Tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản tại phòng kiểm nghiệm Intertek –Cần Thơ

êm 150ml nội chuẩn m-CAP 20ppb. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như mẫu thử. 7.3 Chuẩn bị mẫu để dựng đường chuẩn Cân lần lượt 5 mẫu trắng có khối lượng 10g vào ống ly tâm 50ml, bổ sung dung dịch chuẩn và nội chuẩn như sau: Bảng 4.1. Mối liên hệ giữa thể tích và nồng độ của chuẩn CAP và nội chuẩn m-CAP thêm vào để dựng đường chuẩn Thể tích (ml) Nồng độ trong mẫu (ppb) CAP 20ppb m-CAP 20ppb CAP m-CAP 0 50 150 300 450 150 150 150 150 150 0 0.1 0.3 0.6 0.9 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 7.4 Cho thêm 20ml hỗn hợp (EtOAC:NH4OH, 98:2) đồng nhất bằng cách vortex cho đến khi toàn bộ khối mẫu rời ra (khoảng 30 giây). Trộn đều trên máy Multitube Vortex trong 10 phút. 7.5 Ly tâm 7 phút ở tốc độ 4000 rpm, chuyển phần dung dịch vào ống ly tâm PP 50ml khác. Thổi khí nitơ ở nhiệt độ 50oC. 7.6 Lặp lại quá trình ly trích theo bước 7.4 và 7.5 hai lần 7.7 Làm khô hoàn toàn dịch chiết bằng khí nitơ. 7.8 Thêm 30ml acid acetic 0.05% trong nước cho vào dịch trích đã được làm khô, vortex khoảng 5 phút. 7.9 Thêm 10ml hexan vào ống 50ml và đậy nắp lại. Vortex. Ly tâm 3 phút ở 4000 rpm. Dùng ống hút pipet để loại phần hexan trên mặt. Lặp lại bước khử béo trên 2 lần với mỗi lần 5ml hexan và cuối cùng hút bỏ hết phần chất lỏng trên mặt phân cách giữa hexan và nước. 7.10 Hoạt hóa cột SPE C18 bằng 3ml metanol và 3ml nước. Chuyển phần dung dịch sau ly trích vào hệ thống cột SPE, tốc độ chảy khoảng 1 giọt/giây. 17 7.11 Rửa giải cột với 2ml nước, giải hấp bằng 2ml MeOH vào trong ống ly tâm 15ml. Làm bay hơi MeOH bằng khí nitơ. 7.12 Hỗn hợp ly trích sau khi làm khô được hòa tan lại bằng 0.5ml nước, vortex 5 phút để hòa tan phần còn lại và dùng ổng tiêm lọc qua màng lọc Acrodisc, cho vào vial để phân tích trên LC-MS. 8 Thông số chạy máy Pha động A: Nước Pha động B: Acetonitrile Gradient Program Bảng 4.2. Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích CAP No. Time, min Flow, ml/min A, % B, % 1 0.00 200 65 35 2 6.00 200 65 35 3 6.50 200 10 90 4 13.50 200 10 90 5 14.00 200 65 35 6 20.00 200 65 35 Source: ESI Spay voltage: 1500V Sheath gas pressure: 29 Aux gas pressure: 18 Capillary temperature: 350oC Tube lens offset: 70 Collision pressure (argon): 1.5torr Wash Bottle: metanol Injection volume (ml): 75.00 Flush volume (ml): 2000 Needle height from bottom (mm): 0.2 Wash volume (ml): 2000 Flush speed (ml/s): 250 Post – Injection Valve switch time (min): 0 Syringe speed (ml/s): 8 Tray temp control is on. Temp (oC): 5 Column oven control is on. Temp (oC): 30 Min. pressure, bar: 10 18 Max. pressure, bar: 400 Pumping Efficiency, %: 100 Fractionations/ Filling Stroke: 1 Use custom stability limits: No 9 Điều kiện phân mảnh MS/MS Product ion m/z CAP : 257, 152 m-CAP: 207 10 Tính toán kết quả Hệ số tính hiệu của từng mẫu phân tích theo từng nồng độ chất chuẩn: X x C x W RF = ---------------- Y x V Trong đó: - X là tỷ số trung bình diện tích pic (CAP/m-CAP) cho dung dịch mẫu thử. - C là hàm lượng của CAP trong dung dịch các chuẩn, tính theo ng/g. - W là khối lượng mẫu thử, tính theo g - Y là tỷ số diện tích trung bình CAP/m-CAP trong dung dịch các chuẩn. - V là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử tính theo ml. Dựng đồ thị hàm lượng CAP trong từng mẫu phân tích với nồng độ chất chuẩn bổ sung theo phương pháp hồi qui tuyến tính. RF = ax + b a: hệ số góc của đường chuẩn b: tung độ gốc của đường chuẩn Tính hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu kiểm dựa theo hệ số tính hiệu của từng mẫu phân tích và đường chuẩn theo đơn vị ppb. 4.1.2 Nhóm kháng sinh Malachite Green và Leucomalachite Green PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LEUCOMALACHITE GREEN BẰNG SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC/MS/MS 1 Phạm vi áp dụng 19 Phương pháp này hướng dẫn việc xác định dư lượng Leucomalachite Green và Malachite Green trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng LC/MS/MS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1ppb. 2 Nguyên tắc MG và LMG được trích bằng dung dịch đệm acetate và acetonitrile. Tiếp theo, dịch trích được chiết tách lại bằng methylene chloride. LMG sẽ bị oxi hóa trở về dạng MG bằng phản ứng với 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone. Mẫu phân tích được làm sạch hơn bằng sự chiết với pha rắn gồm alumina và propylsulfonic acid. Cuối cùng, dịch chiết được phân tích bằng LC với bước sóng phát hiện ở 618 nm. 3 Thiết bị, dụng cụ 3.1 Thiết bị - Hệ thống LC-MS bao gồm: - LC 1100 Agilent - MS với nguồn ESI hoặc APCI - Phần mềm điều khiển Xcaliber ( Version 1.3) - Máy đồng nhất mẫu - Máy ly tâm - Vortex 3.2 Dụng cụ - Ống ly tâm 50ml - Bình định mức - Pipettes - Bình quả lê 150ml - Bình chiết 250ml - Cột chiết pha rắn SPE: Cột Alumina (ALN-SPE), Bakerbond alumina SPE, 6ml, 500mg, acid propylsulfonic (PRS-SPE),500mg. - Vial 2ml và một số dụng cụ khác. 4 Hóa chất, thuốc thử 4.1 Hóa chất - Nước cất, HPLC - Methanol, HPLC - Acetonitrile, HPLC - Methylene chloride 20 4.2 Dung dịch, thuốc thử 4.2.1 Acid formic 0.1% (pha động cho LC-MS): Hút 1ml acid formic cho vào bình định mức 1000ml và định mức đến vạch bằng nước cất. 4.2.2 Dung dịch đệm acetate: hòa tan 7.7g ammonium acetate và 5ml p- toluene sulfonic acid (p-TSA) trong nước, đều chỉnh pH về 4.5 bằng acid acetic, thêm nước để được 1 lít. 4.2.3 Dung dịch 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone (DDQ): từ dung dịch chuẩn DDQ được pha loãng trong acetonitrile để được dung dịch làm việc DDQ 0.001M 4.2.4 Một số dung dịch khác - Diethylene glycol - Alumina - Hydroxyamine hydrochloride 0.25g/ml - Dung dịch p-TSA 1M trong nước. 4.2.5 Dung dịch chuẩn gốc Malachite Green (MG) 100ppm: Cân 10g chuẩn MG cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol. 4.2.6 Dung dịch chuẩn trung gian MG 1ppm: Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc MG (4.2.5) 100ppm cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol. 4.2.7 Dung dịch chuẩn làm việc MG 100ppb: Hút 1ml dung dịch chuẩn trung gian MG (4.2.6) 1ppm cho vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng methanol. 