Tìm một số dòng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

i d giếng thạch = 13 mm Hình 3.3: Cách đo bề rộng vòng đối kháng Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Office Excell 2003. CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn lactic từ mắm, nước mắm 4.1.1 Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn trên môi trường MRS Agar dựa vào hình thái khuẩn lạc và khả năng sinh axít lactic 4.1.1.1 Kết quả thu nhận huyền phù do vi khuẩn phát triển Qua Bảng 1 (Phụ luc C) cho thấy trong 96 ống nghiệm nuôi cấy có 85 ống nghiệm (tương ứng 85 mẫu) xuất hiện huyền phù vi khuẩn (Hình 4.1 [B]), các mẫu này được tiếp tục cấy ria tách ròng. Hình 4.1: [A] Trước khi tăng sinh; [B] Sau khi tăng sinh 4.1.1.2 Kết quả cấy ria tách ròng và quan sát hình thái khuẩn lạc Trong quá trình cấy ria tách ròng có sự nhiễm nấm. Nguyên nhân có thể nấm nhiễm từ môi trường ngoài như: không khí, giấy thấm. Nấm có dạng sợi nhuyễn màu trắng, mọc thành cụm tròn to trên thạch MRS agar (Hình 4.2). Mặc dù MRS agar và broth được thiết lập thành phần để gia tăng sự phát triển của LAB (bao gồm cả: Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus và Leuconostoc. Tất cả những loài này đều sinh ra axít lactic. Chúng là vi khuẩn Gram dương, catalase âm tính, đòi hỏi nhiều dưỡng chất) và tính chọn lọc của MRS thì biến đổi phụ thuộc vào pH (De Man et al., 1960). Hình 4.2: Mẫu bị nhiễm nấm Tuy nhiên nấm có khả năng chuyển hoá mà cho phép chúng sử dụng đa dạng những loại chất nền hữu cơ để phát triển, bao gồm các hợp chất đơn giản như nitrat, amoniac, axêtat hay êtanol. Mặt khác, nấm thường phát triển tốt hơn trong môi trường có pH = 5 (trong khi môi trường MRS agar có pH 5,7), là môi trường quá axit đối với sự phát triển của đa số các loài vi khuẩn (Marzluf, 1981). Do đó nấm vẫn có thể phát triển được trên MRS agar. Các mẫu nhiễm nấm được loại bỏ và quan sát khuẩn lạc ở 54 mẫu giữ lại (Bảng 2, Phụ lục C). Bảng 4.1: Kết quả của quá trình cấy ria tách ròng Đĩa có xuất hiện khuẩn lạc Đĩa không xuất hiện khuẩn lạc Tổng Bị nhiễm nấm Không nhiễm nấm 26 54 5 85 Qua quá trình quan sát khuẩn lạc nhận thấy hình dạng bao gồm tròn (đường kính từ 1 – 4 mm) hoặc không đều; bề mặt lồi hoặc phẳng; mép trơn hoặc gợn sóng; kích cỡ nhỏ hoặc to; đa số có màu trắng đục, một số có màu trắng ngả vàng (Bảng 4.3); tất cả khuẩn lạc được chọn đều sinh axít lacitc tác dụng với CaCO3 tạo nên khoảng trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của sharpe (1979) và không khác biệt so với các nghiên cứu trước đây về LAB được tuyển chọn trên các sản phẩm lên men khác như: Theo Oluwafemi và Adetunji (2011) đã mô tả hình thái khuẩn lạc 4 chủng vi khuẩn lactic gồm: Lactobacillus plantarum (phân lập từ ATCC 25927) và L. plantarum (phân lập từ qua trình lên men rượu ngô) đều có dạng có dạng tròn đều, nhỏ, mặt trơn bóng, mép trơn, hơi lồi; 2 chủng phân lập từ sữa chua thương mại gồm: Lactobacillus bulgaricus có dạng tròn đều, nhỏ, màu kem bóng, mép trơn, bằng phẳng và Streptococcus thermophillus nhỏ, trắng, tròn, mặt trơn láng. Milton Luiz Pinho Espirito Santo et al. (2005) mô tả vi khuẩn Lactobacillus sakei 2a (được phân lập từ sản phẩm xúc xích thịt heo của người Brazil) là trực khuẩn, gram dương, xếp thành chuỗi, khuẩn lạc màu trắng đến vàng kem, tròn đều, trơn láng, lồi, đường kính 0,5 – 1 mm. Năm 2008, nhóm nghiên cứu tại Trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã phân lập được 50 chủng vi khuẩn lactic trên các sản phẩm lên men chua (dưa cải muối, sữa chua, nem chua) tại thành phố Hà Nội. Nhóm nghiên cứu đã tuyển chọn 10 chủng thể hiện khả năng sinh axít lactic cao nhất được xác định thuộc nhóm Lactobacillus. Khuẩn lạc nhóm này có chung đặc điểm là tròn đều, đường kính từ 1 – 3 mm, màu trắng với độ đục khác nhau. Hình 4.3: Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic phát triển trên MRS agar Bảng 4.2: Kết quả mô tả hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi (độ phóng đại 4X) Quan sát khuẩn lạc Mô tả khuẩn lạc Kí hiệu mẫu Khuẩn lạc tròn, to, đường kính 3 – 3,5 mm, mép gợn sóng, hơi lồi, màu trắng đục. 28; 12; 40; 5; 2; 21 Khuẩn lạc tròn, vừa, đường kính 1,5 – 2 mm, mép gợn sóng, có rảnh, mặt bằng phẳng, màu trắng đục. 56 Khuẩn lạc to, không đều, bề mặt gồ gề, chia rảnh, màu vàng kem. 3 Khuẩn lạc không đều, mép gợn sóng, to, lồi lên ở giữa, có những nếp cuộn lên trên bề mặt, màu trắng đục. 35 Khuẩn lạc tròn, vừa, đường kính 1,5 – 2 mm , mép trơn, lồi, nhẵn, bóng, màu trắng đục. 7; 41; 29; 78; 24 Khuẩn lạc vừa, đường kính 1,5 – 2 mm, không tròn đều, mép gợn sóng nhỏ, mặt gồ gề, màu trắng đục. 45; 60; 38; 39; 63; 68 Khuẩn lạc không đều, mép gợn sóng, phẳng, mặt gồ gề, có rãnh, màu trắng đục, ngả vàng ở giữa. 10; 19; 26 Khuẩn lạc mép gợn sóng không đều, to, lồi lên ở giữa, có những nếp cuộn lên trên bề mặt, màu trắng đục 22 Khuẩn lạc tròn nhỏ, đường kính 1 mm , nhẵn, lồi, bóng, màu trắng đục. 83; 77; 81; 17; 79; 58; 1; 20; 31; 80; 6; 36; 66; 13; 15; 30; 57; 23; 8 Khuẩn lạc không đều, mép gợn sóng, có những nếp xoáy, ở giữa nhọn lên, màu trắng đục. 82 Khuẩn lạc to không đều, bề mặt gồ gề, chia rảnh, màu trắng đục. 9; 16; 44; 48 Khuẩn lạc tròn, to, đường kính 3 – 4 mm, nhẵn, lồi, bóng, mép trơn, màu trắng đục. 71; 43; 34; 4; 11; 51 4.1.2 Kết quả thử nghiệm catalase Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì có khả năng chuyển hóa H2O2 thành H2O và O2, LAB thì không có khả năng này (Bergey, 1979 ). Do đó, thông qua phản ứng catalase nhằm bổ sung cho sự xác định dòng vi khuẩn lactic có độ tin cậy cao hơn. Kết quả kiểm tra cho thấy có 54 dòng có phản ứng catalase âm tính (không sủi bọt) B A Hình 4.4: [A] Vi khuẩn lactic catalase âm tính; [B] E. ictaluri catalase dương tính Theo Nguyễn Thị Bích Thùy (2009) đã thử nghiệm catalase ở 40 chủng vi khuẩn đã được phân lập trên MRS agar (không bổ sung CaCO3) thì có 5 chủng cho kết quả âm tính và được loại bỏ khả năng chúng là vi khuẩn lacitc, theo tác giả sự xuất hiện các dòng vi khuẩn khác trên môi trường phân lập được giải thích là mỗi mẫu sản phẩm lên men tự nhiên chắc chắn chứa ít nhất 50 loài vi khuẩn khác nhau thì việc giống nhau ở