Tóm tắt Luận án Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa của cây hoa Mõm chó (torenia fournieri l.) nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN QUÁ TRÌNH RA HOA CỦA CÂY HOA MÕM CHÓ (Torenia fournieri L.) NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 9 42 01 12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC TP. HCM – 2020 Công trình được hoàn thành tại: Viện Sinh học Nhiệt đới và Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Dương Tấn Nhựt TS. Nguyễn Hữu Hổ Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ .., ngày tháng năm 202 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Torenia fournieri được sự quan tâm của các nhà khoa học bằng vẻ đẹp giản dị, dễ dàng chăm sóc và có thể được trồng với nhiều mục đích khác nhau như trồng trong chậu, ven đường đi, trong nhà, ngoài trời, trồng ở nơi có khí hậu nóng, ôn hoà hay lạnh. Ngoài giá trị trang trí, T. fournieri với vòng đời ngắn, đáp ứng nhanh với sự thay đổi của môi trường nuôi cấy, là một loại cây mô hình thí nghiệm hữu ích cho các nhà nghiên cứu, đặc biệt thích hợp cho việc nghiên cứu các hiện tượng sinh lý cơ bản. T. fournieri cũng được sử dụng làm nguồn vật liệu cho các nghiên cứu in vitro như chuyển gene, tạo biến dị dòng soma, nhân giống vô tính, tạo hoa in vitro Mặc dù, đã có một số nghiên cứu về sự ra hoa in vitro của cây T. fournieri, việc làm sáng tỏ thêm mối quan hệ giữa sự ra hoa và các tác động của chất điều hòa sinh trưởng thực vật, nguồn carbon, môi trường dinh dưỡng khoáng và một số yếu tố khác như polyamine, acid amin vẫn là cần thiết để làm sáng tỏ các cơ chế phức tạp của quá trình ra hoa ở loài cây này. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cùng với kỹ thuật sinh học phân tử đã góp phần cung cấp thêm những kiến thức về quá trình ra hoa ở thực vật. Cho đến nay, bên cạnh cây A. thaliana, một loại cây mô hình đã được sử dụng nhiều cho việc nghiên cứu ra hoa, cây T. fournieri cũng đã được sử dụng làm nguồn vật liệu để nghiên cứu về quá trình ra hoa in vitro. Trong nghiên cứu về sự ra hoa ở thực vật, điều kiện nuôi cấy in vitro là điều kiện lý tưởng để thực hiện những nghiên cứu sâu hơn về quá trình này. Trong điều kiện in vitro, các nhà khoa học có thể chủ động điều chỉnh một số yếu tố như cường độ ánh sáng, quang kỳ, nhiệt độ, đường, chất khoáng, chất điều hòa sinh trưởng thực vật... tùy theo từng mục đích nghiên cứu. Những thay đổi trong thành phần môi trường, chất điều 2 hòa sinh trưởng thực vật hoặc thay đổi cụ thể trong từng điều kiện nuôi cấy có thể đẩy nhanh tốc độ sinh trưởng, rút ngắn giai đoạn sinh trưởng và dẫn đến sự ra hoa sớm. Với kỹ thuật này, các nhà khoa học đang hướng tới việc nghiên cứu sâu hơn các hiện tượng sinh lý của quá trình ra hoa. Đây chính là bước tiến quan trọng trên con đường chinh phục thiên nhiên của con người. Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa của cây hoa Mõm chó (Torenia fournieri L.) nuôi cấy in vitro” đã được tiến hành thực hiện. 2. Mục tiêu của đề tài Mục tiêu của đề tài là xác định được vai trò của một số yếu tố như ánh sáng, loại và nồng độ đường, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, môi trường khoáng, acid amin và polyamine đối với sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro. 3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1. Nghiên cứu vai trò của một số yếu tố đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro Nội dung 2: Quan sát hình thái, cấu trúc mô phân sinh và hoạt động biến dưỡng của cây T. fournieri in vitro trong quá trình ra hoa CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây Torenia fournieri (T. fournieri) Đặc điểm thực vật học Phân loại v Giới: Plantae (Thực vật) v Ngành: Magnoliophyta (ngành Ngọc Lan) v Lớp: Magnoliopsida (Lớp Ngọc Lan) v Bộ: Lamiales (Hoa môi) 3 v Họ: Scrophulariaceae (Huyền sâm hay Mõm chó) v Chi: Torenia v Loài: Torenia fournieri L. Hình dạng ngoài của T. fournieri được mô tả như sau: v Thân: màu xanh, cao từ 15-35 cm, thường mọc thẳng, một số loài mới có dạng thân bò. v Lá: màu xanh bóng, có thể dài đến 5 cm, có dạng đơn giản, hình trứng (trái xoan), bờ lá có răng cưa, sắp xếp theo kiểu đối xứng vòng. v Hoa: rất đa dạng về màu sắc và hình dạng. Các màu truyền thống gồm: tía, tím, xanh; các màu mới có thể kể là: trắng, đỏ, hồng, màu kép, vàng. Hoa thường có cấu tạo bốn cánh (đôi khi có nhiều hơn) với hai môi. Môi trên: lớn nhất trong các cánh, bị che khuất một phần, thường có dạng xoăn hoặc gấp nếp. Môi dưới: nhỏ hơn, thùy tròn, thường có một chấm vàng đặc trưng. Tuy nhiên, ở một vài loài mới, chấm này có thể bị mất đi, toàn bộ bông hoa chỉ có một màu. Torenia fournieri thuộc nhóm thực vật 2 lá mầm, thân thảo lâu năm nhưng hầu hết được trồng như cây một năm. T. fournieri là cây lưỡng bội (n = 9). Cây tứ bội thể (n = 18) có thể được tạo ra bằng cách xử lý colchicine của cây con và có hoa tương đối lớn mang lại tiềm năng phát triển các giống thương mại. Tuy nhiên, các cây tứ bội này, khả năng sống sót của phấn hoa giảm đáng kể, sự hình thành hạt và sự phân bố nhiễm sắc thể không đồng đều ở giai đoạn phân chia tế bào (anaphase) khi so sánh với các cây bố mẹ lưỡng bộ. T. fournieri là loài hoa được ưa thích vì màu sắc đa dạng, dễ chăm sóc và thích hợp cho nhiều mục đích như trồng trong chậu, làm cảnh, làm hàng rào hay đơn giản trồng để che phủ mặt đất. Ngoài giá trị trang trí, T. fournieri còn là một loại cây mô hình thí nghiệm hữu ích cho các nhà tế bào học nghiên cứu lai tạo vì dễ thực hiện do tính chất nhô ra của 4 túi phôi. T. fournieri cũng được sử dụng để nghiên cứu vị trí và sự di chuyển của nhiễm sắc thể và tâm động ở giai đoạn đầu của quá trình tạo phôi trong các cây lai. 1.2. Các con đường ra hoa ở thực vật Các cơ chế tiến hoá ở thực vật diễn ra một cách chặt chẽ để đảm bảo sự ra hoa phải xảy ra vào thời điểm tối ưu giúp cho quá trình sinh sản thành công. Sự phối hợp của những cơ chế điều hoà này cần sự thống nhất của rất nhiều yếu tố từ môi trường cùng với những yếu tố nội sinh để quá trình chuyển tiếp ra hoa diễn ra vào đúng thời điểm Trên thực tế, có ít nhất 4 con đường ra hoa ở thực vật bao gồm quang kỳ, con đường năng lượng, chất điều hòa sinh trưởng và con đường tự chủ ra hoa được nghiên cứu từ cây mô hình cây A. thaliana. Tuy nhiên, không phải tất cả thực vật có hoa đều ra hoa theo đúng bốn con đường cơ bản này. Tuỳ theo từng loài, từng điều kiện sống nhất định thực vật sẽ có những yếu tố kích thích khác nhau phù hợp cho quá trình sinh sản. 1.3. Những thành tựu nghiên cứu trong và ngoài nước về ra hoa in vitro và cây Torenia 1.3.1. Một số nghiên cứu trong nước Chất điều hoà sinh trưởng thực vật vẫn luôn giữ vai trò quan trọng đối với thực vật và sự điều khiển ra hoa bởi các chất điều hòa sinh trưởng này được nghiên cứu khá rộng rãi. Lê Hồng Thuỷ Tiên (2006) nghiên cứu về sự ra hoa in vitro của cây dừa cạn (Catharanthus roseus) và cây dã yên thảo (Petunia hybrida), sự ra hoa thành công khi môi trường MS bổ sung 0,05 mg/l TDZ và 0,1 mg/l NAA. Tổ hợp cytokinin và auxin đã được sử dụng nhiều nhất để cảm ứng ra hoa là BA và NAA (có thể là IAA, IBA) ở các cây tím phi (Saintpaulia ionantha Wendl), cây mào gà (Celosia cristala), hoa hồng mini (Rosa hybrida). Bên cạnh đó, GA3 cũng đã được sử dụng và cảm ứng ra hoa in vitro thành công ở 5 cây lan sò (Dischidia pectinoides Pearson). Ngoài tác động cảm ứng ra hoa, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật còn đóng vai trò hỗ trợ cho sự phát triển hoa hoàn chỉnh hoặc rút ngắn thời gian ra hoa. Ở cây mào gà (Celosia cristala), PBZ ở nồng độ 2,0 mg/l làm tăng tỷ lệ ra hoa và cảm ứng sự ra hoa sớm, thời gian là 30 ngày thay vì 50 ngày sau nuôi cấy. Kinetin với nồng độ 1,0 mg/l thúc đẩy hình thành thêm các phác hoa nhỏ, trong khi nồng độ thấp hơn xuất hiện nhiều lá bắc, làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của các hoa này. Đối với hoa hướng dương (Helianthus annuus), môi trường bổ sung 50 g/l sucrose kết hợp 1,0 mg/l IBA giúp các bộ phận hoa phát triển hoàn chỉnh. 1.3.2. Một số nghiên cứu ngoài nước Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về sự ra hoa in vitro trên các loài lan thuộc chi Dendrobium như ở loài D. madame, D. chao-praya-smile và D. candididum. Ở các loài lan khác như C. goeringii và C. hybridium, sự ra hoa trong ống nghiệm cũng đã được ghi nhận trong nghiên cứu của Li-Ming và Ji-Liang (2006). Cảm ứng ra hoa in vitro bằng cách sử dụng cytokinin và gibberellin đã được nghiên cứu ở cây Pharbitis nil, cây Passiflora suberosa và cây Lilium longiflorum. Một số nỗ lực thành công trong việc tạo ra hoa hồng in vitro đã được báo cáo. Năm 2013, Zeng và đồng tác giả đã nghiên cứu thành công sự ra hoa in vitro ở cây hoa hồng mini (Rosa hybrida cv. Fairy Dance). Sự ra hoa trong ống nghiệm cũng đã được nghiên cứu khi nuôi cấy phôi soma ở một số cây như cây B. vulgaris và cây D. giganteus. John và Nadgauda (1997) đã tạo được hoa in vitro ở cây Bambusa vulgaris var. vittata và cây B. arundinacea. Một số loài tre khác đã được dùng làm nguồn vật liệu để nghiên cứu ra hoa như cây B. edulis, cây D. hookeri và cây D. latiflorus. 6 Những nỗ lực nghiên cứu sự ra hoa in vitro thành công đã được thực hiện trên một số cây dược liệu. Seidlova và đồng tác giả (1981) nghiên cứu ảnh hưởng của ABA đối với sự ra hoa trong cây ngày ngắn Chenopodium rubrum. Ở cây nhân sâm (Panax ginseng), Tang (2000) đã nghiên cứu ra sự ra hoa trong ống nghiệm từ nuôi cấy phôi. Những thay đổi của hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh trong quá trình phân biệt chồi hoa và chồi sinh dưỡng trong nuôi cấy lớp mỏng tế bào của cây Cichorium intybus đã được nghiên cứu bởi Ying-zhang và Bi-wen (1996). Sự ra hoa trong ống nghiệm đã được nghiên cứu ở các cây thuốc có giá trị như cây Solanum nigrum, cây Centaurium pulchellum và cây Chamomilla recutita, Vadawale và đồng tác giả (2006) đã nghiên cứu thành công sự ra hoa ở cây ngũ chảo (Vitex negundo) in vitro. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Cây hoa T. fournieri, giống hoa màu tím trắng được sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu. Lá của cây hoa T. fournieri ex vitro được khử trùng sơ bộ bề mặt với xà phòng loãng và đặt dưới vòi nước chảy trong 30 phút. Chuyển mẫu vào trong tủ cấy, lắc mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1% với 1-2 giọt tween 20 trong thời gian 5 phút. Sau đó, mẫu được rửa lại bằng nước cất đã khử trùng 3 lần rồi cấy vào môi trường Murashige và Skoog (MS) bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và 0,5 mg/l BA để tái sinh chồi. Sau đó, các mẫu chồi này được cấy chuyền sang môi trường MS để tạo mẫu chồi khỏe mạnh và đồng nhất, những chồi đạt chiều cao 2,0 cm được sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm. 7 2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.2.1. Nội dung 1: Nghiên cứu vai trò của một số yếu tố đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.1.1. Thí nghiệm 1.1: Nghiên cứu vai trò của ánh sáng đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.1.2. Thí nghiệm 1.2: Nghiên cứu vai trò của đường đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.1.3. Thí nghiệm 1.3: Nghiên cứu vai trò của chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại sinh đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.1.4. Thí nghiệm 1.4: Nghiên cứu vai trò của môi trường khoáng đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.1.5. Thí nghiệm 1.5: Nghiên cứu vai trò của acid amin (L-tyrosine, arginine và proline) đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.1.6. Thí nghiệm 1.6: Nghiên cứu vai trò của polyamine (spermidine, spermine, putrescine) đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.2. Nội dung 2: Quan sát hình thái, cấu trúc mô phân sinh và hoạt động biến dưỡng của cây T. fournieri in vitro trong quá trình ra hoa. 2.3. Điều kiện nuôi cấy Các thí nghiệm nuôi cấy được đặt trong điều kiện chiếu sáng với thời gian chiếu sáng là 10 giờ/ngày, cường độ ánh sáng là 45 ± 2 µmol m-2 s-1, nhiệt độ: 25 ± 2°C, độ ẩm trung bình: 60 ± 5%. 2.4. Phương pháp nghiên cứu • Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật • Phương pháp giải phẫu hình thái mô phân sinh • Phương pháp đo hàm lượng chlorophyll ở thực vật • Phương pháp đo hàm lượng đường tổng số ở thực vật • Phương pháp đo cường độ quang hợp và hô hấp ở thực vật • Phương pháp đo diện tích lá 8 • Phương pháp thu thập, thống kê và xử lý số liệu CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung 1. Ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 3.1.1. Vai trò của ánh sáng đến sự ra hoa ở cây T. fournieri in vitro Một trong những con đường quan trọng trong sự cảm ứng ra hoa ở thực vật là con đường ánh sáng. Chất lượng, cường độ và thời gian chiếu sáng của ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển thực vật. Nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và đồng tác giả (2013) trên cây T. fournieri cho thấy cây T. fournieri khi được nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng với cường độ là 45 µmol m-2 s-1 và thời gian chiếu sáng là 10 giờ/ngày, sau 60 ngày nuôi cấy, cây có thân to cứng cáp, lá xanh và tỷ lệ ra hoa cao (70,06%). Kế thừa những nghiên cứu trước đó, trong nghiên cứu này chất lượng hay bước sóng của ánh sáng được khảo sát nhằm xác định vai trò của bước sóng ánh sáng lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro. Chất lượng ánh sáng khác nhau ảnh hưởng khác nhau đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro. Sau 40 ngày nuôi cấy, kết quả ở bảng 3.1 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức sử dụng đèn LED và nghiệm thức sử dụng đèn huỳnh quang. Tỷ lệ ra hoa của cây T. fournieri in vitro cao nhất ở 50% LED đỏ kết hợp với 50% LED xanh và tỷ lệ ra hoa là 19,59% với số nụ hoa/chồi là 0,33. Khi tăng tỷ lệ ánh sáng LED đỏ lên 60% thì tỷ lệ ra hoa giảm còn 13,34%. Khi tỷ lệ ánh sáng LED đỏ vượt qua tỷ lệ này thì sự ra hoa bắt đầu giảm mạnh. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Dewir và đồng tác giả (2006) trên cây Euphorbia millii, sự ra hoa trong ống nghiệm giảm khi tỷ lệ đèn LED đỏ tăng. 9 Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển của cây T. fournieri in vitro ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau sau 40 ngày nuôi cấy. Nghiệm thức Tỷ lệ chồi ra hoa (%) Số nụ hoa/chồi Chiều cao chồi (cm) Diện tích lá (cm2) HQ 0,00d 0,00 6,60a 1,33a Xanh 0,00d 0,00 5,00b 0,94bc Đỏ 0,00d 0,00 5,90ab 0,72c 5Đ:5X 19,59a 0,33 6,66a 1,31a 6Đ:4X 13,34b 0,13 6,32a 0,90bc 7Đ:3X 0,59c 0,06 6,33a 0,79c 8Đ:2X 0,61c 0,06 5,77ab 0,76c 9Đ:1X 0,00d 0,00 5,84ab 0,69c P * ns * * Trong cùng một cột, những số có chữ cái theo sau khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (*); ns: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê; Đỏ: 100% LED đỏ; Xanh: 100% LED xanh; 9Đ:1X: 90% LED đỏ + 10% LED xanh; 8Đ:2X: 80% LED đỏ + 20% LED xanh; 7Đ:3X: 70% LED đỏ + 30% LED xanh; 5Đ:5X: 50% LED đỏ + 50% LED xanh; HQ: Ánh sáng đèn huỳnh quang (Philip, 36W, 1,2 m). Kết quả nghiên cứu của Heo và đồng tác giả (2006) cũng cho thấy tỷ lệ ra hoa cùng với số lượng nụ hoa của cây nho nhiều hơn khi sử dụng đèn LED đỏ kết hợp với đèn LED xanh và cao hơn so với các điều kiện chiếu sáng chỉ sử dụng đèn LED ở một loại bước sóng đơn lẻ (xanh hoặc đỏ). Kết quả của nghiên cứu trên cây T. fournieri in vitro cũng tương tự với nghiên cứu của Heo và đồng tác giả (2006). Các chồi được đặt dưới điều kiện chiếu sáng là 100% LED