4.2.8 Dung dịch chuẩn gốc Leucomalachite Green (LMG) 100ppm: Cân 10g chuẩn LMG cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol. 4.2.9 Dung dịch chuẩn bố sung LMG 1ppm: Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc LMG (4.2.8) 100ppm cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol. 4.2.10 Dung dịch chuẩn làm việc LMG 100ppb: Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc LMG (4.2.9) 1ppm cho vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng methanol. 5. Các bước chuẩn bị mẫu Mẫu được đồng nhất trước khi tiến hành ly trích, bảo quản mẫu bằng nước đá khô hoặc trữ đông ở -20oC đến khi phân tích. 21 5.1 Chuẩn bị mẫu thử Cân 5g mẫu cho vào ống ly tâm 50ml. 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Cân 5g mẫu không chứa MG và LMG cho vào ống ly tâm 50ml. 5.3 Chuẩn bị mẫu để dựng đường chuẩn Chuẩn bị lần lượt 6 mẫu trắng mỗi mẫu 5g cho vào ống ly tâm 50ml và bổ sung dung dịch chuẩn làm việc MG 100ppb và dung dịch chuẩn làm việc LMG 100ppb để được dãy đường chuẩn có nồng độ lần lượt là 0, 1, 2, 4, 10 và 20ppb. Bảng 4.3. Thể tích và nồng độ tương ứng khi thêm MG và LMG vào mẫu trắng để dựng đường chuẩn Thể tích (µl) Nồng độ trong mẫu (ppb) MG 100ppb LMG 100ppb MG LMG 0 0 0 0 50 50 1 1 100 100 2 2 200 200 4 4 500 500 10 10 1000 1000 20 20 Sau đó tiến hành ly trích mẫu qua các bước sau: - Thêm vào các ống nhựa chứa mẫu 5ml dung dịch đệm acetate, 100ml dung dịch p-TSA 1M, 1ml hydroxyamine (0.25g/ml). Lắc đều. - Thêm 25 ml acetonitrile, lắc 30 giây. Sau đó thêm tiếp 5 – 6g alumina và lắc tiếp 15 giây. Ly tâm 4000rpm ở 0oC. Chuyển dịch trong vào bình chiết thủy tinh 250 ml đã chứa sẵn 50 ml nước và 2 ml diethylene glycol. - Thêm 25 ml acetonitrile vào ống chứa mẫu. Chuyển dịch trong vào cùng bình chiết thủy tinh 250 ml ở bước trên. - Thêm 25 ml methylene chloride vào trong bình chiết. Lắc nhẹ và để yên cho tách lớp. Chuyển lớp methylene chloride (ở dưới) vào trong bình cầu quả lê 150 ml. - Cô dịch trong bình cầu quả lê cho đến khô trên máy cô quay chân không. - Hòa tan cặn khô bằng 3 ml ACN và 3ml DDQ 0.001M để oxi hóa LMG về dạng MG. 22 - Cho qua hệ thống chiết pha rắn với alumina và acid propylsulfonic với tốc độ 4ml/min. - Rửa cột bằng acetonitrile và MG được rửa giải bằng 4ml dung dịch đệm acetonitrile: ammonium acetate (50:50) và định mức lên 5ml cho mỗi mẫu. - Cho vào vial để phân tích trên máy bằng LC/MS/MS 6. Thông số chạy máy Pha động A: Acid formic 0.1% Pha động B: ACN 6.1. Điều kiện phân tích trên LC Nhiệt độ cột: 30oC (nhiệt độ phòng) Tốc độ dòng: 0.7 ml pha động/phút, thành phần pha động theo chế độ gradient (đã cài đặt trong máy HPLC) Bảng 4.4. Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích MG và LMG No. Time, min A, % B, % 1 0.00 63 37 2 10.00 63 37 3 10.5 0 100 4 12 0 100 5 12.5 63 37 6 15 63 37 Thể tích tiêm mẫu: 10 ml Thời gian phân tích: 15 phút 6.2. Điều kiện phân tích trên MS Corona discharge: 0mA Vaporizer Temp (oC): 400 Sheath gas: 70 Auxiliary gas: 40 Capillary Temp (oC): 220 Capillary Voltage (V): 40 7. Điều kiện phân mảnh Component Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) MG 329 313 – 315 165 23 LMG 331 239 316 8. Tính toán kết quả Sử dụng phần mềm trên máy HPLC tính diện tích các peak MG, LMG, các MG, LMG chuẩn. Xây dựng đường chuẩn tuyến tính giữa tỉ số diện tích MG/MG chuẩn (hoặc LMG/LMG chuẩn). Dựa vào phương trình đường thẳng y = ax + b. Sử dụng đường chuẩn thu được tính nồng độ MG (hoặc LMG) trong mẫu thử. 4.1.3 Nhóm kháng sinh Nitrofuran: ĐỊNH LƯỢNG NITROFURAN TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG SẮC LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC/MS/MS 1. Phạm vi áp dụng Phương pháp này hướng dẫn xác định hàm lượng nitrofuran và các chất chuyển hóa thuộc nhóm nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ LC/MS/MS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0.5ppb. 2. Nguyên tắc Dư lượng liên kết với mô của các chất chuyển hóa nhóm nitrofurans trong thủy sản và sản phẩm thủy sản được thủy phân bằng acid HCl loãng để thu được mạch nhánh của các chất nhóm nitrofurans (AOZ, AMOZ, AHD, SEM). Các mạch nhánh này được dẫn xuất hóa bằng 2-nitrobezaldehyd để tạo thành NP- AOZ, NP-AMOZ, NP-AHD, NP-SEM. Xác định và định lượng các chất dẫn xuất bằng LC/MS/MS 3. Thiết bị, dụng cụ. - Hệ thống sắc ký lỏng gồm: bơm và bộ tiêm mẫu tự động. - Đầu dò MS (ThermoQuest Finnigan TSQ Quantum) - Phần mềm điều khiển: Xcalibur Version 1.3. - Cột LC: Inertsil ODS-3 5m 130 x 2.0mm - Tiền cột: ODS-3 5m 130 x 2.0mm - Máy Vortex, máy lắc - Bộ thổi khí nitơ N – EVAP 4. Hóa chất 24 - Ethyl acetate (EtOAc) dùng trong HPLC - Acid hydrocloric (HCl) đậm đặc. - Aicd formic 90% - Sodium Chloride (NaCl) - Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate (K2HPO4) - NaOH tinh thể - 2-Nitrobenzaldehyde - Methnol (MeOH) dùng trong HPLC - Nước cất - NP-SEM, NP-AHD, NP-AMOZ và NP-AOZ (dẫn xuất 2-NBA của SEM, AHD, AMOZ, AOZ) 5. Dung dịch, thuốc thử 5.1. Thuốc thử 5.1.1. HCl 0.125M Cho 5,2ml acid HCl đậm đặc vào bình định mức 500ml có chứa khoảng 200ml nước và định mức đến vạch bằng nước. 5.1.2. K2HPO4 0.1M Hòa tan 17.4g K2HPO4 vào ít hơn 1L nước. Chuyển dung dịch vào bình định mức 1L và định mức đến vạch bằng nước. 5.1.3. NaOH 0.8M Hòa tan 3,2g NaOH vào ít hơn 100ml nước. Chuyển dung dịch vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước. 5.1.4. NaOH 0.125M Pha loãng 10ml NaOH 0.8M trong 630ml nước 5.1.5. Acid formic 0.1% Cho 1ml acid formic vào ít hơn 1L nước trong bình định mức 1L và định mức đến vạch bằng nước. 5.1.6. 