCS là đồ uống ngọt. Một HFCS 55% tập trung phù hợp với vị ngọt của saccharose và cho phép thay thế 100%. Giá của nó là từ 10 đến 20% thấp hơn giá saccharose, dựa trên độ ngọt 42% tập trung HFCS được sử dụng trong sữa, nướng bánh, và các ngành công nghiệp bánh kẹo và chuẩn bị thực phẩm đóng hộp, mứt, thạch, và nước sốt cà chua. Tuy nhiên, ứng dụng trong các ngành công nghiệp được giới hạn bởi một số những hạn chế cố hữu đối với HFCS, cụ thể là, bản chất của nó hút ẩm và nhớt, xu hướng màu nâu, và không có khả năng kết tinh. Trong quá trình thương mại, 42% fructose nói chung là sản xuất trong hỗn hợp cân bằng, điều này cần phải được gia tăng cho các ứng dụng chính của nó. Phương pháp để gia tăng fructose có liên quan đến complexation của fructose bởi các hợp chất borat trong đồng phân. Mức độ làm giàu phụ thuộc vào glucose tập trung và số lượng của borat gia tăng. Phương pháp này cho kết quả trong sản xuất xi-rô có chứa 80% fructose. Tuy nhiên, chi phí loại bỏ và phục hồi của borat ngăn cản sự thành công kinh tế của quá trình này. Đơn giản nhất hoàn thành chuyển đổi glucose thành fructose mãi mãi là ước mơ của các ngành công nghiệp xay xát và tinh chế ngô. Một cách để tăng sản lượng fructose bằng cách sử dụng D-glucose là tạo ra một nồng độ vượt qua trạng thái cân bằng tạm thời của các sản phẩm như mô tả của Schray và Rose. Một cách tiếp cận để làm cho 55% fructose là tăng đồng phân nhiệt độ. Tăng nhiệt độhơn 700C dẫn đến sự gia tăng nồng độ HFCS 50% hoặc nhiều hơn. Đã được loại trừ nhựa phân tử được sử dụng để làm tăng nồng độ fructose. Một xi-rô có chứa hơn 90% fructose thu được bằng cách hình thành fructoseoxyanion phức với germanate. Kỹ thuật sắc ký hiện đại với các loại nhựa trao đổi ion là tốt nhất cho việc tách fructose từ glucose. Một xi-rô có chứa 95% fructose trên thị trường tại Pháp và được bán ở dạng tinh thể. Hạ thấp pH đồng phân pH tối ưu cho các đồng phân là giữa 7.0 và 9.0. Các hoạt động của enzym giảm nhanh chóng tại các giá trị pH thấp hơn. Độ pH thấp là một lợi thế vì lợi ích của monosaccharide ổn định và khả năng tương thích của quá trình này với saccharification tinh bột bởi một amylase. Các nguyên liệu phổ biến nhất được sử dụng cho sản xuất HFCS là bột bắp sản xuất bởi ngô ướt xay xát. Hóa lỏng và saccharification, tinh bột liên quan đến sự tham gia của một amylase, glucoamylase, và debranching enzyme, tất cả đều có độ pH tối ưu trong phạm vi của 4.5 đến 6.2, trong khi cho isomerase giữa pH 7.0 và 8.0. Một tiết kiệm lớn chi phí sẽ được có thể nếu hai quá trình có thể được tiến hành đồng thời ở cùng một độ pH trong một lò phản ứng duy nhất. Đồng phân ở pH thấp là thuận lợi, bởi vì nó làm giảm sự hình thành của các hợp chất cacbonyl màu nhiệt độ cao hơn và có thể dẫn đến giảm chi phí trao đổi ion và carbon lọc. GI từ Thermus aquaticus được báo cáo là hoạt động ở pH 3.5 và có đầy đủ hoạt động ở pH 5.5. "Hạn uni-pH quá trình" ngụ ý một quá trình trong đó hóa lỏng, saccharification, và đồng phân thực hiện tại cùng một độ pH, tốt nhất tại pH 4.5 đến 5.0 là pH tối ưu cho amylase và amyloglucosidase. Sự hiện diện của Ca2+ là một điều kiện tiên quyết cho các hoạt động của amylase, trong khi Ca2+ ức chế GI. Acid ổn định glucose isomerase có khả năng kháng để ức chế bởi Ca2+ hữu ích trong một uni-pH quá trình. GI từ một sp Thermoanaerobacter. được đặc trưng với phát triển một bước quá trình sản xuất chất ngọt. Sự kết hợp của saccharification và đồng phân là một lý tưởng phát triển trong sự tiến bộ của sản xuất HFCS, và nó có khả năng hoạt động khi một axit ổn định, chịu nhiệt, và chịu Ca2+ GI được phát hiện. Điều này sẽ được enzyme được sử dụng cho sản xuất thương mại của HFCS. Đồng thời đồng phân và lên men xylose Tình hình thiếu hụt dầu mỏ và khí tự nhiên có nhắc lại nghiên cứu trong việc chuyển đổi của vi sinh vật của pentose có tài nguyên sinh khối tái tạo để sản xuất ethanol và các nguyên liệu hữu ích khác. Nhiều nấm men có thể phát triển trên xylose, nhưng chúng không hiệu quả trong quá trình lên men đường anaerobically và có một sản lượng ethanol rất thấp. Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, và Candida tropicalis có khả năng lên men xylulose có nguồn gốc từ đồng phân của xylose với GI trong quá trình lên men kỵ khí hoàn toàn. Đồng thời đồng phân và lên men xylose (SIFX) được ưa thích đồng phân trước khi lên men, vì tỷ lệ của xylulose để xylose (1:5) là thấp ở trạng thái cân bằng. Loại bỏ xylulose từ hỗn hợp tạo điều kiện chuyển đổi xylose thành xylulose, đồng thời chuyển đổi thành ethanol bởi nấm men. Độ pH tối ưu cho quá trình lên men là 5.0, trong khi GI ổn định ở pH trung tính. Cả hai đồng phân và lên men có thể xảy ra tại một sự thỏa hiệp pH 5.5 hoặc 6.0. Mặc dù sự khác biệt trong tỷ lệ lên men của glucose và xylose, sản lượng cuối cùng của ethanol trong SIFX ấn tượng. Enzyme cấp thấp hoặc ức chế các enzym bởi xylose, xylulose, hoặc ethanol có thể được chịu trách nhiệm về tính không hiệu quả SIFX. Tuy nhiên, SIFX cung cấp một cải tiến đáng kể so với hệ thống lên men xylose để sản xuất ethanol. Sử dụngbất động GI và nấm men có thể hạ thấp chi phí SIFX và sử dụng ổn định đường tiêu hóa acid sẽ góp phần hiệu quả của việc SIFX. Phạm vi nghiên cứu trong tương lai GI lý tưởng nên có một tối ưu pH thấp hơn, cao hơn nhiệt độ tối ưu, một sức đề kháng để ức chế của Ca2+, và ái lực cao hơn cho glucose hơn so với hiện nay sử dụng các enzyme. Giới thiệu tất cả các đặc tính này thành một loại protein duy nhất là một nhiệm vụ hết sức nặng nề, mà đã là một trở ngại trong việc phát triển của một quá trình thương mại, kinh tế khả thi đối với enzyme đồng phân glucose với fructose. Những tiến bộ trong tái tổ hợp công nghệ DNA và kỹ thuật protein đã mở mới và khuyến khích khả năng kết hợp các thuộc tính mong muốn trong một sinh vật duy nhất để sản xuất một protein thích hợp thực hiện. Giảm chi phí enzyme bằng cách khuếch đại của gen GI có thể làm tăng năng suất lên men. Cô lập một đột biến cho sản xuất cấu thành của đường tiêu hóa và loại bỏ các yêu cầu của ion kim loại sẽ góp phần đáng kể vào cải thiện các quy trình hiện có để sản xuất HFCS. Sự kết hợp của saccharification tinh bột với đồng phân sẽ cho kết quả rút ngắn thời gian phản ứng và dẫn đến một tiết kiệm lớn về chi phí thiết bị. Tuy nhiên, chính hạn chế trong sự phát triển của quá trình đơn pH là nhiều sự khác biệt trong điều kiện phản ứng tối ưu cho cả hai enzyme có xu hướng giảm hiệu quả của một hệ thống đồng thời. Những nỗ lực để sản xuất GI chịu nhiệt và acid ổn định với cao hơn ái lực với đường SDM của gen GI đã sẵn sàng bằng cách này, với một cái nhìn để phát triển một sự chuẩn bị thích hợp GI cho công nghệ sinh học ứng dụng. Pháp chế về việc sử dụng glucose isomerase Immobilised 0.0015–0.03% DS fixed bed 0.16 DS batch Ở Mỹ: Điều kiện GRAS – 184.1372 (chuẩn bị immobilized) – Actinoplanes missouriensis; Bacillus coagulans; Streptomyces olivaceous; Streptomyces murinus, Streptomyces rubiginosus, Streptomyces olivochromogenes, Arthrobacter globiformus. Canada: Actinoplanes missouriensis; Bacillus coagulans; Streptomyces spp.; Olivochromogenes spp.; S. olivaceous. Glucose, si-rô glucose một phần hoặc hoàn toànvới fructose isomerised. UK và Châu Âu: Hòa tan được - Bacillus coagulans Immobolilised - Bacillus coagulans, Strepmyces olivaceous Australia/pacific rim: Nhật Bản: Được cho phép Enzyme glucose oxidase Giới thiệu chung về enzyme glucose oxidase Glucose oxidase (GOX) xúc tác quá trình oxy hóa của β-D-glucose thành D-glucono-δ-lacton và hydrogen peroxide. Nó là rất cụ thể cho β-D-glucose và không hoạt động trên α-D-glucose. Sử dụng chính của glucose oxidase được trong việc xác định miễn phí glucose trong các sản phẩm bodyfluids, thực phẩm và nông nghiệp. Tuy nhiên, nó đã được được sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp nướng bánh, nó oxy hóa hiệu quả kết quả trong bột nhão mạnh mẽ hơn. Trong một số ứng dụng có thể được sử dụng để thay thế oxy hóa, chẳng hạn như Bromate và axit L-ascorbic. Các ứng dụng khác của glucose oxidase bao gồm việc loại bỏ oxy từ quá trình đóng gói thực phẩm và loại bỏ D - glucose từ lòng trắng trứng để ngăn chặn sự sậm màu. Nó đã được đề xuất cho một kỹ thuật mà hệ thống enzyme thứ hai, tức là horseradish peroxidase (HRP) chỉ đơn giản là thêm vào hỗn hợp phản ứng khá tương tự như xét nghiệm về hóa học lâm sàng (Kuhlmann năm 1970; Kuhlmann và Avrameas 1971). Trong sử dụng ban đầu của nó, nguyên tắc khuếch đại enzyme này thường đưa ra một hạn chế ở cấp độ kính hiển vi ánh sáng bằng