[Tóm tắt] Luận án Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hai loài tầm gửi Taxillus chinensis (DC.) Dans. và Macrosolen tricolor (L.) Dans.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ XUÂN GIANG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HAI LOÀI TẦM GỬI TAXILLUS CHINENSIS (DC.) DANS. VÀ MACROSOLEN TRICOLOR (L.) DANS. TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Chuyên ngành : DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN Mã số : 62.72.04.06 Hà Nội, năm 2014 Công trình được hoàn thành tại: - Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội. - Viện Hóa học, Viện Hóa sinh biển, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội. Người hướng dẫn khoa học: 1. GS., TS. Phạm Thanh Kỳ. Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại Trường Đại học Dược Hà Nội vào hồi giờ ngày tháng năm . Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam. - Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội. A. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Họ Tầm gửi là một họ lớn gồm khoảng 40 chi, 1400 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, một số ít ở vùng ôn đới. Thành phần hóa học của họ Tầm gửi có nhiều lớp chất có hoạt tính sinh học như các flavonoid, các hợp chất phenolic và các pentacyclic triterpen, coumarin, saponin, acid hữu cơ, chất béo, đường khử, steroid, polysaccharid Cho đến nay những công bố về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các loài tầm gửi trên thế giới còn rất ít. Để góp phần tìm hiểu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của một số loài tầm gửi đang được dùng theo kinh nghiệm dân gian ở một số địa phương, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hai loài tầm gửi Taxillus chinensis (DC.) Dans. và Macrosolen tricolor (L.) Dans.” 2. Mục tiêu của luận án - Mô tả đặc điểm thực vật, thẩm định tên khoa học, xác định đặc điểm vi học loài tầm gửi ký sinh trên cây Gạo (Taxillus chinensis (DC.) Dans.) và loài tầm gửi ký sinh trên cây Na (Macrosolen tricolor (L.) Dans.). - Nghiên cứu thành phần hóa học của 2 loài tầm gửi trên. - Xác định độc tính cấp và một số tác dụng sinh học (tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, tác dụng chống viêm, tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư) của 2 loài tầm gửi trên. 3. Những đóng góp mới của luận án 3.1. Về thực vật Đã xác định tên khoa học của 2 loài tầm gửi nghiên cứu và mô tả chi tiết đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi học 2 loài này. 3.2. Về hóa học Đã chiết xuất, phân lập được từ 2 loài nghiên cứu 13 hợp chất và tất cả đều xác định được cấu trúc hóa học. Trong đó, có 2 hợp chất mới lần đầu phân lập được từ tự nhiên, 4 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Taxillus, 2 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Macrosolen, 4 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài Taxillus chinensis kí sinh trên cây Gạo và 1 hợp chất từ loài Macrosolen tricolor ký sinh trên cây Na. 3.3. Về tác dụng sinh học - Không xác định được LD50 của dịch chiết tầm gửi loài Taxillus chinensis kí sinh trên cây Gạo và của Macrosolen tricolor ký sinh trên cây Na với liều cao nhất có thể cho chuột uống (300g/kg thể trọng chuột). - Đã chứng minh cao lỏng tầm gửi Taxillus chinensis kí sinh trên cây Gạo và Macrosolen tricolor ký sinh trên cây Na đều có tác dụng bảo vệ gan qua việc hạn chế tăng trọng lượng gan, hạn chế tăng hoạt độ enzym AST, ALT và hạn chế tổn thương đại thể và vi thể gan. Cao lỏng tầm gửi Taxillus chinensis có tác dụng chống oxy hóa qua việc làm giảm hàm lượng MDA. - Cao lỏng tầm gửi Taxillus chinensis ký sinh trên cây Gạo và Macrosolen tricolor ký sinh trên cây Na đều có tác dụng chống viêm cấp thông qua việc làm giảm thể tích chân chuột, giảm số lượng dịch rỉ viêm, giảm hàm lượng protein trong dịch rỉ viêm, giảm số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm. - Đã chứng minh 3 hợp chất phân lập từ tầm gửi Taxillus chinensis ký sinh trên cây Gạo là quercitrin, catechin, quercituron có hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH, còn hợp chất (24s) - 24 - Ethylcholesta 5, 22 (E), 25 - trien - 3β - ol không có hoạt tính chống oxy hóa và cả 4 hợp chất trên đều không có hoạt tính gây độc tế bào với 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm (Hep-G2,Lu,RD). Những kết quả trên là thông báo đầu tiên về tác dụng sinh học của 2 loài tầm gửi nghiên cứu. 4. Ý nghĩa của luận án - Xác định tên khoa học của 2 loài tầm gửi nghiên cứu đã giúp cho kết quả nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh học được khẳng định rõ nguồn gốc. - Xác định đặc điểm vi học góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu. - Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học đã phát hiện 2 chất mới lần đầu tiên phân lập từ tự nhiên, những hợp chất lần đầu tiên phân lập từ chi Taxillus và chi Macrosolen nói chung và loài Taxillus chinensis, Macrosolen tricolor nói riêng. - Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp và tác dụng sinh học góp phần giải thích kinh nghiệm sử dụng của người dân địa phương và là cơ sở khoa học mở ra triển vọng nghiên cứu đầy đủ hơn để có thể sử dụng rộng rãi dược liệu này trong cộng đồng. 5. Bố cục của luận án Luận án có 136 trang, gồm 4 chương, 37 bảng, 28 hình. Bố cục gồm các phần: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (32 trang); Nguyên vật liệu, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu (19 trang); Kết quả nghiên cứu (60 trang); Bàn luận (20 trang); Kết luận và kiến nghị (3 trang). Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án (1 trang). Luận án có 123 tài liệu tham khảo (10 trang) và 18 phụ lục. B. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương 1. TỔNG QUAN Đã tổng hợp và phân tích vị trí phân loại họ Tầm gửi (Loranthaceae). Tập hợp và trình bày một cách hệ thống các kết quả nghiên cứu từ trước tới nay về thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học, công dụng của chi Taxillus và chi Macrosolen trên thế giới và ở Việt Nam. Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu - Tầm gửi ký sinh cây Gạo thu hái vào tháng 5- 7 các năm 2007- 2008- 2009 tại Tam Nông (Phú Thọ). Tầm gửi ký sinh trên cây Na thu hái vào tháng 7 năm 2008, 2009 ở Kim Bôi (Hòa Bình). - Các hóa chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược điển Việt Nam IV. - Chuột nhắt trắng chủng Swiss, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp. Chuột cống trắng chủng Wistar, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Học viện Quân y cung cấp. - Các dòng tế bào ung thư do phòng sinh học thực nghiệm viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam cung cấp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Thẩm định tên khoa học của 2 mẫu nghiên cứu dựa trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, thực vật, đối chiếu với khóa phân loại và tiêu bản mẫu chuẩn lưu ở các phòng tiêu bản. - Xác định đặc điểm vi phẫu lá, thân và đặc điểm bột dược bằng phương pháp hiển vi. - Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hoá học. - Định lượng các chất trong phân đoạn ethylacetat theo phương pháp cân. - Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột dùng silicagel pha thường (0,040-0,063mm, Merk), silicagel pha đảo YMC-RP-18, Dianion HP- 20, theo dõi các phân đoạn bằng SKLM. - Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào độ chảy, dữ liệu của phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều, hai chiều, kết hợp đối chiếu với tài liệu đã công bố. - Thử độc tính cấp theo quy định 371 của Bộ Y tế và phương pháp cải tiến của Litchfied – Wilcoxon. - Thử tác dụng chống oxy hoá invitro trên hệ DPPH. - Thử tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng Paracetamol (PAR). - Thử tác dụng ức chế viêm cấp trên mô hình gây phù chân chuột và trên mô hình gây viêm màng bụng. - Thử tác dụng ức chế viêm mạn trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng amiant. - Thử hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp của Likhiwitayawuid và cộng sự. - Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel. Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật 3.1.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật tầm gửi cây Gạo * Đặc điểm hình thái và thẩm định tên khoa học: Đã mô tả chi tiết và đầy đủ các bộ phận của cơ quan dinh dưỡng (thân, lá), cơ quan sinh sản (hoa, quả, hạt), đối chiếu với khóa phân loại và so sánh với tiêu bản mẫu lưu ở Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Bách thảo thực vật trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, GS. TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn đã định tên khoa học của tầm gửi ký sinh trên cây Gạo là Taxillus chinensis (DC.) Dans, thuộc họ Loranthaceae. * Đặc điểm vi phẫu lá và thân Đã tiến hành cắt, tẩy, nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi và mô tả chi tiết vi phẫu thân, lá tầm gửi Gạo. * Đặc điểm bột dược liệu Bột màu vàng lục nhạt, không mùi, không vị, mảnh bần cấu tạo bởi các tế bào hình đa giác. Mảnh biểu bì mang lỗ khí. Mảnh mô mềm là các tế bào hình đa giác thành mỏng. Tế bào sợi đứng riêng lẻ hay tụ tập thành bó. Mảnh mạch thường thấy mạch hình mạng và mạch xoắn. Tinh thể calci oxalat hình khối. Hạt phấn hoa hình ba góc. Lông che chở đa bào hình sao. 3.1.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật tầm gửi cây Na * Đặc điểm hình thái và thẩm định tên khoa học: Đã mô tả chi tiết và đầy đủ các bộ phận của cơ quan dinh dưỡng (thân, lá), cơ quan sinh sản (hoa, quả, hạt), đối chiếu với khóa phân loại và so sánh với tiêu bản mẫu lưu, PGS. TS. Vũ Xuân Phương, Ths. Nguyễn Thế Cường Viện Sinh thái và Tài nguyên Thực vật; TS. Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội giám định tên khoa học là: Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser, Loranthaceae. * Đặc điểm vi phẫu lá và thân Đã tiến hành cắt, tẩy, nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi và mô tả chi tiết vi phẫu thân, lá tầm gửi Na. * Đặc điểm bột dược liệu: Bột màu vàng lục nhạt, không mùi, không vị. Mảnh bần cấu tạo bởi các tế bào hình đa giác xếp thành nhiều lớp chồng lên nhau. Mảnh biểu bì mang lỗ khí. Mảnh mô mềm là các tế bào hình đa giác thành mỏng. Tế bào sợi đứng riêng lẻ hay tụ tập thành bó. Mảnh mô mềm mang các tinh thể calci oxalat. Mảnh mạch thường thấy mạch hình mạng và mạch xoắn. Tinh thể calci oxalat hình khối. 3.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học 3.