2-NBA 50mM Hòa tan 0.07555g 2-NBA trong 10ml MeOH 5.1.7. Hỗn hợp MeOH/nước = 50:50 Cho 50ml MeOH vào 50ml nước 5.2. Dung dịch chuẩn 25 5.2.1. Hòa tan 43, 56, 46 và 33mg NBA-AHD, NBA-SEM, NBA-AOZ và NBA-AMOZ trong 100ml MeOH theo thứ tự. Hỗn hợp gốc chứa 430 ng/ml, 560 ng/ml, 460 ng/ml, 330 ng/ml của NBA-AHD, NBA-SEM, NBA-AOZ và NBA- AMOZ theo thứ tự, nồng độ của các chất không dẫn xuất AHD, SEM, AOZ, AMOZ tương ứng đều là 200 ng/ml. 5.2.2. Pha loãng hỗn hợp gốc trên 500 lần để được dung dịch chuẩn D500: Cho 10ml dung dịch gốc cộng 5ml dung dịch hỗn hợp MeOH/nước = 50:50 (nồng độ của các chất không dẫn xuất là 0.4 ng/ml) 5.2.3. Dung dịch chuẩn D1000: Cho 2ml dung dịch D500 cộng 2ml dung dịch hỗn hợp MeOH/nước = 50:50 (nồng độ của các chất không dẫn xuất là 0.2 ng/ml) 5.2.4. Dung dịch chuẩn D2000: Cho 2ml dung dịch D1000 cộng 2ml dung dịch hỗn hợp MeOH/nước = 50:50 (nồng độ của các chất không dẫn xuất là 0.1 ng/ml) 5.2.5. Dung dịch chuẩn D4000: Cho 2ml dung dịch D2000 cộng 2ml dung dịch hỗn hợp MeOH/nước = 50:50 (nồng độ của các chất không dẫn xuất là 0.05 ng/ml) 5.2.6. Dung dịch chuẩn D8000: cho 2ml dung dịch D4000 cộng 2ml dung dịch hỗn hợp MeOH/nước = 50:50 (nồng độ của các chất không dẫn xuất là 0.025 ng/ml) 6. Các bước chuẩn bị mẫu 6.1. Chuẩn bị mẫu thử: Bóc vỏ nguyên liệu (nếu có) cho vào máy xay mẫu và xay nhuyễn cho đến khi mẫu đồng nhất. Cân chính xác 2.0 (± 0.1)g mẫu cho vào ống ly tâm polypropylene 50ml, ghi lại khối lượng mẫu. 6.2. Chuẩn bị mẫu trắng: Cân chính xác 2.0 (± 0.1)g mẫu cho vào ống ly tâm polypropylene 50ml, ghi lại khối lượng mẫu. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như mẫu thử. 6.3. Chuẩn bị mẫu để dựng đường chuẩn: Cân 5 mẫu trắng mỗi mẫu có khối lượng 2.0 (± 0.1)g cho vào ống ly tâm 50ml và tiến hành chuẩn bị như mẫu thử. Thêm dung dịch chuẩn D8000 để đươc dãy chuẩn có nồng độ 0, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2ppb. 6.4. Thêm 10ml HCl 0.125M và 400ml 2-NBA 50mM vào mỗi mẫu, đậy nắp lại và vortex trong 15 giây. 26 6.5. Ủ mẫu trong 16 giờ ở 37oC với máy lắc 80rpm. 6.6. Sau khi ủ để mẫu ở nhiệt độ phòng. Thêm 1ml K2HPO4 0.1M và 1 ml NaOH 0.8M. Vortex trong 15 giây 6.7. Điều chỉnh pH khoảng 7.3 ± 0.2 với HCl 0.125M và NaOH 0.125M. Ghi nhận pH cuối cùng. Thể tích cuối cùng của mẫu không hơn 20ml. Ghi nhận thể tích cuối cùng 6.8. Ly tâm mẫu ở 4oC và 3000 rpm trong 5 phút . 6.9. Hút phần dịch lỏng ở trên sau ly tâm qua một ống ly tâm 50ml thứ hai, thêm 3ml nước vào phần thịt tôm còn lại, tiếp tục vortex 15 giây, ly tâm ở 4oC và 3000 rpm trong 5 phút. 6.10. Hút hết lớp dung dịch phía trên sau khi ly tâm cho vào ống ly tâm thứ hai trên. 6.11. Thêm nước để định mức dung dịch đến thể tích 20ml, thêm khoảng 0.5g NaCl và 12 ml EtOAc, đậy nắp lại và vortex trong 15 giây, ly tâm ở 4oC và 3000 rpm trong 5 phút. 6.12. Hút lấy lớp trên cho vào ống ly tâm 15 ml khác, thêm 2ml nước, hút lớp dưới (nước) bỏ. 6.13. Thổi khô dịch chiết bằng khí nitơ ở 40oC 6.14. Thêm 1ml dung dịch MeOH/nước = 50:50, vortex 15 giây 6.15. Lọc dịch chiết cho vào vial 1.8ml để phân tích trên LC/MS/MS 7. Thông số chạy máy 7.1. Thông số cho LC Pha động A: Acid formic 1% trong nước Pha động B: MeOH Thời gian phân tích: 30 phút Gradient Program 27 Bảng 4.5. Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích Nitrofuran 7.2. Thông số cho MS Source: ESI ESI capillary position (oC): 90 Spay voltage (V): 4000 Sheath gas pressure (bar): 35 Aux gas pressure (bar): 3 Capillary temperature: 300oC Tube lens offset (V): 121 Capillary Offset (V): 35 Q2 Collision gas: 1.5 mTorr Injection volume (ml): 40.00 Flush volume (ml): 400 Needle height from bottom (mm): 0.2 Wash volume (ml): 400 Flush speed (ml/s): 250 Post – Injection Valve switch time (min): 0 Loop loading speed (ml/s): 5 Syringe speed (ml/s): 8 Tray temp control is on. Temp (oC): 10 Column oven control is on. Temp (oC): 30 Min. pressure (bar): 0 Max. pressure (bar): 431 Time, min Flow, ml/min A, % B, % 0 - 8 0.15 45 55 8 – 8.5 0.15 45 - 0 55 - 100 8.5 – 8.7 0.15 –0.30 0 100 8.7 - 15 0.3 0 100 15 – 15.5 0.3 0 - 45 100 - 55 15.5 - 20 0.3 45 55 20 - 21 0.3 –0.15 45 55 21 - 30 0.15 45 55 28 Bảng 4.6. Điều kiện phân mảnh MS/MS của hỗn hợp dẫn xuất của các chất trong nhóm Nitrofuran Component Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Dwell time (s) Collision energy (eV) NP-SEM 209 134 166 192 0.2 0.2 0.2 13 11 15 NP - AOZ 236 104 134 149 0.2 0.2 0.2 15 12 13 NP - AHD 249 104 134 178 0.2 0.2 0.2 15 13 13 NP - AMOZ 335 128 262 291 0.2 0.2 0.2 8 10 12 8. Tính toán kết quả Sử dụng phần mềm trên máy HPLC tính diện tích các peak của các chất dẫn xuất và các chất chuẩn thêm vào. Xây dựng đường chuẩn tuyến tính giữa tỉ số các chất dẫn xuất và các chất chuẩn thêm vào. Dựa vào phương trình đường thẳng y = ax + b. Sử dụng đường chuẩn thu được tính nồng độ các chất cần phân tích. Phần mềm quản lý sẽ tự tính kết quả. 4.2 Phương pháp kiểm thuốc trừ sâu ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRỪ SÂU HỌ CHLOR BẰNG SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (GCMS) 1 Phạm vi áp dụng Phương pháp này được áp dụng để định lượng thuốc trừ sâu họ Chlor trong nền mẫu là nước, nông sản, trong đất hoặc trong một số nền mẫu tương tự bằng GCMS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 3ppb. 2 Nguyên tắc 29 Dịch chiết thô thuốc trừ sâu họ Chlor trong mẫu được cho qua cột C18. Chlor được giữu lại trên cột, sử dụng dung môi thích hợp để rửa giải và định lượng bằng GCMS 3 Thiết bị, dụng cụ 3.1 Thiết bị - Bể siêu âm. - Máy li tâm. - Vortex - Cân kỹ thuật có độ chính xác 0.001g - Cân phân tích có độ chính xác 0.0001g - Máy GCMS – QP2010, Shimadzu - Bộ thổi khí nitơ 3.2 Dụng cụ - Phễu thủy tinh - Đầu côn các loại - Pipette Pasteur - Bình định mức 10, 20, 50, 100ml. - Cốc thủy tinh 50, 100, 250, 500, 1000ml - Cột SPE C18 (500mg, 3ml) - Vial 1.5ml - Bao PE - Màng lọc đường kính 0.45mm 3.3 Hóa chất - Hexan (GC) - Dichloromethane (GC) - Methanol (GC) - Ethylacetate PA - Nước cất 2 lần - Chuẩn thuốc trừ sâu: dung dịch 10ppm (dạng hỗn hợp hay từng chất) 4 Chuẩn thuốc trừ sâu họ Chlor 4.1 Dung dịch chuẩn 4.1.1 Dung dịch chuẩn gốc 10(mg/ml) 4.1.2 Dung dịch chuẩn thứ cấp 1mg/ml 30 Hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 10ml. Thêm hexane đến vạch. 4.1.3 Dung dịch chuẩn thứ cấp 0.1mg/ml Hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn thứ cấp 1mg/ml cho vào bình định mức 10ml. Thêm hexane đến vạch. 4.1.4 Dung dịch chuẩn thứ cấp 0.01mg/ml Hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn thứ cấp 0.1mg/ml cho vào bình định mức 10ml. Thêm hexane đến