[Tóm tắt] Luận án Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất trong thuốc bằng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình

hồng ngoại gần và trung kết hợp với các phương pháp hồi quy đa biến để xác định nhanh chất lượng thuốc. Nghiên cứu này sẽ góp phần khẳng định xu hướng đưa các phép phân tích ra khỏi nghiên cứu đơn thuần và áp dụng nhanh trong thực tế, đồng thời cho phép tiết kiệm thời gian, hóa chất và đặc biệt là góp phần phát triển kỹ thuật phân tích xanh. 2 Nội dung nghiên cứu Để xây dựng qui trình xác định các hoạt chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với phương pháp thống kê đa biến, nội dung nghiên cứu chủ yếu của luận án gồm: 1. Khảo sát tìm các điều kiện tối ưu của phép đo phổ hồng ngoại vùng gần và trung với các hoạt chất và mẫu tự tạo, mẫu thực tế. 2. Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi qui đa biến phù hợp để xác định một hoạt chất khi có mặt các tá dược trong mẫu và nghiên cứu xác định đồng thời các hoạt chất trong cùng nhóm chất bằng một mô hình hồi qui đa biến tuyến tính. 3. Đánh giá các thông số chính của một qui trình phân tích nhanh trên cơ sở xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính từ các mẫu tự tạo có chứa hoạt chất và tá dược thường dùng. 4. Ứng dụng qui trình phân tích xây dựng được để phân tích một số mẫu thuốc kháng sinh đang lưu hành trên thị trường hiện nay và so sánh kết quả với phương pháp tiêu chuẩn qui định trong Dược điển. Điểm mới, những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn của luận án  Về mặt khoa học - Lần đầu tiên đã xây dựng được quy trình phân tích nhanh các hoạt chất nhóm sulfamid và một số chất thuộc nhóm beta lactam (ampicillin, cefixim, cefaclor, ceftriaxone, cefotaxim) bằng phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại vùng gần và trung trên cơ sở sử dụng các mô hình hồi quy đa biến PLS và PCR. Quy trình này cho phép phân tích không cần phá hủy mẫu, không sử dụng dung môi độc hại, nhanh và cho kết quả phù hợp trong việc sàn lọc nguyên liệu và phân tích nhanh các sản phẩm thuốc. - Đã xây dựng được quy trình phân tích đồng thời các hoạt chất trong cùng nhóm thuốc sulfamid và beta lactam. Quy trình này cho phép xác định được bất kỳ một chất nào trong thuốc bằng một mô hình hồi quy đa biến, giúp cho việc xây dựng phần mềm trên thiết bị cầm tay được thuận lợi.  Về mặt thực tiễn - Quy trình phân tích nhanh, không tốn dung môi, không độc hại (tuy nhiên chưa loại trừ được ảnh hưởng của độ ẩm môi trường) phù hợp có thể ứng dụng sàn lọc nguyên liệu và các các sản phẩm thuốc. Mở ra các hướng nghiên cứu mới trên các đối tượng phức tạp hơn như thực phẩm chức năng, các mẫu sinh học và thực phẩm Bố cục của luận án Luận án gồm năm phần chính là: mở đầu, chương 1: tổng quan, chương 2: thực nghiệm, chương 3: kết quả và thảo luận, kết luận. Trong mỗi phần có các hình ảnh và bảng biểu minh họa tương ứng, phù hợp. Ngoài ra luận án còn gồm đầy đủ các phần: mục lục, danh mục các ký hiệu và chữ cái viết tắt, danh mục bảng, danh mục hình, danh mục các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án, tài liệu tham khảo tiếng Việt, tiếng Anh và các phụ lục liên quan. 3 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về các nhóm thuốc kháng sinh nghiên cứu 1.1.1. Nhóm thuốc kháng sinh Sulfamid Các sulfamid kháng khuẩn là dẫn chất của p- aminobenzensulfonamid, có công thức cấu tạo chung là: HNR2 SO2 NH R1 Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của nhóm Sulfamid Trong đó thường gặp R2 là H, và cũng chỉ khi R2 là H thì sulfamid mới có hoạt tính kháng khuẩn, khi R2 ≠H, thì chất đó là tiền thuốc. R1 có thể là mạch thẳng, dị vòng. Tuy nhiên, nếu R1 là dị vòng thì hiệu lực kháng khuẩn mạnh hơn, thông thường là các dị vòng 2 – 3 dị tố. Khi R1 và R2 đều là gốc hidro thì thu được sulfamid là có cấu tạo đơn giản nhất (sulfanilamid). Sulfamid ở dạng tinh thể màu trắng hoặc màu vàng nhạt trừ prontosil, không mùi, thường ít tan trong nước, benzen, chloroform. Sulfamid tan trong dung dịch acid vô cơ loãng và hydroxyd kiềm (trừ sulfaguanidin). Hầu hết các Sulfamid đều có tính chất lưỡng tính: tính acid thể hiện do có H ở N- amid linh động (trừ sulfaguanidin) có tính bazơ do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung dịch acid. 1.1.2. Nhóm thuốc kháng sinh họ β- lactam Các kháng sinh mà phân tử có cấu trúc azetidin-2-on (vòng β-lactam)- một amid vòng 4 cạnh. Gồm các nhóm : penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem. Trong đó 2 nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin. Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Azetidin-2-on( beta-lactam) Nhóm các penicillin: Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β-lactam. 4 N S CH 3 CH 3 N H O COR COOM 2 3 4 1 56 7 Hình 1.3: Công thức cấu tạo chung của các kháng sinh nhóm penicillin Nhóm các cephalosporin. Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các gốc R N H O COR1 N S R3 R2 COOM 1 2 3 4 5 67 8 Hình 1.4: Công thức cấu tạo chung của các kháng sinh nhóm cephalosporin Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau. Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng ngà, dạng axit ít tan trong nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm -COOH và -NH2, do có C bất đối tạo góc quay cực αD, có khả năng thụ UV ứng dụng trong TLC, HPLC (định tính, thử tinh khiết, tạp liên quan, định lượng) và có hấp thụ hồng ngoại do chứa nhiều nhóm chức cực đại hấp thụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ). 