cách nhuộm màu không chính xác với sự định hóa khuếch tán của các chi tiết di động. Hệ thống enzyme nhiều bước đã cho thấy rằng một hệ thống enzyme kết hợp chặt chẽ sẽ làm việc tốt hơn vì nó có một hiệu ứng tích lũy về hiệu quả của phản ứng tổng thể là đạt được (Mosbach và Mattiasson 1976). Vì vậy các bộ khuếch đại hệ thống thứ hai (HRP) ở gần của các enzyme đánh dấu (GOX) vào các phạm vi di động tương tự bằng cách miễn dịch hoặc cầu avidin-biotin, và do đó, nội địa hóa tuyệt vời của kháng nguyên có thể đạt được. Tính hữu dụng và độ nhạy của phương pháp mới do đó được chứng minh bởi immunolocalization IgA trong amidan, fetoprotein-alpha ở gan và mô kháng nguyên polypeptide trong tuyến vú. Cho mục đích này, kháng thể gián tiếp lanelled và kháng thể kỹ thuật brigde bao gồm cả phương pháp avidin-biotin emploted. Nguyên tắc hoạt động Glucose oxidase xúc tác quá trình oxy hóa của β – D - glucose thành D – glucono - δ - lactone với việc xảy ra đồng thời của hydrogen peroxide. Trong sự hiện diện của peroxidase (POD) hydrogen peroxide (H2O2) tham gia vào một phản ứng thứ hai liên quan đến axit p-hydroxybenzoic và 4-aminoantipyrine với sự hình thành định lượng của một quinoneimine phức tạp thuốc nhuộm được đo ở 510 nm. Các phản ứng có liên quan là: Động học và cơ chế hoạt động enzyme glucose oxidase Glucose Oxidase từ khuôn mẫu đã được nghiên cứu bởi một số của người lao động. Enzyme xúc tác quá trình oxy hóa của β – D - glucose thành D - glucono – δ - lactone. Đặc trưng chất nền của nó đã được kiểm tra, và nó cũng tác động lên 2 -deoxy-glucose, D-mannose, D-galactose và D-xylose, mặc dù kết quả cho ba đường cuối cùng là rất thấp. Cộng hưởng tín hiệu và sự xuất hiện hấp thụ quang phổ tương ứng với các hình thức enzyme trung gian giữa oxy hóa hoàn toàn và đầy đủ giảm flavin, cũng không làm giảm quá trình oxy hóa như trung gian các hình thức nhất thiết phải hoạt động một phần trong xúc tác. Do đó mỗi enzyme phải được kiểm tra một cách riêng biệt và các kết quả của sự cộng hưởng spin electron quang phổ tương quan với các nghiên cứu phản ứng nhanh chóng, thành lập có hoặc không có hình thức trung gian của enzyme phản ứng ở một giá trị đủ để có lợi cho hoạt động xúc tác của nó. Điện tử quay nghiên cứu cộng hưởng của glucose oxidase đã được báo cáo của Beinert và Sands và Mason et al. và trong khi kinh nghiệm trên glucose oxidase từ AspergiZZuns Iger trong tiến trình, Nakamura và Ogura xuất bản một bài báo quan trọng về động học của quá trình oxy hóa của glucose bởi các enzyme từ Penicillium arnagaskiense. Tóm lại, những bằng chứng này chỉ ra rằng các trung gian semiquinoid lợi ích một phần không dùng trong cơ chế xúc tác của glucose oxidase. Phương pháp thực nghiệm Vật liệu Tinh khiết glucose oxidase (A. niger) được chuẩn bị từ Dee-Oconcentrate được thu từ Công ty Hóa chất Miles bằng cách sửa đổi phương pháp của Kusai. Catalase (thịt bò, gan) với 1.260 đơn vị Keilin mỗi g được thu thập từ Công ty L.Light, Bucks, England. D - Glucose, D - galactose, D - xylose, D - mannose và D - glucono – δ - lactone được lấy từ nhà thuốc của Anh, Ltd, Poole, Dorset, Anh. 2 – deoxy - D – glucose (a grade, glucose free) được thu thập từ Tổng công ty California để nghiên cứu Sinh hóa. Độ tinh khiết của Đường Galactose, xylose, mannose thử nghiệm cho sự tinh khiết và đường nhiễm bẫn cả hai chromatographically và enzymically. Tăng dần sắc ký trên giấy trong một hệ thống bao gồm dung môi ethyl acetate pyridin - nước (2: 1: 2 v / v) cho thấy không có nhiễm bẩn đường, nhưng rất nhỏ nhiễn bẩn của galactose với lactose. Tuy nhiên, glucose nhiễm bẩn dưới 1% gặp nhiều khó khăn để phát hiện bằng sắc ký. Tỷ lệ xúc tác quá trình oxy hóa bởi glucose oxidase glucose rất nhanh hơn nhiều so với quá trình oxy hóa của mannose, galactose, hoặc xylose. Nhiễm bẩn glucose không đáng kể có thể được phát hiện trong xét nghiệm sự đo áp, kể từ khi, nếu nồng độ phù hợp của một trong những các loại đường và enzyme được sử dụng, bất kỳ nhiễm bẩn glucose đáng kể tăng lên với tốc độ ban đầu nhanh chóng của sự hấp thu oxy, theo sau với tốc độ chậm liên tục, sự hấp thu do chủ yếu đường một mình. Tại 0,67 M, galactose, mannose và xylose được phát hiện là bị nhiễm bẩn bởi đường khoảng 0.2, 0.2 và 0.1 '%, tương ứng. (Một