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ Trong tầm gửi cây Gạo đều có: flavonoid, tanin, coumarin, acid hữu cơ, chất béo, đường khử, steroid, polysaccharid, riêng lá có saponin steroid. Trong tầm gửi cây Na đều có flavonoid, tanin, coumarin, chất béo, đường khử, steroid, polysaccharid, caroten, riêng lá có saponin triterpenoid. 3.2.2. Định lượng phân đoạn chiết bằng ethylacetat Hàm lượng các chất trong phân đoạn chiết ethylacetat của tầm gửi cây Gạo là 0,9527% và tầm gửi cây Na là 0,3589%. 3.2.3. Chiết xuất và phân lập các hợp chất Từ loài Taxillus chinensis (DC.) Dans. ký sinh trên cây Gạo đã phân lập được 10 chất, ký hiệu TGGT1, TGGT2, TGGT3, TGGT5, TGGT7, TGGT8, TGGT9, TGGT10, TGGT12, TGGT13. Từ loài Macrosolen tricolor (L.) Dans. ký sinh trên cây Na đã phâp lập được 3 chất, ký hiệu MT4A, MT5C1, MT2E1. 3.2.4. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được - Hợp chất TGGT1: thu được dưới dạng bột màu vàng đặc trưng của hợp chất flavonoid, nhiệt độ nóng chảy 182-1850C. Phổ ESI-MS có pic [M + Na]+ : 471m/Z; [M-H] - : 447m/Z, cho biết M = 448, tương ứng với công thức phân tử C21H20O11. Phổ 1H-NMR của TGGT1 xuất hiện các tín hiệu của 5 proton vòng thơm trong đó hai proton được xác định ở vị trí metha và 3 proton còn lại được xác định thuộc vào một vòng thơm. Thêm vào đó, tín hiệu của một proton anomer xuất hiện tại δ 5,37 (1H, d, J = 1,5 Hz), các tín hiệu của các nhóm methin gắn với nhóm hydroxyl xuất hiện ở 4,25 (1H, dd, J = 1,5, 3,0 Hz), 3,78 (1H, d, J = 1,5, 8,5 Hz), 3,44(m), 3,32(m) và tín hiệu của một nhóm methyl gắn với gốc đường tại δH 0,96 (3H, d, J = 6,5 Hz) gợi ý cho sự xuất hiện của một phân tử đường rhamnose. Phổ 13C-NMR của TGGT1 xuất hiện tín hiệu của 21 carbon, trong đó có 6 carbon thuộc vào một phân tử đường. Phổ DEPT cho thấy trong cấu trúc của TGGT1 có 1 nhóm CH3, 10 nhóm CH và có 10 carbon bậc 4. Căn cứ vào điểm nóng chảy, số liệu phổ MS, 1H- NMR, 13C-NMR, DEPT và so với tài liệu đã công bố, cho phép khẳng định hợp chất TGGT1 là quercitrin (3-O-α-L- Rhamnopyranosid quercetin) (hình 4.1). - Hợp chất TGGT2: thu được dưới dạng bột màu vàng đặc trưng của hợp chất flavonoid, nhiệt độ nóng chảy 172- 174°C. Phổ ESI- MS: m/z 455 [M+Na]+, m/z 431 [M-H]- → M= 432, tương ứng với công thức phân tử C21H20O10. Phổ ESI-MS cũng xuất hiện các tín hiệu phần aglycon của TGGT2 đã bị mất 1 phân tử đường rhamnose tại m/z 309 [M+Na-Rha]+, m/z 285 [M-H-Rha]-. Căn cứ vào nhiệt độ nóng chảy, số liệu phổ ESI- MS, 1H- NMR, 13C-NMR, DEPT và so với tài liệu đã công bố cho thấy hợp chất TGGT2 chính là 3-O-α-L-rhamnopyranosid kaempferol (kaempferin) hay còn gọi là afzelin, một hợp chất đã được phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau, tuy nhiên đây là công bố đầu tiên afzelin có trong tầm gửi cây Gạo (hình 4.1). Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất TGGT2 Vị trí C *C a, b *C a, c DEPT H a, d Mult., (J in Hz) Aglycone: 2 159,5 159,20 C - 3 135,1 136,18 C - 4 178,6 179,55 C - 5 163,1 163,13 C - 6 100,4 100,07 CH 6,21 br s 7 166,4 166,72 C - 8 95,2 94,93 CH 6,38 br s 9 158,9 158,57 C - 10 105,0 105,53 C - 1′ 123,0 122,75 C - 2′, 6′ 132,3 131,86 CH 7,77 d (8,5) 3′, 5′ 116,0 116,58 CH 6,95 d (8,5) 4′ 161,5 161,54 C - 3-O--L-rhamnopyranosyl: 1′′ 103,5 103,53 CH 5,39 d (1,5) 2′′ 72,2 72,23 CH 4,24 dd (1,5, 3,5) 3′′ 72,0 71,01 CH 3,73 dd ( 3,5, 9,0) 4′′ 73,3 73,29 CH 3,70 m 5′′ 71,9 71,93 CH 3,36 dd (3,5, 5,5) 6′′ 17,6 17,62 CH3 0,94 d (5,5) a Đo trong CD3OD-d4, b75,5 MHz, c125 MHz, d500 MHz; *C của afzelin - Hợp chất TGGT3: thu được dưới dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 175-177oC. Phổ ESI-MS cho M=290 tương ứng với công thức phân tử C15H14O6. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 4,59 (1H, d , J = 2,5 Hz, H-2), 4,01 (1H, m, H-3), 2,53 (1H, dd, J = 8,0, 16,0 Hz, Ha-4), 2,88 (1H, dd, J = 5,5, 16,0 Hz, Hb-4), 5,95 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 5,89 (1H, d, J = 2,5Hz, H-8), 6,86 (1H, d, J = 2,0Hz, H-2'), 6,78 (d, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,86 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6'). Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 82,76 (C-2), 68,75 (C-3), 28,40 (C-4), 156,85 (C-5), 96,32 (C-6), 157,74 (C-7), 95,53 (C-8), 157,49 (C-9), 100,83 (C-10), 132,18 (C-1'), 115,23 (C-2'), 146,15 (C- 3'), 146,17 (C-4'), 116,09 (C-5'), 120,03 (C-6'). So sánh các dữ kiện phổ NMR của TGGT3 với catechin hoàn toàn phù hợp. Phổ HMBC cũng được thực hiện và các tương tác HMBC nhận được hoàn toàn khẳng định cấu trúc của TGGT3 là catechin (hình 4.1). - Hợp chất TGGT5: thu được dưới dạng bột màu vàng. Nhiệt độ nóng chảy 193 - 195°C. Phổ ESI-MS cho M=478 tương ứng với công thức phân tử C21H18O13. Phổ 1H-NMR (500MHz, MeOD): δppm: 6,18 (1H, br s, H-6), 6,36 (1H, br s, H-8), 6,85 (1H, d, J= 8,5 Hz, H-2’ ), 7,65 (1H, br s, H-5’), 7,62 (1H, d, J= 8,5 Hz, H-6’ ), 5,33 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-1’’ ), 3,57 (1H, m, H-2’’), 3,51 (1H, m, H-3’’), 3,63 (1H, m, H-4’’), 3,80 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5’’). Phổ 13C-NMR (125MHz, MeOD): δppm: 158,29 (C-2), 135,40 (C- 3),179,10 (C-4), 163,86 (C-5), 99,82 (C-6), 165,86 (C-7), 94,77 (C-8), 158,95 (C-9),105,56 (C-10), 122,79 (C-1’), 115,98 (C-2’), 145,81 (C- 3’), 149,80 (C-4’), 117,25 (C-5’), 123,51 (C-6’), 104,35 (C-1’’), 75,36 (C-2’’), 77,56 (C-3’’), 72,80 (C-4’’), 76,97 (C-5’’), 172,26 (C- 6’’,C=0). Căn cứ vào nhiệt độ nóng chảy, phổ ESI-MS, phổ NMR một chiều và hai chiều và so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất TGGT5 được nhận dạng là quercituron, còn gọi là miquelianin (hình 4.1). - Hợp chất TGGT7: thu được dưới dạng bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy (mp): 146-148°C. Dựa vào sự phân tích của số liệu phổ và so sánh kết quả với số liệu phổ đã công bố cho phép khẳng định hợp chất TGGT7 là: (24s)-24- Ethylcholesta 5,22 (E), 25-trien-3β-ol, đây là hợp chất lần đầu tiên công bố trong tầm gửi Taxillus chinensis sống trên cây Gạo (hình 4.1). Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất TGGT7 Vị trí C #C C a,b H a, c Mult., (J in Hz) HMBC (H → C) 1 37,0 37,30 1,06/1,83 m 2 27,8 31,69 1,50/1,82 m 3 70,0 71,82 3,50 m 4 38,1 42,33 2,21/2,28 m 5 139,7 140,80 - 6 122,6 121,68 5,34 d (5,0) 4, 7, 10 7 31,9 31,92 1,44/1,98 m 8 31,9 31,93 1,96 m 9 50,1 50,21 0,91 m 10 36,6 36,54 - 11 21,0 21,10 1,45/1,51 m 12 39,6 39,72 1,18/1,98 m 13 42,3 42,29 - 14 56,8 56,88 1,01 m 15 24,3 24,34 1,04/1,57 m 16 28,7 28,70 1,28/1,68 m 17 55,9 55,94 - 18 12,0 12.07 0,69 s 12, 13, 14, 17 19 19,3 19,41 1,00 s 1, 5, 9, 10 20 40,2 40,17 - 21 21,4 20,82 0,99 d (6,5) 17, 20, 22 22 137,2 137,20 5,24 dd (15,5, 8,0) 17, 20, 23, 24 23 130,1 130,08 5,18 dd (15,5, 6,5) 20, 22, 24, 25, 28 24 52,0 52,02 2,42 brq (6,5) 23, 25, 26, 27, 28, 29 25 148,6 148,60 - 26 109,5 109,50 4,69/4,70 brs 24, 25, 27 27 20,2 20,23 1,65 s 24, 25, 26 28 25,7 25,74 1,39/1,47 m 29 12,1 12,13 0,84 t (7,0) 24, 28 OAc 175,5 20,8 aĐo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz; # δc của 1a: (24s) -24- Ethylcholesta – 5, 22(E), 25-trien- 3β- yl acetate - Hợp chất TGGT8: TGGT8 thu được dưới dạng bột màu trắng, độ nóng chảy (mp) =136-137°C. Phổ 1H-NMR (500MHz CDCl3), δH (ppm): 5,37 (brd, J = 5.1 Hz, H-6), 3,54 (tt, J = 5.1, 11.7Hz, H-3), 0,68 (3H, s, H-18), 1.01 (3h, s, H- 19), 0,92 (3H, d, J = 6,5Hz), 0,83 (3H, d, J = 7,3 Hz, H-26), 0.81 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-27), 0.84 (3H, t, J = 7.5Hz, H-29). Phổ 13C-NMR (125 MHz CDCl3), δC (ppm): 37.67 (t, C-1), 32,05 (t, C-2), 72.19 (d, C- 3), 42.70 (t, C-4), 141.17 (s, C-5)122,50 (d, C-6), 32,32 (t, C-7), 32,32 (d, C-8), 50.55 (d, C-9), 36,91 (s, C-10), 21.49 (t, C-11), 40.19 (t, C- 12), 42.73 (s, C-13), 57.18 (d, C-14), 24.71 (t, C-15), 28.65 (t, C-16), 56.48 (d, C-17), 12.26 (q, C-18), 19.79 (q, C-19), 36.55 (d, C-20), 19.18 (q, C-21), 34.36 (t, C-22), 26.51 (t, C-23), 46.25 (d, C-24), 29.57 (d, C-25), 20.24 (q, C-26), 19.44 (q, C-27), 23.48 (t, C-28), 12.39 (q, C-29). So sánh số liệu phổ 13C-NMR của TGGTT8 với β-sitosterol đều trùng khớp. Dựa vào sự phân tích các số liệu phổ nêu trên cùng với kết quả phổ khối lượng ESI-MS tại m/z [M + Na]+ 437 tương ứng với công thức phân tử C29H50O (M=414) hợp chất TGGT8 được nhận dạng là β- sitosterol (hình 4.1). - Hợp chất TGGT9: thu được dưới dạng hợp chất dầu không màu. Phổ khối ESI-MS cho M=296 tương ứng với công thức phân tử: C20H40O. Phổ 1H-NMR có sự xuất hiện của 5 nhóm methyl, 9 nhóm methilen của một carbon không no mạch dài và một nhóm oximethilen. Phổ 13C- NMR cho thấy TGGT9 là một ditecpen xuất hiện tín hiệu của 20 carbon, trong đó có 5 nhóm CH3 , 10 nhóm CH2 , 4 nhóm CH và 1 carbon bậc 4. Các số liệu phổ NMR của TGGT9 gợi ý tới một chất trans-phytol. So sánh số liệu phổ NMR của TGGT9 với tài liệu phổ đã được công bố thấy sự trùng khớp hoàn toàn về các giá trị phổ NMR tại các vị trí tương ứng cho phép khẳng định cấu trúc hóa học của TGGT9 chính là trans-phytol (hình 4.1). - Hợp chất TGGT10: thu được dưới dạng chất lỏng màu vàng. Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của một vòng benzoquinon, tín hiệu của ba nhóm methyl, tín hiệu của một nhóm oximethyl. Trên phổ 13C- NMR cho thấy xuất hiện tín hiệu của 29 carbon, trong đó xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm ceton, tín hiệu của hai cặp nối đôi nội vòng, tín hiệu của 8 nhóm methyl, tín hiệu của 11 nhóm methilen, tín hiệu của carbon bậc 4. Căn cứ vào số liệu phổ đã phân tích và so sánh với số liệu phổ đã công bố hợp chất TGGT10 được nhận dạng là α-tocopherolquinon (hình 4.1). - Hợp chất TGGT12: Qua nghiên cứu bộ phổ 13CCPD và DEPT đã nhận rõ đặc điểm của cấu trúc này là có chứa 1 đường glucose và trong vòng 13C của đường có lẫn 2 nhóm –CH2-O và 1 nhóm CH-O-. Ngoài ra còn thấy rõ TGGT12 còn chứa 2 gốc acid. Như vậy cấu trúc gốc của TGGT12 là một glucosid. Để khẳng định cấu trúc của dạng hợp chất này cần xác định rõ độ dài mạch của R1, R2, số nối đôi có trong từng mạch và sự phân bố các nối đôi. Kết hợp với phổ MS đã hoàn toàn xác định được công thức phân tử của TGGT12 là C43H70O10. Kiểm tra lại dự báo về số carbon một cách chi tiết trên phổ 13C và HSQC thấy kết quả là chính xác. Để định vị các vị trí nối đôi trên từng nhánh, ngoài đặc trưng “đối xứng” nêu trên các phổ đều được phân tích rất chi tiết đặc biệt quan tâm tới dạng phổ proton và tương quan HMBC. Số liệu chứng minh cấu trúc này về đặc điểm dịch chuyển hóa học của 43 carbon đều được xác định chi tiết và toàn bộ các pic tương quan C→H trong phổ HMBC đều phù hợp với cấu trúc đã xác định. Căn cứ vào số liệu phổ đã phân tích, hợp chất TGGT12 được xác định là Glycerol-1-(6,9,12- hexadecatrienoat) -2-(8,11,14- octadecatrienoat) -3-O-β-D- galactopyranosid (hình 4.1). - Hợp chất TGGT13: Bộ phổ NMR của hợp chất TGGT13 bao gồm các phổ 1H, 13C- CPD, DEPT, HSQC và HMBC. Bộ phổ của hợp chất TGGT13 cho thấy ở vùng không bị chèn lấp có thể nhận ra từ phổ 13C.CPD và DEPT các tín hiệu: hai carbon bậc 4. Có thể dễ dàng nhận thấy đây là 2 carbon acid, sáu carbon olefin. Qua phổ HSQC đã nhận ra rõ rệt ở vùng proton tương ứng chỉ gồm 6 proton. Vùng 105 đến 60 ppm là vùng có đặc trưng rõ nét và độ phân giải rất tốt bao gồm 6 pic CH và 3 pic -CH2- (9 pic), đây là vùng rất dễ nhận dạng sự có mặt của một đường o-β-D-galactose gồm 5 nhóm -CH-O- và 1 nhóm -CH2-OH. Điều đáng chú ý là ở vùng này còn có mặt 1 nhóm -CH-O- và 2 nhóm - CH2-O- khác. Để thẩm định cấu trúc và gán chính xác các vị trí phổ HMBC đã được phân tích chi tiết trên cơ sở dữ liệu thu được từ các phổ 1H, 13C và HSQC. Các tín hiệu tương quan xuất hiện HMBC là hoàn toàn phù hợp. Căn cứ dữ liệu các phổ đã phân tích, hợp chất TGGT13 được nhận dạng là Glycerol-1-(9-hexadecane noat)-2-(9, 12-octadecadienoat)-3-O-β-D-galactopyranosid (hình 4.1). - Hợp chất MT4A: Phổ 1H- NMR và 13C- NMR của hợp chất MT4A đặc trưng cho hợp chất triterpenoid. Phổ 1H-NMR của MT4A xuất hiện 2 tín hiệu proton methin, ngoài ra tại vị trí 1,18 xuất hiện tín hiệu chồng lấp đặc trưng của một mạch dài. Trên phổ 13C- NMR và DEPT của MT4A thấy xuất hiện tín hiệu của một nhóm carbonyl, 2 nhóm oximethin, 8 nhóm methyl. Điều này gợi mở đây là một ester giữa hợp chất triterpenoid và một acid béo mạch dài. Các tín hiệu proton được gán với các tín hiệu carbon tương ứng trên cơ sở phân tích các tương tác nhận được trên phổ HSQC. Khi kết hợp với việc phân tích phổ HMBC càng khẳng định tính chính xác hợp chất MT4A là hợp chất dạng ester béo của triterpenoid. Tuy nhiên, khi so sánh số liệu phổ 13C- NMR của hợp chất MT4A với hợp chất loranthol thấy số liệu phổ hoàn toàn tương đồng. Sự sai khác về giá trị cộng hưởng tại vị trí carbon số 3 của loranthol C 78,9 so với 80,26 của MT4A gợi ý sự xuất hiện sự ester hóa tại vị trí này. Điều này càng được khẳng định khi giá trị này trùng khớp với giá trị cộng hưởng của ester béo của triterpenoid C 80,3. Để xác định khối lượng phân tử và acid béo, hợp chất MT4A được tiến hành đo phổ khối lượng phân giải cao. Sự xuất hiện của pic ion m/z 282.28130 [M + H – C30H49O2]+ (theo tính toán 282.29227) cho phép xác nhận công thức phân tử nhánh của acid béo là (C19H37O + H). Từ đó có thể kết luận hợp chất MT4A là 20(29)-lupene-3β- nonandecanoyl-7α-ol với công thức phân tử C49H86O3 có khối lượng tính toán là 722.65770. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên. - Hợp chất MT5C1: Hợp chất MT5C1 thu được dưới dạng bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của MT5C1 xuất hiện 3 tín hiệu proton methin, ngoài ra tại vị trí 1,25 xuất hiện tín hiệu chồng lấp đặc trưng của một mạch dài. Trên phổ 13C- NMR và DEPT của MT5C1 thấy xuất hiện tín hiệu của một nhóm carbonyl, 3 nhóm oximetin cũng như tín hiệu của một nối đôi ngoài mạch. Ngoài ra, còn có sự xuất hiện tín hiệu của 8 nhóm methyl. Điều này gợi mở đây là một este giữa hợp chất tritecpenoid và một acid béo mạch dài. So sánh số liệu phổ của hợp chất MT5C1 với este béo của tritecpen cho thấy sự tương đương về các dữ liệu phổ. Từ đó có thể khẳng định hợp chất MT5C1 ở tầm gửi cây Na là một este béo của tritecpen. Để xác định khối lượng phân tử và acid béo, hợp chất MT5C1 được tiến hành đo phổ khối lượng phân giải cao. Sự xuất hiện của pic ion m/z 763,68157[M+2H+Na]+ (theo tính toán 766,65803) cho phép xác nhận công thức phân tử là C49H86O4 và sự xuất hiện của pic ion m/z 282,27731[M+H-C30H49O3] (theo tính toán 282,29227) cho phép xác nhận công thức phân tử nhánh của acid béo là [C19H37O+H]. Từ đó có thể kết luận hợp chất MT5C1 là 20(29)-lupene-3β- nonandecanoyl-7β,15α-diol. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên(hình 4.1). - Hợp chất MT2E1: Hợp chất MT2E1: thu được dưới dạng bột màu trắng. Phổ proton và carbon của hợp chất này đặc trưng cho cho một hợp chất dạng triterpenoid có một nối đôi và một nhóm hydroxy. Phổ xuất hiện tín hiệu của 7 nhóm methyl bậc bốn, tín hiệu của 1 nhóm oximethin và 1 nhóm CH2 của nối đôi ngoài vòng. Trên phổ 13C- NMR thấy xuất hiện tổng cộng 30 carbon. So sánh các dữ liệu phổ của hợp chất MT2E1 với dữ liệu phổ của hợp chất Lupeol (3β-Hydroxylup-20(29)-ene) thấy có sự trùng khớp về số liệu. Điều này cho phép khẳng định hợp chất MT2E1 của tầm gửi cây Na là Lupeol (3β-Hydroxylup -20(29)-ene) (hình 4.1). * Cấu trúc hóa học của 13 hợp chất: O O O HO OH OH O OH CH3 OHOH OH2 45 7 9 1' 3' 1'' 5'' 3" 5' 10 6" O O OOH HO OH 2 3 45 6 7 8 9 10 1' 3' 5' 1" 2" 3" 4" 5" 6" O CH3 OH OHOH Quercitrin (TGGT1) Afzelin (Kaempferin) (TGGT2) Catechin (TGGT3) Quercituron (TGGT5) HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 27 28 29 1 HO 17 18 19 20 22 5 24 26 27 28 3 (24s)-24-Ethylcholesta 5,22 (E), 25-trien-3β-ol (TGGT7) β-sitosterol (TGGT8) OH 135791113 16 18 19 2017 trans-phytol (TGGT9) O O OH 1 2 3 4 5 6 1' 3' 5' 7' 9' 11' 13' 15' α-tocopherolquinon (TGGT10) Glycerol-1-(6,9,12- hexadecatrienoat)-2- (8,11,14- octadecatrienoat)- 3-O-β-D-galactopyranosid (TGGT12) Glycerol-1-(9-hexadecanenoat)-2-(9,12-octadecadienoat)-3-O-β-D- galactopyranosid (TGGT13) O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 30 29 O 1'19 ' 13 OH H 20(29)-lupene-3β-nonandecanoyl-7α-ol (MT4A) (mới) 20(29)-lupene-3β-nonandecanoyl-7β, 15α-diol (MT5C1) (mới) 3β-Hydroxylup-20(29)-ene (Lupeol) (MT2E1) Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của 13 hợp chất 3.3. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng sinh học 3.3.1. Thử độc tính cấp Cho từng lô chuột nhắt uống dịch chiết tầm gửi cây Gạo, tầm gửi Na với các liều tăng dần đến liều 300g dược liệu/kg thể trọng chuột không có các triệu chứng biểu hiện ngộ độc trên hành vi hoạt động tự nhiên, trên hô hấp và tiêu hoá và trong thí nghiệm không có chuột nào chết nên không xác định được LD50. 3.3.2. Thử hoạt tính chống oxy hoá Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất TGGT1 (Quercitrin), TGGT3 (Catechin), TGGT5 (Quercituron) của tầm gửi cây Gạo có hoạt tính chống oxy hoá trên hệ DPPH với giá trị SC50 lần lượt là 40,87; 15,74; 13,31g/ml, hợp chất TGGT7 ((24s)-24-Ethylcholesta 5,22 (E) 25 trien-3β-ol) không có hoạt tính chống oxy hoá trên hệ DPPH. Kết quả nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa ở mô hình gây tăng MDA trên chuột nhiễm độc PAR cho thấy hàm lượng MDA ở các lô chuột uống cao lỏng tầm gửi cây Gạo liều 30g/kg và 60g/kg trong 8 ngày trước khi gây độc đã giảm rõ rệt so với lô uống PAR (p<0,05). Hoạt tính chống oxy hóa của tầm gửi cây Gạo liều 30g/kg và 60 g/kg (32,21% và 21,63%) tương đương với hoạt tính chống oxy hóa của Silymarin liều 70mg/kg (21,15%). Hàm lượng MDA ở các lô chuột uống cao lỏng tầm gửi Na liều 30g/kg và 60 g/kg đều có giảm so với lô uống PAR nhưng sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Hoạt tính chống oxy hóa của tầm gửi cây Na liều 30g/kg và 60 g/kg (16,35% và 15,87%) thấp hơn so với hoạt tính chống oxy hóa của Silymarin liều 70mg/kg (21,15%). 3.3.3. Tác dụng bảo vệ gan Trên mô hình gây độc gan chuột nhắt trắng bằng paracetamol, ở các lô uống thuốc (cả thuốc thử và thuốc chứng dương) trọng lượng gan đều giảm so với lô mô hình, tuy nhiên, sự khác biệt chỉ có ý nghĩa thống kê ở các lô chuột uống cao lỏng tầm gửi cây Gạo liều 60g/kg và tầm gửi cây Na liều 30g/kg. Hoạt độ AST ở lô mô hình gây độc bằng paracetamol tăng cao rõ rệt so với lô chứng sinh học (p<0,001). Hoạt độ AST ở lô chuột uống tầm gửi cây Gạo và cây Na ở cả 2 liều 30g/kg và 60g/kg trong 8 ngày trước khi gây độc gan đã giảm rõ rệt so với lô mô hình (p<0,001) nhưng vẫn tăng hơn lô chứng sinh học. Tác dụng của cao lỏng tầm gửi Gạo và Na tương đương với Silymarin liều 70mg/kg. Hoạt độ ALT ở các lô chuột uống cao lỏng tầm gửi cây Gạo và cây Na ở cả 2 liều 30g/kg, 60g/kg và silymarin liều 70mg/kg trong 8 ngày trước khi gây độc gan đã giảm rõ rệt so với lô mô hình gây độc bằng PAR (p<0,001) nhưng vẫn tăng hơn lô chứng sinh học. 3.3.4. Ttác dụng chống viêm cấp tính Trên mô hình gây phù chân chuột - Cao lỏng tầm gửi cây Gạo ở cả 2 liều 20g DL/kg và 40g DL/kg đều có tác dụng chống viêm cấp thông qua làm giảm thể tích chân chuột. Ở liều cao 40g/kg thể hiện tác dụng chống viêm mạnh hơn liều 20g/kg (liều cao có tác dụng chống viêm tại 3 thời điểm sau gây viêm 2 giờ, 4 giờ và 6 giờ trong khi liều thấp chỉ có tác dụng chống viêm rõ rệt tại 1 thời điểm duy nhất: sau gây viêm 6 giờ). - Cao lỏng tầm gửi cây Na ở liều 20g DL/kg có xu hướng làm giảm thể tích chân chuột nhưng chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05), ở liều 40g DL/kg có tác dụng chống viêm cấp, thông qua làm giảm thể tích chân chuột rõ rệt tại thời điểm sau gây viêm 2 giờ (p<0,05). Trên mô hình gây tràn dịch màng bụng chuột cống trắng - Cao lỏng tầm gửi cây Gạo ở liều 20g DL/kg và 40g DL/kg đều có tác dụng chống viêm cấp thông qua việc làm giảm rõ rệt số lượng dịch rỉ viêm so với lô chứng (p<0,05-0,001), tác dụng chống viêm ở liều 40g DL/kg mạnh hơn rõ rệt so với aspirin liều 150mg/kg. - Cao lỏng tầm gửi cây Na ở liều 20g DL/kg không có tác dụng làm giảm số lượng dịch rỉ viêm, tuy nhiên liều 40g DL/kg có tác dụng làm giảm lượng dịch rỉ viêm rõ rệt so với chứng (p<0,05), tác dụng này không bằng cao lỏng tầm gửi cây Gạo liều 40g DL/kg và aspirin liều 150mg/kg. - Cao lỏng tầm gửi cây Gạo và cây Na ở liều 20g DL/kg và 40g DL/kg đều làm giảm hàm lượng protein trong dịch rỉ viêm nhưng chỉ ở lô 3 (tầm gửi cây Gạo liều 20g/kg) sự khác biệt mới rõ rệt (p<0,05). - Cao lỏng tầm gửi cây Gạo ở 2 liều 20g DL/kg và 40g DL/kg đều có tác dụng chống viêm cấp thông qua làm giảm rõ rệt số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm so với lô chứng (p<0,05). Tác dụng tương đương với aspirin liều 150mg/kg. - Cao lỏng tầm gửi cây Na ở 2 liều 20g DL/kg và 40g DL/kg đều làm giảm số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm so với lô chứng nhưng chỉ ở lô 5 (liều 20g/kg) sự khác biệt mới có ý nghĩa (p<0,05). 3.3.5.Tác dụng chống viêm mạn tính Cao lỏng tầm gửi cây Gạo và cây Na ở cả 2 liều 30g DL/kg và 60g DL/kg đều không có tác dụng chống viêm mạn tính, thể hiện qua việc không làm giảm trọng lượng khối u hạt (p>0,05). 3.3.6. Thử hoạt tính gây độc tế bào Các hợp chất TGGT1 (Quercitrin), TGGT3 (Catechin), TGGT5 (Quercituron) và TGGT7: (24s)-24-Ethylcholesta 5,22 (E) 25-trien-3β- ol phân lập từ tầm gửi cây Gạo đều không có hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào thử nghiệm (Hep-G2, Lu, RD.). Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. Về thực vật - Việc xác định tên khoa học của loài tầm gửi kí sinh trên cây Gạo là Taxillus chinensis (DC.) Dans, tầm gửi kí sinh trên cây Na là Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser, Loranthaceae đã giúp cho kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học được khẳng định về nguồn gốc nguyên liệu. - Việc mô tả chi tiết đặc điểm thực vật và đặc điểm vi học 2 loài nghiên cứu đã góp phần nhận biết và tiêu chuẩn hóa dược liệu. 4.2. Về thành phần hóa học - Kết quả định tính đã xác định trong tầm gửi Taxillus chinensis sống kí sinh trên cây Gạo có: flavonoid, tanin, coumarin, saponin, acid hữu cơ, chất béo, đường khử, steroid, polysaccharid, trong tầm gửi Macrosolen tricolor sống kí sinh trên cây Na có flavonoid, tanin, coumarin, saponin, chất béo, đường khử, steroid, polysaccharid, caroten. Kết quả nghiên cứu trong luận án cũng tương tự như kết quả định tính của một số tác giả nghiên cứu loài T. chinensis kí sinh trên cây Quất hồng bì, loài M. tricolor kí sinh trên cây Nhãn. - Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng các chất tan trong phân đoạn chiết bằng ethylacetat của tầm gửi cây Gạo (Taxillus chinensis) đạt 0,9527%, của tầm gửi cây Na (Macrosolen tricolor) là 0,3589%. Qua đó cho thấy hàm lượng các chất tan trong ethylacetat ở loài Taxillus chinensis kí sinh trên cây Gạo gấp 2,65 lần loài Macrosolen tricolor kí sinh trên Na. - Từ loài Taxillus chinensis (DC.) Dans., kí sinh trên cây Gạo đã phân lập được 10 hợp chất ký hiệu TGGT1, TGGT2, TGGT3, TGGT5, TGGT7, TGGT8, TGGT9, TGGT10, TGGT12, TGGT13. Từ loài Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser. kí sinh trên cây Na đã phân lập được 3 chất ký hiệu MT4A, MT2E1, MT5C1. - Trong 13 hợp chất đã phân lập được có 2 hợp chất mới lần đầu tiên tìm thấy trong thiên nhiên là: 20(29)-lupene-3β-nonandecanoyl-7α-ol (MT4A) và hợp chất 20(29)-lupene-3β-nonandecanoyl-7β, 15α-diol (MT5C1). 2 hợp chất là glycerol - 1 - (6,9,12 - hexadecatrienoat) - 2 - (8,11,14 - octadecatrienoat) - 3 - O - β - D - galactopyranosid (TGGT12) và glycerol -1-(9-hexadecanenoat)-2-(9,12-octadecadien oat)-3-O-β-D-galactopyranosid (TGGT13) cũng chưa tìm thấy tài liệu nào trong nước và trên thế giới công bố có trong thực vật. 4 hợp chất lần đầu tiên công bố phân lập được từ chi Taxillus là: Quercituron (TGGT5), (24s)-24-Ethylcholesta 5,22 (E), 25-trien-3β-ol (TGGT7), trans-phytol (TGGT9), α-tocopherolquinon (TGGT10). 4 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ loài Taxillus chinensis sống ký sinh trên cây Gạo: Quercetin (TGGT1), Afzelin (TGGT2), Catechin (TGGT3), β-sitosterol (TGGT8). 1 hợp chất lần đầu tiên công bố phân lập được từ loài Macrosolen tricolor sống ký sinh trên cây Na là lupeol. Các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học là những đóng góp mới của luận án. 4.3. Về độc tính cấp và tác dụng sinh học - Kết quả thử độc tính cấp với liều cao nhất có thể cho chuột uống được là 300g DL/kg thể trọng chuột, tầm gửi cây Gạo và tầm gửi cây Na đều không có chuột chết do đó không xác định được LD50, qua đó cho thấy liều dùng theo kinh nghiệm dân gian là an toàn. - Kết quả nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa invitro của một số hợp chất phân lập được từ Taxillus chinensis (DC.) Dans. ký sinh trên cây Gạo cho thấy hợp chất quercitrin, catechin, quercituron có hoạt tính chống oxy hoá trên hệ DPPH với giá trị SC50 lần lượt là 40,87; 15,74; 13,31g/ml. Kết quả này cũng phù hợp với nhiều tác giả đã nghiên cứu các hợp chất từ các loài khác. - Kết quả nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan, chống viêm cấp đã góp phần chứng minh việc sử dụng tầm gửi trong nhân dân để chữa viêm gan, thấp khớp, đau dây thần kinh là có cơ sở khoa học. - Từ tầm gửi Taxillus chinensis ký sinh trên cây Gạo đã phân lập được Quercitrin, afzelin, catechin, quercituron là những flavonoid và hàm lượng các chất tan trong phân đoạn chiết bằng ethylacetat là 0,9527% cao gấp 2,65 lần tầm gửi Macrosolen tricolor ký sinh trên cây Na, kết quả này có thể giải thích tác dụng chống oxy hoá bảo vệ gan và tác dụng chống viêm cấp mạnh hơn tầm gửi Macrosolen tricolor ký sinh trên cây Na. - Lupeol tìm thấy ở nhiều loài thực vật khác nhau, lupeol có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, hạ huyết áp, bảo vệ gan và đặc biệt có tác dụng kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư. Lupeol được phân lập từ loài Macrosolen tricolor ký sinh trên cây Na, do đó có thể coi là nguồn nguyên liệu cần quan tâm nghiên cứu tiếp. KẾT LUẬN 1. Về thực vật Đã mô tả đặc điểm thực vật và xác định tên khoa học của mẫu tầm gửi ký sinh trên cây Gạo thu hái ở Tam Nông (Phú Thọ) là Taxillus chinensis (DC.) Dans. họ Tầm gửi Loranthaceae. Tầm gửi ký sinh trên cây Na thu hái ở Kim Bôi (Hòa Bình) là Marcosolen tricolor (Lec.) Dans. họ Tầm gửi Loranthaceae. Đã xác định đặc điểm vi phẫu lá, thân, đặc điểm bột dược liệu của loài Taxillus chinensis (DC.) Dans và loài Macrosolen tricolor (Lec.) Dans. 2. Về hóa học Đã xác định tầm gửi Taxillus chinensis (DC.) Dans ký sinh trên cây Gạo, Marcosolen tricolor (Lec.) Dans. ký sinh trên cây Na có: flavonoid, tanin, coumarin, saponin, chất béo, đường khử, steroid, polysaccharid. Hàm lượng