đỏ hay 100% LED xanh thì hầu như không có sự cảm ứng ra hoa. Sự cảm ứng ra hoa ở cây T. fournieri chỉ xảy ra khi nhận được tín hiệu thích hợp của ánh sáng LED xanh kết hợp với ánh sáng LED đỏ. Điều này có thể được giải thích rằng ánh sáng LED đỏ kích thích sự hoạt động của phytochrome, ánh sáng LED xanh kích thích cho sự hoạt động của cryptochrome; sự kết hợp ánh sáng LED xanh và ánh sáng LED đỏ tạo một tỷ lệ thích hợp để kích thích sự biểu hiện của gene liên quan đến cảm ứng ra hoa như gene flc, 10 một trong những loại gene mã hóa protein MADs-box. Từ đó, sự hoạt động của flc sẽ thúc đẩy chuỗi hoạt động ra hoa sau này bao gồm kích thích sự hoạt động của tổ hợp gene xác định thời điểm ra hoa như ft, soc1 và lfy và kích thích sự hoạt động của mô phân sinh phác thể hoa, sau cùng là dẫn đến sự ra hoa. 3.1.2. Vai trò của loại và nồng độ đường đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro Khi so sánh kết quả tác động của các loại đường với nồng độ khác nhau lên tỷ lệ ra hoa, kết quả cho thấy các cây T. fournieri được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung fructose với nồng độ 50 g/l cho tỷ lệ ra hoa tốt nhất (53,14%), kế tiếp là glucose ở nồng độ 50 g/l (tỷ lệ ra hoa là 51,48%) (Hình 3.1). Tuy nhiên, trong thí nghiệm sử dụng fructose, số lượng cây bị vàng, hóa nâu và chết, tỷ lệ mẫu cây chết tương đối cao hơn so với thí nghiệm ở các loại đường khác. Vì vậy, glucose với nồng độ 50 g/l phù hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển, đặc biệt là cảm ứng ra hoa ở cây T. fournieri in vitro. Đối với cây T. fournieri in vitro, 2 loại đường đơn như fructose và glucose tác động lên sự ra hoa hiệu quả hơn 2 loại đường đôi như sucorse và maltose. Kết quả của nghiên cứu này cũng tương đồng với nghiên cứu của Taylor và đồng tác giả (2007). Nghiên cứu của Taylor và đồng tác giả (2007) cũng đã chứng minh tỷ lệ ra hoa của cây K. leucocephala tăng lên khi các chồi được nuôi trên môi trường bổ sung các loại đường đơn, điều này được giải thích là do sự tác động của loại đường này đối với sự phân chia tế bào tại mô phân sinh chồi đỉnh, vấn đề này rất quan trọng đối với sự cảm ứng ra hoa ở thực vật. Glucose và fructose không phải lúc nào cũng kích thích sự cảm ứng hình thành hoa, nên hiệu ứng này có thể không phổ biến và có thể phụ thuộc vào loài 11 thực vật, bản chất của mẫu cấy và khả năng của mẫu cấy sử dụng các nguồn carbon khác nhau. Hình 3.1. Ảnh hưởng của loại và nồng độ đường lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro sau 40 ngày nuôi cấy. Việc phân biệt giữa cảm ứng ra hoa và phát triển hoa liên quan đến hoạt động của đường là một vấn đề cần xem xét. Trong khi một loại đường cụ thể nào đó có thể không kích thích cảm ứng hoa, nhưng có thể có tác động tích cực đến sự phát triển của hoa như được ghi nhận ở cây T. fournieri. Trong nghiên cứu này, mặc dù sucrose không ảnh hưởng đáng kể đến sự cảm ứng hình thành hoa, nhưng trong nghiên cứu trước đó trên cây T. fournieri, khi bổ sung sucrose với nồng độ 60 g/l vào môi Tỷ lệ c hồ i r a ho a (% ) 12 trường cảm ứng ra hoa (môi trường ¼MS) thì tỷ lệ ra hoa cũng như số nụ hoa cao hơn so với các nghiệm thức đối chứng (nghiệm thức sử dụng môi trường cảm ứng). Điều này cũng cho thấy, sucrose không có vai trò trong sự cảm ứng ra hoa mà chỉ có vai trò thúc đẩy sự phát triển hoa T. fournieri in vitro. 3.1.3. Vai trò của chất điều hoà sinh trưởng thực vật trong sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro Ảnh hưởng của GA3 kết hợp với ABA lên sự cảm ứng ra hoa ở cây T. fournieri in vitro Tanimoto và đồng tác giả (1985) đã cho thấy khi nuôi cấy chồi T. fournieri trên môi trường không bổ sung CĐHST thực vật, sự hình thành hoa bị ảnh hưởng bởi các nhân tố nội sinh bên trong mẫu, trong đó có hàm lượng ABA nội sinh. Do đó, khi bổ sung 0,1 mg/l ABA vào môi trường nuôi cấy đã kích thích sự hình thành hoa ở các mẫu chồi cây T. fournieri in vitro. Kết quả này phù hợp với kết quả trong thí nghiệm này, khi sử dụng ABA ở các nồng độ khác nhau đã cảm ứng sự hình thành hoa. Ở nồng độ 1,5 mg/l ABA cho tỷ lệ hình thành hoa cao hơn so với các nghiệm thức còn lại (các nghiệm thức kết hợp ABA với GA3) và cao hơn so với nghiệm thức đối chứng, tỷ lệ ra hoa ở nghiệm thức này là 80% so với 40% ở nghiệm thức đối chứng (Bảng 3.2). Điều này cho thấy, đối với cây T. fournieri, ABA đóng vai trò quan trong trong sự cảm ứng hình thành hoa. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy tác động của ABA đối với sự cảm ứng ra hoa có thể được giải thích là do sự biểu hiện của gene abi3, abi5 và basic leucine zipper, những gene này đóng vai trò quan trọng trong sự cảm ứng ra hoa bằng cách điều hòa biểu hiện gene flc. Một protein khác cũng tham gia trong sự điều khiển sự ra hoa là HAB1 (HYPERSENSITIVE TO ABA 1), là yếu tố ức chế của sự đáp ứng các tín 13 hiệu ABA. Biểu hiện của protein HAB1 được tìm thấy trong khi cảm ứng sự ra hoa ở cây A. thaliana. Protein HAB1 tương tác với phức hợp protein SWI/SNF. Nhóm tác giả cho rằng sự tương tác của protein HAB1 và phức hợp SWI/SNF (phức hợp chromatin) trong sự phiên mã để đáp ứng lại các tín hiệu ABA cần thiết cho sự điều hòa các gene liên quan đến sự đáp ứng các tín hiệu ABA. Có rất nhiều gene miRNA cũng được ghi nhận có liên quan đến sự ra hoa theo con đường ABA. Gene miR159 liên quan đến sự phát triển hoa, điều khiển sự biểu hiện gene myb101, myb33 cũng được điều hòa bởi ABA. Gene miR160 điều khiển sự phát sinh hình thái hoa cũng được điều khiển bởi ABA. Mặt khác, sự biểu hiện quá mức của miR172c làm giảm sự mất nước của cây và thúc đẩy ra hoa sớm bằng các điểu khiển sự biểu hiện gene ft và lfy trong điều kiện ngày dài. Gene miR172 được cảm ứng bởi ABA, liên quan đến sự chịu hạn làm tăng độ nhạy đối với ABA, đẩy nhanh những đáp ứng với sự khô hạn. Trong nghiên cứu này, ở các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của GA3 riêng lẻ hay GA3 kết hợp với ABA ở các nồng độ khác nhau lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro, sau 40 ngày nuôi cấy, kết quả thu được cho thấy tỷ lệ ra hoa ở các nghiệm thức này thấp hơn so với nghiệm thức chỉ sử dụng ABA riêng lẻ và nghiệm thức đối chứng. Điều này cho thấy GA3 ảnh hưởng không đáng kể đến sự cảm ứng ra hoa ở loài cây này. Vai trò của GA3 lên sự cảm ứng ra hoa ở những cây không phụ thuộc vào quang kỳ vẫn chưa được chứng minh cụ thể, có thể GA3 là nhân tố thúc đẩy sự ra hoa ở loài cây này nhưng không ảnh hưởng lên sự ra hoa ở một loài cây khác. 14 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của GA3 kết hợp với ABA lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro sau 40 ngày nuôi cấy CĐHSTTV Tỷ lệ chồi ra hoa (%) Số nụ hoa /mẫu Chiều cao chồi (cm) GA3 (mg/l) ABA (mg/l) 0,0 0,0 40,00bc 5,92bcd 0,63bc 0,5 40,00bc 6,37b 0,63bc 1,0 46,67ab 5,58bcd 0,73ab 1,5 80,00a 8,08a 1,33a 2,0 20,00bcd 5,45bcd 0,30bc 0,5 0,0 13,33bcd 5,60bcd 0,20bc 0,5 26,67bcd 5,08bcd 0,37bc 1,0 20,00bcd 6,41b 0,27bc 1,5 23,33bcd 6,19bc 0,47bc 2,0 0,00d 5,43bcd 0,00c 1,0 0,0 0,00d 6,12bcd 0,00c 0,5 0,00d 6,37b 0,00c 1,0 0,00d 5,56bcd 0,00c 1,5 3,33d 5,73bcd 0,07bc 2,0 10,00cd 5,98bcd 0,13bc 1,5 0,0 6,67cd 5,91bcd 0,10bc 0,5 6,67cd 5,27bcd 0,13bc 1,0 0,00d 4,63cd 0,00c 1,5 3,33d 4,59d 0,03c 2,0 10,00cd 4,65cd 0,17bc 2,0 0,0 3,33cd 5,32bcd 0,03c 0,5 10,00cd 5,59bcd 0,10bc 1,0 0,00d 5,50bcd 0,00c 1,5 0,00d 5,43bcd 0,00c 2,0 3,33d 5,11bcd 0,03c PGA * * * PABA * * * PGA*ABA * * * Trong cùng một cột, những số có chữ cái theo sau khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (*). 15 Ảnh hưởng của GA3 kết hợp với BA lên sự cảm ứng ra hoa ở cây T. fournieri in vitro Đối với cây T. fournieri, kết quả cho thấy khi kết hợp BA với GA3, các chồi T. fournieri in vitro không có sự hình thành hoa, chỉ hình thành chồi mới với chiều cao chồi trung bình khoảng 3,0 cm, đốt thân dài và có hiện tượng thuỷ tinh thể. Các kết quả tương tự thu được ở khi nghiên cứu trên cây Tylophora indica. GA3 đã được báo cáo là thích hợp cho tái sinh chồi in vitro, thúc đẩy sự tăng trưởng, sản xuất sinh khối và kéo dài mạch xylem. Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên sự cảm ứng ra hoa ở cây T. fournieri in vitro Tương tự như nghiệm thức GA3 kết hợp với BA, sau 40 ngày nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA và NAA, kết quả cũng cho thấy 2 loại chất điều hòa sinh trường này không ảnh hưởng đến sự ra hoa ở cây T. fournieri in vitro. Trên môi trường bổ sung BA ở nồng độ thấp (0,5 mg/l BA), chiều cao chồi trung bình cao hơn so với các mẫu cấy trên môi trường bổ sung BA nồng độ cao và có sự hình thành rễ ở mẫu cấy. 3.1.4. Vai trò của môi trường khoáng đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro Nhằm đánh giá ảnh hưởng của môi trường khoáng đối với sự sinh trưởng và hình thành hoa của cây T. fournieri in vitro, thí nghiệm được thực hiện với môi trường MS và các cải biến của môi trường này đến sự hình thành hoa cây T. fournieri in vitro được thực hiện. Sau 40 ngày nuôi cấy, tỷ lệ hình thành hoa trên môi trường ¼MS là 60,00% cao hơn so với đối chứng và các môi trường còn lại. Các thành phần đa lượng trong môi trường ¼MS và ½MS đã bị giảm theo tỷ lệ lần lượt là ½; ¼ và thành phần vi lượng không đổi so với các môi trường MS, sự thay đổi này dẫn đến tỷ lệ C/N trong môi trường 16 đã bị thay đổi. Điều này có thể được giải thích khi các nguyên tố đa lượng, đặc biệt là N, hiện diện với hàm lượng cao đã phần nào ức chế sự chuyển đổi từ pha sinh dưỡng sang pha sinh sản hay là sự hình thành chồi hoa T. fournieri. Trong môi trường nuôi cấy, khi giảm hàm lượng khoáng đa lượng dẫn theo hàm lượng N cũng giảm theo trong khi đó hàm lượng C không đổi, sẽ dẫn đến tỷ lệ C/N cao, chính điều này đã kích thích sự ra hoa, ngược lại khi tỷ lệ C/N thấp, sự phát sinh dinh dưỡng chiếm ưu thế. Theo Tanimoto và Harada (1981), tỷ lệ C/N có vai trò quan trọng trong sự chuyển tiếp ra hoa ở thực vật. Tỷ lệ C/N trong môi trường ¼MS cao hơn so với môi trường MS, cây nuôi cấy trên môi trường có tỷ lệ C/N cao sẽ đi vào trạng thái sinh sản, kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Wang và đồng tác giả (2002). Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro sau 40 ngày nuôi cấy NT Tỷ lệ chồi ra hoa (%) Số nụ hoa/chồi Chiều cao chồi (cm) ½MS 43,33ab 0,47 6,20b MS½ 23,33bc 0,33 6,34b ¼MS 60,0a 0,70 8,70a MS¼ 6,67c 0,07 9,13a MS 16,67bc 0,27 5,25b P * ns * Trong cùng một cột, những số có chữ cái theo sau khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (*); ns: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. 