1.2. Các phương pháp phân tích định tính các hoạt chất kháng sinh trong thuốc Phương pháp sắc ký lớp mỏng 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng các hoạt chất kháng sinh trong thuốc 1.3.1. Phương pháp chuẩn độ thể tích Quy trình tốn nhiều thời gian, nếu nguyên liệu hay chế phẩm có lẫn các tạp chất thì sẽ ảnh hưởng đến kết tủa do có tính chọn lọc không cao. Tuy nhiên phương pháp này dễ thực hiện ở các phòng thí nghiệm với quy mô nhỏ. 5 1.3.2. Phương pháp trắc quang Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang và tính phát quang. Các phương pháp này đơn giản dễ tiến hành thông dụng được ứng dụng nhiều khi xác định các β-lactam đặc biệt trong dược phẩm tuy nhiên độ chọn lọc không cao, độ nhạy kém, nồng độ chất phân tích cao. 1.3.3. Phương pháp điện hóa Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β- lactam nhưng không phổ biến nhiều. Phương pháp có tính chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, độ chính xác cao nhưng khó ứng dụng trong phân tích đồng thời. 1.3.4. Phương pháp điện di mao quản- capillary electrophoresis (CE) Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β- lactam trong nhiều mẫu đối tượng khác nhau. Phương pháp có độ thu hồi cao, giới hạn phát hiện thấp, độ lệch chuẩn thấp nhưng việc chuẩn bị mẫu khá phức tạp 1.3.5. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp phổ biến có khả năng tách và định lượng đồng thời các chất có độ phân cực gần nhau,có độ chính xác, độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp được áp dụng rộng rãi để xác định các hoạt chất kháng sinh trong các sản phẩm dược phẩm. Tuy nhiên phương pháp được sử dụng trên thiết bị đắt tiền, tốn dung môi, thời gian làm sạch và ổn định sau mỗi lần chạy lâu. 1.4. Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến phân tích các hoạt chất kháng sinh trong thuốc 1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp đo phổ hồng ngoại 1.4.1.1. Sự xuất hiện của phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại là phổ của các phân tử và nhóm phân tử xuất hiện dưới tác dụng của chùm sáng kích thích có năng lượng phù hợp ( tương tác không đàn hồi) nằm trong vùng hồng ngoại (IR), làm cho các điện tử hóa trị trong các liên kết п và σ của các nguyên tử trong phân tử bị kích thích, chuyển lên mức năng lượng cao E1. Đồng thời, khi đó phân tử , các nhóm phân tử, nguyên tử quay và dao động. Ba quá trình đó sinh ra phổ hấp thụ hồng ngoại của chất dưới tác dụng của chùm sáng kích thích 6 1.4.1.2. Nguyên tắc của phép đo phổ hồng ngoại Các chất ở trạng thái rắn, lỏng, khí,khi bị kích thích bằng một chùm sáng có năng lượng phù hợp( tương tác không đàn hồi) có thể sinh ra phổ hồng ngoại IR của nó. Do đó, muốn đo phổ IR của một chất ta phải thực hiện qua các bước:  Chuẩn bị mẫu đo:  Nguồn kích thích phổ  Máy đo phổ  Đánh giá phổ + Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại Có nhiều yếu tố gây ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại bao gồm ảnh hưởng do cấu trúc của phân tử ( hằng số lực hóa trị, sự thay thế đồng vị, hiệu ứng electron, yếu tố không gian, liên kết hidro nội phân tử), ảnh hưởng do tương tác giữa các phân tử, ảnh hưởng của quy trình chuẩn bị mẫu và ảnh hưởng của môi trường. Tuy nhiên, với trạng thái tồn tại khác nhau của mẫu thì các yếu tố ảnh hưởng tác động đến các mẫu đo là khác nhau. Với mẫu rắn việc chuẩn bị mẫu là rất quan trọng. Do mẫu rắn có hiện tượng tán xạ ánh sáng làm giảm cường độ hấp thụ của mẫu và làm mất đi những thông tin hóa học. Vì vậy việc làm giảm tán xạ của mẫu đến mức tối thiểu là cần thiết. Khi chuẩn bị mẫu ta phải đảm bảo các yêu cầu của mẫu đo có kích thước hạt nhỏ, phân tán đồng đều, bề mặt nhẵn, trong, mỏng. Mặt khác, đối với phổ truyền qua thông thường được áp dụng bằng định luật Beer, nhưng với phương pháp phân tích phổ hồng ngoại cho mẫu rắn có sự sai lệch đáng kể do nồng độ của chất hấp thụ quá cao nằm ngoài khoảng tuyến tính của định luật. Ngay cả khi ở nồng độ thấp trong khoảng tuyến tính của định luật thì hiện tượng tán xạ ánh sáng cũng gây nên sự sai khác nên đồ thị thu được biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu quang cũng hiếm khi đi qua gốc tọa độ. Một nguyên nhân nữa khiến định luật Beer không thể áp dụng trong việc định lượng các mẫu rắn bằng phương pháp phổ hồng ngoại là do phổ hấp thụ của các chất nằm trong các vùng hẹp chứa các đỉnh đặc trưng nên thường hẹp hơn dải phổ hồng ngoại được lựa chọn khi đo định lượng do đó có sự sai lệch phi tuyến ánh sáng. Khi hiệu chỉnh bằng hồi quy đa biến việc hiệu chỉnh tốt nhất cho các biến ở nồng độ cao hay thấp tiến gần đến giá trị trung bình ta phải phân bố tập số liệu đồng đều. Do đó, khi lập ma trận nồng độ cần phân bố đồng đều nồng độ từ cao đến thấp. Ngoài ra, còn yếu tố ảnh hưởng của độ ẩm môi trường do xuất hiện pic của nước ở vùng sóng 3450cm -1 nên khi chuẩn bị mẫu đo cần giữ mẫu đo và chất nền khô. 7 Đối với mẫu khí và lỏng thì ảnh hưởng do hiện tượng tán xạ ánh sáng rất ít, mà tín hiệu đo lại bị ảnh hưởng của các liên kết hidro nội phân tử, hiệu ứng electron, yếu tố không gian, ảnh hưởng do tương tác giữa các phân tử, ảnh hưởng của độ ẩm do nước tạo liện kết hidro hay tương tác với chất phân tích làm giảm cường độ ở các đỉnh đặc trưng làm mất thông tin hóa học liên quan đến chất phân tích. 1.4.2. Định lượng các chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với chemometrics Phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với chemometric đã mở ra một kỷ nguyên mới cho phép phân tích nhanh, hiệu quả, thân thiện với môi trường- công nghệ hóa học xanh. Tuy nhiên, đây vẫn là một hướng nghiên cứu khả mới mẻ trên thế giới. Tại các nước như Mỹ, Anh cũng có giới thiệu các thiết bị cầm tay để xác định thuốc giả. Các thiết bị này