vạch. 4.1.5 Dung dịch chuẩn 1; 2.5; 5 mg/ml Hút chính xác 1, 2.5, 5ml dung dịch chuẩn thứ cấp 0.01mg/ml (4.1.4), 1ml nội chuẩn (4.2) cho vào bình định mức 10ml. Thêm hexane đến vạch. 4.1.6 Dung dịch chuẩn 10; 100 mg/ml Hút chính xác 0.1, 1.0ml dung dịch chuẩn thứ cấp 1mg/ml (4.1.2), 1ml nội chuẩn (4.2) cho vào bình định mức 10ml. Thêm hexane đến vạch. 4.2 Dung dịch nội chuẩn Dung dịch 1,2,4 – trochlorobenzene ( 0.06mg/ml ) 4.3 Bảo quản 4.3.1 Tất cả các dung dịch chuẩn phải được bảo quản trong ống thủy tinh có nắp đậy kín và đặt trong ngăn lạnh, nhiệt độ khoảng 4oC 4.3.2 Thời gian sử dụng của dung dịch chuẩn gốc tùy thuộc vào nhà sản xuất 4.3.3 Thời gian sử dụng của dung dịch chuẩn thứ cấp (4.1.3) trong tháng, chuẩn (4.1.4) chỉ dùng trong ngày 4.3.4 Dung dịch chuẩn thứ cấp (4.1.4) và chuẩn làm việc được pha trước khi phân tích. 5 Tiến hành phân tích 5.1 Chuẩn bị mẫu 5.1.1 Mẫu rắn Cân khoảng 15 – 20g mẫu đã được đồng nhất bằng cách băm hoặc xay nhuyễn, cho vào ống ly tâm dung tích 50ml, thêm vào 20ml MeOH, vortex khoảng 1 phút, siêu âm khoảng 5 phút, ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 5500rpm, gạn lấy phần dịch trong cho vào ống ly tâm thứ hai. 31 Cho tiếp 10ml MeOH vào phần rắn, vortex khoảng 1 phút, siêu âm khoảng 5 phút, ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 5500rpm, gạn lấy phần dịch trong cho vào ống ly tâm thứ hai. Pha loãng mẫu với 200ml nước. Hoạt hóa cột SPE C18 (500mg, 3ml) trên bộ tách chiết pha rắn bằng: 5ml MeOH, 3ml nước, cho mẫu qua cột. Rửa cột bằng 5ml hỗn hợp nước: methanol = 80:20, hút chân không đến khi khô cột Rửa giải bằng 5ml hỗn hợp Dichlorobenzene : Hexane = 7:3, thổi khô, định mức bằng 1ml hexane nồng độ nội chuẩn là 60ppb. Lọc dịch qua màng lọc 0.45mm, cho vào vial (lọ có nắp đậy) thể tích 1.5ml (vial có nắp dùng cho tiêm tự động) 5.1.2 Mẫu nước Lấy 200ml nước* cho qua cột SPE C18 (500mg, 3ml) đã được hoạt hóa và thực hiện tương tự như mục 5.1.1. * Lưu ý: Lọc nếu mẫu có nhiều cặn hoặc các chất lơ lững. Rữa lại giấy lọc bằng 5ml MeOH. 5.2 Điều kiện đo 5.2.1 Điều kiện đo trên sắc ký khí - Cột sắc ký: cột MDN-5S 30m x 0.25mm x 0.25mm hoặc Zebron-MultiResidue 30m x 0.25mm x 0.25mm - Chương trình nhiệt · Chạy trên NCI source: thuốc trừ sâu họ Chlor: chạy theo chế độ NCI Bảng 4.7. Chương trình nhiệt chạy trên NCI source khi phân tích thuốc trừ sau họ Chlor Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) 50 2 10 1 180 1 3 1 250 2 10 1 290 10 32 Injection Temp: 250oC Injection mode: Splitless Sampling time: 1 phút Thể tích bơm: 1ml Tốc độ dòng: 1.20ml/ phút Pressure: 55.3 kPa Tốc độ khí mnag chung: 38ml/phút Tốc độ dòng Purge 3.0ml/ phút Tỉ lệ Split: -1 · Chạy trên EI source Bảng 4.8. Chương trình nhiệt chạy trên EI source khi phân tích thuốc trừ sâu họ Chlor Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) 50 1 180 1 15 1 200 1 220 1 240 1 10 1 300 10 Injection Temp: 250oC Injection mode: Splitless Sampling time: 1 phút Thể tích bơm: 1ml Tốc độ dòng: 0.75ml/ phút Pressure: 32.7 kPa Tốc độ khí mnag chung: 38ml/phút Tốc độ dòng Purge: 3.0ml/ phút Tỉ lệ Split: -1 5.2.2 Điều kiện của đầu dò MS · Chạy trên NCI source Ionization mode: SEI (phosphor), NCI (chlor) Detector Voltage: 1.3 kV, Absolute (SEI), Relative Tuning File (NCI) 33 Interface Temp: 250oC Ion source: 200oC · Chạy trên EI Source Ionization mode: EI (phosphore, chlor) Detector Voltage: 1.12 kV, Absolute Interface Temp: 250oC Ion source: 200oC Nội chuẩn 1, 2, 4 – Triclorobenzene 60 ppb pha trong hexane 6 Tính kết quả Hàm lượng thuốc trừ sâu trong mẫu Đối với mẫu lỏng: C (mg/l) = ÷÷ ø ö çç è æ m dmo V VC * Đối với mẫu rắn hoặc sệt C (mg/kg) = ÷÷ ø ö çç è æ m dmo a VC * Trong đó: C: nồng độ thuốc trừ sâu trong mẫu, tính theo mg/l (mẫu nước) và mg/kg (mẫu rắn hoặc sệt). Co: nồng độ thuốc trừ sâu tính từ đường chuẩn mg/l Vdm: thể tích định mức (ml) Vm: thể tích mẫu phân tích (ml) a: khối lượng mẫu phân tích (g) 4.3 Một số phương pháp phân tích kim loại nặng 4.3.1 Qui trình phân tích thủy ngân (Hg) tổng số trong thủy sản và sản phẩm thủy sản PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG THỦY NGÂN TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG MÁY QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ (AAS) 1. Phạm vi áp dụng 34 Phương pháp này mô tả cách xác định hàm lượng thủy ngân (Hg) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS). Giới hạn phát hiện của phương pháp 10ppb. 2. Nguyên tắc Thủy ngân trong thủy sản và sản phẩm thủy sản tồn tại ở dạng vô cơ lẫn hữu cơ. Vì vậy để xác định được ta phải chuyển tất cả về dạng vô cơ bằng acid có nồng độ cao ở nhiệt độ và áp suất cao. Thủy ngân được khử bằng NaBH4 trong bộ hóa hơi. Sau đó được xác định bằng máy phổ hấp thu nguyên tử (AAS) tại bước sóng 253.7nm. 3. Thiết bị, dụng cụ 3.1 Thiết bị Hệ thống máy phổ hấp thu nguyên tử bao gồm: - Bộ phận làm lạnh - Bộ hóa hơi thủy ngân - Bộ bơm mẫu tự động - Hệ thống đèn - Máy AAS Máy Multiwave 3000. Cân kỹ thuật có độ chính xác 0.001g. 3.2 Dụng cụ - Pipetteman 100µl, 1000µl, 5000µl. - Máy xay mẫu. - Bình định mức 10ml. - Pipette Pasteur. - Ống Teflon phá mẫu. 4 Hóa chất 4.1 Hóa chất - Dung dịch Hg chuẩn, Merck (hoặc tương đương) - Nước cất một lần. - HNO3 1.5%, Merck (hoặc tương đương) - H2O2 30%, Merck (hoặc tương đương) - Dung dịch NaBH4 3% + NaOH 5%. 4.2 Dung dịch, thuốc thử 4.2.1 Dung dịch chuẩn trung gian Hg 10ppm 35 Hút chính xác 100µl dung dịch chuẩn 1000ppm vào bình định mức 10ml định mức bằng dung dịch HNO3 1.5%. Bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ từ 2-80C. Hạn sử dụng 3 tháng. 4.2.2 Dung dịch chuẩn làm việc Hg 100ppb Hút chính xác 100µl dung dịch chuẩn 10ppm vào bình định mức 10ml định mức bằng dung dịch HNO3 1.5% Bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ từ 2-80C. Hạn sử dụng 1 tháng. 4.2.3 Dung dịch HNO3 1.5% Hút chính xác 23.07ml HNO3 65% cho vào bình định mức 1000ml, định mức bằng nước cất đến vạch. Hạn sử dụng trong 1 năm, bảo quản ở nhiệt độ phòng. 