lô galactose có một ô nhiễm 2% với glucose và đã bị từ chối). D - glucono – δ - lactone đã được tìm thấy có khoảng 0.1% ô nhiễm ZO glucose. Glucose - đường Mannose, Galactose, Xylose, Glucose Được yêu cầu cho các thí nghiệm dòng chảy dừng lại kỵ khí. Nhiễm bẩn Glucose được giảm đến một mức độ không đáng kể enzymically bằng ủ đường bị ô nhiễm tại 350 trong 1 giờ trong không khí (bằng cách lắc) với một số lượng không đáng kể của glucose oxidase. Số lượng glucose oxidase được tính toán đủ để oxi hóa gần như tất cả các đường trong thời gian này, nhưng chưa đủ để chuyển đổi hơn 1% của các loại đường với các sản phẩm. Enaymic hoạt động chấm dứt khi các giải pháp đường kỵ khí được thực hiện. Ngoài ra, galactose rất tinh khiết đã được chuẩn bị từ pentaacetylgalactose đã được recrystallized một số lần từ methanol. Dừng lại dòng chảy kết quả thu được galactose tinh khiết trong với đồng thuận tuyệt vời với những người thu được với enzymically galactose đã xử lý. Bộ đệm Trong các thí nghiệm dòng chảy cả manometric và dừng lại, 0.1 và 0.13 M sodium đệm phosphate, pH 5.6, được sử dụng. Keilin và Hartree sử dụng bộ đệm phosphate, pH 5.6, trong thí nghiệm của mình với glucose oxidase. Manometric thí nghiệm cũng đã được thực hiện với 0,1 M đệm natri acetate, pH 5.6, được sử dụng bởi các công nhân khác. Không có sự khác biệt trong kết quả đã được thu được với hai bộ đệm, mặc dù cả hai đều kết thúc của các dãy đệm tương ứng của họ. Trong các thí nghiệm với glucono… đệm sodium phosphate 0.2M, pH 6.3 đã được sử dụng. Nồng độ đo Tất cả các giải pháp đường từ các chất rắn được phép mutarotate vào hỗn hợp cân bằng (hình thức α và β trước khi sử dụng trong các thí nghiệm động. Dữ lệu Kinetic trong bài báo này được thể hiện trong điều kiện đường tổng tập trung, mặc dù glucose oxidase là cụ thể cho β-glucose. Nồng độ enzyme được đo trong các điệu kiện của nó chứa đựng flavin. Trong các thí nghiệm dòng chảy dừng lại, giải pháp đã gọi là chứa đựng O2 đã được chuẩn bị bằng cách cân bằng áp suất khí quyển trong mạch mở và không khí trong phòng hoặc bằng cách cân bằng với oxy tinh khiết trong áp kế thủy tinh. Nồng độ oxy được tính toán từ các bảng độ hòa tan của nó. Bởi vì nồng độ cao của glucose làm suy giảm tính hòa tan của khí trong nước, như một quy tắc chung, giải pháp cân bằng enzyme với oxy, và glucose được giải thoát khỏi khí hoà tan bằng cách lắc và di tản. Các áp kế đã được lấp đầy với nitơ prepurified (Công ty Anh oxy, Wembley, Middlesex, Anh), và các giải pháp oxy đã được chuyển giao trực tiếp vào bộ máy dòng chảy dừng lại. Phương pháp Manometric Experiments Tiêu chuẩn Warburg áp kế được sử dụng. Tỷ lệ hấp thu oxy trong sự hiện diện của glucose oxidase và catalase tinh khiết (100 µg mỗi áp kế) được nghiên cứu trên một phạm vi nồng độ đường (0.1-0.01 M) tại pH 5.6, 00 và 250, và hàm lượng oxy khác nhau. Các khí không gian của áp kế đã được lấp đầy với một trong hai ôxy, không khí ( 21% oxy), 10,5% oxy. Nhìn chung, số lượng enzyme mỗi áp kế đã được điều chỉnh để oxy hấp thu không vượt quá 3µl mỗi phút. Các áp kế đã lung lay tại một tỷ lệ không đổi cho mỗi phút 150. Oxy hấp thu hơn 25 phút đã được sử dụng trong tính toán tỷ lệ hấp thu oxy, kể từ khi tỷ lệ này là liên tục cho thời gian này. Gây ô nhiễm glucose (0,0002 IVR hoặc ít hơn) trong mannose, galactose, và xylose ở nồng độ 0,1 M đã được sử dụng rất nhanh chóng, mà chỉ có tỷ lệ trong 2 đến 5 phút đầu tiên lớn hơn ở lần sau. Trong thực tế, ở nồng độ thấp hơn 0.1 M đường, glucose ô nhiễm ngày càng trở nên khó khăn để phát hiện ở tất cả các. Tuy nhiên, hằng số tỷ lệ hấp thu oxy lần lớn hơn 5 phút sau khi trộn đã được sử dụng để tính mục đích. Dừng dòng thí nghiệm Đây là những thực hiện với bộ máy của Gibson và Milnes với việc sử dụng của một 2cm con đường ánh sáng. Đa số các thí nghiệm được thực hiện ở 450 µm với một nguồn ánh sáng vonfram, đối với một số người, trong vùng tử ngoại khu vực, 150-watt, dòng hồ quang xenon được sử dụng. Nếu glucose là vượt quá đủ lớn liên quan đến oxy để nồng độ của nó có thể được coi là không đổi trong suốt phản ứng, sau đó, cung cấp mà glucose phản ứng với một hình thức của loại enzyme có quang phổ của các enzyme bị oxy hóa, số lượng doanh thu bất kỳ ngay lập tức là tỷ lệ thuận với sự