đều có ưu điểm là khá gọn nhẹ, nhưng có hạn chế là khi đo chất trong các nền khác nhau thường không đưa ra được các kết quả có độ chính xác cao. Phần mềm và cơ sở dữ liệu của chúng lại không cho phép can thiệp nên khó khăn trong việc bổ sung thêm cơ sở dữ liệu. Do đó việc nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến để kiểm tra nhanh chất lượng thuốc là một vấn đề vô cùng cần thiết. Hiện tại chưa có một nghiên cứu nào về định lượng nhanh nhóm Sulfamid bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình được công bố. Đây chính là cơ sở để chúng tôi lựa chọn tiến hành nghiên cứu định lượng một số hoạt chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình. Như vậy, để định lượng nhanh hoạt chất trong thuốc bằng phương pháp phổ hồng ngoại ta phải kết hợp với chemometric do có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu phổ trong quá trình chuẩn bị mẫu, ảnh hưởng đáng kể của các tá dược, ảnh hưởng của độ ẩm môi trường và sự sai lệch của định luật Lambe – Bia. Việc định lượng cần tiến hành trên các mẫu chuẩn và mẫu tự tạo có tá dược hoặc mẫu chuẩn đã được xác định hàm lượng bằng HPLC. Kỹ thuật đo được áp dụng là kỹ thuật đo hấp thụ biến đổi Fourier. 8 Chương 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và thiết bị 2.2. Đối tượng, nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu - Các hoạt chất: + Nhóm β lactam các penicilin: Penicilin, Ampicillin, Amoxicillin + Nhóm β lactam các cephalosporin: Thế hệ 1: Cefadroxil, Cephalexin. Thế hệ 2: Cefaclor Thế hệ 3: Cefixime, Ceftriaxon, Cefotaxime. + Nhóm sulfamid: Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol +Hoạt chất đi kèm với nhóm sulfamid Trimethoprim. - Các đối tượng mẫu thực tế tiến hành nghiên cứu 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1. Nguyên tắc phân tích định lượng bằng hồng ngoại gần và trung bình Để xác định hàm lượng các hoạt chất trong thuốc cần phải tiến hành tuần tự các bước sau: 1. Chuẩn bị các mẫu chuẩn tự tạo dạng rắn để xác định từng hoạt chất: cân hoạt chất và các tá dược khác nhau với tỉ lệ khối lượng phù hợp, sau đó nghiền và trộn đều để đồng nhất 2. Tiến hành đo phổ hấp thụ hồng ngoại truyền qua của mẫu chuẩn ở điều kiện phù hợp trong vùng phổ hồng ngoại gần và trung thu được ma trận tín hiệu độ hấp thụ quang A theo số sóng . 3. Xây dựng mô hình hồi qui để xác định các hoạt chất trong thuốc dựa trên mô hình được xây dựng từ ma trận độ hấp thụ quang của 20-30 mẫu chuẩn dùng để xây dựng mô hình hồi qui đa biến và ma trận nồng độ có chứa chất phân tích và tá dược. Trên phần mềm matlab, xử lí số liệu theo 4 phương pháp PCR, CLS, ILS và PLS. 4. Kiểm tra độ chính xác của mô hình thông qua phân tích 10-15 mẫu chuẩn tự tạo, đánh giá sai số tương đối và các hệ số tương quan để lựa chọn mô hình phù hợp. 5. Phân tích mẫu thực tế trên cơ sở vecto độ hấp thụ quang và mô hình đa biến tuyến tính. 9 2.2.2.2. Quy trình phân tích Hình 2.1: Lược đồ phân tích các hoạt chất trong thuốc bằng phương pháp IR kết hợp với chemometrics 2.3. Chương trình máy tính của các phương pháp hồi quy đa biến Chạy 4 mô hình hồi quy tuyến tính trong phần mềm matlab 2015 là CLS, ILS, PLS và PCR 2.4. Các phương pháp phân tích đối chứng xác định hàm lượng các hoạt chất kháng sinh trong thuốc 2.4.1. Phương pháp phân tích đối chứng theo dược điển 1. Trộn hoạt chất và tá dược có thành phần khối lượng thay đổi. 2. Lấy 2mg mẫu chất rắn + 98mg KBr →(Hỗn hợp A) 3. Ép viên15mg hỗn hợp A Nghiền và trộn 10 phút Nghiền và trộn 10 phút 4. Đo phổ hấp thụ hồng ngoại truyền qua thu được ma trận tín hiệu Y 5. Nhập dữ liệu ma trận hàm lượng và ma trận tín hiệu của các mẫu chuẩn và các mẫu kiểm tra vào phần mềm matlab xử lí theo 4 phương pháp CLS, ILS, PLS và PCR Nếu cho kết quả tốt Nếu kết quả không tốt Đạo hàm bậc 1, đạo hàm bậc 2 ma trận tín hiệu Chuyển dữ liệu vào Matlab đến khi thu được kết quả tốt 7.Lựa chọn mô hình với số PC phù hợp 8.Phân tích định lượng mẫu thực tế Đo phổ NIR 3600-2800cm-1 6. Đánh giá kết quả hàm lượng tìm được từ mô hình bằng các hệ số tương quan R, RMSE 10 Các hoạt chất kháng sinh được phân tích theo dược điển bằng phương pháp HPLC - Hoạt chất sulfaguanidin, penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalexin, cefaclor, cefadroxil, cefotaxim, cefixim được xác định theo DĐVN4 - Hoạt chất sulfamethoxazol và trimethoprim được xác định theo dược điển Mỹ USP 34- NF 29 2.4.2. Phương pháp đối chứng LC/MS Các hoạt chất cefaclor, cefadroxil, cephalexin, cefotaxim, cefriaxon được phân tích đối chứng theo phương pháp LC/MS. - Cột tách :C18 (2,1 mm ID × 50mm × 1,9 µm) - Pha động gồm: kênh A là đệm CH3COONH4 12,50 mM, kênh B: ACN với tỉ lệ thể tích hai kênh A và B là 30/70. Thể tích mẫu bơm là 10µl, tốc độ pha động là 200 µl/phút. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu phép đo hồng ngoại 3.1.1. Lựa chọn vùng đo phổ hấp thụ hồng ngoại của các hoạt chất Các hoạt chất nhóm sulfamid và nhóm beta lactam trong công thức cấu tạo của chúng đều chứa các nhóm chức SO2NH-, NH2, C-H, -OCH3, C=O, OH, COOH. Vì vậy khi đo phổ hồng ngoại trên vùng phổ từ 4000 – 400 cm-1 ta thấy xuất hiện các đỉnh đặc trưng ở vùng từ 3600 – 2800 cm-1 và vùng từ 1800 – 400 cm-1. Trên phổ hồng ngoại hấp thụ thu được khi đo các hoạt chất dải số sóng đo 7500-2800 cm-1 trong vùng 3600-2800cm-1 các hoạt chất đều có đỉnh pic đặc trưng và rõ ràng của các nhóm chức NH-, NH2, OCH3, OH, COOH nên chúng tôi lựa chọn vùng phổ này để nghiên cứu. 