4.2.4 Dung dịch NaBH4 3% + NaOH 5% Cân chính xác 0.3g NaBH4 và 0.5g NaOH vào bình định mức 100ml định mức bằng nước cất đến vạch. Pha trước khi chạy máy. 5 Chuấn bị mẫu 5.1 Chuẩn bị mẫu thử Đồng nhất tối thiểu 200g mẫu trên máy xay mẫu. Đối với mẫu khô thì cắt hoặc giã nhỏ. Giử mẫu trong tủ đông -180C cho đến khi phân tích. Cân 1g ± 0.05g mẫu đã đồng nhất vào ống Teflon để phá mẫu. Sau đó thêm 2ml HNO3 65% và 2ml H2O2 30%. 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Hút 1ml nước cất vào ống Teflon, rồi thực hiện như mẫu thử. 5.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát Cân 1g ± 0.05g mẫu thủy sản trắng đã được chọn trước vào ống Teflon, hút chính xác 500µl dung dịch thủy ngân chuẩn 100ppb (Hg 50ppb) sau đó thực hiện như mẫu thử. 5.4 Dựng đường chuẩn Pha từ dung dịch chuẩn làm việc Hg 100ppb pha loãng vào bình định mức 20ml. Pha theo bảng sau: Bảng 4.9. Thể tích và nồng độ tương ứng khi thêm Hg vào mẫu trắng để dựng đường chuẩn Thể tích(µl) Nồng độ (ppb) 200 1 36 400 2 1000 5 2000 10 4000 20 6 Điều kiện đo trên máy hấp thu nguyên tử AAS Element: Hg Lamp/ Current (mA) Holow cathode lamp / 6mA Electrodeless discharge lamp/ 210mA Wavelength 253.7nm Slit Withd 0.7nm Measurement mode peak hight Signal type atomic absorption Intergration time 20 sec Baseline correction time 2 sec Data processing, smoothing 19 pionts or 0.5 sec Cell temperature 100oC Sample volume 500ml Argon gas supply pressure 3.6 bar or 52 psig or 360kPa Argon gas flow rate 70-85 ml/min Carrier soluution/ flow rate 3% HCl/ 9-12 ml/min Reductant solution/ flow rate 0.02% NaBH4 in 0.005% NaOH solution/ 5-7ml/min 7 Tính toán Nồng độ của Hg trong mẫu được tính như sau: K = ((CHg-CH20)*V*100)/R*m Trong đó: CHg : nồng độ của Hg trong mẫu tính từ đường chuẩn (ppb). CH20: nồng độ của Hg trong nước tính từ đường chuẩn (ppb) V : thể tích cuối của dung dịch. R : Độ thu hồi của mẫu kiểm soát. m : khối lượng của mẫu. 8 Yêu cầu Độ hồi qui tuyến tính R2≥99%. 37 Độ thu hồi của mẫu phải nằm trong khoảng chấp nhận, 75%-125%. 4.3.2 Qui trình phân tích Cadmium (Cd) tổng số trong thủy sản và sản phẩm thủy sản PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CADMIUM TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG MÁY QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ (AAS) 1 Phạm vi áp dụng Phương pháp này mô tả cách xác định hàm lượng cadmium (Cd) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng máy phổ hấp thu nguyên tử (AAS). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 5ppb. 2 Nguyên tắc Cadmium trong thủy sản và sản phẩm thủy sản tồn tại ở dạng vô cơ lẫn hữu cơ. Vì vậy để xác định được ta phải chuyển tất cả về dạng vô cơ bằng acid có nồng độ cao ở nhiệt độ và áp suất cao. Sau đó được xác định bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS) tại bước sóng 228.8 nm. 3 Thiết bị, dụng cụ 3.1 Thiết bị Hệ thống máy quang phổ hấp thu nguyên tử bao gồm: - Bộ phận làm lạnh - Lò graphite - Bộ bơm mẫu tự động - Hệ thống đèn - Máy AAS Máy Multiwave 3000. Cân kỹ thuật có độ chính xác 0.001g. 3.2 Dụng cụ - Pipetteman 100µl, 1000µl, 5000µl. - Máy xay mẫu. - Bình định mức 20ml. - Pipette Pasteur. - Ống Teflon phá mẫu. 4 Hóa chất, thuốc thử 38 4.1 Hóa chất: - Dung dịch Cd chuẩn. Merck (hoặc tương đương). - Nước cất một lần. - HNO3 65%, Merck (hoặc tương đương). - H2O2 30%, Merck (hoặc tương đương). - Dung dịch H3PO4 85%. 4.2 Dung dịch, thuốc thử: 4.2.1 Dung dịch chuẩn trung gian Cd 10ppm: Hút chính xác 100µl dung dịch chuẩn 1000ppm vào bình định mức 10ml định mức bằng dung dịch HNO3 1.5%. Bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ từ 2-80C. Hạn sử dụng 3 tháng. 4.2.2 Dung dịch chuẩn làm việc Cd 100ppb: Hút chính xác 100µl dung dịch chuẩn 10ppm vào bình định mức 10ml định mức bằng dung dịch HNO3 1.5%. Bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ từ 2-80C. Hạn sử dụng 1 tháng. 4.2.3 Dung dịch HNO3 1.5%: Hút chính xác 23.07ml HNO3 65% cho vào bình định mức 1000ml, định mức bằng nước cất đến vạch. Hạn sử dụng 1 năm, bảo quản ở nhiệt độ phòng. 4.2.4 Dung dịch H3PO4 50 µg/ml: Hút chính xác 58.82µl dung dịch gốc H3PO4 1000µg/ml (85%) vào bình định mức 50ml định mức bằng nước cất đến vạch. 5 Chuẩn bị mẫu 5.1 Chuẩn bị mẫu thử: Đồng nhất tối thiểu 200g mẫu trên máy xay mẫu. Đối với mẫu khô thì cắt hoặc giã nhỏ. Giữ mẫu trong tủ đông -180C cho đến khi phân tích. Cân 1g ± 0.05g mẫu đã đồng nhất vào ống Teflon. Sau đó thêm 2ml HNO3 65% và 2ml H2O2 30%. 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng: Hút 1ml nước cất vào ống Teflon, rồi thực hiện như mẫu thử. 5.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát: 5.3.1 Cadimi 25ppb: 39 Hút chính xác 250µl dung dịch cadmium chuẩn 100ppb cho vào 1g ± 0.05g mẫu thủy sản trắng đã được cho trước vào ống Teflon, sau đó thực hiện như mẫu thử. 5.3.2 Dựng đường chuẩn: Đường chuẩn được dựng với các nồng độ cadmium khác nhau từ 0.25ppb đến 3ppb từ chuẩn cadmium 5ppb với chế độ automix. 6 Điều kiện đo trên máy quang phổ hấp thu nguyên tử AAS Element: Cd Lamp/ Current (mA) Holow cathode lamp / 4mA Electrodeless discharge lamp/ 170mA Wavelength 228.8nm Slit Withd 0.7nm Measurement mode peak hight Signal type atomic absorption - background absorption Intergration time 5 sec Baseline correction time 2 sec Sample volume 10ml Injection temperature 20oC Argon gas supply pressure 3.6 bar or 52 psig or 360kPa Argon gas flow rate 300 ml/min Chương trình cài đặt đối với lò graphit theo bảng sau: Bảng 4.10. Chương trình cài đặt đối với lò graphit khi phân tích Cd bằng quang phổ hấp thu nguyên tử AAS 7 Tính toán Nồng độ của Cd trong mẫu được tính như sau: K = ((CCd-CH20)*V*100)/R*m Step Temperature (oC) Ramp Time (sec) Hold time (sec) Internal Gas (Argon) Flow (min) Read step 1. Drying 130 10 50 300 2. Pyrolysis 700 10 30 300 3. Cooling 20 1 15 300 4.Atomization 1500 0 5 0 x 5. Clean out 2600 1 5 300 40 Trong đó: CCd : nồng độ của Cd trong mẫu tính từ đường chuẩn (ppb). CH20: nồng độ của Cd trong nước tính từ đường chuẩn (ppb) V : thể tích cuối của dung dịch. R : Độ thu hồi của mẫu kiểm soát. m : khối lượng của mẫu. 8. Yêu cầu Độ hồi qui tuyến tính R2≥99%. Độ thu hồi của mẫu phải nằm trong khoảng chấp nhận 75%-125%. 