3.1.5. Vai trò của acid amin (proline, arginine và L-tyrosine) đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro Trong 3 loại acid amine được khảo sát, kết quả cho thấy sự hình thành hoa thay đổi tùy vào từng loại và nồng độ acid amin được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Đối với cây T. fournieri, arginine ở nồng độ 1,5 mg/l thích hợp nhất cho sự hình thành hoa (Hình 3.2). Vai trò của acid amin đến sự cảm ứng hoa cũng không rõ ràng vì hầu hết các 17 nghiệm thức sử dụng acid amin thì sự cảm ứng ra hoa chỉ xuất hiện ở ngày thứ 80 sau nuôi cấy, so với các yếu tố khác thì sự hình thành hoa đã xảy ra ở ngày thứ 40 sau nuôi cấy. Hình 3.2. Ảnh hưởng của acid amin lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro sau 80 ngày nuôi cấy. P1.0, P1.5, P2.0, P2.5, P3.0, P3.5, P4.0, P4.5, P5.0: tương ứng với proline ở các nồng độ từ 1,0 đến 5,0 mg/l; A1.0, A1.5, A2.0, A2.5, A3.0, A3.5, A4.0, A4.5, A5.0: tương ứng với arginine ở các nồng độ từ 1.0 đến 5.0 mg/l; T1.0, T1.5, T2.0, T2.5, T3.0, T3.5, T4.0, T4.5, T5.0: tương ứng với L-tyrosine ở các nồng độ từ 1,0 đến 5,0 mg/l. 0 20 40 60 80 MS P1,0 P1,5 P2,0 P2,5 P3,0 P3,5 P4,0 P4,5 P5,0 A1,0 A1,5 A2,0 A2,5 A3,0 A3,5 A4,0 A4,5 A5,0 T1,0 T1,5 T2,0 T2,5 T3,0 T3,5 T4,0 T4,5 T5,0 MS P1,0 P1,5 P2,0 P2,5 P3,0 P3,5 P4,0 P4,5 P5,0 A1,0 A1,5 A2,0 A2,5 A3,0 A3,5 A4,0 A4,5 A5,0 T1,0 T1,5 T2,0 T2,5 T3,0 T3,5 T4,0 T4,5 T5,0 TY LE RA HOA CCC A ci d am in e 18 3.1.6. Vai trò của polyamine (spermidine, spermine, putrescine) đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro Polyamine (PA) được xem là một nhóm các chất điều hòa sinh trưởng trong thực vật, do đó tác động của PA lên sự cảm ứng ra hoa tùy thuộc vào từng loại thực vật khác nhau, nồng độ và loại PA được khảo sát. Năm loại enzyme sinh tổng hợp quan trọng liên quan đến sinh tổng hợp PA ở thực vật bậc cao hiện đang được nghiên cứu: arginine decarboxylase (ADC), ornithine decarboxylase (ODC), S- adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC), Spd synthase (SPDC) và Spm synthase (SPMS). Các chức năng sinh lý quan trọng của PA nội sinh trong cảm ứng hoa và hình thành cơ quan và sơ khởi hoa đã được xác nhận trong nhiều nghiên cứu khác nhau. Triamine Spd, quan trọng nhất trong ba PA nói trên, có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý. Trong Polianthes tuberosa, Spd và Cad là những điểm đánh dấu cho sự biệt hóa tạo hoa. Các thí nghiệm trên Cucurbita pepo và Ginkgo biloba cũng đã phát hiện ra rằng Spd chiếm ưu thế trong quá trình biệt hóa tạo hoa. Khi Spd đạt đến một mức độ nhất định sẽ dẫn đến việc thúc đẩy sự biểu hiện của gen ra hoa, do đó kích hoạt sự tổng hợp của một protein đặc biệt và cuối cùng là sự hình thành của sơ khởi hoa. Điều này cũng đã giải thích vai trò quan trọng của Spd ngoại sinh trong sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro. Trong nghiên cứu này, các loại polyamine khác nhau ảnh hưởng khác nhau đến sự cảm ứng ra hoa của cây T. fournieri in vitro. Spermidine và spermine thích hợp cho sự cảm ứng ra hoa của cây T. fournieri, tỷ lệ hình thành hoa đạt 43,33% và số nụ hoa/mẫu đạt 0,47 nụ hoa khi nuôi cấy cây T. fournieri trên môi trường bổ sung 40 mg/l spermidine. Tỷ lệ hình thành hoa của cây T. fournieri ở trên môi trường có bổ sung 40 mg/l spermine là 43,33% và số chồi hoa/mẫu đạt 0,80 chồi hoa/mẫu. 19 Hình 3.3. Ảnh hưởng của các polyamine lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro sau 80 ngày nuôi cấy. SPD1, SPD10, SPD20, SPD30, SPD40: tương ứng với spermidine ở các nồng độ từ 1,0 đến 40 mg/l; SPM1, SPM10, SPM20, SPM30, SPM40: tương ứng với spermine ở các nồng độ từ 1,0 đến 40 mg/l; PUT1, PUT 10, PUT 20, PUT 30, PUT 40: tương ứng với putrescine ở các nồng độ từ 1,0 đến 40 mg/l; MS: nghiệm thức đối chứng sử dụng môi trường MS; CCC: chiều cao chồi Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các PA ngoại sinh có thể ảnh hưởng đến sự cảm ứng ra hoa ở một số cây như cây Spirodela punctata, thuốc lá và cây Pharbitis nil. PA ngoại sinh đã được chứng minh là có thể đẩy nhanh quá trình biệt hóa tạo hoa và hàm lượng PA cao trong chồi đỉnh có lợi cho việc bắt đầu và duy trì sự biệt hóa tạo nụ hoa trong cây cúc. Ở cây A. thaliana, việc bổ sung PA ngoại sinh đã thúc đẩy đáng kể phản ứng ra hoa của loài cây này. Tuy nhiên, PA cũng gây ức chế sự ra hoa ở loài Lemna aequinoctialis dưới điều kiện cảm ứng quang kỳ. Tùy theo từng loại PA khác nhau mà sự tác động đến quá trình ra hoa ở 0 20 40 60 MS SPD1 SPD10 SPD20 SPD30 SPD40 SPM1 SPM10 SPM20 SPM30 SPM40 PUT1 PUT10 PUT20 PUT30 PUT40 MS SPD1 SPD10 SPD20 SPD30 SPD40 SPM1 SPM10 SPM20 SPM30 SPM40 PUT1 PUT10 PUT20 PUT30 PUT40 TY LE RA HOA CCC Po ly am in e 20 từng loại là khác nhau. Trong nghiên cứu này, Put một loại PA không ảnh hưởng đến sự ra hoa ở cây T. fournieri in vitro. Trong nghiên cứu này, khi so sánh các yếu tố ảnh hưởng đến sự ra hoa khác như ánh sáng, đường chất điều hòa sinh trưởng thực vật