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tá dược Do thành phần tá dược trong mỗi mẫu thuốc thay đổi theo từng nhà sản xuất khác nhau. Vì thế, chúng tôi đã khảo sát phổ hồng ngoại của một số loại tá dược thường được sử dụng để sản xuất các kháng sinh được lựa chọn nghiên cứu. + Nhóm sulfamid: tinh bột sắn, magie stearate, bột talc, canxi phosphat, maltodextrin. + Nhóm Penicillin: sodium starch glycolate, magiesi stearate. 11 + Nhóm Cefalosporin: magie stearate, bột talc, natriglycolat starch, natrilaurysulfat, lactose. Tiến hành lấy lần lượt 2 mg từng tá dược trộn với 98 mg KBr, nghiền mịn đồng nhất từng mẫu trong cối mã não trong 10 phút. Lấy khoảng 15 mg lượng bột vừa nghiền được cho vào bộ ép viên để thu được mẫu viên của các tá dược, sau đó đem đo phổ hồng ngoại của các mẫu này trong vùng phổ từ 3600-2800 cm - 1 .Quan sát các phổ hấp thụ hồng ngoại ta thấy, các tá dược khảo sát đều có hấp thụ hồng ngoại trong vùng phổ khảo sát là 3600-2800 cm -1 Do đó không thể xác định riêng rẽ các hoạt chất khi có mặt của các loại tá dược trên. Ảnh hưởng của các tá dược trong vùng khảo sát sẽ được loại trừ bằng cách phân tích đồng thời cả tá dược và hoạt chất trong mẫu sử dụng thuật toán hồi qui đa biến. 3.1.3. Khảo sát tỉ lệ khối lượng mẫu /KBr Để khảo sát lựa chọn tỉ lệ khối lượng mẫu/ KBr phù hợp chúng tôi tiến hành khảo sát trên với mẫu thuốc chứa một hoạt chất ( mẫu thuốc viên Cephalexin – chứa hoạt chất Cephalexin 500mg trong một viên) và mẫu thuốc chứa hai hoạt chất (mẫu thuốc viên Bisepton - chứa hàm lượng sulfamethoxazol 400 mg và trimethoprim 80 mg trên một viên). Tiến hành trộn bột thuốc của mẫu thuốc viên với KBr theo tỷ lệ khối lượng mẫu trên KBr là x/y với x= 1-10 và y = 100- x. Chúng tôi nhận thấy khi tỷ lệ khối lượng mẫu/ KBr tăng thì độ hấp thụ quang của các mẫu viên cũng tăng lên. Tuy nhiên khi độ hấp thụ quang càng cao thì độ lặp lại của phép đo càng kém. Mặt khác, nếu lượng mẫu đưa vào quá nhỏ thì dễ gây sai số trong quá trình cân, do đó chúng tôi đã lựa chọn tỷ lệ mẫu/ KBr là 2/98 cho những nghiên cứu tiếp theo. 3.1.4. Khảo sát khối lượng mẫu đem ép viên và độ lặp lại của quá trình ép viên Lượng mẫu ép viên ảnh hưởng đến bề dày viên, do đó có ảnh hưởng trực tiếp độ hấp thụ quang của hoạt chất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi có khảo sát lượng mẫu đem ép viên từ 10mg, 15mg, 17mg và 20 mg. Nhận thấy rằng, lượng mẫu đem ép viên tăng kéo theo độ hấp thụ tăng. Tuy nhiên, khi cân lượng ép viên là 10mg , thì viên bị rạn, nứt. Với lượng mẫu đem ép viên lớn (20mg) độ hấp thụ quang quá cao gây sai số. Vì vậy, chúng tôi chọn lượng mẫu đem ép viên là 15 mg. 12 3.1.5. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của độ ẩm mẫu Độ ẩm không khí là một trong những yếu tố quan trọng gây ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng hấp thụ hồng ngoại của các chất. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng độ ẩm bằng cách chuẩn bị 2 mẫu tự tạo gồm Cefixim và các tá dược có thành phần và khối lượng như nhau. Trong đó, 1 mẫu được chuẩn bị tại nhiệt độ, độ ẩm của phòng (45%, 30 C) và một mẫu sau khi chuẩn bị với cùng điều kiện với mẫu 1, được sấy chân không( 50 C, 500MPa ). Sau khi khảo sát độ ẩm trên đối tượng Cefixim thấy rằng độ ẩm làm tăng giá trị độ hấp thụ quang A. Do đó, có thể kết luận độ ẩm mẫu có ảnh hưởng đến kết quả đo. Kết luận: Từ khảo sát các điều kiện tối ưu cho phép đo đã lựa chọn được: - Vùng phổ đo mẫu: 3600 -2800 cm-1 - Tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr = 2/98 - Độ dày viên: 15mg - Tá dược trong thành phần mẫu đo: + Nhóm Sulfamid: Tinh bột sắn, maltodextrin và canxiphosphat. + Nhóm Penicillin: Sodium starch glycolate, magiesi stearate. + Nhóm Cefalosporin: Magie stearate, bột talc, natriglycolat starch, natrilaurysulfat, lactose. - Độ ẩm không khí 30- 45% 3.2. Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến xác định từng hoạt chất kháng sinh trong thuốc. Kết quả khảo sát điều kiện đo ở mục 3.1 cho thấy các hoạt chất nghiên cứu đều hấp thụ ánh sáng mạnh ở vùng sóng 3600 - 2800cm-1, các tá dược đóng góp đáng kể vào giá trị độ hấp thụ quang đo được. Ngoài ra, độ đồng đều, kích thước hạt, bề mặt nhẵn của viên, độ dày viên ép khác nhau làm cho tín hiệu đo của một mẫu sau mỗi lần đo là không lặp lại. Vì vậy, để định lượng nhanh hoạt chất kháng sinh khi có lẫn tá dược phải kết hợp phân tích phổ hồng ngoại kết hợp với hồi quy đa biến. Từ các nguyên tắc của các mô hình hồi quy đa biến ta nhận thấy rằng mô hình CLS tính toán dựa trên giá trị độ hấp thụ quang theo số sóng trên toàn dải phổ và trên tập số liệu thô ban đầu, còn với mô hình ILS thì phù hợp với tập số liệu nhỏ và chỉ sử dụng một số giá trị độ hấp thụ tại một số số sóng đặc trưng khác. Với hai mô hình PCR và PLS tính toán trên cơ sở tối ưu hóa cơ sở dữ liệu, loại bỏ nhiễu bằng cách tìm số PC phù hợp. Sau khi xử lí tập dữ liệu theo các mô hình hồi quy, dựa trên các hệ số tương quan R2, RMSE để đánh giá và lựa chọn mô hình phù hợp để phân tích định lượng. 13 3.2.1. Ma trận mẫu chuẩn và ma trận mẫu kiểm tra xác định hoạt chất cefixim khi có mặt các tá dược Tiến hành chuẩn bị 30 mẫu chuẩn (gồm 20 mẫu chuẩn làm ma trận chuẩn và 10 mẫu chuẩn để làm ma trận kiểm tra) chứa hỗn hợp gồm cefixim cùng với bốn tá dược là magie stearate, bột talc, natriglycolat starch, natrilaurysulfat theo như quy trình phân tích trong mục 2.2. với hàm lượng (%) khối lượng thay đổi theo bảng 3.6 và 3.7. Đo phổ hồng ngoại hấp thụ của các mẫu này trong vùng phổ từ 3600-2800 cm-1, ghi lại độ hấp thụ quang của từng mẫu theo số sóng. Lưu lại kết quả dưới dạng ma trận tín hiệu đo có kích thước (20x417) và (10x417) để xây dựng mô hình hồi qui. Dữ liệu độ hấp thụ quang được ghi vào đĩa CD – phụ lục 3. 3.2.2. Nghiên cứu xác định cefixim khi có tá dược bằng phương pháp CLS và ILS CLS tính toán trên các tập số liệu ban đầu để tìm ra ma trận hệ số K: Y0nxk =X0nxm Kmxk Trong đó n số mẫu để xây dựng mô hình hồi quy đa biến (n=20), k số sóng (k=417), m số cấu tử cần phân tích (m=1); K là ma trận hệ số, trong đó với hồi qui đa biến K được tính như sau: K=(X0 t X0) -1 X0 t Y0 trong đó X0 t là ma trận chuyển vị của ma trận X. Tương tự ILS tính toán trên tập ma trận tín Y0 hiệu độ hấp thụ quang A để tìm ra ma trận hệ số K theo công thức X0nxm =Y0nxk Pkxm Trong đó n là số mẫu n=20, m là số cấu tử m=1, k là số bước sóng k=417, P là ma trận hệ số được tính là P=(Y0tY0)-1Y0tX0. Sau khi xử lí số liệu thấy rằng trong phương pháp CLS, do đặc tính số liệu độ hấp thụ quang là số liệu thô ban đầu nên kết quả phân tích sẽ bị ảnh hưởng trực tiếp bởi độ lớn giá trị độ hấp thụ quang A. Các kết quả trên cho thấy, sự sai khác giữa hàm lượng thực và hàm lượng tính được từ mô hình không quá lớn với mẫu kiểm tra có thể do thành phần tá dược trong các mẫu này giống với các mẫu chuẩn và đã có tín hiệu tương ứng với mô hình hồi qui nên. Tuy nhiên, khi phân tích mẫu thực tế, nếu nhà sản xuất thay đổi thành phần tá dược thì kết quả sai số sẽ tăng lên. Với phương pháp ILS, hàm lượng thu được là số âm chứng tỏ dưới giới hạn phát hiện của phương pháp. Điều này có thể do mô hình chỉ sử dụng một số giá trị độ hấp thụ tại một số số sóng chọn ngẫu nhiên (mà có thể tại đó không có tín hiệu đo) nên gây ra nguồn sai số lớn. 14 Do vậy không nên sử dụng hai phương pháp CLS và ILC trong phân tích định lượng bằng phổ IR. 3.2.3. Nghiên cứu xác định cefixim khi có lẫn tá dược theo phương pháp PCR PCR tính toán theo các bước sau :  Xử lý PCA: - Tìm ma trận trọng số (PCAloading) và ma trận trị số (PCAscore) từ ma trận tín hiệu (độ hấp thụ quang) - Tìm số PC phù hợp của ma trận tín hiệu X - Tìm phương trình hồi qui biểu diễn mối quan hệ giữa ma trận hàm lượng và ma trận trọng số, ma trận trị số của các PC - Tính lại các hàm lượng của hoạt chất cefixim trong mẫu chuẩn tự tạo - Kiểm tra tính chính xác của mô hình hồi qui đa biến. Căn cứ vào kết quả xử lí số liệu thấy rằng kết quả tốt, lặp lại ở ma trận ban đầu với số PC bằng 4 và ở ma trận đạo hàm bậc 1 và 2 với các số PC 3 và 4. Các ma trận này đều có thể sử dụng làm mô hình chuẩn với các số PC tối ưu khác nhau để định lượng nhanh cefixim khi có lẫn tá dược trong các mẫu thuốc thành phẩm. 3.2.4. Xác định cefixim khi có lẫn tá dược theo phương pháp pháp PLS Tính toán PLS theo các bước sau : - Tìm ma trận trị số (score matrices) và ma trận trọng số (loading matrices), tìm hệ số hồi quy “BETA” - Tìm số PC theo ma trận X và Y - Tìm mối tương quan giữa X và Y theo số PC vừa tìm được ta được “BETA” - Tính lại hàm lượng cefixim trong các mẫu chuẩn tự tạo - Kiểm tra tính chính xác của mô hình hồi qui đa biến. Với các mô hình PLS xây dựng trên tập số liệu lừ ma trận phổ đạo hàm bậc một và ma trận bậc hai cho ta kết quả khả quan hơn rất nhiều. Ở số PC=2, có sự phù hợp lớn về hàm lượng tìm được với hàm lượng ban đầu trong ma trận chuẩn nhưng sai khác rất lớn ở các ma trận kiểm tra. Khi số PC bằng 3 và 4 kết quả đều tốt ở các mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra. Vậy ta có thể lựa chọn các mô hình đạo hàm bậc 1 và mô hình đạo hàm bậc 2 với số PC bằng 3 hoặc 4 theo phương pháp PLS làm mô hình chuẩn xác định cefixim trong thuốc thành phẩm. 15 Như vậy đối với các hợp chất bất kỳ, để xác định bằng phương pháp phổ IR két hợp với thuật toán PLS, việc xây dựng mô hình chuẩn cần tiến hành theo các bước sau đây: - Sử dụng ma trận hàm lượng (của mẫu chuẩn tự tạo) và ma trận tín hiệu ban đầu tìm số PC và tính lại hàm lượng các hoạt chất trong các mẫu chuẩn bắt đầu với số PC sao cho tổng phương sai tích lũy đạt 95%, cho đến khi các hệ số tương quan và hệ số biến thiến (RMSES) đạt yêu cầu (R>0,9 và RMSES <5 nếu tính theo % hàm lượng). Nếu tìm được số PC phù hợp thì dừng lại. - Nếu tăng số PC mà % phương sai tích lũy đã lớn hơn 99% nhưng vẫn chưa đạt yêu cầu về R và RMSE thì phải tiến hành đạo hàm bậc 1 và đạo hàm bậc 2 phổ IR rồi tiếp tục tìm số PC phù hợp. Kết quả hàm lượng thu được ở cho thấy cả 2 phương pháp PCR và PLS đều cho kết quả tốt, song với phương pháp PLS có các giá trị RMSES và RMSET thấp hơn. Mặt khác, với mô hình đạo hàm bậc 2 có thể tách tín hiệu, loại bỏ nhiễu nhưng làm giảm giá trị A nên làm cho sai số lại tăng lên. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn ma trận đạo hàm bậc 1 với số PC bằng 4 theo phương pháp PLS để làm mô hình chuẩn xác định hoạt chất cefixim trong thuốc. 3.2.5. Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến xác định hoạt chất kháng sinh sulfaguanidin trong thuốc Chuẩn bị 35 mẫu tự tạo theo quy trình xử lí mẫu mục 2.2, gồm 25 mẫu làm ma trận chuẩn và 10 mẫu làm ma trận kiểm tra chứa hoạt chất sulfaguanidin và tá dược thường sử dụng trong thành phần viên thuốc là magie stearat, natriglycolat starch. Đo 35 mẫu tự tạo theo quy trình mục 2.2. Ma trận chuẩn gồm ma trận nồng độ có kích thước (25x1), ma trận tín hiệu có kích thước (25x417); ma trận kiểm tra gồm ma trận nồng độ có kích thước (10x1), ma trận tín hiệu có kích thước (10x417) ( đĩa CD – phụ lục 3). Nhập các dữ liệu ma trận nồng độ và ma trận tín hiệu của ma trận chuẩn, ma trận kiểm tra vào cửa sổ workspace và chạy câu lệnh theo từng bước của từng phương pháp PLS và PCR trong cửa sổ comman window. Kết quả ta thu được các ma trận Ypred, Ytest tính ra được từ mô hình với các số PC khác nhau. Xử lí kết quả theo các công thức (3.1, 3.2, 3.3) tìm ra các hệ số tương quan R2, RMSES, RMSET để tìm ra thuật toán hồi quy phù hợp với số PC lựa chọn tối ưu. 16 Dựa vào bảng kết quả phân tích số liệu ta thấy rằng các giá trị R2 tăng lên khi thay đổi số PC từ 3 đến 5, khi số PC thay đổi từ 5 đến 7 thì hệ số tương quan R2 không thay đổi nhiều. Các giá trị RMSE thay đổi không nhiều và có xu hướng giảm dần khi tăng số PC. So sánh các giá trị hệ số tương quan của các ma trận chuẩn và ma trận kiểm tra ta thấy với số PC=5 độ chính xác lặp lại. Do vậy, ta có thể lựa chọn phương pháp PLS với PC tối ưu bằng 5 để xác định sulfaguanidin trong các mẫu thuốc. 