Tóm tắt Luận án Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má [centella asiatica (l.) urban] họ hoa tán (apiaceae )

ol, β-Sitosterol, asiatic acid, madecassic acid, Hỗn hợp stigmasterol glucoside và β-sitosterol glucoside (1:1) và madecassoside. 4.1.2. Định lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong cây rau má bằng phƣơng pháp CC và HPLC 4.2.3.1. Phương pháp HPLC Bảng 4.1: Tổng hàm lượng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má Thành phần RMST 4,25 g RMND 4,20 g RMHCM 1,67 g % diện tích pic % trong mẫu khô % diện tích pic % trong mẫu khô % diện tích pic % trong mẫu khô Asiatic acid 33,81 0,718 30,49 0,615 28,92 0,241 Madecassic acid 41,93 0,891 43,02 0,865 28,61 0,239 4.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid 4.3. Chuyển hóa hóa học của asiatic acid và madecassic acid 4.3.1. Chuyển hóa của asiatic acid 4.3.1.1. Chuyển hóa hóa học của nhóm COOH vị trí C-28 Như trong sơ đồ 4.1, asiatic acid được chuyển hóa thành các dẫn xuất amide bằng phản ứng với các hợp chất amin bậc 1 và bậc 2 khác nhau. 7 Sơ đồ 4.1: Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid Các tác nhân và điều kiện phản ứng: a) (CH3CO)2O, pyridine, rt., 12 h, 80%, b) oxalyl chloride, DCM, rt., 24 h, c) RNH2, DCM, rt, 24 h, (75-92%), d) AcCl, DMAP, DCM, 2h, 75-80%, e) KOH, MeOH, rt, 16 h, 72-80%, f) acetyl chloride, DMAP, rt, 85%. Trong dãy phản ứng chuyển hóa asiatic acid (1) thành các amide, các nhóm OH vòng A trước hết được bảo vệ với nhóm acetyl. Asiatic acid được xử lý với acetic anhydride trong pyridine tạo thành asiatic acid triacetate (145) với hiệu suất 80%. Cấu trúc của hợp chất 145 được khẳng định qua phân tích phổ IR, ESI-MS và 1D-NMR. Phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 145 cho thấy ngoài các tín hiệu tương ứng của hợp chất 1 đã xuất hiện 3 tín hiệu của 3 nhóm acetyl CH3 tại H (ppm): 1,92 (3H, s, -CH3-CO), 1,96 (3H, s, -CH3-CO), 2,02 (3H, s, -CH3-CO) và C (ppm): 170,83 (CH3CO-), 170,48 (CH3CO-), 170,37 (CH3CO-). Các tín hiệu H- 2β, H-3α và H-23 được dịch chuyển về phía trường thấp hơn ở δH (ppm) 3,51 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,78 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23b), 5,01 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3α) và 5,09 (1H, dt, J = 4,5, 10,5 Hz, H-2β) so với các tín hiệu tương ứng [δH (ppm) 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,38 8 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-3α), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 9,5 Hz, H-2β)] của hợp chất 1. Như vậy cả 3 nhóm OH đều đã được acetyl hóa. Điều này được chứng minh thêm bởi phổ FT-IR của hợp chất 145 với đỉnh hấp phụ đặc trưng cho acetate tại 1746,26 và 1237,00, 1698,88 (-COOH) và phổ khối ESI-MS ion dương tại m/z 615 [M+H] + . Dữ liệu phổ của hợp chất 145 giống với tài liệu tham khảo [96]. Hợp chất 145 được chuyển hóa thành asiatic acid chloride triacetate (146) bằng phản ứng với oxalyl chloride. Sản phẩm trung gian này, không cần tách và tinh chế, được phản ứng với các amin tương ứng trong sự có mặt của triethylaminee làm xúc tác bắt acid HCl. Các phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng với hiệu suất cao từ 75-92% so với nguyên liệu đầu 145 (Sơ đồ 4. 1). Hợp chất 147 cho thấy trong phổ 1H-NMR có các cụm pic mới xuất hiện của các nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 2,69 (2H, t, J = 7,0 Hz, 2H-1’), 3,13 (2H, t, J = 7,0 Hz, 2H-7’) và các tín hiệu của 7 nhóm methylene mạch nhánh. Các kết quả trên phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho pic ion giả phân tử tại m/z 727 [M+H]+ phù hợp với CTPT C43H70N2O7 của hợp hợp chất 147. Như vậy phản ứng amide hóa của hợp chất 145 với 1,7-heptadiamin đã thành công. Hợp chất 148 cho thấy trong phổ 1H-NMR có các cụm pic mới xuất hiện của các nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 2,94 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H-1’), 3,12-3,14 (2H, m, 2H-9’). Cấu trúc của hợp chất 148 cũng được khẳng định qua phổ ESI-MS ion dương với pic ion giả phân tử tại m/z 755 [M+H]+ tương ứng với CTPT C47H74N2O7 của hợp chất 148 như trong phản ứng. Hợp chất 149: trên phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton của nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 2,94 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H-1’), 3,14-3,11 (2H, m, 2H- 10’). Trên phổ 13C-NMR còn xuất hiện tín hiệu tại C (ppm): 30,33-30,68 và 40,73-41,09 của nhóm methylene mạch nhánh. Kết quả này cũng được khẳng định thêm qua phổ ESI-MS ion dương với pic ion giả phân tử tại m/z 769 [M+H]+, cho thấy hợp chất 149 phù hợp với CTPT C46H76N2O7 như trong phương trình phản ứng. Hợp chất 150: trên phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton của nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 3,11-3,16 (1H, m, H-1’a), 3,53-3,63 (3H, m, H-1’b, 2H- 3’). Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 672 [M+H] + phù hợp với CTPT C39H61NO8. Hợp chất 151 cho thấy đỉnh hấp thụ tại ν* (cm-1): 1742 và 1235 của các nhóm acetate và nhiều đỉnh hấp thụ xung quanh vùng 3418 của nhóm -NHNH2. Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 629 [M+H] + phù hợp với CTPT C36H56N2O7 chứng minh rằng phản ứng của hợp chất 145 với hydrzine đã tạo thành sản phẩm mong muốn 151. Trên phổ 1H-NMR của amide 152 quan sát thấy tín hiệu triplet ở δ (ppm): 6,48 (1H, t, J = 4,0 Hz, -NH-amide), đặc trưng cho liên kết amide. Ngoài các tín hiệu 9 phổ của 145, còn quan sát thấy tín hiệu ở δ (ppm): 3,83 (1H, dd, J = 4,0, 18,5 Hz, H-1’a), 4,05 (1H, dd, J = 5,0, 18,5 Hz, H-1’b), 4,21 (2H, q, J = 7,0 Hz, H-1’’), 1,29 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-2’’) nhóm tín hiệu và hằng số tương tác này đặc trưng cho độ dịch chuyển hóa học của glycine. Trong phổ 13C-NMR có các tín hiệu của nhóm methylene gắn với -COOCH2CH3 của mạch nhánh xuất hiện tại C : 61,48 ppm. Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 700 [M+H]+ phù hợp với CTPT C40H61NO9. Trên phổ 1H-NMR của amide 153 ngoài các tín hiệu của 145, quan sát thấy sự xuất hiện 3 tín hiệu singlet của các proton vòng imidazole tương ứng ở δ (ppm): 7,03 (1H, s, H-2’), 7,54 (1H, s, H-1’), 8,26 (1H, s, H-3’). Phổ 13C-NMR có chứa các tín hiệu của mạch nhánh ở δ (ppm): 137,08 (C-3’), 129,74 (C-1’), 117,94 (C-2’). Amide 154: quan sát trên phổ 1H-NMR của hợp chất 154 có xuất hiện thêm các tín hiệu tại H (ppm): 4,12 (0,5H, q, J = 7,0 Hz, -NH-CH3), 4,36 (0,5H, q, J = 7,0 Hz, -NH-CH3). Amide 155: quan sát trên phổ khối ESI-MS ion dương có xuất hiện ion giả phân tử tại m/z 672 [M+ H]+ phù hợp với CTPT C39H61NO8 của hợp chất này. Phổ 1 H-NMR của hợp chất 155 có xuất hiện thêm các tín hiệu tại H (ppm): 3,92 (1H, hept, J = 7,0 Hz, H-1’) cùng với tín hiệu của 2 nhóm methyl bậc 2 xuất hiện chồng lấp với các nhóm methyl của khung asiatic acid từ 1,12-1,05 ppm. Phổ 13C-NMR có chứa các tín hiệu của nhóm isopropyl trong mạch nhánh ở vùng trường cao chồng lấp với các tín hiệu khác của khung. Như vậy cấu trúc của hợp chất 155 đã được khẳng định như trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4. 1). Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 156 xuất hiện thêm tín hiệu tại H (ppm): 3,72 (4H, br s, 2H-2’) và C (ppm): 60,87 (C-2’). Các hợp chất 147-156 đã được chứng minh qua các số liệu phổ 1H-NMR, 13C- NMR, ESI-MS. Kết quả hoàn toàn phù hợp với công thức như trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4. 1). Các phản ứng acetyl hóa mạch nhánh Các nhóm chức -NH2 và -OH mạch nhánh của các hợp chất 147-150, 156 được acetyl hóa bằng phản ứng với acetyl chloride (CH3COCl) với sự xúc tác của DMAP trong dung môi dichloromethane (DMC) ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ. Xử lý hỗn hợp sau phản ứng như trong phần thực nghiệm 3.3.1 cho các sản phẩm tương ứng 157-161 với hiệu suất từ 75-80%. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 157 cho các tín hiệu tại H (ppm): 6,05 (1H, t, J = 5,0 Hz, -NH-amide), 4,10 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-3’), 3,09 (1H, m, H-1’a), 3,39 (1H, m, H-1’b) cùng với một tín hiệu methyl singlet mới tại H (ppm): 2,1 bên cạnh nhóm methylene còn lại của mạch nhánh chồng lấp với các tín hiệu của nhóm -CH2- khác trong khung cho thấy mạch nhánh đã được gắn vào vị trí C-28. Tín hiệu H-3' trong hợp chất 157 xuất hiện ở dạng một triplet ở δH 4,10 ppm (J = 6,0 Hz) so với tín hiệu hợp chất gốc 150 là multiplet ở δH 3,53 -3,63 ppm, chồng 10 lấp với H-23a, H-2'a. Các tín hiệu -NH của 157 cũng dịch chuyển về phía trường cao tại δH 6,05 (t, J = 5,0 Hz) so với δH 6,18 (t, J = 5,5 Hz) trong hợp chất 150. Điều này được chứng minh thêm qua phổ 13C-NMR với sự xuất hiện tín hiệu tại C (ppm): 62,05 (C-3’) (CH2OAc) so với tín hiệu tại C 59,26 ppm (C-3’) của hợp chất 150. Các kết quả trên cho thấy phản ứng acetyl hóa đã được thực hiện như trong Sơ đồ 4. 1. Hợp chất 158 cho thấy xuất hiện thêm các tín hiệu cộng hưởng sau đây so với hợp chất 147 H (ppm): 5,61 (1H, br s, 1’-NH-amide), 5,85 (1H, t, J = 5,0 Hz, 7’- NH-), 3,00 (1H, m, H-1’a), 3,30 (1H, m, H-1’b), 3,23 (2H, q, J = 6,5 Hz, H-7’) bên cạnh các tín hiệu của những nhóm methylene còn lại của mạch nhánh trùng lặp với các nhóm methylene trong khung xuất hiện ở dạng multiplet trong vùng từ 1,98-1,38 (ppm), phù hợp với phổ 1H-NMR. Đặc biệt ở đây tín hiệu H-7’ có dạng quartet do tương tác với 2H-6’ và –NH-Ac tương đương về từ. Phổ 13C-NMR cũng cho thêm một tín hiệu của nhóm acetate tại C (ppm): 170,82 và các tín hiệu của nhóm –CH2 mạch nhánh trong vùng từ 44,0-21,0 ppm trùng lặp với các nhóm methylene trong khung. Điều này được khẳng định qua phổ qua phổ ESI-MS với pic ion giả phân tử tại m/z 769 [M+H]+ phù hợp với CTPT C45H72N2O8 của hợp chất 158. Hợp chất 159: Tương tự như vậy phổ 1H-NMR của hợp chất 159 có xuất hiện thêm các tín hiệu tại H (ppm): 5,88 (t, J = 5,0 Hz, 1’-NH-amide), 5,96 (1H, br s, 9’-NH-amide) bên cạnh các tín hiệu tại H (ppm): 3,01 (1H, m, H-1’a), 3,29 (1H, m, H-1’b), 3,22 (2H, m, H-9’), 1,99 (3H, s) cùng với các tín hiệu của nhóm methylene khác trong mạch nhánh chồng lấp với các nhóm methylene khác của khung. Phổ 13C-NMR có thêm một tín hiệu của nhóm acetyl tại 170,68 ppm cùng với các nhóm methylene trong mạch nhánh chồng lấp với các nhóm methylene trong khung. Điều này được khẳng định thêm qua phổ khối ESI-MS ion âm với pic ion giả phân tử tại m/z 795 [M-H]- tương ứng với CTPT C47H76N2O8 của hợp chất 159 như trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4. 1). Hợp chất 160: Tương tự như hợp chất 158, 159 cấu trúc của hợp chất 160 được chứng minh qua việc xuất hiện các tín hiệu của mạch nhánh trong phổ 1H-NMR, 13 C-NMR và khẳng định thêm qua phổ khối ESI-MS với pic ion giả phân tử tại m/z 811 [M+H] + với CTPT C48H78N2O8. Hợp chất 161: Phổ 1H-NMR của hợp chất 161 xuất hiện thêm 2 tín hiệu methyl singlet của nhóm acetyl tại H (ppm): 2,07 và 2,08. Bên cạnh đó, các nhóm methylene mang oxy (-CH2OAc) tại H (ppm): 4,25 (4H, br s, 2H-2’) và các tín hiệu của nhóm methylene khác trong mạch nhánh trùng lặp với nhóm methylene của hợp chất ban đầu. Trong hợp chất 161, tín hiệu của H-2' ở δH 4,25 (4H, br s) thay vì δH 3,72 (4H, br s) trong hợp chất 156. Phổ khối của hợp chất 161 cho pic ion giả phân tử tại m/z 786 [M+H] + phù hợp với CTPT C44H67NO11 của hợp chất 161. 11 Tương tự như trên cấu trúc của các hợp chất 157-161 cũng được khẳng định bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS đúng như các công thức ở sơ đồ (Sơ đồ 4.1).  Phản ứng thủy phân nhóm acetyl ở vòng A Để so sánh hoạt tính giữa các sản phẩm amide có nhóm OH vòng A bị khóa bởi nhóm aceyl và các nhóm OH tự do, một số sản phẩm 147-156 được lựa chọn để loại bỏ nhóm Acetyl bằng phản ứng thủy phân trong dung dịch KOH ở nhiệt độ phòng, khuấy trong 16 giờ. Xử lý hỗn hợp sau phản ứng như thường quy (phần thực nghiệm 3.3.1) thu được các sản phẩm tương ứng với hiệu suất cao từ 72- 80%. Cấu trúc của các sản phẩm dãy 162-166 được khẳng định thông qua phân tích phổ ESI-MS và 1H-NMR, 13C-NMR. Hợp chất 162: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 162 đã không còn các tín hiệu của các nhóm acetyl. Ngoài ra, thấy có sự chuyển dịch hóa học của các nhóm methyl gắn dị tố oxy về phía trường cao tạiH (ppm): 3,29 (1H, d, J = 10,0 Hz, H- 23a), 3,38 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 5,0, 10,0 Hz, H-2), 5,36 (1H, t, J = 5,0 Hz, H-12) và H (ppm): 2,86 (2H, t, J = 10,0 Hz, H-1’), 3,14 (2H, m, H-7’). Kết quả này cũng được khẳng định thêm qua phổ 13C-NMR với sự vắng mặt của tín hiệu của các nhóm acetyl carbonyl ở vùng 170 ppm và các nhóm methyl của acetyl ở vùng trường cao. Phổ khối ESI- MS ion dương của hợp chất này cho pic ion giả phân tử tại m/z 601 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H64N2O5 của hợp chất 162 như trong Sơ đồ 4. 