phối. Hình 1: Sao chép dao động dấu vết thu được với dừng lại bộ máy dòng chảy trong sau phản ứng giữa glucose và oxy. Đồng thời thể hiện bằng mũi tên, một giải pháp enzyme ở trạng thái cân bằng với 1 bầu không khí của O2 được trộn với một bằng khối lượng của M & miễn phí đường 0.1. Phản ứng này đã được theo sau trong một con đường ánh sáng 2 cm tại 450 µm, 00 trong 0,13 M đệm phosphate, pH 5.6, nồng độ các men tiêu hóa là 1.17x10-5 M. Tổng số lần enzyme phải chuyển giao khí thải oxy gia tăng có thể được tínhtừ các điều kiện của thí nghiệm, và con số này có thể tương đương với diện tích kèm theo như trong hình trên. Giá trị số tương ứng với một giá trị của phối có thể đượcđược tìm thấy bằng cách đo tỷ lệ trong tổng diện tích kèm theo giữa hai điều phối gần sự khởi đầu của đường cong, nơi tốc độ thay đổi của mật độ quang học nhỏ. Trên giả định rằng số lượng tương ứng của oxy đã được tiêu thụ trong khoảng thời gian giữa các điều phối ở một tỷ lệ không đổi tương ứng với mức trung bình của các điều phối đầu tiên và cuối cùng, giá trị tương ứng với một phối cụ thể có thể được được tìm thấy. Mức thu khác nhau với những loại đường và điều kiện khác nhau Kết quả với glucose ở 00 đã được trình bày trong hình dưới. Cơ chất của một chất kết tủa nghịch đảo đối ứng cho tăng song song như những đường trong hình. 1 có thể được tóm tắt trong bavhằng số: tỷ lệ với nồng độ vô hạn của cả hai nền (Vmax), và nồng độ của mỗi chất nền cần thiết để cung cấp cho một nửa tỷ lệ này tối đa trong sự hiện diện của một vô hạn nồng độ khác (KO2, và Kpiucose). Một số giá trị những số lượng được thu thập trong bảng sau: Với 2 deoxyglucose, kết quả cũng tương tự như trong hình thức, nhưng giá trị số của các hằng số khác nhau rất nhiều. Với 2-deoxyglucose, KO2 là quá nhỏ mà nó là khó khăn để xác định chính xác, Vmax ít hơn nhiều hơn so với glucose dưới điều kiện so sánh. Các loại đường mannose, galactose, và xylose bị tấn công từ từ vẫn còn. Các hình thức của các kết quả động là khác nhau ở chỗ không có bằng chứng cho sự tồn tại của một vận tốc giới hạn, ngay cả khi nồng độ rất cao của các loại đường (0.5 M) được sử dụng, như đã được thực hiện trong các thí nghiệm dòng chảy dừng lại. Một ví dụ làđược đưa ra trong hình dưới. Trong những trường hợp này, kết quả động hoàn toànquy định bằng cách cho số lượng doanh thu tại bất kỳ một nồng độ đường.KO2 có thể không được xác định như là không khả thi làm việc với nồng độ O2 đủ thấp để ảnh hưởng đến giá trị của phản ứng. Hình 2: Quá trình oxy hóa của xylose bởi glucose oxidase được đo manometrically. Mở điểm, quy mô ở bên trái và phía dưới của hình. Điều kiện: 250, 0.13M đệm phosphate, pH 5.6, 0.1 mg của catalase mỗi bình. Điểm đầy giảm glucose oxidase (1.1 x10-5M) bởi xylose, đo trong một bộ máy dòng chảy dừng lại. Quy mô tại con số bên phải và phía trên của hình. Điều kiện: 250, độ pH 5.6, con đường ánh sáng 2 cm, 450 µm, enzyme và các giải pháp đường kỵ khí. Hiệu lực chiều dài sóng khác nhau của các quan sát - Một mở rộng của hàng loạt các quyết định đã được thực hiện trong phạm vi 250 đến 470 µm với nhiều nồng độ glucose. Trong mọi trường hợp đã có mối tương quan giữa các kết quả tốt, mặc dù điều chỉnh độ dài sóng ngắn nhất là cần thiết cho hấp thụ H2O2 hình thành trong phản ứng. Quan sát những thay đổi huỳnh quang trong sản lượng- năng suất rõ ràng huỳnh quang của các axit amin thơm của glucose oxidase thay đổi trên quá trình oxy hóa và giảm, và sự thay đổi này đã cũng được sử dụng để thực hiện theo các phản ứng, đặc biệt tại 280 µm và quan sát huỳnh quang thông qua một sự kết hợp của 3 mm Lucite và 1mm của OX73. Những thay đổi trong tương quang huỳnh quang trong lỗi thử nghiệm với những thay đổi trong hấp thụ. Một lời giải thích cho sự thay đổi huỳnh quang thơmaxit amin vào quá trình oxy hóa và giảm các men tiêu hóa là một phát thải diễn ra, và được liên kết với một mức độ khác nhau truyền năng lượng. Các mối tương quan giữa độ hấp thụ và thay đổi huỳnh quang hỗ trợ này giải thích và lập luận intramolecular chống lại một sự thay đổi trong cấu hình của protein phân tử. Một nửa thí nghiệm phản ứng - phản ứng của các enzyme oxy hóa đường được theo sau bằng cách trộn kỹ enzyme deoxygenated với dung dịch đường oxy tự do và quan sát giảm hấp thụ ở 450 