3.3. Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến xác định đồng thời các hoạt chất kháng sinh trong thuốc Trên thực tế, hầu như các thuốc kháng sinh chỉ chứa một số hoạt chất và tá dược. Do đó, mô hình hồi qui đa biến như phần 3.2 là hoàn toàn phù hợp. Tuy nhiên, do tỷ lệ kháng thuốc và kháng chéo giữa một số kháng sinh đặc biệt nhóm các sulfamid rất cao nên đã có một số loại thuốc ở dạng phối hợp nhiều kháng sinh như phối hợp sulfamethoxazol với trimethoprim hoặc amoxiclin với clavunalat để tăng khả năng điều trị bệnh. Mặt khác, qua khảo sát điều kiện đo ta thấy rằng các hoạt chất kháng sinh đều có chung điều kiện đo phổ IR và thuốc thành phẩm chứa kháng sinh có cùng chung nhiều thành phần tá dược như nhau. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn ghép chung một số hoạt chất vào từng nhóm nhỏ xây dựng ma trận xác định đồng thời các hoạt chất kháng sinh khi có lẫn các tá dược. Mô hình này nếu áp dụng được sẽ rất tiện lợi cho việc phát triển phần mềm mở (cập nhật thông tin mẫu chuẩn vào một mô hình) để xác định một hay nhiều hoạt chất trong thuốc trên các thiết bị IR đo hiện trường. 3.3.1. Nghiên cứu xác định đồng thời cefaclor, cephalexin, cefadroxil khi có tá dược 3.3.1.1. Chế tạo mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra chứa hoạt chất cefaclor, cephalexin, cefadroxil và các tá dược Chuẩn bị 31 mẫu tự tạo (22 mẫu chuẩn và 9 mẫu kiểm tra) chứa đồng thời ba hoạt chất cefaclor, cephalexin, cefadroxil và tổng ba tá dược: Magie stearate, bột talc, lactose theo như quy trình phân tích trong mục 2.2. Ta được ma trận nồng độ chuẩn có kích thước (22x4) và ma trận nồng độ kiểm tra có kích thước (10x4) (đĩa CD- phụ lục 3). 3.3.1.2. Xác định đồng thời cefaclor, cephalexin, cefadroxil khi có lẫn tá dược theo mô hình PCR Để có thể lựa chọn mô hình chuẩn theo phương pháp PCR việc đầu tiên chúng ta phải tìm giá trị PC tối ưu bằng cách nhập các ma trận nồng độ có 17 kích thước (22x1) ứng với thành phần phần trăm của từng chất trong 22 mẫu chuẩn, nhập ma trận tín hiệu bằng cách đo 22 mẫu chuẩn này trong vùng sóng 3600- 2800cm -1 , thu tín hiệu dưới dạng excel, chuyển các giá trị A của mẫu sang hàng ngang tương ứng với từng bước sóng, ta có ma trận tín hiệu ma trận chuẩn có kích thước (22x417). Chuyển các ma trận nồng độ và ma trận tín hiệu vào cửa sổ workspace, nhập câu lệnh tìm số PC như mục 2.3 trong cửa sổ comman window, ta thu được kết quả PC bắt đầu khảo sát là 5. Căn cứ vào các giá trị R2, RMEC, RMEP thu được ta thấy rằng ở số PC=5 vẫn cho kết qủa không chính xác, với PC bằng 6 và 7 thì kết quả có tăng độ chính xác hơn rõ rệt khi các giá trị R2 ở mức dao động trong khoảng giá trị (0,84 – 0,94) và RMEP thấp, khi PC bằng 8 và 9 các giá trị không thay đổi nhiều và cho kết quả tốt với R2 dao động trong khoảng (0,9 – 0,97) trong đó số PC=8 cho kết quả tốt hơn. Kết quả của các mẫu kiểm tra có sự lặp lại so với các mẫu chuẩn do vậy ta có thể lựa chọn ma trận chuẩn làm mô hình chuẩn xác định đồng thời các hoạt chất cefaclor, cephalexin, cefadroxil khi có lẫn các tá dược bằng phương pháp PCR với số PC tối ưu là 8. 3.3.3. Đánh giá lựa chọn mô hình chuẩn xác định đồng thời cefaclor, cephalexin, cefadroxil khi có lẫn tá dược theo phương pháp pháp PLS Dựa vào các giá trị thu được ta thấy rằng với số PC bằng 5 và 6 kết quả thu được là không tốt khi R2 dao động trong khoảng (0,696 – 0,982), RMEC và RMEP còn cao, kết quả không lặp lại ở các ma trận chuẩn và ma trận kiểm tra do đó 2 giá trị PC này không lựa chọn. Với PC bằng 7, 8 và 9 cho kết quả tương đối đồng đều ở cả 3 hoạt chất và có sự lặp lại ở các ma trận chuẩn, ma trận kiểm tra trong đó kết quả tốt nhất là số PC=8. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn ma trận chuẩn làm mô hình chuẩn theo phương pháp PLS với số PC=9 để xác định 3 hoạt chất kháng sinh cefaclor, cephalexin, cefadroxil trong thuốc. Căn cứ vào bảng kết quả xử lí số liệu của ma trận chuẩn và ma trận kiểm tra theo 2 phương pháp PCR và PLS với các số PC khác nhau chúng tôi thấy rằng hoàn toàn có thể dùng ma trận chuẩn để làm mô hình chuẩn xác định các hoạt chất kháng sinh trong thuốc ma không cần tách loại khi kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến PLS với số PC=9 và PCR với số PC=8. Trong 2 phương pháp, phương pháp PLS cho kết quả tốt hơn so với phương pháp PCR khi cho các giá trị R2 ở các hoạt chất trong các ma trận chuẩn và ma trận kiểm tra tốt hơn do vậy với ma trận chuẩn này chúng tôi lựa chọn làm mô hình chuẩn để định lượng các hoạt chất kháng sinh khi có lẫn tá dược bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến PLS với số PC=9. 18 3.3.4. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh trong thuốc theo mô hình PLS và PCR 3.3.4.1. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh nhóm penicilin trong thuốc theo mô hình PLS và PCR Chạy dữ liệu ma trận tín hiệu và ma trận hàm lượng của 24 mẫu chuẩn và 10 mẫu kiểm tra trên hai mô hình PLS và PCR với các số PC thay đổi từ 4 đến 7. Kết quả thu được thấy rằng đều cho kết quả tốt, mô hình PCR cho kết quả tối ưu. Vì vậy, lựa chọn mô hình PCR với số PC = 6 làm mô hình định lượng đồng thời penicilin, ampicilin và amoxicilin trong thuốc. 