một vài đặc điểm là chuyện không tránh khỏi. Các nghiên cứu khác đã tìm thấy được không chỉ vi khuẩn lactic hiện diện trong các nguồn sản phẩm lên men như: Chapman và Sharpe (1981) được tìm thấy Streptococcus trong phô mai, Savadago et al (2004) cũng phân lập Streptococcus Lactococcus từ sữa. Shaw và Harding (1984) nói đến sự hiện diện của vi khuẩn Carnobacterium trong các sản phẩm thịt, cá lên men và còn rất nhiều giống không chỉ vi khuẩn lactic có thể được tìm thấy ở môi trường sống của vi khuẩn lactic. Vì vậy chúng có chung một số đặc điểm sinh hóa và trao đổi chất (được trích dẫn bởi Nguyễn Thị Bích Thùy, 2009). Trong thí nghiệm này, để hạn chế sự xuất hiện các dòng vi khuẩn không phải LAB trong quá trình thí nghiệm dẫn đến sai sót trong kết quả thì việc bổ sung CaCO3 vào môi trường phân lập ban đầu là thật sự cần thiết, nó giúp xác định các dòng sinh axit lactic hiệu quả hơn. Suthasinee Nilsang (2010) đã bổ sung 0,5 % CaCO3 vào môi trường MRS agar dùng để phân lập các chủng LAB trên các sản phẩm lên men truyền thống (trong đó có nước mắm Thái) nhằm tuyển chọn những chủng sinh axit lactic cao, kết quả khi thử nghiệm catalase sau đó ở các chủng sinh axít lactic đều dương tính. 4.1.3 Kết quả nhuộm Gram và mô tả hình thái vi khuẩn Qua kết quả nhuộm Gram cho thấy 54 dòng đều bắt màu tím xanh của dung dịch thuốc nhuộm. Như vậy, có 54 dòng vi khuẩn Gram dương. Tế bào có dạng hình que (ngắn hoặc dài), sắp xếp theo dạng đơn bào, 2 tế bào. Tế bào có dạng hình cầu, sắp xếp theo dạng đơn bào hay kết thành chuổi hoặc bó lại thành chùm (Bảng 3, Phụ lục C). B A Hình 4.5: [A] Vi khuẩn lactic (gram +); [B] Vi khuẩn E. ictaluri (gram –) Thongsanit et al. (2002) đã phân lập được vi khuẩn Tetragenococcus halophilus từ nước mắm Thái (nam-pla), vi khuẩn lactic này có dạng cầu khuẩn, Gram dương, tế bào sắp xếp thành chùm. Oluwafemi và Adetunji (2011) đã mô tả 4 chủng LAB phân lập từ quá trình lên men rượu ngô và sữa chua lên men là Lactobacillus plantarum (ATCC 25927) và L. Plantarum có dạng hình que, Gram dương; L.bulgaricus có dạng hình que dài, Gram dương; Streptococcus thermophillus có dạng hình cầu, tế bào kết lại thành chùm, Gram dương. Như vậy, từ kết quả nhuộm Gram có thể khẳng định 54 dòng vi khuẩn được chọn lọc thuộc vi khuẩn lacitc. Tóm lại, thí nghiệm đã phân lập được 54 dòng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men thủy sản để sử dụng trong kiểm tra tính đối kháng với vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra. Vi khuẩn lactic có lẽ là vi sinh vật phổ biến và ưa chuộng nhất trong thực phẩm lên men (Somboon Tanasupawat, 2009). Theo Tanasupawat et al. (1998), nghiên cứu ‛‛Vi khuẩn lactic trong các sản phẩm cá lên men ở Thái Lan” có 47 chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình có hình que và 5 chủng lên men không đồng hình có hình cầu, các chủng này được tìm thấy từ 4 loại sản phẩm cá lên men (pla-ra, kung-chom, pla-chom và hoi-dong). Noonpakdee et al. (2009) đã phân lập tổng cộng 12.520 vi khuẩn lactic từ sản phẩm cá lên men ‛‛som-fak” (sản phẩm gồm có: thịt cá, muối (2 – 5%), gạo nấu chín, tỏi băm). Theo Zhang Miao-xia et al. (2009) đã phân lập được 13 chủng vi khuẩn lactic từ 5 loại nước mắm tại Zhanjiang và Shantou (Trung Quốc), trong đó có 11 chủng được xác định là Lactobacillus và  2 chủng là Lactococcus  lactis; các chủng này có khả năng hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật gây ương hỏng thịt cá. Cũng theo Somboon Tanasupawat (2009), nhiều chủng loài LAB mới được tìm thấy trong các sản phẩm lên men tại Thái Lan gồm các chủng lên men đồng hình: L. Acidipiscis (từ pla-ra), L. thailandensis, L. camelliae, E. camelliae (từ miang), E. thailandicus (từ mắm) và chủng lên men không đồng hình: W. thailandensis (từ pla-ra). Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn được phân lập trên sản phẩm khô cá và mắm ruốc. 4.2 Kết quả đối kháng của vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn E.ictaluri Qua kiểm tra tính kháng của 54 dòng vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn chỉ thị là E. ictaluri, thu được 39 dòng có vòng kháng khuẩn, các dòng còn lại không nhận thấy vòng đối kháng. Trong nghiên cứu phân lập nhóm vi khuẩn lactic có tính chất đối kháng với vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra của Trần Trọng Nguyễn (2010), kết quả kiểm tra tính kháng của vi khuẩn lactic được phân lập từ hệ tiêu hóa cá Tra đối với E. ictaluri bằng phương pháp giếng khuếch tán nhận thấy chỉ có 1 trong 13 chủng lactic có vòng đối kháng với E. ictaluri, điều này được giải thích do nồng độ vi khuẩn lactic (2x107 tb/ml, sau 48 giờ nuôi ủ ở 30 oC) trong giếng thạch (đường kính 7 mm, chứa 80 µl dịch LAB) không đủ ức chế vi khuẩn chỉ thị (2x108 tb/ml, nuôi ủ sau 24 giờ, ở 30 oC). Trong thí nghiệm này, phương pháp giếng khuếch tán có sự tối ưu hơn: giếng thạch chứa lượng dịch nhiều hơn, thời gian nuôi ủ LAB ngắn hơn (24 giờ thay vì 48 giờ) nên nồng độ LAB thấp hơn (106 – 107 tb/ml), dinh dưỡng trong MRS broth vẫn còn nhiều. Khi cho dịch LAB vào giếng , LAB sử dụng dinh dưỡng còn lại trong môi trường MRS broth để tiếp tục phát triển làm tăng lượng chất ức chế vi khuẩn chỉ thị. Theo Đỗ Quế Mi Hương (2009), nồng độ vi khuẩn chỉ thị cũng ảnh hưởng lên độ trong suốt của vòng kháng khuẩn. Điều này cho thấy sự tương ứng giữa chất kháng khuẩn với mật độ vi khuẩn chỉ thị và để đo được chính xác bề rộng của vòng kháng bằng phương pháp này thì bề dày môi trường BHI agar trong đĩa cần được chuẩn hóa. Môi trường quá dày hoặc quá mỏng sẽ hạn chế sự khuếch tán của các chất kháng khuẩn trong thạch. Trong thí nghiệm này, sau khi thử nghiệm phương pháp với độ dày thạch khác nhau (5 mm, 3 mm), cho thấy độ dày thạch BHI là 5 mm (tương ứng 30 ml môi trường) và nồng độ vi khuẩn chỉ thị 107 – 108 tế bào/ml thì thu được vòng kháng khuẩn rõ nhất. Hơn nữa, mỗi một mẫu được thử nghiệm ở 3 giếng tương ứng với 3 lần lặp lại để thu được kết quả trung bình bề rộng vòng kháng của dòng, đồng thời giúp đánh giá chính xác hơn về tính kháng của dòng. Hình 4.6: Môi trường dày 5 mm (trái) và dày 3 mm (phải) Mặt khác, việc xác định nồng độ vi khuẩn lactic