1. Hợp chất 163: Tương tự như hợp chất 162, trong phổ 1H-NMR của hợp chất 163 đã không còn các tín hiệu cộng hưởng của các nhóm acetyl tại vị trí C-2, C-3, C-23. Đồng thời các tín hiệu của nhóm oxy-methine cũng bị đẩy về phía trường cao hơn và xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2) và 2,66 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1’), 3,13 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-9’) của mạch nhánh. Phù hợp với số liệu này phổ 13C-NMR cũng thấy vắng mặt các tín hiệu của nhóm acetyl carbonyl ở vùng C (ppm): 170 và acetyl methyl ở vùng trường cao. Các kết quả này được minh chứng thêm bởi phổ ESI-MS ion dương của hợp chất 163 với pic ion giả phân tử tại m/z 629 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H68N2O4 của 163 như trong Sơ đồ 4. 1. Hợp chất 164: Cũng tương tự như hợp chất 162, 163 trong phổ 1H-NMR của hợp chất 164 cũng không còn các tín hiệu cộng hưởng của các nhóm methyl acetyl. Đồng thời các tín hiệu của các nhóm oxy methyl cũng dịch chuyển về phía trường cao hơn, xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,80 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,73 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2) và 2,74 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1’), 3,13 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-10’) của mạch nhánh. Phổ 13C-NMR cũng vắng mặt các tín hiệu cộng hưởng của nhóm acetyl ở vùng khoảng 170 ppm và vùng trường cao. Phổ khối ESI-MS ion dương 12 của hợp chất này cũng cho kết quả phù hợp với pic ion giả phân tử tại m/z 643 [M+H] + tương ứng với CTPT C40H70N2O4 của 164 như trong Sơ đồ 4. 1. Cấu trúc của các hợp chất 165, 166 cũng được chứng minh tương tự như trên thông qua phân tích phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR của chúng. Hợp chất 167 Nhằm tạo ra dẫn xuất amide bậc 1 của asiatic acid, hợp chất 146 đã được phản ứng với dung dịch amoniac đặc ở nhiệt độ phòng trong 20 giờ. Xử lý phản ứng như trong phần thực nghiệm 3.3.1 thu được hợp chất 167 với hiệu suất 88%. Cấu trúc của hợp chất 167 được khẳng định như sau: Phổ 1H-NMR của hợp chất 167 có mặt nhóm –NH2-amide tại H (ppm): 5,48 (1H, br s, -NH2) and 5,83 (1H, br s, -NH2). Các dữ liệu phổ 1 H và 13 C-NMR của hợp chất 167 phù hợp với tài liệu [97]. Phổ 13C-NMR có tín hiệu của nhóm chức – CONH2 tại C (ppm): 181,01. Trong phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất 167 có pic ion giả phân tử tại m/z 615 [M+2H]2+ phù hợp với CTPT C36H55NO7. Tương tự như với dãy hợp chất 162-166, hợp chất 167 được loại bỏ nhóm acetyl bằng phản ứng với dung dịch KOH trong MeOH và khuấy ở nhiệt độ phòng 16 giờ. Xử lý sản phẩm phản ứng như trong phần thực nghiệm thu được hợp chất 168 với hiệu suất 72%. Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 168 không còn xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm methyl singlet của các nhóm acetyl, đồng thời các tín hiệu của các nhóm oxymethine và oxymethylene đã dịch chuyển về phía trường cao hơn và xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,37 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2). Phù hợp với phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR cũng cho thấy sự mất đi của tín hiệu các nhóm acetyl (CH3CO-). Phổ khối ion âm ESI-MS của hợp chất này cho pic ion giả phân tử tại m/z 523 [M+HCl]- phù hợp với CTPT C30H49NO4 của hợp chất 168. Các dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 168 phù hợp với tài liệu [97]. Điều đó chứng tỏ rằng phản ứng amide hóa triacetate của asiatic acid và thủy phân dẫn xuất amide để thu được dẫn xuất 28-amide đã được thực hiện như trong sơ đồ phản ứng. Trong một hướng nghiên cứu khác để đánh giá hoạt tính của nhóm COOH (C- 28), amide 167 được dehydrat hóa thành nitrile 169 trong sự có mặt của acetyl chloride, và DMAP trong DCM ở nhiệt độ phòng. Acetyl chloride đóng vai trò loại nước. Sản phẩm của phản ứng là acetic acid và HCl. DMAP có vai trò bắt acid HCl tạo thành trong phản ứng này (vai trò xúc tác). Sau khi xử lý hỗn hợp phản ứng và tinh chế sản phẩm đã thu được dẫn xuất nitrile 169. Trên phổ hồng ngoại của 169 thấy xuất hiện tín hiệu ở 2228,9 cm-1 đặc trưng cho nhóm -CN. Phổ 1 H-NMR trong cùng dung môi CDCl3 không thấy xuất hiện tín hiệu của các proton amide bậc 1 ở 5,83 và 5,47 ppm như trong chất 168. Đặc biệt, phổ 13C- NMR xuất hiện tín hiệu ở 122,95 ppm đặc trưng cho nhóm -CN. Điều đó chứng tỏ, phản ứng dehydrat hóa xẩy ra khá dễ dàng với hiệu suất cao. 13 Hợp chất 169 cũng được thủy phân nhóm acetyl trong KOH và MeOH ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ thu được hợp chất 170 với hiệu suất 74%. Phổ 1H-NMR của hợp chất 170 không thấy xuất hiện các tín hiệu methyl singlet của các nhóm acetyl, đồng thời các tín hiệu của các proton gắn với cacbon mang oxi cũng xuất hiện về phía trường thấp hơn so với hợp chất 169 ở H (ppm): 3,30 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,54 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,74 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2). Phù hợp với kết quả trên, phổ 13C-NMR của hợp chất 170 cũng không còn các tín hiệu của các carbon trong nhóm acetyl tại vùng khoảng 170 ppm và vùng trường cao của nhóm methyl. Tín hiệu của nhóm – CN trong phổ 13C-NMR của chất 170 xuất hiện tại C: 126,41 ppm. Phổ khối ESI- MS ion âm có pic ion giả phân tử tại m/z 505 [M+HCl]- phù hợp với CTPT C30H47NO3. 4.3.1.2. Chuyển hóa hóa học vòng A của asiatic acid Sơ đồ 4.2: Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid Các tác nhân và điều kiện phản ứng: a) 2,2-dimethoxypropane, TsOH.H2O, rt., 7 h, 88%, b) succinic anhydride, DMAP, TEA, rt. 12 h, 74%, c) (CH3CO)2O, pyridine, rt. 12 h, 82%, d) 5% HCl, rt. 4h, 90%. Để nghiên cứu ảnh hưởng của các nhóm chức 2-, 3-, 23-hydroxyl đến hoạt tính sinh học của asiatic acid, một số phản ứng hóa học nhằm tạo ra các dẫn xuất có sự thay đổi ở vòng A đã được thực hiện như Sơ đồ 4. 