µm trong bộ máy dòng chảy dừng lại. Trong mọi trường hợp ngoại trừ 2-deoxyglucose, tỷ lệ xuất hiện của enzyme flavin giảm được tỷ lệ thuận với nồng độ đường được sử dụng với nồng độ cao nhất mà có thể được làm việc trong bộ máy dòng chảy dừng lại. Các giới hạn trên là do sự xuất hiện của thay đổi giả trong hấp thụ do tán xạ trên các gradient chỉ số khúc xạ, và khoảng 0.5 M cho các loại đường như glucose). Với 2-deoxyglucose, có vận tốc tối đa rõ ràng và một cách dễ dàng đo nửa tốc độ tập trung. Các kết quả khác nhau cho đường được thu thập trong bảng 1 trong cột đầu kI và cho thấy rằng, cũng như trong các thí nghiệm sản lượng, glucose phản ứng nhanh hơn so với các loại đường khác. Các kết quả với 2-deoxyglucose được đưa ra trong hình. Hình 3: Phản ứng của oxy hóa glucose oxidase với 2-deoxyglucose đo spectrophotometrically ở 250 trong 0.13 M đệm phosphate, pH 5.6, với một bộ máy dòng chảy dừng lại. Enzyme tập trung sau khi trộn, 1.0 x10-5 M, con đường ánh sáng 2-cm, 450 µm, enzyme và các giải pháp đường kỵ khí. Sự ức chế thí nghiệm Glucose phản ứng nhanh hơn nhiều so với bất kỳ đường khác mà các loại đường khác có thể dễ dàng được kiểm tra ức chế hoạt động. Nó được tìm thấy rằng 2- deoxyglucose một chất ức chế cạnh tranh glucose trong phạm vi dự đoán từ cơ chế phản ứng của các loại đường này được đưa ra dưới đây ("Thảo luận"). Các kết quả của một thí nghiệm manometric được hiển thị trong hình: Hình 4: Ảnh hưởng của thay đổi nồng độ 2-deoxyglucose trên sự hấp thu oxy của glucose oxidase trong sự hiện diện của glucose 0.1M. Manometric thử nghiệm ở 250; 1.2 mM; 0,13 M đệm phosfinite, pH 5.6. Dòng được tính từ biểu thức được đưa ra trong văn bản, bằng cách sử dụng các hằng số tỷ lệ được trích dẫn trong Bảng trên. Nghiên cứu trên chất phản ứng miễn dịch và chất hóa sinh Huyết thanh thỏ miễn dịch chống lại chính con người IgA và alpha-1-fetoprotein (AFP) được chuẩn bị như mô tả (Kuhlmann năm 1975; Kuhlmann và Peschke 1985). Rabbit kháng thể chống lại kháng nguyên mô polypeptide (TPA) được mua từ Sangtec Y khoa (Bromma, Thụy Điển). Dê kháng thể thỏ IgG và thỏ kháng thể dê IgG được phân lập từ huyết thanh hyperimmune tương ứng, kết hợp với GOX hoặc HRP và tinh khiết (Kuhlmann et al 1974; Kuhlmann 1984). Phức hợp kháng thể hòa tan Peroxidase-antiperoxidase (PAP) từ thỏ và dê được chuẩn bị theo phương pháp của Sternberger et al. (Sternberger et al. 1970). Đối với hệ thống avidin-biotin, dê thỏ kháng thể IgG chống, chống dê thỏ kháng thể IgG và GOX biotinylated qua biotinyl-N-hydroxysuccinimide (BNHS) để đạt được một thay thế nhóm amin của khoảng 70% cho các kháng thể và một nhóm thay thế amino40-50% cho GOX (Guesdon et al. 1979). Streptavidin (Calbiochem. GmbH, Frankfurt, CHLB Đức) cùng với glutaraldehyde kích hoạt HRP (Kuhlmann et al 1974.). Thuốc thử cho sự prepara avidin-biotin-peroxidase phức thông thường (ABC) thu được từ phòng thí nghiệm Vector (Burlingame, CA, USA). Mô mẫu vật Amidan con người và các tuyến vú được cố định trong formaldehyde 8% -10% trong 12-24 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó xử lý thường xuyên và nhúng trong dầu hỏa. Khối gan từ chất gây ung thư được điều trị và chuột mang hepatoma (Kuhlmann 1978) được cố định trong nước đá lạnh 99% ethanol-1% acid acetic cho 12-18 h, mất nước và nhúng trong dầu lửa, phần micron dày 5-7 được gắn trên acetone làm sạch và albumin huyết thanh bò (BSA) có điều kiện slide (Kuhlmann 1978; Kuhlmann và Peschke 1984). Phần được deparaffinated xylene và thông qua thông qua ethanol vào 0,01 M pH đệm phosphate 7.2 bổ sung 0,15 M NaCl (PBS). Formaldehyde mẫu vật cố định tiếp tục điều trị bằng pronase (Denk et al 1977;. Kuhlmann và Peschke 1985). Immunolocalization bởi hệ thống enzyme cố định hai bước Các lịch trình ủ bệnh của phương pháp kháng thể enzyme liên hợp cũng như PAP sửa đổi và các kỹ thuật cầu avidin-biotin được tóm tắt trong Bảng dưới. Ràng buộc không đặc hiệu bị chặn lại bởi ủ bệnh của phần mô serurn bình thường 20% (cùng một loài như cung cấp Sandwich chống cơ quan), ngăn chặn các hoạt động avidin liên kết nội sinh là không cần thiết với các mẫu vật làm việc ở đây. Sera, kháng thể, PAP và streptavidin-biotin-enzyme com-plex được pha loãng trong PBS có bổ sung 1% BSA (PBS / BSA). Thuốc