4.3.3 Qui trình phân tích Chì (Pb) tổng số trong thủy sản và sản phẩm thủy sản PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CHÌ TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG MÁY QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ (AAS) 1 Phạm vi áp dụng Phương pháp này mô tả cách xác định hàm lượng chì (Pb) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS). Giới hạn phát hiện của phương pháp 20ppb. 2 Nguyên tắc Chì trong thủy sản và sản phẩm thủy sản tồn tại ở dạng vô cơ lẫn hữu cơ. Vì vậy để xác định được ta phải chuyển tất cả về dạng vô cơ bằng acid có nồng độ cao ở nhiệt độ và áp suất cao. Sau đó được xác định bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS) tại bước sóng 244.8 nm. 3 Thiết bị, dụng cụ 3.1 Thiết bị Hệ thống máy phổ hấp thu nguyên tử bao gồm: - Bộ phận làm lạnh - Lò graphite - Bộ bơm mẫu tự động - Hệ thống đèn - Máy AAS Máy Multiwave 3000. Cân kỹ thuật có độ chính xác 0.001g. 3.2 Dụng cụ 41 - Pipetteman 100µl, 1000µl, 5000µl. - Máy xay mẫu. - Bình định mức 20ml. - Pipette Pasteur. - Ống Teflon phá mẫu. 4 Hóa chất, thuốc thử 4.1 Hóa chất - Dung dịch chì chuẩn, Merck (hoặc tương đương). - Nước cất một lần. - HNO3 65%, Merck(hoặc tương đương). - H2O2 30%, Merck(hoặc tương đương). - Dung dịch H3PO4 85%. 4.2 Dung dịch, thuốc thử 4.2.1 Dung dịch chì trung gian 10ppm Hút chính xác 100µl dung dịch chuẩn 1000ppm vào bình định mức 10ml định mức bằng dung dịch HNO3 1.5%. Bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ từ 2-80C. Hạn sử dụng 3 tháng. 4.2.2 Dung dịch chì chuẩn làm việc 100ppb Hút chính xác 100µl dung dịch chuẩn 10ppm vào bình định mức 10ml định mức bằng dung dịch HNO3 1.5%. Bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ từ 2-80C. Hạn sử dụng 1 tháng. 4.2.3 Dung dịch HNO3 1.5% Hút chính xác 23.07ml HNO3 65% cho vào bình định mức 1000ml, định mức bằng nước cất đến vạch. Hạn sử dụng 1 năm, bảo quản ở nhiệt độ phòng. 4.2.4 Dung dịch H3PO4 50 µg/ml Hút chính xác 58.82µl dung dịch gốc H3PO4 1000 µg/ml vào bình định mức 50ml định mức bằng nước cất đến vạch. 5 Chuẩn bị mẫu 5.1 Chuẩn bị mẫu thử Đồng nhất tối thiểu 200g mẫu trên máy xay mẫu. Đối với mẫu khô thì cắt hoặc giã nhỏ. Giữ mẫu trong tủ đông -180C cho đến khi phân tích. 42 Cân 1g ± 0.05g mẫu đã đồng nhất vào ống Teflon. Sau đó thêm 2ml HNO3 65% và 2ml H2O2 30%. 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng: Hút 1ml nước cất vào ống Teflon, rồi thực hiện như mẫu thử. 5.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát Chì 100ppb: Hút chính xác 1000µl dung dịch chì chuẩn 100ppb và cân 1g ± 0.05g mẫu thủy sản trắng đã được chọn trước vào ống Teflon, sau đó thực hiện như mẫu thử. 5.4 Dựng đường chuẩn Đường chuẩn được dựng với các nồng độ cadmium khác nhau từ 1ppb đến 20ppb từ chuẩn chì 20ppb với chế độ automix. 6 Điều kiện đo trên máy hấp thu nguyên tử AAS Element: Pb Lamp/ Current (mA) Holow cathode lamp / 12mA Electrodeless discharge lamp/ 360mA Wavelength 283.3nm Slit Withd 0.7nm Measurement mode peak hight Signal type atomic absorption - background absorption Intergration time 4 sec Baseline correction time 2 sec Sample volume 20ml Injection temperature 20oC Argon gas supply pressure 3.6 bar or 52 psig or 360kPa Argon gas flow rate 300 ml/min Carrier soluution/ flow rate 3% HCl/ 9-12 ml/min Matrix modifier / Volume H3PO4 / 5ml Chương trình cài đặt đối với lò graphit Bảng 4.11. Chương trình cài đặt đối với lò graphit khi phân tích Cd bằng quang phổ hấp thu nguyên tử AAS Step Temperature (oC) Ramp Time (sec) Hold time (sec) Internal Gas (Argon) Flow (min) Read step 6. Drying 130 10 50 300 43 7. Pyrolysis 800 5 15 300 8. Cooling 20 1 15 300 9.Atomization 1800 0 5 0 x 10. Clean out 2600 1 5 300 7 Tính toán Nồng độ của Pb trong mẫu được tính như sau: K = ((CPb-CH20)*V*100)/R*m Trong đó: CPb : nồng độ của Pb trong mẫu tính từ đường chuẩn (ppb). CH20: nồng độ của Pb trong nước tính từ đường chuẩn (ppb) V : thể tích cuối của dung dịch. R : Độ thu hồi của mẫu kiểm soát. m : khối lượng của mẫu. 8. Yêu cầu Độ hồi qui tuyến tính R2≥99%. Độ thu hồi của mẫu phải nằm trong khoảng chấp nhận, 75%-125%. 4.3.4 Qui trình phân tích Arsenic (As) tổng số trong thủy sản và sản phẩm thủy sản PHƯƠNG PHÁP ĐịNH LƯỢNG ARSENIC TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG MÁY QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ (AAS) 1 Phạm vi áp dụng Phương pháp này mô tả cách xác định hàm lượng arsenic (As) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS). Giới hạn phát hiện của phương pháp 20ppb. 2 Nguyên tắc Arsenic trong thủy sản và sản phẩm thủy sản tồn tại ở dạng vô cơ lẫn hữu cơ. Vì vậy để xác định được ta phải chuyển tất cả về dạng vô cơ bằng acid có nồng độ cao ở nhiệt độ và áp suất cao. Arsenic được khử bằng NaBH4 trong bộ hóa hơi. Sau đó được xác định bằng máy phổ hấp thu nguyên tử (AAS) tại bước sóng 193.7nm. 44 3 Thiết bị, dụng cụ 3.1 Thiết bị Hệ thống máy phổ hấp thu nguyên tử bao gồm: - Bộ phận làm lạnh - Bộ hóa hơi - Bộ bơm mẫu tự động - Hệ thống đèn - Máy AAS Máy Multiwave 3000. Cân kỹ thuật có độ chính xác 0.001g. 3.2 Dụng cụ - Pipetteman 100µl, 1000µl, 5000µl. - Máy xay mẫu. - Bình định mức 10ml. - Pipette Pasteur. - Ống Teplon phá mẫu. 4 Hóa chất, thuốc thử 4.1 Hóa chất - Dung dịch As chuẩn, Merck (hoặc tương đương) - Nước cất một lần. - HNO3 1.5%, Merck (hoặc tương đương) - H2O2 30%, Merck (hoặc tương đương) - Dung dịch NaBH4 0.6% + NaOH 0.5%. - Acid ascorbic - KI 4.2 Dung dịch, thuốc thử 4.2.1 Dung dịch chuẩn trung gian As 10ppm Hút chính xác 100µl dung dịch As chuẩn 1000ppm vào bình định mức 10ml định mức bằng dung dịch HNO3 1.5%. Bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ từ 2-80C. Hạn sử dụng 3 tháng. 4.2.2 Dung dịch chuẩn làm việc As 100ppb Hút chính xác 500µl dung dịch chuẩn 10ppm vào bình định mức 50ml định mức bằng dung dịch HNO3 1.5%. 45 Bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ từ 2-80C. Hạn sử dụng 1 tháng. 4.2.3 Dung dịch HNO3 1.5% Hút 23 ml HNO3 65% cho vào bình định mức 1000ml, định mức bằng nước cất đến vạch. Hạn sử dụng trong 1 năm, bảo quản ở nhiệt độ phòng. 