trong thí nghiệm là chưa thật sự chuẩn xác. Xét 2 dòng có kí hiệu 2 và 19, sau 24 giờ tăng sinh thì tiến hành xác định nồng độ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, kết quả số lượng khuẩn lạc trong đĩa mẫu 2 nhiều hơn (Hình 4.6), điều này cho thấy tốc độ phát triển dòng số 2 nhanh hơn dòng số 19 và kết quả kiểm tra tính kháng sau đó ở 2 mẫu này cho thấy mẫu 2 có vòng đối kháng khá tốt trong khi mẫu 19 lại không có vòng đối kháng. Vì vậy, có thể nói nồng độ LAB không đủ ức chế vi khuẩn chỉ thị vẫn là một trong những nguyên nhân xuất hiện các mẫu không có vòng đối kháng hoặc có vòng kháng với bề rộng lớn nhỏ khác nhau. Tuy nhiên, không loại bỏ trường hợp khác nhau về khả năng sản sinh chất kháng khuẩn của các chủng lactic khác nhau, nghĩa là trong cùng điều kiện như nhau và chất kháng khuẩn sinh ra giống nhau có thể dòng này sinh chất kháng khuẩn nhiều hơn dòng kia. A B Hình 4.7: So sánh mật độ khuẩn lạc giữa 2 dòng 2 [A] và 19 [B] Theo Schillinger và Lucke (1989) cho rằng khi bề rộng vòng kháng khuẩn >1 mm thì khả năng kháng của vi khuẩn lactic đối với sinh vật chỉ thị coi như là mạnh; khi giá trị này nằm trong khoảng 0,5 – 1 mm tương ứng khả năng kháng trung bình. Còn theo nghiên cứu của C. N. Jacobsen, V. Rosenfeldt Nielsen , A. E. Hayford, P. L. Molller, K. F. Michaelsen, A. Perregaard, B. Sandstrom, M. Tvede, M. Jakobsen (1999) thì bề rộng vòng kháng khuẩn được xét trong khoảng 2 – 5 mm cho khả năng kháng trung bình và trên 5 mm khả năng kháng mạnh. Bề rộng vòng kháng phụ thuộc vào nồng độ vi khuẩn lactic trong dung dịch. Với nồng độ vi khuẩn lactic trong dung dịch thấp hơn 106 – 107 tế bào/ml thì hiệu quả đối kháng hạn chế do lượng hoạt chất đối kháng tiết ra không đủ để diệt vi khuẩn chỉ thị sau 24 giờ, song nồng độ khuẩn lactic quá cao, sẽ sử dụng hết nguồn dinh dưỡng trong dung dịch MRS lỏng, trong khi BHI thạch không phải là môi trường ưa thích của LAB, kết quả là vi khuẩn lactic tiến vào pha tàn nhanh hơn. Mặt khác, để đo được đường kính vòng đối kháng thực sự chính xác thì lượng dung dịch cho vào giếng phải vừa đủ không để chảy tràn lên mặt thạch. Để tiện theo dõi và đánh giá tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn lactic phân lập được trong thí nghiệm, có thể phân loại tính kháng khuẩn (tạm thời đối với vi khuẩn chỉ thị E. ictaluri) như sau: X là bề rộng vòng kháng (mm) Bề rộng vòng kháng khuẩn X > 2,0 mm: tính kháng mạnh (+++) Bề rộng vòng kháng khuẩn 1 mm < X ≤ 2 mm mm: tính kháng trung bình (++) Bề rộng vòng kháng khuẩn X ≤1 mm: tính kháng yếu (+) X = 0: không có tính kháng Bảng 4.3: Kết quả đo bề rộng vòng kháng của 39 dòng vi khuẩn lactic có tính kháng với E. ictaluri Kí hiệu mẫu Bề rộng vòng kháng (mm) Phân loại tính kháng khuẩn Giếng 1 Giếng 2 Giếng 3 Trung bình 29 0 1 1 0,67 + 16 1 0,5 1 0,83 + 44 1 0,5 1 0,83 + 40 0,5 2 0 0,83 + 48 0,5 1 1 0,83 + 9 2 0 1 1,00 + 12 2 0 1 1,00 + 13 1 1 1 1,00 + 15 1 1 1 1,00 + 57 1 1 1 1,00 + 66 1 1 1 1,00 + 51 2,5 0 1 1,17 ++ 34 1,5 1 1 1,17 ++ 11 1 1,5 1 1,17 ++ 5 2 0 2 1,33 ++ 21 2 1 1 1,33 ++ 28 2 1 1 1,33 ++ 43 1,5 1 1,5 1,33 ++ 79 + NaCl 1,5 1,5 1 1,33 ++ 58 1 1 2 1,33 ++ 23 2 1 1,5 1,50 ++ 17 1,5 2 1,5 1,67 ++ 30 1 2,5 1,5 1,67 ++ 8 2 2 1,5 1,83 ++ 24 2 1,5 2 1,83 ++ 82 + NaCl 2 2 2 2,00 ++ 36 2 2 2,5 2,17 +++ 80+ NaCl 2,5 2,5 2 2,33 +++ 78 + NaCl 2 3 2 2,33 +++ 83 + NaCl 2 2,5 2,5 2,33 +++ 81 + NaCl 2,5 2 3 2,50 +++ 71 + NaCl 4 1 3 2,67 +++ 2 3,5 1,5 3 2,67 +++ 77+ NaCl 3 2 3 2,67 +++ 6 2,5 3 2,5 2,67 +++ 4 2 3 3 2,67 +++ 35 3 2,5 3 2,83 +++ 7 3 3 3,5 3,17 +++ 41 3 3 4 3,33 +++ Qua kết quả Bảng 4.3, nhận thấy có 39 dòng có vòng kháng khuẩn. Trong đó có 11 dòng thuộc nhóm có tính kháng yếu, chiếm tỷ lệ 28,2%, 11 dòng này có bề rộng vòng kháng trung bình là 0,933 ± 0,086 mm (Bảng 4, Phụ lục C). Bảng 4.4: Bề rộng vòng kháng của các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng yếu Số mẫu Bề rộng vòng kháng khuẩn (mm) 1 0,67 ± 0,086 2 0,83 ± 0,086 3 0,83 ± 0,086 4 0,83 ± 0,086 5 0,83 ± 0,086 6 1,00 ± 0,086 7 1,00 ± 0,086 8 1,00 ± 0,086 9 1,00 ± 0,086 10 1,00 ± 0,086 11 1,00 ± 0,086 Tuy nhiên, xét ở 3 mẫu 9, 12, 40 có 1 trong 3 giếng kiểm tra xuất hiện vòng kháng có bề rộng 2 mm, điều này cho thấy chỉ dựa vào kết quả trung bình bề rộng vòng kháng cũng chưa thật sự chính xác để phân loại tính kháng của dòng. Như đã nói, độ dày của thạch BHI agar trong đĩa ảnh hưởng đến khả năng khuếch tán các chất kháng khuẩn tiết ra từ dịch vi khuẩn lactic trong giếng. Trong thao tác đỗ môi trường sự không đồng đều xảy ra, lượng BHI agar cho vào 2 đĩa còn lại nhiều hơn, làm cho môi trường thạch dày hơn, hạn chế khả năng khuếch tán các chất kháng khuẩn. Như vậy, mẫu 9, 12, 40 có thể xếp vào phân loại dòng lactic có tính kháng trung bình. Hình 4.8: Bề rộng vòng kháng của các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng yếu Chiếm tỷ lệ 38,5% trong 39 dòng LAB, có số lượng nhiều nhất trong các dòng vi khuẩn lactic được kiểm tra tính kháng đối với E. ictaluri là các dòng LAB có tính kháng xếp vào loại trung bình. Các dòng này có bề rộng vòng kháng trung bình là 1,488 ± 0,265 mm (Bảng 5, Phụ lục C). Bảng 4.5: Bề rộng vòng kháng của nhóm vi khuẩn lactic có tính kháng trung bình Số mẫu Bề rộng vòng kháng khuẩn (mm) 1 1,17 ± 0,265 2 1,17 ± 0,265 3 1,17 ± 0,265 4 1,33 ± 0,265 5 1,33 ± 0,265 6 1,33 ± 0,265 7 1,33 ± 0,265 8 1,33 ± 0,265 9 1,33 ± 0,265 10 1,50 ± 0,265 11 1,67 ± 0,265 12 1,67 ± 0,265 13 1,83 ± 0,265 14 1,83 ± 0,265 15 2,00 ± 0,265 Theo Bảng 4.3, trong trường hợp này, độ dày thạch BHI cũng có sự không đồng đều và đây là nguyên nhân của sự khác biệt về bề rộng vòng kháng ở 2 dòng có kí hiệu 51, 30 so với 13 dòng còn lại, 2 mẫu này có 1 trong 3 giếng có bề dày vòng đối kháng đạt 2,5 mm. Vậy có thể xếp 2 mẫu 51, 30 vào các dòng có tính kháng mạnh. Hình 4.9: Biểu đồ thể hiện bề rộng vòng kháng của các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng trung bình Ghi chú: mẫu 79 và mẫu 82 có bổ sung NaCl Có thể nói rằng đa số các mẫu lactic được kiểm tra có tính đối kháng với vi khuẩn E. ictaluri (39 trong 54 dòng vi khuẩn lactic phân lập được, chiếm hơn 72%), điều này thể hiện qua bề rộng vòng kháng