2. Asiatic acid (1) được phản ứng đóng vòng với 2,2-dimethoxypropane có sự xúc tác của p-toluensulphonic acid (PTSA) ở nhiệt độ phòng trong 7 giờ. Sau khi xử lý hỗn hợp phản ứng (xem phần thực nghiệm 3.3.1) thu được hợp chất 3,23-dioxo 171 với hiệu suất cao (88%). Hợp chất 171 khi tác dụng với succinic anhydride trong triethylamine (TEA) và dimethylaminopyridine (DMAP) ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ thì cho hợp chất 172 có nhóm chức succinate ở vị trí C-2 với hiệu suất 74% sau khi tinh chế. Mặt khác, khi cho hợp chất 171 tác dụng với acetic anhydride trong pyridine ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ sẽ thu được hợp chất 3,23-dioxo-2-acetate 173 với 14 hiệu suất 82%. Thủy phân hợp chất 173 trong acid hydrochloric ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ sẽ cho dẫn xuất 2-O-acetyl-3,23-dihydroxyasiatic acid (174) với hiệu suất cao (90%). Cấu trúc của các hợp chất 171-174 được khẳng định thông qua phân tích phổ MS và NMR của chúng. Hợp chất 171: Hợp chất này cho phổ 1H-NMR và 13C-NMR tương tự như phổ của asiatic acid (1) ngoại trừ việc trong phổ 1H-NMR của hợp chất 171 có thêm 2 tín hiệu methyl singlet của nhóm dimethyldioxo mới tạo thành xuất hiện tại H (ppm): 1,42 (3H, s), 1,48 (3H, s), đồng thời tín hiệu cộng hưởng của H-23a, H-23b được dịch chuyển về phía trường thấp hơn so với 1 và xuất hiện tại 3,50 ppm (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23a), 3,56 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23b), so với 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b) do ảnh hưởng của nhóm dioxo mới tạo thành. Đối với proton H-3α sự dịch chuyển về phía trường thấp hơn là 0,04 ppm so với asiatic acid và xuất hiện tại H : 3,56 ppm. Trong phổ 13 C-NMR của hợp chất 171 xuất hiện thêm tín hiêu của nguyên tử carbon bậc 4 của nhóm dioxo tại C : 100,72 ppm (C-31). Thông qua sự hình thành ketal, tín hiệu C-3, C- 23 được chuyển sang trường thấp hơn và xuất hiện ở δC 83,03 và 73,66 ppm thay vì ở δC 69,68 và 66,31 trong asiatic acid (1) trong khi tín hiệu C-2 được chuyển sang trường cao hơn và xuất hiện ở δC 66,15 so với δC 78,17 ppm trong hợp chất 1. Phổ NMR của hợp chất 171 tương tự như tài liệu tham khảo [94]. Phù hợp với kết quả từ phổ 1H-NMR và 13C-NMR, phổ khối ESI-MS ion âm của hợp chất 171 cho pic ion giả phân tử tại m/z 527 [M-H]- ứng với CTPT C35H52O5 như trong sơ đồ phản ứng. Như vậy phản ứng đã thực hiện như dự đoán. Để có được một dẫn xuất succinate, được cho là có hoạt tính sinh học, hợp chất 171 đã phản ứng với anhydrit succinic trong DMAP và TEA ở nhiệt độ phòng để tạo ra succinat 172. Hợp chất 172: Phổ 1H-NMR của hợp chất 172 tương tự như phổ của hợp chất 171 và có xuất hiện thêm các tín hiệu cộng hưởng phù hợp với nhóm succinate mới được gắn vào, thể hiện ở tín hiệu tại H (ppm): 2,57 - 2,71 (4H, m, H-35, H- 36). Trên phổ 13C-NMR của hợp chất 172 có sự xuất hiện thêm 2 tín hiệu carbon cacboxylic tại C (ppm): 178,04 (C-37) và 171,71 (C-34) của nhóm succinat cùng với tín hiệu của 2 nhóm methylene ở vùng trường cao trùng lặp với các tín hiệu trong khung. Phổ ESI-MS ion âm của hợp chất 172 cho pic ion giả phân tử tại m/z 627 [M-H] - phù hợp với CTPT C37H56O8 như trong Sơ đồ 4. 2 cho hợp chất 172. Điều đó chứng tỏ phản ứng tạo succinat đã thành công. Hợp chất 173: Phổ 1H-NMR của hợp chất 173 có thêm một tín hiệu methyl singlet của nhóm 2-O-acetyl xuất hiện tại H (ppm): 2,01 so với phổ 1 H-NMR của hợp chất 171. Phổ 13C-NMR thêm một tín hiệu cộng hưởng của nhóm carbonyl ở C 170,62 ppm (CH3COO-) đồng thời xuất hiện thêm một tín hiệu –CH3 tại vùng 15 trường cao C (ppm): 21,15. Phổ khối ESI-MS ion âm m/z 569 [M-H] - phù hợp với CTPT C35H54O6 như trong sơ đồ phản ứng 4.2. Hợp chất 174: Phổ 1H-NMR của hợp chất 174 có thêm 1 tín hiệu methyl singlet của nhóm 2α-O-acetyl tại H (ppm): 2,07 (3H, s, CH3-CO) so với phổ 1 H-NMR của asiatic acid (1), đồng thời tín hiệu cộng hưởng của H-2β cũng bị dịch chuyển về phía trường thấp hơn và xuất hiện tại H (ppm): 5,03 (1H, dt, J = 4,5, 11,5 Hz, H-2β) trong khi ở asiatic acid ghi trong cùng dung môi thì H-2β xuất hiện tại H (ppm): 3,71 (1H, dt, J = 4,5, 9,5 Hz, H-2), ΔH = 5,03-3,71= 1,32 ppm. Phù hợp với dẫn xuất acetate tại C-2, phổ 13 C-NMR có xuất hiện thêm 2 tín hiệu thuộc nhóm acetyl tại C (ppm): 78,89 (C-2), 170,62 (CH3COO-). Phổ khối ESI-MS ion âm của hợp chất 174 có chứa pic ion giả phân tử tại m/z 531 [M-H]- phù hợp với CTPT C32H50O6. Như vậy cấu trúc của hợp chất 174 đã được khẳng định. 4.3.2. Các dẫn xuất của madecassic acid Sơ đồ 4.3: Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid Các tác nhân và điều kiện phản ứng: a) (CH3CO)2O, pyridine, rt., 12 h, 80%; b) oxalyl chloride, DCM, rt., 24 h, c) R1NH2, DCM, rt, 24 h; d) AcCl, DMAP, DCM, 2h, 75-80%; e) KOH, MeOH, rt, 16 h. Madecassic acid (10) được acetyl hóa với acetic anhydride trong pyridine ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ, xử lý hỗn hợp sau phản ứng như thường quy (xem phần thực nghiệm 3.2.2) sẽ cho madecassic acid 2,3,23-triacetate (175), hiệu suất 85%. Trong phản ứng này nhóm α-hydroxy ở vị trí C-6 không bị acetyl hóa do sự che chắn không gian của các nhóm C-24, C-25, C-26. Điều đó được chứng minh như sau: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 175 ta thấy xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm acetyl methyl đồng thời các methyl proton ở C-2, C-3, C-23 đã được dịch chuyển nhiều về phía trường thấp và xuất hiện tại H (ppm): 3,72 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3,93 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,01 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,24 (1H, dt, J = 5,0, 10,5 Hz, H-2). So với phổ của madecassic acid (10) các tín hiệu tương ứng xuất hiện tại 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,76 (1H, dt, J = 4,5, 11,5 Hz, H-2), và H-23b bị chồng lấp với tín 16 hiệu dung môi methanol. Trong khi tín hiệu của H-6α trong hợp chất 175 hầu như không thay đổi và xuất hiện tại H (ppm): 4,34 (s), và ở 10 tín hiệu này là 4,40 (br s). Điều đó chứng tỏ nhóm 6-β-OH không bị acetyl hóa. Phù hợp với kết quả này phổ hồng ngoại của hợp chất 175 vẫn cho các đỉnh hấp thụ của nhóm hydroxy ở 3534 cm-1 bên cạnh 2 đỉnh hấp thụ mạnh ở 1734 cm-1 và 1245 cm-1 của nhóm acetate. Phổ khối ion âm ESI-MS của 175 cho pic ion giả phân tử tại m/z: 629 [M-H]-. Hợp chất 175 được cho tác dụng với oxalyl chloride trong DCM ở nhiệt độ phòng để tạo thành acid chloride 176. Hợp chất 176 không cần tách và tinh chế được cho phản ứng luôn với các amin tương ứng ở nhiệt độ phòng. Sau khi xử lý hỗn hợp phản ứng như trong phần thực nghiệm 3.3.2 thu được các amide tương ứng 177-185. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 177-185 được khẳng định thông qua phổ khối, phổ 1H- và 13C-NMR của chúng. Hợp chất 177: Phổ 1H-NMR của hợp chất 177 có chứa thêm các tín hiệu của mạch nhánh amide thông qua các tín hiệu cộng hưởng của 4 proton trong nhóm – CH2-OH tại H (ppm): 3,73 (4H, br s, H-2', -OH) và tín hiệu của 4 proton của nhóm –NCH2 tại 3,53-3,56 (2H, br s, H-2'); các tín hiệu khác trùng hợp với phổ của 175. Ở phổ 13C-NMR của hợp chất 177 có xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm – CH2OH ở mạch nhánh tại C ppm = 61,53 (C-2'), 60,91 (C-2'). Hợp chất 178: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất này xuất hiện tín hiệu của nhóm –NH-CH2- tại H: (7,31 (t, J = 5,5 Hz, –NH) và 7,39 (t, J = 5,5 Hz, –NH) đồng phân) bên cạnh các tín hiệu tại 3,61 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-3', -CH2-OH), 3,27-3,36 (1H, m, H-1', -CH2-NH-), 3,18-3,22 (1H, m, H-1', -CH2-NH-). Tín hiệu của nhóm –CH2 còn lại của mạch nhánh xuất hiện trùng với các tín hiệu của khung trong vùng trường cao hơn. Phổ 13C-NMR của hợp chất này xuất hiện các tín hiệu của nhóm methylene xen lẫn với các tín hiệu khác của khung madecassic acid trong vùng trường cao và tín hiệu của -CH2-OH tại C: 61,52 (C-3'). Phổ hồng ngoại của hợp chất này có chứa cụm tín hiệu mạnh của nhóm –OH liên kết cầu hydro tại 3500 và 3379 cm-1 cùng với đỉnh hấp thụ tại 1584 cm-1. Điều đó chứng tỏ hợp chất 178 đã được tạo thành như trong sơ đồ phản ứng. Hợp chất 179: So với phổ 1H-NMR của hợp chất 175 thì trong phổ 1H-NMR của hợp chất 179 xuất hiện thêm các tín hiệu của hai methyl doublet của nhóm isopropyl chồng lấp với các tín hiệu của khung madecassic acid triacetate trong vùng H: 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,07 (3H, s) cùng với các tín hiệu khác của mạch nhánh tại H: 5,59 (1H, d, J = 7,0 Hz, -NH), 3,84-3,88 (1H, m, H-1', -NH- CH-(CH3)2). Phù hợp với phổ 1 H-NMR, ở phổ 13C-NMR của hợp chất 179 có chứa các tín hiệu cộng hưởng của carbon tương ứng trong mạch nhánh. Hợp chất 180: Phổ 1H-NMR của hợp chất 180 thấy xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm –NH2 amide tại H (ppm): 5,83 (1H, br s, -NH2) và 6,34 (1H, br s, -NH2) so với hợp chất 175. Phổ hồng ngoại của hợp chất 180 có đỉnh hấp thụ mạnh tại 3478 cm-1 (- NH2) cùng với đỉnh hấp thụ tại 1660 cm -1 (-CN). Trong phổ khối ESI-MS ion dương 17 của hợp chất 180 có pic m/z 652 [M+Na]+ phù hợp với CTPT của hợp chất 180 là C36H55NO8. Như vậy phản ứng đã xảy ra như dự kiến ở Sơ đồ 4. 3. Hợp chất 181: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 181 thấy xuất hiện thêm các tín hiệu cộng hưởng của mạch nhánh tại H: 2,69 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1’), 3,12- 3,15 (2H, m, H-7’). Các tín hiệu của các proton còn lại của mạch nhánh trùng lặp với các proton khác trong khung ở vùng trường cao. Phổ 13C-NMR của chất này có xuất hiện các tín hiệu của nhóm –CH2 mạch nhánh chồng lấp với các tín hiệu carbon của khung. Trong phổ khối ESI-MS ion dương thấy xuất hiện mảnh ion tại m/z 743 [M+H] + phù hợp với CTPT C43H70N2O7 của hợp chất 181. Điều đó chứng minh phản ứng xảy ra như dự kiến. Hợp chất 182: Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất 182 có chứa pic ion giả phân tử tại m/z 771 [M+H]+ phù hợp với CTPT C45H74N2O8 của hợp chất 182. Phù hợp với kết quả này trên phổ 1H-NMR của hợp chất 182 xuất hiện cụm tín hiệu tại H: 2,78 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1’), 3,09-3,20 (2H, m, H-9’). Các tín hiệu khác của nhóm methylene mạch nhánh chồng lấp với các tín hiệu của khung madecassic acid trong vùng trường thấp. Phổ 13C-NMR của chất này có xuất hiện thêm các tín hiệu của nhóm methylene mạch nhánh xen lẫn trong vùng tín hiệu của khung. Như vậy cấu trúc của hợp chất 182 đã được khẳng định. Hợp chất 183: Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất 183 có chứa pic ion giả phân tử tại m/z 785 [M+H]+ phù hợp với CTPT C46H76N2O8 của hợp chất 183. Phổ 1H-NMR của chất này có các tín hiệu của nhóm –CH2-NH2 tại H: 2,13-2,39 (1H, m, H-1’), 2,55-2,57 (1H, m, H-1’), 3,02-3,09 (2H, m, H-10’). Các tín hiệu proton của các nhóm CH2 khác chồng lấp với các proton của khung trong vùng trường cao. Phổ 13C-NMR cũng phù hợp với cấu trúc trên khi có chứa các tín hiệu của nhóm methylene xuất hiện trùng với các tín hiệu khác của khung. Điều đó chứng tỏ phản ứng tổng hợp 183 đã xảy ra như dự kiến (Sơ đồ 4. 3). Trên phổ 1H-NMR của amide 184 quan sát thấy tín hiệu triplet ở δ (ppm): 5,41 (1H, t-like, -NH) đặc trưng cho liên kết amide. Ngoài các tín hiệu phổ của 175, còn quan sát thấy tín hiệu ở δ (ppm): 3,19-3,20 (1H, m, H-1’a), 3,29-3,30 (1H, m, H- 1’b), 4,12 (2H, q, J = 7,0 Hz, H-1’’) nhóm tín hiệu và hằng số tương tác này đặc trưng cho độ dịch chuyển hóa học nhóm methylene của glycine. Trong phổ 13C-NMR có các tín hiệu của nhóm methylene gắn với -COOCH2CH3 của mạch nhánh xuất hiện tại C : 62,20 ppm (C-1’’). Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 716 [M+H]+ phù hợp với CTPT C40H61NO10. Trên phổ 1H-NMR của amide 185 ngoài các tín hiệu của 175, quan sát thấy sự xuất hiện 3 tín hiệu singlet của các proton vòng imidazole ở δ (ppm): 7,04 (1H, s, H-4’), 7,52 (1H, s, H-2’), 8,24 (1H, s, H-5’). Phổ 13C-NMR có chứa các tín hiệu của mạch nhánh imidazole ở δ (ppm): 138,05 (C-2’), 129,87 (C-5’), 119,37 (C-4’). Hợp chất 186-191: Từ các hợp chất 177-183 được thủy phân trong dung dịch KOH trong MeOH ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ. Xử lý hỗn hợp phản ứng như 18 trong phần thực nghiệm 3.3.2. Sau khi tinh chế sản phẩm thu được các hợp chất 186-191 với hiệu suất từ 75-90%. Cấu trúc của các hợp chất 186-191 cũng được khẳng định khi phân tích phổ IR, MS, NMR của chúng. Hợp chất 186: Phổ khối ESI-MS của hợp chất 186 có pic ion giả phân tử tại m/z 592 [M+H] + phù hợp với CTPT C34H57NO7 của hợp chất 186. Phổ 1 H-NMR của hợp chất này không thấy sự có mặt của các nhóm methyl singlet của acetyl quanh vùng H khoảng 2 ppm. Thêm vào đó phổ 1 H-NMR có các pic của proton gắn với carbon mang oxy tại vị trí C-2, C-3, C-23, C-6 xuất hiện tại H (ppm): 4,00-4,04 (3H, m, H-23a, H-23b,-OH), 4,16-4,17 (1H, m, H-2), 4,24 (1H, br s, H- 6), 4,31 (1H, br s, H-3) ngoài ra còn