4.2.4 Dung dịch NaBH4 0.6% + NaOH 0.5% Cân chính xác 0.3g NaBH4 và 0.5g NaOH vào bình định mức 100ml định mức bằng nước cất đến vạch. Pha trước khi chạy máy. 4.2.5 Dung dịch KI 20% Cân chính xác 20g KI cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước cất. 4.2.6 Dung dịch acid ascorbic 20% Cân chính xác 20g acid ascorbic cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước cất. 5 Chuẩn bị mẫu 5.1 Chuẩn bị mẫu thử Đồng nhất tối thiểu 200g mẫu trên máy xay mẫu. Đối với mẫu khô thì cắt hoặc giã nhỏ. Giử mẫu trong tủ đông -180C cho đến khi phân tích. Cân 1g ± 0.05g mẫu đã đồng nhất vào ống Teplon để phá mẫu. Sau đó thêm 1ml HNO3 65% và 3ml H2O2 30%.và 2ml H2O 5.2 Chuẩn bị mẫu nước trắng Hút 1ml nước cất vào ống Teplon, rồi thực hiện như mẫu thử. 5.3 Chuẩn bị mẫu thủy sản trắng và mẫu kiểm soát (As 100ppb) 5.4 Mẫu thủy sản trắng: Cân 1g ± 0.05g mẫu thủy sản trắng đã được chọn trước vào ống Teplon, sau đó thực hiện như mẫu thử. 5.5 Mẫu kiểm soát (As 20ppb) Hút chính xác 200µl dung dịch arsenic chuẩn 100ppb và cân 1g ± 0.05g mẫu thủy sản trắng đã được chọn trước vào ống Teplon, sau đó thực hiện như mẫu thử. 5.6 Vô cơ hóa mẫu Đặt ống Teflon chứa mẫu vào rotor của máy Multiwave 3000, chạy máy theo chương trình đã được cài đặt. 46 Bảng 4.12. Các thông số cài đặt trên máy phá mẫu Multiwave 3000 Ph Power Ramp Hold Fan 1 250 01:00 06:00 1 2 400 02:00 05:00 1 3 600 05:00 35:00 1 4 0 30:00 3 Sau khi phá mẫu, cho vào bình định mức 20ml, thêm 1,5ml dung dịch KI 20% + 1ml dung dịch acid ascorbic 20% + 0,5ml dung dịch HCl 37%. Sau đó định mức bằng nước cất cho đến vạch. 5.7 Dựng đường chuẩn Pha từ dung dịch chuẩn làm việc As 100ppb pha loãng vào bình định mức 20ml. Pha theo bảng sau: Bảng 4.13. Thể tích chuẩn As 100ppb thêm vào để dựng đường chuẩn As Thể tích(µl) Nồng độ (ppb) 100 0.5 200 1 400 2 1000 5 2000 10 6 Đo trên máy hấp thu nguyên tử AAS 6.1 Các thông số chạy máy Element - Matrix: As - Instrument Type: Flame Conc. Units: ug/L Instrument Mode: Absorbance Sampling Mode: Manual Calibration Mode: Concentration Measurement Mode: PROMT Precision Standard: 1.0 % Precision Sample: 1.0 % Expansion Factor: 1.0 Minimum Reading: Disabled Smoothing: 7 point Conc. Dec. Places: 2 47 Wavelength: 193.7 nm Slit Width: 0.5 nm Gain: 72 % Lamp Current: 10.0 mA Lamp Position: 1 Background Correction: BC On STANDARD 1: 0.50 ug/L STANDARD 2: 1.00 ug/L STANDARD 3: 2.00 ug/L STANDARD 4: 5.00 ug/L STANDARD 5: 10.00 ug/L Reslope Rate: 50 Reslope Standard No.: 3 Reslope Lower Limit: 75.0 % Reslope Upper Limit: 125.0 % Recalibration Rate: 100 Calibration Algorithm: Linear Cal. Lower Limit: 20.0 % Cal. Upper Limit: 150.0 % SIPS: Off Measurement Time: 10.0 s Pre-Read Delay: 45 s Flame Type: Air/Acetylene Air Flow: 13.80 L/min Acetylene Flow: 2.25 L/min Burner Height: 0.0 mm 6.2 Chạy máy - Tiêm dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn độ hồi qui tuyến tính R2≥98%. - Tiêm dung dịch chuẩn để kiểm tra độ nhạy của máy. - Tiêm mẫu trắng. - Tiêm mẫu kiểm tra. - Tiêm mẫu thật. 7 Tính toán Nồng độ của As trong mẫu được tính như sau: K = (CAs*V*100)/R*m 48 Trong đó: CAs : nồng độ của As trong mẫu tính từ đường chuẩn (ppb). V : thể tích cuối của dung dịch. R : Độ thu hồi của mẫu kiểm soát. m : khối lượng của mẫu. 8 Kết quả Kết quả phân tích As được thể hiện trong phụ lục 3: Bảng báo cáo kết quả phân tích As. Ngày 22/04/2009 khảo sát độ tuyến tính của đường chuẩn trong khoảng nồng độ từ 0.5ppb đến 10ppb Bảng 4.14. Mối liện hệ giữa nồng độ và độ hấp thu của As khi chạy chuẩn Nồng độ, ppb (Conc) Độ hấp thu (Abs) As 1 As 2 As 3 0 0.0086 0.0003 -0.0001 0.5 0.0377 0.014 0.0246 1 0.0476 0.0337 0.0392 2 0.0669 0.0572 0.0704 5 0.1383 0.1408 0.1568 10 0.2289 0.2305 0.2513 y = 0.0212x + 0.0226 R2 = 0.9892 y = 0.0232x + 0.0079 R2 = 0.9878 y = 0.0248x + 0.0138 R2 = 0.9844 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 2 4 6 8 10 12 Conc A b s As 1 As 2 As 3 Linear (As 1) Linear (As 2) Linear (As 3) Hình 4.1 Đồ thị khảo sát độ tuyển tính của As trong khoảng nồng độ từ 0.5ppb đến 10ppb Kết quả: độ tuyến tính của As trong khoảng từ 0.5ppb đến 10ppb rất tốt, hệ số hồi qui >0,98 49 Ngày 25/04/2009 chạy trên nền mẫu để khảo sát độ thu hồi Bảng 4.15. Độ thu hồi của As trên mẫu spike 20ppb và mẫu spike 100ppb Mẫu Spike 20ppb R% Spike 100ppb R% Tôm 1.18 118 4.94 98.80 Tôm 0.41 41 4.33 86.60 Tôm 0.71 71 3.51 70.20 Tôm 1.09 109 4.79 95.80 Tôm 0.33 33 3.35 67.00 Tôm 0.58 58 3.79 75.80 Trung bình 0.72 71.67 4.12 82.37 Kết quả: độ thu hồi đạt được trong khoảng từ 67% đến 98% Ngày 28/04/2009 – 05/05/2009 khảo sát độ lặp lại, độ tái lặp tại 20ppb độ lặp lại trên mẫu tôm ở 1ppb, định mức 20ml Bảng 4.16. Độ tái lặp trên các nền mẫu khác nhau tại 20ppb Mẫu Cá Tôm Mực Spike 20ppb 1.16 1.18 0.6 Spike 20ppb 0.48 0.41 0.97 Spike 20ppb 0.29 0.71 0.05 Spike 20ppb 1.44 1.09 0.56 Spike 20ppb 0.27 0.33 0.02 Spike 20ppb 0.07 0.58 0.42 Trung bình 0.6183 0.7167 0.4367 Độ lệch chuẩn 0.5509 0.3511 0.3605 Độ lệch chuẩn tương đối 89.0952 48.9898 82.5529 Độ tái lặp của mẫu tôm ở 1ppb, định mức 20ml thực hiện trong 3 ngày khác nhau 50 Bảng 4.17. Độ lặp lại trên mẫu tôm spike 1ppb ở 3 ngày khác nhau Ngày 1 2 3 Spike 20ppb 14 0.91 1.18 Spike 20ppb 17.2 0.55 0.41 Spike 20ppb 16.8 0.5 0.71 Spike 20ppb 14 0.46 1.09 Spike 20ppb 13 0.65 0.33 Spike 20ppb 10 0.45 0.58 Trung bình 14.167 0.5867 0.3300 Độ lệch chuẩn 2.6425 0.1744 0.3511 Độ lệch chuẩn tươngđối 18.6528 29.7328 106.3920 Độ lệch chuẩn trung bình 1.0560 Độ lệch chuẩn tương đốitrung bình 51.5925 Kết quả: độ lặp lại và độ tái lặp của phương pháp định lượng As tại nồng độ 20ppb là tương đối tốt Ngày 06/05/2009 tính LOD cho phương pháp Bảng 4.18. Độ hấp thu của As khi chạy 20 mẫu spike 20ppb và 20 mẫu blank 51 Mẫu Abs Mẫu Abs Spike 20ppb 0.0364 Blank 01 -0.0055 Spike 20ppb 0.0275 Blank 02 -0.0044 Spike 20ppb 0.0263 Blank 03 -0.0038 Spike 20ppb 0.0253 Blank 04 -0.012 Spike 20ppb 0.0299 Blank 05 -0.0119 Spike 20ppb 0.025 Blank 06 -0.0153 Spike 20ppb 0.0237 Blank 07 0.0108 Spike 20ppb 0.0248 Blank 08 0.0134 Spike 20ppb 0.0189 Blank 09 0.0025 Spike 20ppb 0.0163 Blank 10 0.0066 Spike 20ppb 0.0177 Blank 11 0 Spike 20ppb 0.0177 Blank 12 -0.0027 Spike 20ppb 