khuẩn. Đặc biệt là các mẫu có hoạt tính kháng mạnh với bề rộng vòng kháng trung bình 2,680 ± 0,313 mm (Bảng 6, Phụ lục C), đây là các dòng vi khuẩn lactic tốt cho quá trình sử dụng vi khuẩn lactic ức chế vi khuẩn E. ictaluri. Bảng 4.6: Bề rộng vòng kháng của các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng mạnh Số mẫu Bề rộng vòng kháng khuẩn (mm) 1 2,17 ± 0,313 2 2,33 ± 0,313 3 2,33 ± 0,313 4 2,33 ± 0,313 5 2,5 ± 0,313 6 2,67 ± 0,313 7 2,67 ± 0,313 8 2,67 ± 0,313 9 2,67 ± 0,313 10 2,67 ± 0,313 11 2,83 ± 0,313 12 3,17 ± 0,313 13 3,33 ± 0,313 Đáng chú ý là các dòng (6 trong 8 dòng) có bổ sung 6% NaCl (NaCl làm tăng độ mặn trong môi trường MRS broth, từ đó kích thích sự phát triển của những vi khuẩn lactic thích ứng với môi trường có độ mặn cao, cụ thể là các mẫu mắm thu tại Bạc Liêu) trong môi trường nuôi tăng sinh, hầu hết đều có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn E. ictaluri. Điều này cho thấy độ mặn trong dung dịch có ảnh hưởng đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic. Theo Milton Luiz Pinho Espirito Santo (2005), quá trình lên men cá Mòi tăng nhanh hơn khi thêm 2% NaCl và 2% đường glucose thì nồng độ axit tăng lên 1,21% sau 7 ngày và tăng 2,55% sau 21 ngày. Do khi bổ sung NaCl và đường glucose ở một lượng thích hợp thì kích thích vi khuẩn lactic phát triển mạnh hơn. Hình 4.10: Biểu đồ thể hiện bề rộng vòng kháng các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng mạnh Ghi chú: mẫu 71, 77, 78, 80, 82, 83 có bổ sung NaCl Như vậy, kết quả quá trình kiểm tra tính kháng như sau Bảng 4.7: Kết quả kiểm tra tính kháng của các dòng vi khuẩn lactic với E. ictaluri Phân loại tính kháng Số lượng mẫu (dòng) Tổng số mẫu Không 15 54 Yếu 8 Trung bình 16 Mạnh 15 Kết quả thí nghiệm không khác biệt so với các nghiên cứu trước đây. Năm 2009, Đỗ Quế Mi Hương đã thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 22 chủng LAB được chọn lọc từ các mẫu sản phẩm lên men (sữa chua, nem, dưa cà muối) và chế phẩm chứa các loài vi khuẩn lactic như: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bungaricus, Streptococcus lactic, Bacillus subtillis, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis bằng phương pháp giếng khuếch tán (lỗ thạch đục là 13 mm, thạch BHI dày 3 mm, vi khuẩn chỉ thị E. coli là 105 tb/ml, dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic trong MRS broth sau 24 giờ, ở 37 oC). Kết quả đo bề rộng vòng kháng khuẩn có 6 dòng là 1 mm thuộc tính kháng yếu; 8 dòng là 2,5 – 4 mm thuộc tính kháng trung bình; 4 dòng là 4,5 – 5 mm thuộc tính kháng mạnh và 2 dòng không có tính kháng. Trần Trọng Nguyễn (2010) cũng đã chứng minh được các chủng LAB được phân lập từ hệ tiêu hóa cá Tra có khả năng ức chế vi khuẩn E. ictaluri sau 24 giờ với bề rộng vòng kháng 15,7 – 25,7 mm khi sử dụng phương pháp đục lỗ thạch để kiểm tra tính kháng của các dòng vi khuẩn lactic. Năm 2010, Suthasinee Nilsang đã phân lập được 32 chủng vi khuẩn lactic từ các dạng thực phẩm lên truyền thống (pla-ra, pla-jom, pak-sian dong, hom dong, goong-jom) và chiết xuất sinh học, đồng thời khảo sát khả năng sinh chất kháng khuẩn của chúng bằng phương pháp giếng khuếch tán (theo mô tả của Moangsombat, 2007). Kết quả dương tính ở các chủng mang ký hiệu LAB7 (phân lập từ Bio-extract) và 2 chủng có ký hiệu LAP12, LAG1 (phân lập từ sản phẩm lên men), các chủng này có khả năng ức chế sự tăng trưởng của cả vi khuẩn Gram dương (S. aureus TISTR 146) và gram âm (E. coli TISTR 780) với bề rộng vòng kháng nhỏ nhất là 1 mm sau 24 giờ. Hình 4.11: Kích thước vòng kháng khuẩn đối với E. ictaluri Việc sản xuất nước mắm nhờ vi khuẩn kỵ khí (đặc biệt là vi khuẩn lactic) có trong ruột cá là chủ yếu, chúng sinh ra enzyme protease để phân giải protein của cá (Natteewan Udomsil e al., 2010). Hyroyuki Uchida et al. (2004) đã phân lập thành công dòng vi khuẩn lactic có tên loài Bacillus subtilis CN2 trong nước mắm Việt Nam, chủng vi khuẩn này tiết một lượng lớn enzyme protease kiềm (alkaline protease) khi phát triển trên môi trường trung gian pepton đậu nành . Theo Schroder et al. (1980) chứng minh rằng L. plantarum phân lập từ hệ tiêu hóa cá Pollachius virens, có khả năng sản sinh ra chất ức chế lại Vibrio sp. Nhiều vi khuẩn lactic (L. plantarum, Carnobacterium sp, C. divergens, và Lactococcus lactis) được phân lập từ hệ tiêu hóa của cá, chúng có thể sản sinh ra các hợp chất ức chế chống lại nhiều loài vi khuẩn gây bệnh ở in vivo và in vitro như Aeromonas salmonicida, A. hydrophila, Pasteurella piscida, Edwardsiella tarda, Flavobacterium psychrophilum, Photobacterium damselae subsp. piscicida, Streptococcus milleri, Vibrio anguillarum, V. Ordali (Byun et al., 1997; Gildberg và Mikkelsen, 1998; Joborn et al., 1997; Robertson et al., 2000; Schroder et al., 1980; Villamil et al., 2002; được trích dẫn bởi Trần Trọng Nguyễn). L. platarum 7-40 (NTU102) có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas aeruginosa (trong thực phẩm) ở in vitro (có vòng kháng khuẩn là 7,7 mm) (Pan et al., 2002). Son et al. (2009) đã chứng minh được khả năng đối kháng của L. plantarum 7-40 (NTU102) với các vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản như Streptococcus spp., Aeromonas hydrophila, Lactococcus garvieae, V. alginolyticus. Tóm lại, thông qua phương pháp giếng khuếch tán đã chọn lọc được 39 dòng vi khuẩn lactic có tính kháng tốt với vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra nuôi. CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Trong mắm và nước mắm lên men truyền thống tại Đồng Bằng Sông Cửu Long đều có chứa vi khuẩn lactic. Qua thử nghiệm bằng phương pháp giếng khuếch tán đã tìm được 39 dòng vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn đối kháng với vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra nuôi. 5.2 Đề xuất Tiến hành định danh và khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng lactic trên những đối tượng vi khuẩn gây bệnh khác trên cá, tôm. Thử nghiệm ương cá Tra giống bằng thức ăn có bổ sung vi khuẩn lactic để phòng ngừa bệnh gan thận mủ. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bản tin Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II (RIA2 – NEWSLETER ) số ra ngày 01/2010. Chu Đức Hà (2010). Sơ bộ tìm hiểu vai trò của lactic trong quá trình sản xuất mắm tôm chua. Báo cáo thực tập tốt nghiệp. Khoa Công nghệ Sinh học - Đại học Nông Nghiệp Hà Nội. Đỗ Quế Mi Hương (2009). Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật của vi khuẩn lên men lactic để chọn chủng tiềm năng Probiotic. Đồ án tốt nghiệp – Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. Huỳnh Chí Thanh (2007). Xác định đặc điểm sinh hóa và bước đầu thử nghiệm điều trị bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá Tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn tốt nghiệp - Khoa Thủy sản - Đại học Cần Thơ. ì-sao-xuất-khẩu-cá-tra-2010-không-đạt-kế-hoạch-đặt-ra 14534.html (14/01/2011). (29/01/2011). Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ánh, Nguyễn Thị Giang (2008). Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn thành phố Hà Nội. Tạp chí khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công Nghệ 24 (2008) 221-226 Nguyễn Thị Bích Thùy (2009). Phân lập vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm và dược phẩm mang hoạt tính probiotic. Đồ án tốt nghiệp - Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học -Trường Đại học Kĩ thuật Công nghệ TP. Hồ Chí Minh Trần Trọng Nguyễn (2010). Nghiên cứu phân lập nhóm vi khuẩn Lactic Acid có tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra Pangasianodon hypophthalmus. Đồ án tốt nghiệp - Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học- Trường Đại học Kĩ thuật Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. Võ Thị Thanh Bình, Lê Thanh Hùng (2008). Giải pháp mới cải thiện tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và tình trạng sức khỏe của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) - Khoa Thủy sản - Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh Tiếng Anh Aboagye D. L. (2008). Evaluation of the commercially - available probiotic lymnozyme as an effective control of bacterial infections in channel catfish. Juornal of World Aquaculture Society. P: v – vi. Ahmad Cheikhyoussef, Natascha Cheikhyoussef, Haiqin Chen, Jianxin Zhao, Jian Tang, Hao Zhang and Wei Chen (2010). Bifidin I – A new bacteriocin produced by  Bifidobacterium infantis  BCRC 14602 Purification and partial amino acid sequence. Food Control , Issue 5. pp: 746-753 Andrea Piva and Denis R. Headon (1994). Pediocin A, a bacteriocin produced by Pediococcus pentosaceus FBB61, Microbiology  April 1994. pp: 697-702 Austin B and Austin D .A. (1999) Bacterial Fish pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. Edinburgh, UK: Heriot – Watt University. Batt C. A. (1999). Lactobacillus. Introduction. Encyclopedia of Food Microbiology. Academic Press. pp: 89-97 Benoit V., Mathis R. and Lefebvre G. (1994). Characterization of brevicin 27, a bacteriocin synthetized by Lactobacillus brevis SB27. CURRENT MICROBIOLOGY V28 Number 1, pp: 53-61 Charlotte A. West and Philip J. Warner (1998). Plantacin B, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum NCDO 1193. FEMS Microbiology Letters V49, Issue 2. pp: 163-165 Crumlish M., T. T. Dung, Turnbull J. F., N. T. N Ngoc and Ferguson H. W. (2002). Identification of Ewardsiella ictaluri from diseased fresh water catfish Pangasius hypophthalmus cultured in Mekong delta, Viet Nam. Journal of fish diseases 2002. pp: 733 – 736. Daba H.,  Pandian S.,  Gosselin J. F.,  Simard R E.,  Huang J., and  Lacroix C. (1991). Detection and activity of a bacteriocin produced by Leuconostoc mesenteroides. Appl Environ Microbiol. 57(12). pp: 3450-3455 De Man J. C., Rogosa M., Sharpe M. E. (1960). A medium for the cultivation of Lactobacilli. Journal of Applied Bacteriology, 23, pp: 130-135. Dubernet S., Desmasures N., Gueuguen M. (2002). A PCR - based method for indentification of lactobacilli at the genus level. FEMS Microbiogy Letters 214. pp: 271-275. Dung T., Crumlish M., N. Ngoc, N. Thinh and D. Thy (2004). Investigate the disease caused by the genus Edwardsiella from Tra catfish (Pangasianodon hypophthalmus). Journal of Science, Can Tho University. Ferguson H. W., Turbull J. F., Shinn A. P., Thomson K, Dung T. T and Crumlish M (2001). Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus from the Mekong delta, Viet Nam. Journal of fish diseases 2002. pp: 509 – 513. Fukami K., Funatsu Y., Kawasaki K. and Watabe S. (2004). Improvement of fish- sauce odor by treatment with bacteria isolated from the fish-sauce mush (moromi) made from frigate mackerel. J. Food Sci 2004; 69(2). pp: 45-49. Hawke J. P. (1979). A bacterium associeted with disease of pond culture channel catfish, Ictalurus punctatus. J. Fish. Res. Board Can. 36, pp: 1508-1312. Hiroyuki Uchida, Daisaku Kondo, Satoko Yamashita, Tomoko Tanaka, Lien Ha Tran, Hiroko Nagano and Takayuki Uwajima (2004). Purification and Properties of a Protease Produced by Bacillus Subtilis CN2 Isolated from a Vietnamese Fish Sauce. World juornal of Microbiology and Biotechnology. pp: 579 – 582. Jacobsen C. N., Rosenfeldt Nielsen V., Hayford A. E., Moller P. L., Michaelsen K. F., Perregaard A., Sandstrom B., Tvede M. and  Jakobsen M. (1999). Screening of Probiotic Activities of Forty-Seven Strains of Lactobacillus spp by In Vitro Techniques and Evaluation of the Colonization Ability of Five Selected Strains in Humans. Applied and Environmental Microbiology. pp: 4949-4956 Kelly D. G., Wolters W. R., Jaynes J. M., Newton J. C. (1993). Enhanced disease resistance to enteric septicemia in channel catfish, Ictalurus punctatus, administered lytic peptide. J Applied Aquaculture 1993; 3(1/2). p: 25 Lee J. Y., Kim C. J., and Kunz B. (2006). Identification of lactic acid bacteria isolated from Kimchi and studies on their suitability for application as starter culture in the production of fermented sausages. J. Meat Sci. 72. pp: 437-445. Lonnermark E., Friman V., Lappas G. (2009). Intake of Lactobacillus plantarum reduces certain gastrointestinal symptoms during treatment with antubiotics. J Clin Gastroenterol. Vol 44, Issue 2. pp 106-112 Lopetcharat K., Choi Y. J., Park J. W., and