thấy các tín hiệu cộng hưởng của nhóm –OH tại H là 4,72 (2H, br s, -OH) và 4,03 (1H, br s) bên cạnh các tín hiệu xuất hiện tại H từ 3,10–3,11 (2H, m, H-1’), và 3,19-3,20 (2H, m, H-1’), 3,47-3,49 (4H, m, H- 2’). Phù hợp với kết quả trên, phổ 13C-NMR của hợp chất này cũng không chứa các tín hiệu cộng hưởng của nhóm acetyl carbonyl quanh vùng 170 ppm cũng như các tín hiệu acetyl methyl ở vùng trường cao. Các kết quả trên phù hợp với sản phẩm tạo thành theo Sơ đồ 3. Hợp chất 187: Trên phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 187 có chứa các đỉnh hấp thụ mạnh của các nhóm –OH liên kết cầu hydro từ 3500-3379 cm-1, đỉnh hấp thụ của nhóm chức acetate cũng không xuất hiện trong phổ IR. Trong phổ 1H- NMR không xuất hiện các tín hiệu methyl singlet tại H trong khoảng 2 ppm đồng thời xuất hiện tín hiệu tại 7,28 (t, J = 5,5 Hz, -NH), 7,36 (t, J = 5,5 Hz, -NH), các tín hiệu của H-2, H-3, H-23a và H-23b đã dịch chuyển về phía trường cao và xuất hiện tại H: 3,32-3,33 (H-3’ chồng lấp), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,59- 3,63 (3H, m, H-3, H-23b, H-3’), 3,73-3,76 (1H, m, H-2). Điều đó chứng tỏ phản ứng thủy phân đã xảy ra hoàn toàn. Hợp chất 188: Phổ 1H-NMR của hợp chất 188 có chứa các tín hiệu của proton gắn với carbon mang oxi chuyển dịch về phía trường cao xuất hiện tại H (ppm): 3,32 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,74-3,79 (1H, m, H-2) trong khi tín hiệu của H-6α không thay đổi xuất hiện tại H: 4,40 ppm (1H, s). Phổ 13 C-NMR của hợp chất này cũng không có các tín hiệu cộng hưởng của nhóm acetyl carbonyl trong vùng khoảng 170 ppm, và các nhóm acetyl methyl ở vùng trường cao. Chứng tỏ hợp chất 188 đã được tạo thành. Phổ ESI-MS ion dương cho mảnh ion tại m/z là 488 (100, [M+3-H2O] 3+ ). Phổ hồng ngoại cho thấy cụm đỉnh hấp thụ của nhóm hydroxyl liên kết cầu hydro trong vùng 3500-3245 cm-1. Như vậy cấu trúc của hợp chất này đã được khẳng định phù hợp với CTPT là C30H49NO5. Hợp chất 189: Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này có pic ion giả phân tử tại m/z là 617 (100, [M+H]+) phù hợp với CTPT C37H64N2O5 của nó. Phổ 1 H-NMR có tín hiệu của nhóm –NH2 tại H: 7,14 (t, J = 5,5 Hz, – NH) và 7,20 (t, J = 5,5 Hz, – NH) và các tín hiệu proton gắn với carbon mang oxy cũng bị dịch 19 chuyển về phía trường cao xuất hiện tại H (ppm): 3,30 (H-3 trùng với dung môi) và 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,74 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), các tín hiệu của methylene mạch nhánh xuất hiện trong khoảng từ H (ppm): 2,95 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1’), 3,12-3,19 (2H, m, H-7’). Phổ 13C-NMR của hợp chất này không chứa các tín hiệu của acetyl carbonyl trong vùng C khoảng 170 ppm, và acetyl methyl trong vùng trường cao khoảng 17-19 ppm. Điều này chứng tỏ hợp chất 189 đã được hình thành như sơ đồ phản ứng. Hợp chất 190: Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất 190 có pic ion giả phân tử tại m/z là 645 ([M+H]+) phù hợp với CTPT C39H68N2O5. Phổ 1 H-NMR của hợp chất này cho thấy rõ ràng các tín hiệu của proton gắn với carbon mang oxy xuất hiện tại H (ppm): 3,32 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,74-3,78 (1H, m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6) cùng với các tín hiệu của mạch nhánh tại H: 2,76 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1’), 3,09- 3,18 (2H, m, H-9’). Các tín hiệu của nhóm methylene mạch nhánh còn lại chồng lấp với các tín hiệu của khung. Phổ 13C-NMR cho thấy không còn các tín hiệu của acetyl carbonyl quanh vùng C: 170 ppm và acetyl methyl quanh vùng từ 19.07-19.32 ppm. Như vậy hợp chất 190 đã được tạo thành như trong sơ đồ phản ứng. Hợp chất 191: Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất 191 cho pic ion giả phân tử tại m/z 659 [M+H]+ phù hợp với CTPT C40H70N2O5 của hợp chất 191. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất này cho thấy các tín hiệu của proton gắn với carbon mang oxy tại H (ppm): 3,33 (H-3, trùng dung môi), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,73-3,78 (1H, m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6). Các nhóm –CH2 của mạch nhánh xuất hiện tại H (ppm): 2,78 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1’), 3,09-3,19 (2H, m, H-10’). Các tín hiệu methylene còn lại của mạch nhánh xuất hiện trong vùng trường cao hơn chồng lấp với các tín hiệu của khung madecassic acid. Phổ 13C-NMR cũng cho các kết quả phù hợp với cấu trúc của hợp chất 191. Các dữ liệu cấu trúc trên chứng tỏ phản ứng thủy phân 183 tạo thành 191 xảy ra hoàn toàn. 4.4. Thử hoạt tính sinh học 4.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro 4.4.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các dẫn xuất của asiatic acid Asiatic acid (1) phân lập từ cây rau má Việt Nam cùng với 28 dẫn xuất tổng hợp được, gồm dẫn xuất triacetyl 145, các hợp chất 147-160, 162-165 và 171-174 đã được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư người là KB (ung thư biểu mô, human epidermoid carcinoma), HepG2 (ung thư gan, hepatocellular carcinoma) and Lu (ung thư phổi, lung cancer), với đối chứng dương là ellipticine. Trừ dẫn xuất triacetyl 145, 167, 168, 171, tất cả 25 hợp chất tổng hợp được đều là hợp chất mới. 20 Kết quả thử nghiệm hoạt tính là rất khả quan. Cụ thể như sau: 8 hợp chất (152, 154, 155, 157, 158, 159, 160, và 167) có hoạt tính gây độc tế bào rất mạnh (IC50 < 2 µM) đối với ít nhất một dòng tế bào thử nghiệm. 