thử Unreacted được rửa với ba rửa liên tiếp trong 5 phút mỗi lần trong PBS / BSA. Trong trường hợp của thí nghiệm avidin-biotin, phức hợp được chuẩn bị sẵn sàng 30 phút trước khi sử dụng hỗn hợp thích hợp streptavidin-HRP liên hợp và biotinylated GOX (xem Bảng trên). Nồng độ tối ưu được xác định trong các thí nghiệm sơ bộ tương tự như sự hình thành của khu phức hợp ABC trong kỹ thuật avidin-biotin-peroxidase thông thường (Hsu et al. 1981). Để chứng minh hiệu quả của phương pháp nhuộm mới GOX (hai bước enzyme cố định hệ thống), các kháng nguyên cũng được nhuộm màu bởi một kỹ thuật GOX, trong đó hệ thống enzyme thứ hai HRP chỉ đơn giản là thêm vào hỗn hợp chất nền (Kuhlmann năm 1970; Kuhlmann vàAvrameas 1971). Hơn nữa, các phương pháp immunoperoxidase thông thường được sử dụng để so sánh (Hsu et al 1981; Kuhlmann 1984). GOX histochemistry và phản ứng kiểm soát cytochemical. Giải pháp dự trữ của D (+)-glucose được chuẩn bị trước để cho phép mutarotation đồng phân-β. Phản ứng trung bình chứa 10 mg β-D-glucose và 0.5 mg DAB mỗi ml 0,01 M đệm phosphate pH 6,8 (10 phút bão hòa với O2). Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, rửa sạch, khử nước và gắn kết trong môi trường nhựa dưới coverglass. Nội sinh hoạt động GOX được kiểm tra trên phần mô bằng phản ứng trong chất nền glucose-DAB mà không có incubations trước khi immunohistological. Cụ thể của nó cũng được xác nhận trên phần immunoreacted được ủ trong các môi trường sau đây: Glucose bỏ qua như chất nền hoặc thay thế bằng galactose Ngoài ra 0.02 M sodium pyruvate môi trường đầy đủ (Aebi et al 1962) Ngoài ra 0,1% catalase chất nền hoàn chỉnh để chặn H2O2 được tạo ra bởi hoạt động của GOX trên glucose và do đó bãi bỏ nhuộm cytochemical. Ngoài ra 0.05 M 3-amino-l,2,4-triazole môi trường chất nền để ức chế nội sinh catalase (Margoliash et al 1960; Venkatachalam và Fahimi 1969), để ngăn chặn oxidase tiềm năng của nó và các hoạt động peroxidase. Kết quả Hai bước kỹ thuật enzyme cố định cho thấy GOX hoạt động trong một trong các phương pháp immunolocalization làm việc một cách dữ dội, tái sản xuất và rõ ràng. Ví dụ, kháng nguyên bào thai AFP carcino nhuộm màu mạnh mẽ trong các tế bào hepatocarcinoma trong khi xung quanh các tế bào gan bình thường không phản ứng (Hình) Các nghiên cứu kháng nguyên khác cũng được phát hiện trong các hoạt động tiêu biểu mô học của nó như IgA trong amidan của con người và cho TPA trong epithelia tuyến vú và các tế bào ung thư biểu mô. Với HRP hòa tan như hệ thống thứ cấp của ampli-fier, tức là HRP chỉ đơn giản là thêm vào hỗn hợp chất nền glucose-DAB thay vì được coimmo bilized trong sự gần gũi của GOX, kháng nguyên định vị là ít chính xác hơn. Hơn nữa, nhuộm loang lổ và hợp lưu cũng quan sát thấy. Kháng nguyên định vị và sự xuất hiện của sản phẩm phản ứng enzyme là gần như giống hệt với những tiêu chuẩn trong các phương pháp nối tiếp phản ứng với immunoperoxidase thông thường. Điều này cũng đúng khi DAB được thay thế bởi AEC như chromogen. Các thí nghiệm với các pha loãng kháng thể chính đã chỉ ra rằng các thủ tục ghi nhãn ở đây được mô tả theo thứ tự độ nhạy và độ đặc hiệu như phương pháp immunoperoxidase so sánh. Nhuộm không quan sát thấy phần mô không có incubations kháng thể trước khi phản ứng với phương tiện chất nền hoàn thành và trong khi trình tự ủ bệnh không liên quan miễn dịch thuốc thử, phức PAP hoặc hệ thống avidin-biotin được tuyển dụng hoặc enzyme đánh dấu (GOX) hoặc "helper "enzyme (HRP). Sau đó, nhuộm không được nhìn thấy khi glucose được bỏ qua hoặc thay thế bằng galactose trong môi trường chất nền và khi sodium pyruvate hoặc ngoại sinh catalase được thêm vào môi trường hoàn chỉnh. Trong trường hợp thứ hai, hệ H2O2 bởi GOX hoạt động ngăn chặn hoặc H2O2 là chặn để DAB không thể bị oxy hóa. Ngoài ra aminotriazole để GOX chất nền không ảnh hưởng đến nhuộm kháng nguyên cytochemical. Thảo luận Các nguyên tắc cùng GOX-HRP được phát triển cho việc sử dụng của GOX là enzyme đánh dấu trong immunohistology bởi vì hoạt động của enzym nội sinh không được biết đến trong các tế bào động vật có vú và đặc biệt là để lợi nhuận từ sự hữu ích chung của DAB cytochemical vết. Với mục đích này, nó trở nên rõ ràng rằng chỉ coimmobilization của cả hai enzyme, tức là cầu nối của