hay môi trường khoáng thì yếu tố PA chỉ cảm ứng ra hoa ở ngày thứ 80 sau nuôi cấy, ở ngày thứ 40 sau nuôi cấy hầu hết các nghiệm thức sử dụng polyamine đều không có sự hình thành hoa. Tuy nhiên, khi chồi T. fournieri in vitro được nuôi cấy trên môi trường ¼MS bổ sung spermidine ở nồng độ từ 0,2-0,4 mg/l spermidine thì tỷ lệ ra hoa tăng từ 72,22-77,78% cao hơn so với nghiệm thức đối chứng (61,11%) ở ngày thứ 40 sau nuôi cấy (Hình 3.3). Điều này cho thấy PA không đóng vai trò quan trọng lên sự cảm ứng ra hoa nhưng có vai trò trong việc thúc đẩy sự phát triển hoa. 3.2. Nội dung 2: Sự thay đổi hình thái, cấu trúc của mô phân sinh chồi và hoạt động biến dưỡng trong quá trình ra hoa của cây T. fournieri in vitro 3.2.1. Hình thái hoa và sự thay đổi của mô phân sinh chồi ngọn trong quá trình ra hoa của cây T. fournieri in vitro Trong quá trình ra hoa ở cây T. fournieri in vitro, ở ngày thứ 10, 20 thì hầu hết các cây không có sự xuất hiện nụ hoa, đến ngày thứ 30 thì thấy có sự xuất hiện của nụ hoa, đến ngày thứ 40 thì nụ hoa phát triển lớn hơn, sau đó ở ngày thứ 50 và 60 nụ hoa phát triển to hơn và nở thành hoa hoàn chỉnh. Nụ hoa T. fournieri in vitro ở giai đoạn 40 ngày sau nuôi cấy được cắt dọc để quan sát và nhận thấy hoa có cấu trúc hoàn chỉnh, không có sự khác biệt về kiểu hình so với hoa trồng bên ngoài. Dựa theo mô hình cấu trúc hoa ABC, hoa T. fournieri in vitro phát triển hoàn toàn bình thường, với cấu trúc gồm đài hoa, cánh hoa, nhị và noãn. Hoa T. fournieri in vitro thường hình thành ở đỉnh chồi và các nách lá. 21 Trong nghiên cứu này, một vấn đề được ghi nhận là màu hoa chuyển sang màu tím nhạt hay màu trắng hoàn toàn, có khác biệt so với vật liệu nghiên cứu ban đầu là giống hoa màu tím trắng. Điều này cũng đã được Dương Tấn Nhựt và đồng tác giả (2013) giải thích rằng sự thay đổi màu sắc của hoa T. fournieri in vitro là do sự tương tác giữa các thành phần khoáng trong môi trường nuôi cấy mà không phải do ảnh hưởng của sự biến đổi di truyền. Quá trình cảm ứng ra hoa trải qua rất nhiều bước, trong đó có sự thay đổi cấu trúc ở mô phân sinh hoa. Ở trạng thái sinh dưỡng, mô phân sinh có kích thước nhỏ, chưa có sự biệt rõ ràng. Khi sự cảm ứng ra hoa diễn ra, hàng loạt các thay đổi về mặt sinh lý tại mô phân sinh chồi ngọn cũng xảy ra để chuẩn bị cho cây bước vào quá trình chuyển tiếp từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản. Điều này rất quan trọng để sự ra hoa có thể diễn ra thành công (Glover, 2007). Khi còn trong giai đoạn sinh dưỡng, mô phân sinh chồi ngọn của cây T. fournieri in vitro có dạng hình đĩa, phẳng, cấu trúc không rõ ràng và mang hai phác thể lá. Trong giai đoạn cảm ứng ra hoa, đường kính của mô phân sinh tăng lên, cấu trúc rõ ràng hơn và chuyển từ dạng hình đĩa sang dạng hình vòm. Cụ thể là, các tế bào ở vùng trung tâm và vùng ngoại biên bắt đầu nhô lên, đầu tiên sơ khởi lá đài xuất hiện, sau đó là sơ khởi cánh hoa, sơ khởi nhị, sau đó là sự kéo dài cánh hoa và cuối cùng là nụ hoa phát triển. 3.2.2. Mối liên hệ giữa biến đổi sinh lý và hình thái mô phân sinh chồi ngọn trong trong quá trình ra hoa Trong quá trình cảm ứng ra hoa ở thực vật, cây thường có những thay đổi về mặt sinh lý trước khi có những biến đổi về mặt hình thái. Trong quá trình nuôi cấy, ở giai đoạn từ 0-10 ngày, các chồi T. fournieri được cấy chuyển sang môi trường mới nên sinh lý mẫu cấy chưa ổn định dẫn đến cường độ hô hấp gia tăng, cường độ hô hấp đạt cao nhất ở ngày 22 thứ 10 sau nuôi cấy (0,55 µmO2/10cm2/phút). Chỉ tiêu này giảm đi từ ngày 10 đến ngày thứ 20 và sau đó tăng lên vào ngày thứ 40 sau nuôi cấy. Ngược lại, đối với chỉ tiêu cường độ quang hợp, các chồi T. fournieri in vitro ở giai đoạn từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 20 có cường độ quang hợp tăng nhanh, sau đó giảm đi ở giai đoạn sau 30 ngày nuôi cấy. Điều này có thể giải thích là trong giai đoạn phát triển sinh dưỡng thì cường độ quang hợp tăng mạnh để giúp cho cây tổng hợp các chất dinh dưỡng cần thiết. Khi bước vào giai đoạn ra hoa, thực vật cần nhiều năng lượng và các chất cần thiết cho sự hình thành và phát triển của hoa nên quá trình hô hấp tăng nhanh giúp phân giải các chất dự trữ tạo các chất cần thiết cho các phản ứng sinh tổng hợp. Ở giai đoạn từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 30 sau nuôi cấy, hàm lượng đường có trong mẫu cây T. fournieri tăng đáng kể (40,078-68,254 µg/g) và tăng cao nhất ở ngày thứ 30. Vấn đề này cũng đã được Bernier và đồng tác giả (1993) ghi nhận khi nghiên cứu trên cây Sinapis alba, có sự gia tăng hàm lượng sucrose ở đỉnh chồi vào thời điểm chuyển tiếp ra hoa. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy tất cả những yếu tố được khảo sát đều tác động đến sự cảm ứng ra hoa của cây T. fournieri in vitro nhưng những ảnh hưởng này là khác nhau tùy thuộc vào từng loại yếu tố, nồng độ và thời gian nuôi cấy khác nhau. Đối với nghiệm thức ánh sáng, tỷ lệ kết hợp giữa đèn LED xanh và LED đỏ khác nhau ảnh hưởng khác nhau lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro. Ở điều kiện chiếu sáng có tỷ lệ kết hợp 50% LED đỏ và 50% LED xanh có tỷ lệ ra hoa tốt nhất, tỷ lệ ra hoa là 19,59%. Các chồi nuôi cấy trên môi trường 23 có bổ sung đường với nồng độ và loại khác nhau thì tỷ lệ chồi ra hoa khác nhau, chồi T. fournieri nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 50 g/l glucose có tỷ lệ chồi ra hoa cao hơn các nghiệm thức sử dụng các nồng độ đường còn lại, tỷ lệ ra hoa là 51,48% sau 40 ngày nuôi cấy. Những loại đường đơn như glucose và fructose ảnh hưởng đến sự ra hoa tốt hơn so với các loại đường đôi như sucrose và maltose. Môi trường ¼MS là môi trường cảm ứng ra hoa tốt hơn so với các môi trường khoáng còn lại với tỷ lệ hình thành hoa là 60% sau 40 ngày nuôi cấy. Các nghiệm thức sử dụng acid amin và polyamine thì không có sự cảm ứng ra hoa vào ngày thứ 40 sau nuôi cấy, hiện tượng ra hoa chỉ xảy ra ở ngày thứ 80, so với các yếu tố khác thì sự cảm ứng ra hoa này xảy ra trễ hơn. Khi đánh giả ảnh hưởng của 3 loại acid amin như arginine, proline, L-tyrosine lên sự ra hoa, arginine ở nồng độ 1,5 mg/l thích hợp nhất cho sự ra hoa ở cây T. fournieri in vitro, tỷ lệ chồi ra hoa đạt 60,0%. Đối với polyamine, spermidine và spermine thích hợp cho sự cảm ứng ra hoa của cây T. fournieri in vitro, tỷ lệ chồi ra hoa đạt 43,33% và số nụ hoa/mẫu đạt 0,47 nụ hoa khi nuôi cấy cây T. fournieri trên môi trường bổ sung 40 mg/l spermidine. Tỷ lệ chồi ra hoa của cây T. fournieri ở trên môi trường có bổ sung 40 mg/l spermine là 43,33%. Bên cạnh những yếu tố trên, ABA dường như là một yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự ra hoa ở cây Torenia fournieri in vitro. Môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l ABA thích hợp cho sự cảm ứng ra hoa ở cây T. fournieri in vitro với tỷ lệ chồi ra hoa là 80%. Sự biến đổi trong quá trình ra hoa: • Trong quá trình nuôi cấy, ở giai đoạn từ 0-10 ngày, chồi T. fournieri có cường độ hô hấp đạt cao nhất ở ngày thứ 10 sau nuôi cấy (0,55 µmO2/10cm2/phút). Chỉ tiêu này giảm đi từ ngày 10 đến ngày thứ 20, sau đó tăng vào ngày thứ 40 sau nuôi cấy. Ngược lại, cường độ 24 quang hợp của chồi T. fournieri in vitro ở giai đoạn từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 20 tăng nhanh, sau đó giảm đi ở giai đoạn sau 30 ngày nuôi cấy. Ở giai đoạn từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 30 sau nuôi cấy, hàm lượng đường có trong mẫu cây T. fournieri in vitro tăng đáng kể và tăng cao nhất ở ngày thứ 30, hàm lượng đường ở giai đoạn này là 68,254 µg/g. Kết quả này cũng tương tự khi đánh giá tác động của đèn LED đến quá trình ra hoa của cây T. fournieri in vitro, ở hầu hết các nghiệm thức hàm lượng đường nội sinh đều tăng đáng kể ở thời điểm ngày thứ 30 sau nuôi cấy, trùng với thời điểm ghi nhận cây bắt đầu cảm ứng ra hoa. Kiến nghị Để nắm rõ hơn quá trình ra hoa của cây T. fournieri in vitro, một số nghiên cứu cần được thực hiện thêm như: v Nghiên cứu tiếp tục tác động của ánh sáng của đèn LED với tỷ lệ ánh sáng xanh cao hơn lên quá trình ra hoa của cây T. fournieri in vitro. v Nghiên cứu sự biểu hiện của gene liên quan đến quá trình ra hoa ở cây T. fournieri in vitro dưới tác động của các yếu tố khác nhau. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Acid abscisic (ABA) ở nồng độ 1,5 mg/l đóng vai trò quan trọng lên khả năng ra hoa ở cây Torenia fournieri in vitro với tỷ lệ ra hoa đạt 80%. Những loại đường đơn như glucose và fructose có tác động đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro tốt hơn so với các loại đường đôi như sucrose và maltose. Bên cạnh đó, arginine, spermidine và spermine cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành hoa ở cây T. fournieri in vitro. DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Trần Trọng Tuấn, Trần Thị Mỹ Trâm, Phạm Thị Ngọc Thúy, Nguyễn Hữu Hổ, Dương Tấn Nhựt (2015). Ảnh hưởng của amino acid và polyamine lên quá trình ra hoa in vitro của cây hoa Mõm chó (Torenia fournieri L.). Tạp chí công nghệ sinh học, 13(3): 929-937. 2. Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Hữu Hổ, Dương Tấn Nhựt (2015). Ảnh hưởng của gibberrellic acid, proline và spermidine lên sự hình thành hoa của cây Torenia (Torenia fournieri L.). Tạp chí Công nghệ Sinh học, 13(1): 123-130. 3. Trần Trọng Tuấn, Đỗ Đức Thăng, Nguyễn Hữu Hổ, Dương Tấn Nhựt (2015). Ảnh hưởng của ánh sáng và đường lên quá trình ra hoa của cây hoa mõm chó (Torenia fournieri L.) nuôi cấy in vitro. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 13(4A): 1303-1311. 4. Dương Tấn Nhựt, Lê Văn Thức, Trần Trọng Tuấn, Trương Thị Diệu Hiền, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Vũ Quốc Luận (2013). Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành hoa in vitro ở cây Torenia (Torenia fournieri L.). Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 51(6): 689-702. 5. Duong Tan Nhut, Nguyen Thanh Hai, Pham Thi Minh Thu, Nguyen Ngoc Thi, Truong Thi Dieu Hien, Tran Trong Tuan, Nguyen Ba Nam, Nguyen Phuc Huy, Hoang Xuan Chien, and Shri Mohan Jain (2013). Protocol for inducing flower color somaclonal variation in torenia (Torenia fournieri Lind.). In: Lambardi M., Ozudogru E.A., Jain S.H, ed., Protocol for micropropagation of selected economically – important horticultural plants. Humana Press, Springer: 455-462.