8 hợp chất, gồm 151, 152, 153, 155, 158, 159, 160 và 167 thể hiện hoạt tính mạnh (IC50 < 10 µM) trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm. Các hợp chất có hoạt tính mạnh gồm 155, 160 và 167 với các giá trị IC50 trên các dòng tế bào KB, Hep G2 và Lu lần lượt là 155: 1,31, 1,33, 0,85; 160: 1,11, 1,09, 1,27 và 167: 0,67, 0,82, 9,30 µM, các giá trị IC50 tương ứng của dẫn xuất 145 lần lượt là 36,32, 39,77, 89,32 và của hợp chất đối chứng dương ellipticine là 1,42, 1,83 và 2,15 µM. Hai hợp chất (169 và 157) thể hiện hoạt tính mạnh trên 2 dòng tế bào ung thư KB và HepG2 với các giá trị IC50 lần lượt là: 154 (1,95 và 8,50 µM), 157 (0,70 và 0,70 µM). Một hợp chất (148) thể hiện hoạt tính mạnh trên 1 dòng tế bào ung thư KB (IC50 8,74 µM). Các hợp chất còn lại được coi như có hoạt tính trung bình, không mạnh hoặc không đáng kể (IC50 > 10 µM). Hai hợp chất 165 và 162 không thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm trong nghiên cứu này. Các kết quả được trình bày ở Bảng 4.3. Bảng 4.3: Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các dẫn xuất tổng hợp của asiatic acid Hợp chất IC50 (µM) Hợp chất IC50 (µM) KB HepG2 Lu KB HepG2 Lu 1 61,9 65,57 120,3 160 1,11 1,09 1,27 145 36,32 39,77 89,32 161 n.d n.d n.d 147 23,70 81,25 69,49 162 n.a n.a n.a 148 8,74 32,12 42,04 163 122,10 186,80 103,02 149 4,16 12,74 8,84 164 35,93 192,22 80,40 150 23,67 21,58 74,68 165 n.a n.a n.a 151 4,03 3,06 3,85 166 n.a n.a n.a 152 1,39 1,99 4,14 167 0,67 0,82 9,30 153 4,89 6,52 8,05 168 3,51 2,75 17,54 154 1,95 8,50 86,31 169 29,18 31,48 33,29 155 1,31 1,33 0,85 170 38,93 42,22 42,62 156 n.a n.a n.a 171 33,86 109,13 142,41 157 0,70 0,70 37,39 172 94,62 203,82 125,78 158 1,78 1,54 2,33 173 20,46 28,40 34,05 159 1,34 1,17 2,51 174 50,94 144,36 151,85 Ellipticine 1,42 1,83 2,15 *n.a: không có hoạt tính *n.d: không thử Các kết quả thử nghiệm hoạt tính nêu trên cho phép đưa ra các nhận xét sau: 21 Trong hầu hết các trường hợp, chuyển hóa nhóm 28-COOH của hợp chất triacetyl asiatic acid (145) thành các dẫn xuất amide đều làm tăng hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng ung thư thử nghiệm (147-155, trừ hợp chất 156). Acetyl hóa các nhóm OH và NH ở mạch nhánh amide ở C-28 sẽ làm tăng hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm (157-160). Thủy phân các nhóm acetyl ở vị trí C-2α, C-3β, C-23 của vòng A sẽ làm giảm mạnh hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm (162-165). Chuyển hóa nhóm amide ở C-28 thành nhóm nitrile không làm tăng đáng kể hoạt tính gây độc tế bào (169 và 170). Khi nhóm 28-COOH được giữ nguyên thì việc chuyển hóa các nhóm OH ở vòng A không có tác động đáng kể đến hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm (171-174). Jing và các cs. đã tổng hợp được 15 dẫn xuất của asiatic acid với các amino acid và amino acid ester và xác định hoạt tính chống khối u và hoạt tính chống tạo mạch (antiangiogenic activity) của chúng. Các tác giả này cũng dùng asiatic acid làm chất đầu, tiến hành các phản ứng acetyl hóa với acetic anhydride/pyridine, sau đó cho phản ứng tiếp với oxalyl chloride, thu được acyl chloride. Phản ứng của các acyl chloride thu được với các amino acid methyl ester hydrochloride cho các amide tương ứng với hiệu suất cao. Cũng theo con đường này, Li J-F và các cs. (2015) đã điều chế được một loạt các dẫn xuất của các aniline thế với 11-oxo- asiatic acid và 2,3,23-triacetyl-11-oxoasiatic acid với hiệu suất cao. Các tác giả này nhận thấy các dẫn xuất giữa 2,3,23-triacetyl asiatic acid và amino acid methyl ester thu được có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn nhiều so với các hợp chất 2,3,23-trihydroxyl tương ứng cũng như so với bản thân asiatic acid. Các kết quả thử nghiệm hoạt tính của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với kết quả của các công bố này. 4.4.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các dẫn xuất của madecassic acid Trong tổng số 17 dẫn xuất mới của madecassic acid tổng hợp được thông qua việc tạo liên kết amide ở vị trí C-28 có 13 dẫn xuất được thăm dò hoạt tính kháng ung thư trên ba dòng tế bào ung thư thực nghiệm là: ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu-1). Ellipticine được dùng làm chất đối chứng dương. Các kết quả về hoạt tính kháng tế bào ung thư có thể được tổng kết lại như sau: Tất cả các dẫn xuất được thử nghiệm đều cho hoạt tính kháng ít nhất một, hai hoặc cả ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm cao hơn, thậm chí một vài hợp chất cao hơn gấp gần một trăm lần madecassic acid (thể hiện ở giá trị IC50). Cụ thể như sau: Hợp chất 179 có giá trị IC50 lần lượt là 1,28, 1,30 và 0,83 µM đối với các dòng tế bào ung thư KB, HepG2 và Lu-1 so với giá trị IC50 của hợp chất 175 (2α,3β,23- triacetoxy madecassic acid) là 43,81, 121,44 và 127,75 tương ứng. Hợp chất 184 có giá trị IC50 lần lượt là 0,85, 1,12 và 2,01 µM đối với các dòng tế bào ung thư tương ứng. 22 Hợp chất 185 có giá trị IC50 lần lượt là 1,25, 1,62, 2,01 µM đối với các dòng tế bào ung thư tương ứng. Các kết quả cụ thể được trình bày ở Bảng 4.4. Tương tự như ở các dẫn xuất asiatic acid, khi thủy phân các nhóm chức acetate ở vị trí C-2, C-3, C-23 của các dẫn xuất 28-amide thì hoạt tính kháng tế bào ung thư thực nghiệm đều giảm đi so với các dẫn xuất 2,3,23-acetyl. Tuy nhiên, hoạt tính của chúng vẫn còn mạnh hơn hoạt tính của madecassic acid (trường hợp các hợp chất 188, 190, 191) Kết luận chung: Vị trí C-28 và C-2, C-3, C-23 của madecassic acid có vai trò quan trọng đối với hoạt tính kháng tế bào ung thư của madecassic acid. Các dẫn xuất 28-amide và 2α,3β,23-triacetyl của madecassic acid đều có hoạt tính mạnh hơn madecassic acid rất nhiều. Bảng 4.4: Hoạt tính gây độc tế bào của dẫn xuất madecassic acid Hợp chất IC50 (µM) KB HepG2 Lu-1 10 157,30 178,77 160,52 175 43,81 121,44 127,75 177 n.d n.d n.d 178 79,46 186,32 186,32 179 1,28 1,30 0,83 180 5,41 10,68 11,92 181 3,13 4,00 3,92 182 2,66 3,06 3,70 183 1,70 2.07 2.61 184 0,85 1.12 2.01 185 1,25 1,62 2,01 186 n.d n.d n.d 187 n.d n.d n.d 188 48,11 53.20 44.81 189 33,25 175.80 190.94 190 14,75 74.07 15.90 191 7,31 8,00 5,86 Ellipticine 1,42 1,83 2,15 n.d: không thử Các kết quả thử nghiệm hoạt tính nêu trên cho phép đưa ra các nhận xét sau: Trong hầu hết các trường hợp, chuyển hóa nhóm 28-COOH thành amide làm tăng hoạt tính gây độc tế bào (hợp chất 179-185, trừ hợp chất 178). Thủy phân các nhóm acetyl ở vòng A làm giảm mạnh hoạt tính gây độc tế bào (hợp chất 188-189). 23 Qua kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các dẫn xuất của madecassic acid chúng tôi thấy: Trong 12 hợp chất tổng hợp được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư người là KB (ung thư biểu mô, human epidermoid carcinoma), HepG2 (ung thư gan, hepatocellular carcinoma) và Lu (ung thư phổi, lung cancer), chứng dương là ellipticine. 8 trong số các hợp chất thử nghiệm (179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 và 191) thể hiện hoạt tính mạnh trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm là KB, HepG2 và Lu 11 hợp chất (179-185, 188-191) có hoạt tính mạnh hơn rõ rệt so với madecassic acid (10) và dẫn xuất 2,3,23-triacetyl (175) của nó. Acetyl hóa các nhóm 2,3,23-trihydroxy hoặc/và acetyl hóa mạch nhánh amide ở C-28 làm tăng đáng kể hoạt tính so với các hợp chất có các nhóm OH hoặc/và NH2 tự do tương ứng. 4.4.2. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) Asiatic acid chiết tách từ cây rau má đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây độc gan bằng paracetamol. Sự sai khác về các giá trị ở lô thử mẫu so với lô đối chứng bệnh lý là có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) đối với AST, ALT và khối lượng gan chuột. Kết quả được trình bày trong bảng 4.5, 4.6, 4.7 như sau: Bảng 4.5: Sự thay đổi các chỉ số AST ( UI/ L) và ALT (UI/L) ở các lô thí nghiệm Lô TN Chỉ tiêu Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5 AST 84,25 ±9,53 508,25 ±6,99 272,83 ±15,31 320,50±14,97 337,00±19,44 ALT 47,52 ±11,77 325,25 ±4,92 201,35±8,42 232,75±12,45 242,50±13,38 Kết quả ở bảng 4.5 cho thấy asiatic acid ở liều 20 mg/kgP/ ngày và liều 4 mg/ kgP/ngày đều có tác dụng bảo vệ gan. Sự sai khác so với các lô đối chứng là có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Bảng 4.6: Khối lượng gan chuột (g/10g cơ thể) ở các lô thí nghiệm Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5 0,86±0,17 1,55±0,17 0,92±0,11 1,18±0,17 1,18±0,15 Kết quả ở bảng 4.6 cho thấy ở lô đối chứng bệnh lý (Lô 2) khối lượng gan là lớn nhất.Ở các lô sử dụng chất bảo vệ (lô 3, 4, 5) khối lượng gan nhỏ hơn. Sự sai khác này có ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng bệnh lý (P < 0,05) Kết quả kiểm tra trực quan tổn thương gan cho thấy: ở lô đối chứng bệnh lý gan nhạt màu, nhu mô gan to, nổi rõ, ở các lô khác gan bình thường, nhu mô gan đồng nhất. Bảng 4.7: Hàm lượng MDA (nmol/ml đồng thể) trong gan chuột thí nghiệm Lô TN Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5 MDA 304,77±6,66 420,31±27,36 330,27±7,45 397,78±24,78 400,69±8,15 Kết quả ở bảng 4.7 cho thấy hàm lượng MDA ở các lô có sử dụng chất bảo vệ đều thấp hơn lô đối chứng bệnh lý. 24 4.5. Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp trên mô hình tế bào (docking phân tử) SIRT 1 (Sirtuin 1, NAD-dependent deacetylase sirtuin type 1) và 17β-HSD1 (17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1) là hai enzyme có liên quan đến một số quá trình xúc tiến ung thư. Khả năng tương tác về lý thuyết giữa các chất tổng hợp được với hai enzyme này đã được tính toán bằng phương pháp docking phân tử và phân tích pharmacophore. Kết quả docking phân tử cho thấy năng lượng liên kết của các chất với SIRT1 (ID: 4151) nằm trong khoảng từ -6,6 đến -8,5 Kcal/mol (asiatic acid: -7,7 Kcal/mol) và năng lượng liên kết với 17β-HSD1 (ID: 3KLM) nằm trong khoảng từ -8,2 đến -10,1 Kcal/mol (asiatic acid: -8,6 Kcal/mol). Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận 1. Đã tiến hành xác định hàm lượng của hai hợp chất triterpene chính là asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má thu tại Sơn Tây (Hà Nội), tỉnh Nam Định và thành phố Hồ Chí Minh bằng phương pháp sắc ký cột và phương pháp HPLC. Kết quả cho thấy hàm lượng của hai triterpene trên trong mẫu rau má Sơn Tây là cao nhất: asiatic acid là 0,72%, madecassic acid là 0,89% so với nguyên liệu khô. Rau má thu tại Sơn Tây đã được lựa chọn làm nguyên liệu để chiết suất asiatic và madecassic acid phục vụ cho các chuyển hóa hóa học. 2. Đã tổng hợp và khẳng định cấu trúc của 29 dẫn xuất của asiatic acid thông qua việc tạo ra các amide ở vị trí C-28 và chuyển hóa các nhóm hydroxy ở vị trí C-2, C-3, C-23. Trong số các hợp chất tổng hợp được có 25 hợp chất mới, chưa được công bố trong tài liệu (chất 147-166, 169-170, 172-174). 3. Từ madecassic acid đã tổng hợp được 17 dẫn xuất mới thông qua việc tạo ra các amide ở vị trí C-28 và acetyl hóa các nhóm hydroxy ở C-2, C-3 và C-23 của madecassic acid (chất 175-191). Cấu trúc của tất cả các dẫn xuất tổng hợp được khẳng định thông qua phân tích các phổ FT-IR, MS và NMR một chiều và hai chiều của chúng. 4. Đã thăm dò hoạt tính bảo vệ gan của asiatic acid chiết tách từ cây rau má trên mô hình gây độc gan chuột bằng paracetamol. Kết quả cho thấy asiatic acid có hoạt tính bảo vệ gan có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng. 5. Đã thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư trên ba dòng là KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan) và Lu-1 (ung thư phổi) của 28 dẫn xuất của asiatic acid và 14 dẫn xuất của madecassic acid tổng hợp được. Hầu hết dẫn xuất tổng hợp đều có hoạt tính cao hơn đáng kể so với hợp chất đầu. Có nhiều hợp chất có hoạt tính cao hơn hợp chất đầu từ 60 đến gần 100 lần trên cả ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Kết quả này hứa hẹn khả năng tìm ra hợp chất mới có hoạt tính kháng ung thư cao, góp phần phát triển ngành Hóa dược. 5.2. Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn xuất tổng hợp được trên các dòng tế bào khác và trên động vật thực nghiệm. 25 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Loc Tran Van, Quynh Nhu Vo Thi, Chien Tran Van, Phuong Thao Tran Thi, Thanh Nguyen Tuan, Thu Ha Le Thi, Sung Tran Van, Synthesis of asiatic acid derivatives and their cytotoxic activity, 2017, bản thảo gởi Natural product research. 2. Loc Tran Van, Quynh Nhu Vo Thi, Chien Tran Van, Phuong Thao Tran Thi, Thu Ha Le Thi, Sung Tran Van, Synthesis of madecassic acid derivatives and their cytotoxic activity, 2017, bản thảo gởi Zeitschrift für Naturforschung B. 3. Võ Thị Quỳnh Nhƣ, Lê Thị Thu Hà, Trần Thị Phương Thảo, Trần Văn Lộc, Hoạt tính bảo vệ gan của axit asiatic tách từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban, 2016, Tạp chí Hóa học, T. 54 (5), 540-541. 4. Vo Thi Quynh Nhu, Tran Thi Phuong Thao, Tran Van Sung, Tran Van Loc, Screening for the main triterpenic acids in Centella asiatica samples from north and south of Vietnam, Vietnam Journal of Chemistry, International Edition, 2016, T. 54 (4), 416-418. 5. Võ Thị Quỳnh Nhƣ, Trần Văn Lộc, Trần Thị Phương Thảo, Nguyễn Tuấn Thành, Lê Thị Thu Hà, Trần Văn Sung, Thành phần hóa học của cây rau má Centella asiatica (L.) Urban thu hái tại thành phố Hồ Chí Minh, 2016, Tạp chí Hóa học, T. 54 (3), 373-376. 6. Trần Văn Lộc, Võ Thị Quỳnh Nhƣ, Lê Thị Thu Hà, Nguyễn Minh Thư, Trần Văn Sung , Tổng hợp một số dẫn xuất của axit madecassic phân lập từ cây rau má (Centella asiatica (L.) Urban) của Việt Nam, 2014, Tạp chí Hóa học, T. 52 (4), 508-513.