Daeschel M. A. (2001). Fish sauce products and manufacturing : a review. Food. Rev. Int. 17(1): 65-88. Marzluf G. A. (1981). Regulation of nitrogen metabolism and gene expression in fungi. Microbiol Rev. 45. pp 437–461 Miao-xia Z., Xiao-ling L., Xue-gong L., Jian-hang H. (2009). Correlation between Strains of Lactic Acid Bacteria in Fish Sauces and the Major Characteristics of Fish Sauces. College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524025,China. Vol. 25, No. 12. pp. 1408-1411 Milton Luiz Pinho Espirito Santo, Cristiane Lisboa, Fernanda Gonçalves Alves, Daniela Martins, Luiz Henrique Beirao, Ernani Sebastiao Sant Anna and Bernadette Dora Gombossy de Melo Franco (2005). Effect of Different Levels of Sodium Chloride and Glucose on Fermentation of Sardines (Sardinella brasiliensis) by Lactobacillus sakei 2a. Brazilian Archives of Biology and Technology – International Journal. p: 45. Natteewan Udomsil, Sureelak Rodtong, Somboon Tanasupawat and Jirawat Yongsawatdigul. (2010). Proteinase-producing halophilic lactic acid bacteria isolated from fish sauce fermentation and their ability to produce volatile compounds. International journal of Food Microbiology 141. pp: 186-194. Nilsang S.(2010). Bacteriocin Production by Lactic Acid Bacteria Encapsulated in Calcium Alginate Beads. KKU Res J 15 (9) : September 2010. p: 889 Oluwafemi F. and Adetunji A. F. (2011). Antimicrobial activities of lactic acid bacteria isolated from traditionally- fermented maize (ogi) against Candida albicans. Journal of Applied Biosciences 41. pp: 2820-2835 Pan T.-M., Chiu C.-H. and Cuu Y.-K. 2002. Characterization of Lactobacillus isolates from pickled vegetables for use as dietary or pickle adjuncts. Foods Food Ingredients Journal of Japan 206:15-21. Pensom Jumriangrit (2004). Characterization and purification of a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum PMU33 strain from fermented fish products. The degree of master of science (Biochemistry), Faculty of graduate studies, MAHIDOL University. p : 26. Ring E., and F. J. Gatesoupe (1998). Lactic acid bacteria in fish: a review. Aquaculture 160. pp: 177-203. Rolf E. Andersson, Mark A. Daeschel and Hosni M. Hassan (1987). Antibacterial activity of plantaricin SIK-83, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum. Biochimie V70, Issue 3, pp: 381-390 . Sanceda N. G., Suzuki E. and Kurata T. (2003). Quality and sensory acceptance of fish sauce partially substituting sodium chloride or natural salt with potassium chloride during the fermentation process. Int. J. Food Sci. Tech.38. pp: 435-443. Satomi M., Kimura B., Mizoi M., Sato T. and Fujii, T (1992). Tetragenococcus muriaticus sp. nov., a new moderately halophilic lactic acid bacterium isolated from fermented squid liver sauce. Inter. J. System. Bact 1997; 47. pp: 832-836. Schillinger U., Lucke F. K. (1989). Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat. Appl Environ Microbiol.55 (8). pp:1901-6. Sharpe, M. E. Skinner, F.A., Lovelock, D.W., Eds., (1979). Identification of the lactic acid bacteria. In Identification Methods for Microbiologists. Academic Press: London. pp: 246-255. Son V. M., Chang C. C., Wu M.C., Guu Y.K., Chiu C.H., and Cheng W. (2009). Dietary administration of the probiotic, Lactobacillus plantarum, enhanced the growth, innate immune responses, and disease resistance of the grouper Epinephelus coioides. Fish Shellfish Immunol 26. pp: 691-698. Tagg J. R., Dajani A. S., and Wannamaker L. W. (1976). Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Bacteriol. Rev. 40. p: 722 Tan Z., Grisez L., Yu X. L., N. V. Hoang and Bolland A. (2003). Edwardsiella ictaluri isolated from catfish in China and Vietnam. Asian-Pacific Aquaculture 2003, World Aquaculture Society. Bangkok, Thailand. p: 11 Tanasupawat S., Okada S., Komagata K. (1998). Lactic acid bacteria found in fermented fish in Thailand. The Journal of General and Applied Microbiology. V44, No. 3. pp:193-200. Tanasupawat S. (2009). Thai Lactic Acid Bacteria: Diversity and Applications. Associate Professor, Department of Microbiology, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University. p: 2. Thongsanit J., Tanasupawat, S., Keeratipibul, S., and Jitikavanich, S., (2002) Characterization and Identification of Tetragenococcus halophilus and Tetragenococcus muriaticus strains from fish sauce (Nam-pla). Japanese Lactic Acid Bact 2002; 13(1). pp: 46-52. Tucker C. S., Hargreaves J. A., (2004). Biology and cultuer of channel catfish. Developments In Aquaculture and Fisheries Science - 34, p: 7 Welker T. L., Lim C., Aksoy Y. M., Shelby R., Klesius P. H. (2007). Immune Response and Resistance to Stress and Edwardsiella ictaluri Challenge in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Fed Diets Containing Commercial Whole-Cell Yeast or Yeast Subcomponents. Journal of the World Aquaculture Society, Vol 38 (03/2007). p: 24. PHỤ LỤC A BHI_Broth ( Brain Heart Infusion Broth) 1000ml Beef heart infusion 250,0g Calf brain in fusion 200,0g Proteose peptone 10,0g NaCl 5,0g Na2HPO4.12H2O 2,5g Glucose 2,0g pH 7, 4 ± 0, 2; 25 oC MRS_Broth 1000ml Glucose 20,0g Peptone 10,0g Beef extract 8,0g Yeast extract 4,0g CH3COONa 3,0g K2HPO4.3H2O 2,0g Mg2SO4.7H2O 0,2g MnSO4.4H2O 0,05g Triamonium citrate 2,0g Tween 80 1 ml pH 5,7 ± 0,2; 25 oC PHỤ LỤC B * Cách làm đĩa thạch vô trùng Pha môi trường BHIA (0,52g/ ml) Chuẩn bị đĩa petri. Hấp tiệt trùng dụng cụ chứa môi trường và đĩa petri ở 121 oC trong 20 phút. Lau cồn quanh mặt trong của tủ cấy vô trùng. Thắp đèn cồn để tránh nhiễm vi khuẩn vào đĩa môi trường. Đợi khi nhiệt độ bình môi trường nguội đến 60 oC rồi cho vào tủ cấy vô trùng cùng với đĩa petri để chuẩn bị đổ đĩa. Không đổ đĩa khi môi trường nóng hơn 60 oC để tránh hơi nước đọng trên nắp đĩa và mặt thạch. Sát trùng tay bằng cồn 70% trước khi đổ đĩa. Quay tròn bình để trộn đều môi trường, tránh lắc mạnh sinh bọt khí. Thao tác đổ môi trường ra đĩa theo hình sau Hình 1: Cách đỗ môi trường Đổ khoảng 8 ml – 10 ml môi trường vào đĩa pertri. Nếu thấy có bọt khí trên mặt thạch thì dùng que cấy nung đỏ trên ngọn lử đèn cồn châm vỡ bọt khí. Thao tác này cần thực hiện khi thạch còn nóng, chưa đông. Để yên cho thạch đông, tránh làm rung đĩa petri để bề mặt thạch được phẳng, đồng đều. Để cho đĩa thạch đông chắc trong đĩa và nguội đến nhiệt độ phòng. Gói giấy báo, ghi tên môi trường và ngày đổ đĩa bên ngoài rồi cho vào tủ lạnh hoặc có thể dùng ngay để cấy vi khuẩn. * Phương pháp cấy ria trên đĩa thạch vô trùng Chuẩn bị Giống cần cấy. Đĩa thạch Que cấy. Đèn cồn. Vệ sinh bằng cồn 70% khắp mặt bên trong của tủ cấy. Thao tác Rửa tay bằng cồn. Lắc đều ống huyền phù. Hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn đến khi đầu que cấy nóng đỏ, làm nguội que cấy trong không khí khoảng 15 giây. Mở nắp dụng cụ chứa vi khuẩn cần cấy, đưa nhẹ qua ngọn lửa đèn cồn. Cho que cấy vào ống huyền phù tế bào, chạm đầu que cấy vào thành ống để làm nguội tiếp. Nhúng đầu que cấy vào dịch huyền phù. Tay trái hé mở nắp đĩa thạch. Đặt đầu que cấy vào một góc đĩa thạch chấm nhẹ để loại bớt tế bào một lần nữa. Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên mặt thạch theo đường zích zắc dày. Đậy nắp đĩa. Khử trùng đầu que cấy trên đèn cồn và làm nguội đầu que cấy. Hé mở nắp đĩa, đặt đầu que cấy lên phần thạch chưa ria cấy để làm nguội tiếp. Bắt đầu từ một cạnh của đường zích zắc thứ nhất, ria đường zích zắc thứ hai có chiều khác với đường ban đầu. Đậy nắp đĩa lại. Khử trùng que cấy, làm nguội, bắt đầu từ một cạnh của đường zích zắc thứ hai, ria cấy đường zích zắc thứ ba có chiều khác với các đường thứ nhất và thứ hai trên khoảng trống còn lại. Đậy nắp đĩa, khử trùng que cấy trước khi cắm vào giá. Ngoài kiểu ria cấy tạo thành ba đường zích zắc (hay còn gọi là ria cấy ba pha) có thể ria cấy bốn đường zích zắc (bốn pha) để thu nhận các khuẩn lạc sạch. Hình 2: Các cách cấy ria Hình 3: Các thao tác cấy truyền * Phương pháp tráng đĩa (cấy trang hay tán vi sinh trên đĩa thạch) Chuẩn bị Đĩa petri Que cấy thủy tinh đầu tam giác Pipet 20–200 µl, hộp đầu tip Cồn 70% Cốc 100 ml Đèn cồn Máy vortex Thao tác Lấy ống nghiệm đã pha loãng ở nồng độ 10-4 để tiến hành tráng đĩa. Vệ sinh bằng cồn khắp mặt trong của tủ cấy. Cho các dụng cụ trên vào tủ cấy (trừ máy khuấy ống nghiệm). Rửa tay bằng cồn 70%. Lắc kỹ ống nghiệm bằng máy khuấy ống nghiệm trong 1 phút. Mở nút bông (nhựa) đậy ống nghiệm chứa mẫu, hơ nhanh trên ngọn đèn cồn. Dùng micropipet hút 50 ml dung dịch mẫu. Hơ nhanh miệng ống nghiệm trên ngọn đèn cồn, đậy nút lại. Tay trái hé mở nắp đĩa thạch, tay phải cầm micropipet cho vào 50 ml mẫu. Dùng que cấy nhúng vào cồn, hơ trên ngọn đèn cồn, làm nguội trong không khí 15 giây, tiếp tục làm nguội que gạt trên phần thạch không có dung dịch vi khuẩn, khi que cấy đã nguội thì gạt giọt dịch trải đều khắp mặt thạch: tay trái hé mở nắp hộp, ngón út trái xoay nhẹ cho đĩa chuyển động tròn, tay phải liên tục gạt cho tới khi mặt thạch khô ráo. Thay đầu típ và tiếp tục với các ống còn lại Chú ý: Để các tế bào vi sinh vật tách rời nhau và phân bố đều trên mặt thạch, sau khi nhỏ giọt dịch pha loãng cần tiến hành gạt ngay. Nếu để lâu giọt dịch sẽ bị khô, các tế bào gắn chặt vào mặt thạch, việc gạt dàn đều chúng sẽ rất khó khăn, dẫn đến kết quả sai lệch. Các đĩa thạch đã được tráng sẽ được dán parafilm và cho vào tủ ấm ở 30 oC trong vòng 48 giờ. * Phương pháp pha loãng Chuẩn bị Ống nghiệm chứa mẫu cần pha loãng Ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý đã hấp tiệt trùng Máy khuấy ống nghiệm. Đèn cồn Micropiet, Hộp đầu tip đã hấp tiệt trùng, Bút Tiến hành: Vệ sinh bằng cồn khắp mặt trong của tủ cấy. Cho các dụng cụ trên vào bên trong tủ cấy. Rửa tay bằng cồn. Lắc đều bình chứa mẫu cần pha loãng bằng máy khuấy ống nghiệm trong 1 phút. Mở nút bông bình chứa mẫu, hơ nhanh miệng bình pha loãng trên ngọn đèn cồn. Dùng micropipet hút 1 ml Mở nút bông ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý, hơ nhanh miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn. Cho 1 ml mẫu vào. Hơ nhanh miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn, đậy nhanh nút bông lại. Sơ đồ pha loãng Hình 4: Cách pha loãng Hình 5: cách cấy mẫu vào môi trường *Phương pháp đếm khuẩn lạc Các đĩa thạch sau khi được tráng vi khuẩn và giữ trong tủ ấm ở 30oC sau 48 giờ được đem ra đếm. Cách đếm: dùng bút chia khuẩn lạc thành hai phần, hoặc bốn phần bằng nhau. Đếm số khuẩn lạc có trong từng phần đó cộng lại. Chú ý không bỏ sót khuẩn lạc bé hoặc khuẩn lạc mọc ở những chỗ khuất cũng như khuẩn lạc dính vào nhau. Trong quá trình đếm khuẩn lạc cũng cần ghi lại hình dạng của các chủng vi khuẩn. Có thể cùng một chủng vi khuẩn nhưng trong các môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ cho hình dạng khuẩn lạc khác nhau * Phương pháp thử catalase Có thể thực hiện thử nghiệm catalase bằng một trong những phương pháp sau Thử trên lam kính: dùng kim cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt trên một lam kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối vi sinh vật trên lame kính. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có. Mặt khác có thể thử bằng cách chuyển một ít sinh khối của khuẩn lạc lên lame kính, nhỏ một giọt H2O2 3% rồi đậy lại bằng một lamelle. Ghi nhận nếu có sự xuất hiện của bọt khí bị giữ lại giữa lame kính và lamelle. Kết quả dương tính (chủng có hệ thống enzyme catalase): sủi bọt Kết quả âm tính: không sủi bọt * Phương pháp nhuộm gram vi khuẩn và mô tả hình thái Nhuộm Gram Mục đích: giúp ta phân biệt vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: vi khuẩn G+ (gram dương) bắt màu tím và vi khuẩn G- (gram âm) bắt màu hồng. Ngoài ra nó còn giúp ta quan sát rõ và phân biệt về hình dạng, cấu tạo, cách phân bố của các loại vi khuẩn khác nhau. Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến Chuẩnbị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Soi kính: dùng vật kính dầu 100x. Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, gram (-) bắt màu đỏ. PHỤ LỤC C KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Bảng 1: Kết quả thu nhận huyền phù vi khuẩn STT Mẫu Môi trường Kết quả Có (+) hoặc không (-) Địa điểm thu mẫu 1 Cá Linh Nước Cất + Châu Đốc- An Giang 2 Cá Linh MRS Broth + 3 Cá Linh Muối sinh lý + 4 Cá Sặc Nước cất + 5 Cá Sặc MRS Broth + 6 Cá Sặc Muối sinh lý + 7 Cá Chốt Nước cất + 8 Cá Chốt MRS Broth + 9 Cá Chốt Muối sinh lý – 10 Cá Lóc Nước cất + 11 Cá Lóc MRS Broth + 12 Cá Lóc Muối Sinh lý – 13 Cá Rô đồng lớn Nước cất + 14 Cá Rô đồng lớn MRS Broth + 15 Cá Rô đồng lớn Muối sinh lý + 16 Cá Rô đồng nhỏ Nước cất + 17 Cá Rô đồng nhỏ MRS Broth + 18 Cá Rô đồng nhỏ Muối sinh lý + 19 Cá Trèn Nước cất + 20 Cá Trèn MRS Broth + 21 Cá Trèn Muối sinh lý + 22 Rô Phi Nước cất + 23 Rô Phi MRS Broth + 24 Rô Phi Muối sinh lý + 25 Mè Vinh Nước cất – 26 Mè Vinh MRS Broth + 27 Mè Vinh Muối sinh lý + 28 Cá Sặc Nước cất + Cần Thơ 29 Cá Sặc MRS Broth + 30 Cá Sặc Muổi sinh lý + 31 Tép Nước cất + 32 Tép MRS Broth + 33 Tép Muối sinh lý + 34 Nước mắm Quốc Hải Nước cất – 35 Nước mắm Quốc Hải MRS Broth + 36 Nước mắm Quốc Hải Muối sinh lý + 37 Nước mắm Hồng Đài Nước cất – 38 Nước mắm Hồng Đài MRS Broth + 39 Nước mắm Hồng Đài Muối sinh lý + 40 Nước mắm KABIN Nước cất + 41 Nước mắm KABIN MRS Broth + 42 Nước mắm KABIN Muối sinh lý – 43 Nước mắm Nam Ngư Nước cất + 44 Nước mắm Nam Ngư MRS Broth + 45 Nước mắm Nam Ngư Muối sinh lý + 46 Nước mắm Thanh Liêm Nước cất + 47 Nước mắm Thanh Liêm MRS Broth + 48 Nước mắm Thanh Liêm Muối sinh lý + 49 Ruốc Trí Hải Nước cất + 50 Ruốc Trí Hải MRS Broth + 51 Ruốc Trí Hải Muối sinh lý + 52 Ruốc Gò Công Nước cất + Tiền Giang 53 Ruốc Gò Công MRS Broth + 54 Ruốc Gò Công Muối sinh lý + 55 Cá Sặc 1 Nước cất + Bạc Liêu 56 Cá Sặc 1 Muối sinh lý + 57 Cá Sặc 1 MRS Broth + 58 Ruốc Nước cất + 59 Ruốc MRS Broth + 60 Ruốc Muối sinh lý + 61 Cá Lóc Nước cất + 62 Cá Lóc MRS Broth + 63 Cá Lóc Muối sinh lý + 64 Cá Trèn Nước cất – 65 Cá Trèn MRS Broth + 66 Cá Trèn Muối sinh lý – 67 Cá Sặc 2 Nước cất + 68 Cá Sặc 2 MRS Broth + 69 Cá Sặc 2 Muối sinh lý + 70 Ba khía Nước cất + 71 Ba khía MRS Broth + 72 Ba khía Muối sinh lý + 73 Cá Cơm Nước cất – 74 Cá Cơm MRS Broth + 75 Cá Cơm Muối sinh lý – 76 Cá biển 1 Nước cất + 77 Cá biển 1 MRS Broth + 78 Cá biển 1 Muối sinh lý + 79 Cá biển 2 Nước cất + 80 Cá biển 2 MRS Broth + 81 Cá biển 2 Muối sinh lý + 82 Cá Đối + Cơm Nước cất + 83 Cá Đối + Cơm MRS Broth + 84 Cá Đối + Cơm Muối sinh lý + 85 Cá Rô Nước cất + 86 Cá Rô MRS Broth + 87 Cá Rô Muối sinh lý + 88 Cá Sặc Nước cất + Sóc Trăng 89 Cá Sặc MRS Broth + 90 Cá Sặc Muối sinh lý + 91 Prohoc 1 Nước cất – 92 Prohoc 1 MRS Broth + 93 Prohoc 1 Muối sinh lý + 94 Prohoc 2 Nước cất + 95 Prohoc 2 MRS Broth + 96 Prohoc 2 Muối sinh lý + Bảng 2: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn sinh axít lactic STT Mẫu mắm Ký hiệu Môi trường 1 Cá Linh 1 MRS Broth 2 Cá Sặc 2 MRS Broth 3 Cá Chốt 3 Nước cất 4 Cá Lóc 4 Nước cất 5 Cá Lóc 5 MRS Broth 6 Cá Linh 6 Muối sinh lý 7 Cá Rô đồng lớn 77 Nước cất 8 Cá Rô đồng lớn 80 MRS Broth 9 Cá Chốt 8 MRS Broth 10 Cá Rô đồng nhỏ 10 MRS Broth 11 Cá Trèn 11 MRS Broth 12 Cá Rô đồng nhỏ 19 Nước cất 13 Cá Sặc 21 Nước cất 14 Rô Phi 60 Nước cất 15 Cá Trèn 23 Nước cất 16 Cá Sặc 9 Muổi sinh lý 17 Tép 12 Muối sinh lý 18 Nước mắm Quốc Hải 13 MRS Broth 19 Nước mắm KABIN 15 MRS Broth 20 Nước mắm Nam Ngư 16 Nước cất 21 Nước mắm Thanh Liêm 17 Muối sinh lý 22 Nước mắm Hồng Đài 20 Muối sinh lý 23 Tép 22 MRS Broth 24 Ruốc Trí Hải 26 Nước cất 25 Tép 28 Nước cất 26 Nước mắm Quốc Hải 30 Muối sinh lý 27 Nước mắm Thanh Liêm 31 Nước cất 28 Ruốc Gò Công (Mắm Bà Hai) 24 Muối sinh lý 29 Ruốc Gò Công (Mắm Bà Hai) 29 Nước cất 30 Ruốc Gò Công (Mắm Bà Hai) 7 MRS Broth 31 Cá Sặc 1 34 MRS Broth 32 Ruốc 35 Nước cất 33 Cá Lóc 36 Nước cất 34 Cá Sặc 2 38 Nước cất 35 Cá Sặc 1 39 Nước cất 36 Ruốc 40 MRS Broth 37 Cá Lóc 43 Muối sinh lý 38 Cá Sặc 2 44 MRS Broth 39 Cá Sặc 2 48 Muối sinh lý 40 Ba khía 51 Nước cất 41 Cá biển 1 57 Muối sinh lý 42 Cá biển 1 58 MRS Broth 43 Cá Lóc 63 MRS Broth 44 Cá biển 2 66 MRS Broth 45 Cá Đối + Cơm 68 Nước cất 46 Cá biển 2 71 Muối sinh lý 47 Cá Rô 78 MRS Broth 48 Cá Đối + Cơm 79 Muối sinh lý 49 Cá Rô 81 Nước cất 50 Cá Đối + Cơm 82 MRS Broth 51 Cá Rô 83 Muối sinh lý 52 Cá Sặc 41 MRS Broth 53 Cá Sặc 45 Muối sinh lý 54 Prohoc 2 56 MRS Broth Bảng 3: Kết quả nhuộm gram và mô tả hình thái vi khuẩn lactic Ký hiệu mẫu Hình Nhuộm gram Kiểu tế bào Cách sắp xếp tế bào 66, 13, 15, 30, 57 + Hình cầu Đôi, chuỗi 1, 20, 31 + Hình cầu chùm 34, 4, 11, 51, 10, 19, 26 + Hình que rất ngắn Đơn 71, 43, 35 + Hình que ngắn Đơn, đôi 2, 21, 80, 6, 36, 45, 60, 38, 39, 63, 68, 28, 12, 40, 5, 56 + Hình que ngắn Đơn,đôi 7, 41, 29, 78, 24, 3, 83, 77, 81, 17, 79, 58, 8, 23 + Hình que ngắn Đơn 9, 16 , 44, 48, 22, 82 + Hình que dài Đơn Ewardsiella ictaluri _ Hình que Đơn Bảng 4: Tổng hợp kết quả kiểm tra tính kháng của các dòng vi khuẩn lactic với vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp giếng khuếch tán Bề dày vòng kháng mẫu 81, 82, 78, 71, 28, 77 31, 44, 83, 34, 7, 35 6, 8, 66, 40, 58, 23 41, 15, 48, 57, 38, 16 80, 39, 79, 11, (Lặp lại 6, 8, 77, 28, 81, 82, 78, 38, 58) 4, 24, (Lặp lại: 15, 16, 57, 68, 56) 13, 36, 20, 43, 17, 30 2, 5, 51, 12, 9, 21 3, 19, 68, 56, 26, 10 Mẫu 60, 1, 22, 45, 29, 63 Bảng 4: Kết quả xử lý giá trị bề rộng vòng kháng khuẩn của nhóm vi khuẩn lactic có tính kháng yếu Mean 0.933333333 Standard Error 0.027216553 Median 1 Mode 1 Standard Deviation 0.086066297 Sample Variance 0.007407407 Kurtosis -2.276785714 Skewness -0.484122918 Range 0.166666667 Minimum 0.833333333 Maximum 1 Sum 9.333333333 Count 10 Confidence Level(95.0%) 0.06156812 Bảng 5: Kết quả xử lý giá trị bề rộng vòng kháng khuẩn của nhóm vi khuẩn lactic có tính kháng trung bình Mean 1.488095238 Standard Error 0.070892371 Median 1.333333333 Mode 1.333333333 Standard Deviation 0.265254963 Sample Variance 0.070360195 Kurtosis -0.777987715 Skewness 0.669215202 Range 0.833333333 Minimum 1.166666667 Maximum 2 Sum 20.83333333 Count 14 Confidence Level(95.0%) 0.153153656 Bảng 6: Kết quả xử lý giá trị bề rộng vòng kháng khuẩn của nhóm vi khuẩn lactic có tính kháng mạnh Mean 2.680555556 Standard Error 0.090496045 Median 2.666666667 Mode 2.666666667 Standard Deviation 0.313487497 Sample Variance 0.098274411 Kurtosis 0.5780209 Skewness 0.938760862 Range 1 Minimum 2.333333333 Maximum 3.333333333 Sum 32.16666667 Count 12 Confidence Level(95.0%) 0.199180453