GOX và HRP cùng một phạm vi di động, chứng tỏ là một công cụ đáng tin cậy. Do đó, cường độ mạnh hơn và speciflc được tạo ra hơn là thu được với HRP hòa tan là hệ thống enzyme thứ hai. Phương pháp mới có thể dễ dàng thực hiện. Sự rõ nét và cường độ của phản ứng cytochemical so sánh cũng thu được với các phương pháp immunoperoxidase. Điều tương tự cũng đúng với sự xuất hiện độ nhạy, độ đặc hiệu và hình thái của sản phẩm phản ứng enzyme. Các thuốc thử có thể thể dễ dàng chế biến hoặc mua thương mại. Hơn nữa, và điều này là rất quan trọng đối với sự bảo vệ của kháng nguyên, chúng tôi quan sát với các mẫu mô của chúng ta rằng GOX - HRP coimmobilized nhuộm nguyên tắc không yêu cầu sự ức chế của peroxidases nội sinh như thường cần thiết cho phương pháp immunoperoxidase thông thường. Prelimi - BREW để giúp các thí nghiệm cho thấy phương pháp được mô tả là cũng thích hợp cho các kỹ thuật immunoenzyme khác như các phương pháp ELISA và immunoblot. Một số kiểm soát thí nghiệm chứng minh các đặc trưng của phản ứng immunocytochemical. Kết GOX - HRP nguyên tắc cụ thể để phát hiện hoạt động của GOX. Nó đòi hỏi sự hiện diện của chất nền cụ thể (glucose; O2 bão hòa của bộ đệm không phải là một điều kiện tiên quyết) và bị ức chế bằng cách thêm của pyruvate catalase hoặc natri (suy thoái H2O2 và ức chế của H2O2 giải phóng) chất nền enzyme. Sự vắng mặt của hoạt động của peroxidase nội sinh chứng minh hiệu quả của phản ứng chụp HRP mà ngăn cản sự khuếch tán của GO tạo ra H2O2. Quá trình oxy hóa của DAB có thể xảy ra trong các mô trong điều kiện nhất định trong peroxidases nội sinh có thể hoạt động trên H2O2 giải phóng bởi quá trình oxy hóa trước đây của nền nội sinh (Graham và Karnovsky 1965). Trong trường hợp này, thuốc ức chế thích hợp được đề nghị. Ngoài ra, chuẩn bị mẫu vật, trong đó oxidases điện tử chấp nhận có thể oxy hóa DAB một cách tự nhiên, do đó can thiệp vào sự định vị kháng nguyên cụ thể, sẽ yêu cầu ức chế pretreatments. Dương tính giả và sai kết quả âm tính do để nội sinh catalase có thể dễ dàng tránh được bằng cách bổ sung aminotriazole để vừa chất nền (Margoliash et al 1960; Venkatachalam và Fahimi 1969). Tuy nhiên, trong các mẫu của chúng tôi, như vậy ức chế không cần thiết. Nói chung, nguyên tắc avidin-biotin có thể liên quan đến vấn đề của nonspecificity đặc biệt là do việc sử dụng lòng trắng trứng avidin. Điều này có thể được khắc phục với bộ đệm pH cao và nồng độ mol mạnh (Hsu et al 1981;. Bussolati và Gugliotta 1983). Như vậy, chúng ta thích streptavidin từ Streptomy - CES avidinii vì các tương tác protein-protein không đặc hiệu được giảm thiểu trong phần mô ở pH sinh lý do đặc tính vật lý của nó (Morris và Saelinger 1984). Pháp chế trong việc sử dụng Liều lượng Đồ uống có cồn: rượu vang - loại bỏ oxy ở dạng bột hoặc chất lỏng tại 10-70 GOU / l. Không cồnĐồ uống: nước giải khát, ổn định tecpen quả có múi ở dạng bột hoặc chất lỏng tại 20-90 Gou / l. Trái cây và rau - nước trái cây - loại bỏ oxy như bột /hoặc lỏng 2-20 Gou / l. Thịt và các proteinaceous khác - thực phẩm - trứng và các sản phẩm trứng - loại bỏ glucose từ trứng khô dạng bột hoặc chất lỏng tại 150-225 GOU / l trắng, toàn bộ 300-375GOU / l Sự cho phép ở các nước và khu vực Mỹ: GRAS – Aspergillus niger. FDA 21CFR 184.1372 UK và EUROPE: UK: Aspergillus niger Canada: Nguồn cho phép - Aspergillus niger hoặc cho phép trong nước giải khát, quả trứng lỏng, lòng trắng trứng và lỏng đỏ trứng đến để sấy. AUSTRALIA/PACIFIC RIM: Nhật Bản: cho phép KẾT LUẬN Phụ gia thực phẩm là một lĩnh vực đang rất phát triển và cũng là một trong những vấn đề nan giải của việc quản lý trong sản xuất các sản thực phẩm. Ngoài những tác dụng mà nó mang lại nhưng nếu chúng ta không sử dụng đúng chủng loại, chất lượng và liều lượng thì nó sẽ vô cùng có hại cho người tiêu dùng. Hai enzyme glucose isomerase và glucose oxidase là hai enzyme quan trọng tham gia vào quá trình chuyển hóa đồng phân và oxy hóa tạo thành các loại đường có độ ngọt cao hơn. Tuy không thấy nghiên cứu về độc tính nhưng ở một số nước vẫn có quy định về liệu lượng và chọn enzyme sử dụng được lấy từ nguồn vi sinh vật nào. Việc tìm hiểu kĩ về loại phụ gia đó giúp ta lựa chọn đúng phụ gia, phù hợp quy định của các cơ quan quản lý và an toàn cho người sử dụng.