các chất tan trong phân đoạn ethylacetat của Taxillus chinensis kí sinh trên cây Gạo là 0,9527%, của Macrosolen tricolor ký sinh trên cây Na là 0,3597%. Đã phân lập được 10 hợp chất từ loài Taxillus chinensis (DC.) Dans và 3 hợp chất từ loài Macrosolen tricolor (Lec.) Dans, trong đó có: - 2 hợp chất mới: 20(29)-lupen-3β-nonandecanonyl-7α-ol (MT-4A) và 20(29)-lupen-3β-nonandecanonyl-7β-15α-diol (MT5C-1). - 4 hợp chất lần đầu tiên công bố có trong chi Taxillus: Quercituron (TGGT5), (24s)-24-ethylcholesta 5,22(E)25-trien-3β-ol (TGGT7), trans-phyton (TGGT9) và α-tocopherolquinon (TGGT10). - 2 hợp chất lần đầu tiên công bố có trong chi Macrosolen: Glycerol-1- (6,9,12- hexadecatrienoat)-2- (8,11,14-octadecatrienoat) -3-O-β-D- galactopyranosid (TGGT12) và glycerol-1-(9-hexadecanenoat)-2- (9,12-octadecadienoat)-3-O-β-D-galactopyranosid (TGGT13). - 4 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài Taxillus chinensis kí sinh trên cây Gạo: Quercitrin (TGGT1), Afzelin (TGGT2), catechin (TGGT3) và β-sitosterol (TGGT8). - 1 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài Macrosolen tricolor ký sinh trên cây Na: lupeol. 3. Về độc tính cấp và tác dụng sinh học Bằng đường uống không có chuột nào chết ở các lô thử nghiệm, do đó chưa xác định được LD50 của loài Taxillus chinensis kí sinh trên cây Gạo và của Macrosolen tricolor ký sinh trên cây Na. Đã chứng minh cao lỏng tầm gửi Taxillus chinensis kí sinh trên cây Gạo và Macrosolen tricolor ký sinh trên cây Na ở cả 2 liều 30g DL/kg và 60g DL/kg đều có tác dụng bảo vệ gan qua việc hạn chế tăng trọng lượng gan, hạn chế tăng hoạt độ enzym AST, ALT và hạn chế tổn thương đại thể và vi thể gan. Tầm gửi Taxillus chinensis ở cả 2 liều 30g DL/kg và 60g DL/kg đều có tác dụng chống oxy hóa qua việc làm giảm hàm lượng MDA dịch đồng thể gan chuột tương đương silymarin liều 70mg/kg (p<0,05). Tầm gửi Macrosolen tricolor ở liều 30g DL/kg và 60g DL/kg có tác dụng làm giảm hàm lượng MDA nhưng chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Trên mô hình gây phù chân chuột công trắng bằng carrageenin và gây viêm màng bụng chuột cống trắng bằng carrageenin và formaldehyt, cao lỏng tầm gửi Taxillus chinensis ký sinh trên cây Gạo với liều 20g dược liệu/kg và 40g dược liệu/kg đều có tác dụng chống viêm cấp, tuy nhiên ở liều 40g dược liệu/kg có tác dụng mạnh hơn liều 20g dược liệu/kg ở cả 2 mô hình gây viêm cấp. Còn tầm gửi Macrosolen tricolor ký sinh trên cây Na chỉ có tác dụng chống viêm cấp ở cả 2 mô hình với liều 40g dược liệu/kg, còn liều 20g dược liệu/kg chưa có tác dụng chống viêm cấp. Trên mô hình gây viêm mạn bằng cách cấy sợi amiant dưới da gáy chuột nhắt trắng, cao lỏng tầm gửi T.chinensis và M.tricolor ở cả 2 liều 30g DL/kg và 60g DL/kg không có tác dụng chống viêm mạn tính. Đã chứng minh 3 hợp chất phân lập từ tầm gửi Taxillus chinensis là quercitrin (TGGT1), catechin (TGGT3), quercituron (TGGT5) có hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH với giá trị SC50 lần lượt là 40, 87, 15, 74; 13,31μg/ml hợp chất (24s) - 24 - Ethylcholesta 5, 22 (E), 25 - trien - 3β - ol không có hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH và cả 4 hợp chất trên đều không có hoạt tính gây độc tế bào với 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm (Hep-G2,Lu,RD). KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu độc tính bán trường diễn của 2 loài tầm gửi nghiên cứu, nghiên cứu dạng bào chế thích hợp để thử nghiệm trên lâm sàng theo hướng chữa viêm gan, bảo vệ gan. 2. Tiếp tục nghiên cứu các tác dụng sinh học khác của tầm gửi cây Gạo và tầm gửi cây Na. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Vũ Xuân Giang, Phạm Thanh Kỳ, Phan Văn Kiệm (2011), “Phân lập và xác định cấu trúc quercitrin và afzelin từ cây tầm gửi - Taxillus chinensis (DC) Dans. sống trên cây Gạo”, Tạp chí Dược học, số 419 - 3: tr.37. 2. Vũ Xuân Giang, Phạm Thanh Kỳ, Phan Văn Kiệm (2011), “Phân lập và xác định cấu trúc catechin và quercituron từ cây tầm gửi - Taxillus chinensis (DC) Dans. sống trên cây Gạo”, Tạp chí Dược học, số 423 - 7: tr.29. 3. Vũ Xuân Giang, Phạm Thanh Kỳ, Phan Văn Kiệm (2011), “Hợp chất sterol trong tầm gửi Taxillus chinensis (DC) Dans. sống trên cây Gạo”, Tạp chí Dược liệu, số 4 – tập 16: tr.248. 4. Vũ Xuân Giang, Phạm Thanh Kỳ, Phan Văn Kiệm (2011), “Phân lập và xác định cấu trúc trans-phytol và α-tocopherolquinon từ cây tầm gửi - Taxillus chinensis (DC) Dans. sống trên cây Gạo”, Tạp chí Dược học, số 423 - 7: tr.36. 5. Vũ Xuân Giang, Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Trọng Thông, Phạm Thị Vân Anh (2011), “Nghiên cứu tác dụng chống viêm của tầm gửi cây Gạo (Taxillus chinensis (DC) Dans. và tầm gửi cây Na (Macrosolen tricolor (Lecomte) Dans”, Tạp chí Dược học, số 425 - 9: tr.41. 6. Vũ Xuân Giang, Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Trọng Thông, Phạm Thị Vân Anh (2011), “Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của tầm gửi cây Gạo (Taxillus chinensis (DC) Dans. và tầm gửi cây Na (Macrosolen tricolor (Lecomte) Dans”, Tạp chí Dược học, số 426 - 10: tr.40. 7. Vũ Xuân Giang, Phạm Thanh Kỳ, Phan Văn Kiệm (2013), “Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất triterpen trong tầm gửi cây Na - Macrosolen tricolor (Lecomte) Dans ”, Tạp chí Dược học, số 450 - 10: tr.41.