0.0177 Blank 13 -0.013 Spike 20ppb 0.0166 Blank 14 -0.016 Spike 20ppb 0.0158 Blank 15 -0.0167 Spike 20ppb 0.0166 Blank 16 -0.017 Spike 20ppb 0.0136 Blank 17 -0.0185 Spike 20ppb 0.0221 Blank 18 -0.0192 Trung bình 0.0218 Trung bình -0.0068 Kết quả: độ hấp thu trung bình ở nồng độ 1ppb là 0.0218 lớn hơn gấp 3 lần độ hấp thu trung bình của Blank. Vậy LOD của phương pháp là 20ppb. 52 Chương V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Do thời gian có hạn nên việc tìm hiểu cũng chỉ giới hạn trong khoảng thời gian thực tập tại công ty. Trên đây là những phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh, hóa chất, thuốc trừ sâu trong thủy sản và sản phẩm thủy sản được tìm hiểu trong suốt quá trình thực tập và ghi nhận lại Đối với phương pháp phân tích hàm lượng Arsenic tổng số trong thủy sản và sản phẩm thủy sản do có điều kiện tham gia trực tiếp tìm phương pháp và đã thu được những kết quả ban đầu: - Phương pháp: đo bằng phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử dùng ngọn lửa - Độ thu hồi: độ thu hồi đạt được trong khoảng từ 67% đến 98% - Giới hạn phát hiện của phương pháp: 20ppb 5.2 Đề xuất Cần phải nghiên cứu thêm để tìm hiểu những nguyên nhân gây ra hiệu suất thấp cho phương pháp phân tích hàm lượng As trong thủy sản và sản phẩm thủy sản . Từ đó có những biện pháp khắc phục để hoàn thiện phương pháp hơn, cho hiệu suất cao và được áp dụng rộng rãi hơn. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO –&— 1 Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/2/2005 của Bộ Thuỷ sản về ban hành danh mục hoá chất, kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản 2 Trần Thị Kim Giang, 2006. Luận văn tốt nghiệp đại học – Xác định dư lượng Malachite Green trong thủy sản bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ. 3 Trần Minh Phú, Vương Thanh Tùng, Lê Bảo Ngọc – Khoa Thủy Sản – Trường Đại Học Cần Thơ. Bài giảng Phân Tích Thực Phẩm Thủy Sản. 4 Các trang Web: www.vienkinhte.hochiminhcity.gov.vn www.fistenet.gov.vn 5 28 TCN194 : 2004: Các chất chuyển hoá thuộc nhóm Nitrofuran trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ-khối phổ. 6 28 TCN196 : 2004: Sulfonamit trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. 7 28 TCN 177 : 2002 Hàm lượng thuốc kháng sinh nhóm Tetracyclin trong sản phẩm thủy sản 8 Hàm lượng thuốc kháng sinh nhóm tetracyclin trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 9 28 TCN 178 : 2002 Hàm lượng axit oxolinic trong sản phẩm thủy sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 10 28 TCN 186 : 2003 Hàm lượng cloramphenicol trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký khí 11 28TCN 160:2000 Hàm lượng thuỷ ngân trong thủy sản - Phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử 12 28TCN 161:2000 Hàm lượng chì trong thủy sản - Phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử 13 28TCN 162:2000 Hàm lượng cađimi trong thủy sản - Phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử 14 Determination and Confirmation of Leucomalachite Green in Salmon using No-Discharge Atmospheric Pressure Chemical Ionization LC-MSn www.cfsan.fda.gov/~frf/lib4333.pdf 15 Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam – Thực trạng và thách thức 54 www.vienkinhte.hochiminhcity.gov.vn/xemtin.asp?idcha=2806&cap=3&i d=3200 16 Determination of Chloramphenicol Residues in Shimp and Crab Tissues by Electrospay Triple Quadrupole LC/MS/MS. Joe Strey, Al Plenning, Sherri Turnipseed, Gene Nandrea, Rebecca Lee, Cathy Burns, Mark Madson www.foodsafety.gov/~frf/lib4306.html 17 Detection of Nitrofuran Metabolites in Shrimp 55 PHỤ LỤC –&— Phụ lục 1 DANH MỤC HOÁ CHẤT, KHÁNG SINH CẤM SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT, KINH DOANH THỦY SẢN (Ban hành kèm theo Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24 tháng 2 năm 2005 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản) TT Tên hoá chất, kháng sinh Đối tượng áp dụng 1 Aristolochia spp và các chế phẩm từ chúng 2 Chloramphenicol 3 Chloroform 4 Chlorpromazine 5 Colchicine 6 Dapsone 7 Dimetridazole 8 Metronidazole 9 Nitrofuran (bao gồm cảFurazolidone) 10 Ronidazole 11 Green Malachite (Xanh Malachite) 12 Ipronidazole 13 Các Nitroimidazole khác 14 Clenbuterol 15 Diethylstibestrol (DES) 16 Glycopeptides 17 Trichlorfon (Dipterex) Thức ăn, thuốc thú y, hoá chất, chất xử lý môi trường, chất tẩy rửa khử trùng, chất bảo quản, kem bôi da tay trong tất cả các khâu sản xuất giống, nuôi trồng động thực vật dưới nước và lưỡng cư, dịch vụ nghề cá và bảo quản, chế biến. 56 Phụ lục 2 DANH MỤC CÁC HOÁ CHẤT, KHÁNG SINH HẠN CHẾ SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT KINH DOANH THỦY SẢN (Ban hành kèm theo Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24 tháng 2 năm 2005 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản) TT Tên hoá chất, kháng sinh Dư lượng tối đa(ppb)* Mục đích sử dụng Thời gian dừng thuốc trước khi thu hoạch làm thực phẩm 1 Amoxicillin 50 2 Ampicillin 50 3 Benzylpenicillin 50 4 Cloxacillin 300 5 Dicloxacillin 300 6 Oxacillin 300 7 Danofloxacin 100 8 Difloxacin 300 9 Enrofloxacin 100 10 Ciprofloxacin 100 11 Oxolinic Acid 100 12 Sarafloxacin 30 13 Flumepuine 600 14 Colistin 150 15 Cypermethrim 50 16 Deltamethrin 10 17 Diflubenzuron 1000 18 Teflubenzuron 500 19 Emamectin 100 20 Erythromycine 200 21 Tilmicosin 50 22 Tylosin 100 23 Florfenicol 1000 24 Lincomycine 100 25 Neomycine 500 26 Paromomycin 500 27 Spectinomycin 300 28 Chlortetracycline 100 Dùng làm nguyên liệu sản xuất thuốc thú y cho đông, thực vật thủy sản và lưỡng cư Cơ sở SXKD phải có đủ bằng chứng khoa học và thực tiễn về thời gian thải loại dư lượng thuốc trong động, thực vật dưới nước và lưỡng cư xuống dưới mức giới hạn cho phép cho từng đối tượng nuôi và phải ghi thời gian ngừng sử dụng thuốc trước khi thu hoạch trên nhãn sản phẩm 57 29 Oxytetracycline 100 30 Tetracycline 100 31 Sulfonamide (các loại) 100 32 Trimethoprim 50 33 Ormetoprim 50 34 Tricainemethanesulfonate 15-330 * Tính trong động, thực vật dưới nước, lưỡng cư và sản phẩm động, thực vật dưới nước, lưỡng cư Phụ lục 3: BẢNG BÁO CÁO KẾT QUẢ PHÂN TÍCH As