3.3.4.2. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh ceftriaxon và cefotaxim trong thuốc theo mô hình PLS và PCR Xây dựng mô hình xác định ceftriaxon và cefotaxim bằng ma trận tín hiệu và ma trận hàm lượng của 24 mẫu chuẩn và kiểm tra độ đúng bằng ma trận tín hiệu và ma trận hàm lượng của 16 mẫu kiểm tra. Chạy dữ liệu trên hai mô hình PLS và PCR với các số PC thay đổi từ 5 đến 8. Kết quả thu được thấy rằng đều cho kết quả tốt ở hai mô hình PLS và PCR. Vì vậy, có thể xác định hai hoạt chất này trên cả hai mô hình với số PC = 7 3.3.4.3. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh cefixim và cefadroxil trong thuốc theo mô hình PLS và PCR Chạy dữ liệu ma trận tín hiệu và ma trận nồng độ của 22 mẫu chuẩn và 10 mẫu kiểm tra trên hai mô hình PLS và PCR với các số PC thay đổi từ 4 đến 7. Kết quả thu được thấy rằng đều cho kết quả tốt, mô hình PCR cho kết quả tối ưu. Vì vậy, lựa chọn mô hình PLS với số PC = 5 làm mô hình định lượng đồng thời cefixim và cefadroxil trong thuốc. 3.3.4.4. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh penicilin và cephalexin trong thuốc theo mô hình PLS và PCR Sau khi xử lí số liệu trên ma trận tín hiệu ban đầu kết quả thu được không tốt, do tiến hành tối ưu hóa ma trận và tiến hành đạo hàm bậc 1 và ma trận bậc hai. Xử lí số liệu trong matlab2015 theo 2 mô hình PLS và PCR với các số PC thay đổi từ 2 đến 5. Kết quả thu được ma trận đạo hàm bậc 1 theo mô hình PLS với số PC =4 là tối ưu cho việc xác định các hoạt chất cephalexin và penicilin trong thuốc. 19 3.3.4.5. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh nhóm sulfamid trong thuốc theo mô hình PLS và PCR Chạy dữ liệu ma trận tín hiệu và ma trận nồng độ của 30 mẫu chuẩn và 15 mẫu kiểm tra trên hai mô hình PLS và PCR với các số PC thay đổi từ 3 đến 5. Kết quả thu được thấy rằng đều cho kết quả tốt, mô hình PCR cho kết quả tối ưu. Vì vậy, lựa chọn mô hình PCR với số PC = 5 làm mô hình định lượng đồng thời sulfaguanidin, sulfamethoxazol, trimethoprim trong thuốc. 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến kết quả tính toán theo mô hình Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm trong nhóm penicillin để có thể đánh giá ảnh hưởng của độ ẩm đến sai số của mẫu chi tiết hơn. Tiến hành lập một ma trận chuẩn gồm 15 mẫu trộn 3 hoạt chất penicillin, ampicillin, amoxicillin và các tá dược, đưa mẫu đo vào trong máy điều chỉnh độ ẩm thời gian khoảng một tiếng, điều chỉnh ở các độ ẩm khác nhau sau đấy lấy mẫu ra đem đo nhanh thu được ma trận tín hiệu (15x 417). Như vậy, kết quả cho thấy, hơi nước là một yếu tố trực tiếp ảnh hưởng đến phổ hấp thụ hồng ngoại của chất. Các phân tử nước có hấp thụ hồng ngoại ở vùng 3450 cm -1 (thuộc cùng khảo sát của hoạt chất nghiên cứu) gây ra sự chồng chập các peak hấp thụ hồng ngoại, làm tang cường độ hấp thụ. Khi độ ẩm tăng lên đến giá trị 50% đã gây ra sai số lớn hơn mức cho phép. Vì thế, để loại trừ ảnh hưởng của nước cần giữ mẫu khô trong phòng giữ độ ẩm ở 30 đến 45%. 3.5. Phân tích mẫu thực tế 3.5.1. Định tính mẫu thực tế Từ kết quả hình ảnh phổ hấp thu hồng ngoại của mẫu thực tế và bảng dữ liệu phổ thu được từ các mẫu thực tế, chúng ta nhận thấy có sự giống nhau giữa các mẫu thực tế so với phổ thư viện tham chiếu (các số liệu đều cho kết quả gần về 0). Chứng tỏ rằng các mẫu thực tế có chứa hoạt chất cần nghiên cứu. Do đó, có thể tiến hành định lượng các mẫu thực tế bằng phương pháp nghiên cứu. 3.5.2. Định lượng các kháng sinh trong mẫu thuốc 3.5.2.1. Định lượng các kháng sinh nhóm sulfamid 20 Bảng 3.1: Hàm lượng (mg/viên) của SFG trong các mẫu thực tế (đã tính hệ số pha loãng) Mẫu Phương pháp hồng ngoại (mg/viên) Phương pháp đối chứng (mg/viên) Hàm lượng trên bao bì (mg/viên) S1 464,5± 0,6 483,5±0,4 500 S2 483,6±1,8 486,1±0,3 500 S3 456,4±1,2 494,4±0,3 500 S4 481,1±2,5 490,8±0,2 500 Bảng 3.2: Hàm lượng (mg/viên) của SFM và TMP trong các mẫu thực tế (đã tính hệ số pha loãng) Mẫu Hàm lượng SFM (mg/viên) Hàm lượng TMP (mg/viên) PP hồng ngoại PP đối chứng HL trên bao bì PP hồng ngoại PP đối chứng HL trên bao bì ST1 369,5±1,8 391,2±0,2 400 69,0±1,8 77,5±0,3 80 ST2 382,7±1,2 395,2±0,9 400 71.9±1,2 81,6±0,4 80 ST3 392,7±1,0 394,4±0,2 400 76,0±1,0 77,5±0,2 80 ST4 390,1±0,7 389,2±0,6 400 76,8±0,7 80,6±0,4 80 3.5.2.2. Định lượng các kháng sinh nhóm penicillin Bảng 3.3: Hàm lượng (mg/viên) của PN,AM,AX trong các mẫu thực tế (đã tính hệ số pha loãng) Mẫu Phương pháp hồng ngoại (mg/viên) Phương pháp đối chứng (mg/viên) Hàm lượng trên bao bì (mg/viên) PN 605,2±1,1 598, 1±0,6 625 AM 464,2±2,0 493,0±0,7 500 AX 547,1±0,9 496,5±0,8 500 Bảng 3.4: Hàm lượng (mg/viên) của nhóm Cefalosporin trong các mẫu thực tế (đã tính hệ số pha loãng) Mẫu Phương pháp hồng ngoại (mg/viên) Phương pháp đối chứng (mg/viên) Hàm lượng trên bao bì (mg/viên) Phương pháp đối chứng theo dược điển VN4 Phương pháp đối chứng LC- MS Cephalexin MKP 530,7±3,20 - 545,9±0,4 500 Cephalexin 540,2±1,1 528,50±0,9 - 500 Mekocefaclor 243,1 ± 7,9 - 283,8±0,3 250 Cadidroxyl 513,9 ± 1,7 - 512,7±0,3 500 Cefixim 214,8±4,6 205,60±0,8 - 200 Cefadroxil 467,2±1,3 507,00±1,2 - 500 Cefaclor 224,6±5,6 249, 25±1,0 - 250 21 3.5.2.3. Định lượng các kháng sinh nhóm Cefalosporin Bảng 3.5: Hàm lượng (g/lọ) thuốc tiêm của nhóm Cefalosporin trong các mẫu thực tế (đã tính hệ số pha loãng) Mẫu Phương pháp hồng ngoại (g/lọ) Phương pháp đối chứng (g/lọ) Hàm lượng trên bao bì (g/lọ) Phương pháp đối chứng theo dược điển VN4(g/lọ) Phương pháp đối chứng LC- MS(g/lọ) Ceftriaxone UNION 1,033±0,023 - 1,003±0,065 1,000 Cefotaxime Myclox 1,021±0,014 1,007±0,056 - 1,000 Cefotaxime BHARAT 1,058±0,025 - 1,068±0,079 1,000 Từ các kết quả thu được chúng tôi nhận thấy hàm lượng các hoạt chất thu được theo phương hồi quy đa biến với phương pháp phân tích tiêu chuẩn trong dược điển sai khác không đáng kể. Độ chệch tương đối hàm lượng Cephalexin giữa phương pháp hồng ngoại và phương pháp đối chứng là 2,2%- 2,7% , Cefaclor là:9,88%-11,36%, Cefadroxil là : 0,24%-7,8% , Cefixim là: 4,48%, Cetriaxone là: 0,3%, Cefotaxim là : 1%-2%. Từ sự chênh lệch giữa các phương pháp phân tích, cho ta thấy rằng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến tỏ ra khá ưu việt khi áp dụng vào phân tích một số hoạt chất nhóm Cefalosporin. Do đó hoàn toàn có thể áp dụng phổ biến để phân tích nhanh hàm lượng các mẫu thuốc ngoài thị trường. Để dễ so sánh, kết quả phân tích được bằng phương pháp IR sử dụng thuật toán PCR và PLS so với phương pháp đối chứng của tất cả 16 mẫu thuốc được biểu diễn thông qua so sánh tương quan hàm lượng bằng cách tính hệ số tương quan (hình 3.54). Hệ số tương quan đạt được tính qua R2= 0,9891 chứng tỏ kết quả phân tích là tương đương nhau. 22 Hình 3.1: Tương quan giữa hàm lượng hoạt chất được xác định bằng hồi quy đa biến và hàm lượng hoạt chất được xác định theo dược điển (n=16) Bảng 3.6: Hàm lượng (mg/viên) của nhóm Cefalosporin trong các mẫu thực tế (đã tính hệ số pha loãng) Mẫu Phương pháp hồng ngoại (mg/viên) Phương pháp đối chứng (mg/viên) Hàm lượng trên bao bì (mg/viên) Phương pháp đối chứng theo dược điển VN4 Phương pháp đối chứng LC- MS Cephalexin MKP 530,715±3,2 - 545,88±0,4 500 Cephalexin 540,22±1,08 528,5±0,89 - 500 Mekocefaclor 243,04 ± 7,87 - 283,81±0,3 250 Cadidroxyl 513,94 ± 1,65 - 512,67±0,3 500 Cefixim 214,82±4,56 205,6±0,78 - 200 Cefadroxil 467,2±1,32 507±1,23 - 500 Cefaclor 224,61±5,6 249, 25±0,97 - 250 Bảng 3.7: Hàm lượng (g/lọ) thuốc tiêm của nhóm Cefalosporin trong các mẫu thực tế (đã tính hệ số pha loãng) Mẫu Phương pháp hồng ngoại (g/lọ) Phương pháp đối chứng (g/lọ) Hàm lượng trên bao bì (g/lọ) Phương pháp đối chứng theo dược điển VN4(g/lọ) Phương pháp đối chứng LC- MS(g/lọ) Ceftriaxone UNION 1,033±2,3 - 1,003±0,65 1,000 Cefotaxime Myclox 1,021±1,4 1,007±0,56 - 1,000 Cefotaxime BHARAT 1,058±2,5 - 1,068±0,79 1,000 R² = 0.9891 0 100 200 300 400 500 600 700 0 100 200 300 400 500 600 700 H àm lư ợ n g h o ạt c h ất t ín h t h e o m ô h ìn h Hàm lượng hoạt chất xác định theo HPLC 23 KẾT LUẬN Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam ứng dụng thành công kỹ thuật đo phổ IR vùng gần và trung để định lượng các hoạt chất kháng sinh nhóm sulfamid và nhóm beta lactam trong thuốc viên nén và thuốc tiêm nhờ xử lý số liệu bằng phương pháp hồi quy đa biến. Các kết quả chính luận án đạt được như sau: 1. Đã lựa chọn được các điều kiện phù hợp của phép đo phổ hồng ngoại truyền qua nhằm định lượng các hoạt chất kháng sinh trong viên thuốc. Mẫu được đo trục tiếp dạng rắn với vùng phổ IR tối ưu để xác định các hoạt chất kháng sinh nhóm sulfamid và nhóm beta- lactam từ 3600 cm-1 - 2800 cm -1; tỉ lệ khối lượng khi trộn mẫu với KBr là 2:98; khối lượng cân đem ép viên là 15mg. Độ ẩm của mẫu đo và môi trường đo có ảnh hưởng đáng kể đến kết quả và cần khống chế độ ẩm dưới 45%. 2. Các thành phần tá dược phổ biến thường đi kèm với hoạt chất trong các loại thuốc viên có ảnh hưởng rất lớn đến tín hiệu phổ hấp thụ hồng ngoại trong khoảng 3600 cm-1 - 2800 cm-1 nên không thể sử dụng kỹ thuật định lượng theo phương pháp đường chuẩn biểu diễn độ hấp thụ quang tại đỉnh pic hoặc diện tích pic theo hàm lượng mà phải sử dụng các mô hình hồi quy đa biến tuyến tính cho số liệu trên toàn dải phổ (417 số sóng trong khoảng phổ đo). 3. Trong số các mô hình hồi qui đa biến tuyến tính CLS, ILS, PCR, PLS thì hai mô hình xử lý tín hiệu thông qua ma trận số liệu ban đầu là CLS và ILS đều cho sai số rất lớn (hàng nghìn %). Nguyên nhân có thể do giá trị độ hấp thụ quang không lặp lại giữa các lần đo và tín hiệu bị ảnh hưởng bởi rất nhiều thành phần chất không có trong mẫu chuẩn tự tạo. 4. Hai phương pháp hồi qui đa biến tuyến tính PCR và PLS sử dụng ma trận tín hiệu độ hấp thụ quang chuyển đổi theo thuật toán giảm số biến và loại bỏ nhiễu cho kết quả phân tích rất tốt. Mô hình hồi qui được xây dựng dựa trên ma trận tín hiệu độ hấp thụ quang và ma trận hàm lượng hoạt chất trong 20-30 mẫu chuẩn tự tạo, sau đó được đánh giá độ chính xác bằng ma trận 10-15 mẫu kiểm tra. Khi xác định cefixim, số PC tối ưu cho mô hình PLS với PC bằng 4 với ma trận đạo hàm bậc 1. Hai mô hình này đã được áp dụng để phân tích cefixim trong mẫu chuẩn kiểm tra (tự tạo) với hệ số tương quan R>0,95. Khi xác định sulfaguanidin trong mẫu chuẩn kiểm tra (tự tạo) với số PC tối ưu là 5 theo phương pháp PLS, thì hệ số tương quan hàm lượng tìm được với hàm lượng biết trước là R> 0,95 với ma trận ban đầu không cần đạo hàm. 24 5. Hai thuật toán hồi qui đa biến PCR và PLS cũng đã được sử dụng thành công để xác định đồng thời một số các kháng sinh trong cùng nhóm chất, gồm: sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim; cephalexin, cefaclor và cefadroxil; penicilin, ampicilin và amoxicilin; cefotaxim và ceftriaxon; cefixim và cefadroxil; với hệ số tương quan R biểu thị hàm lượng tìm được và hàm lượng biết trước trong mẫu chuẩn kiểm tra đạt từ 0,83 đến 0,99. Các mô hình được bắt đầu với số PC từ 3 (thông thường chọn từ PC nào mà tổng % phương sai tích lũy đạt 95% trở lên) cho đến 9 sao cho hệ số tương quan R >0,95. Nếu chưa đạt sẽ tiến hành với ma trận tín hiệu đạo hàm bậc 1 và bậc hai. Các đều cho kết quả rất phù hơp với hàm lượng biết trước trong mẫu kiểm tra mà không cần đạo hàm phổ. Riêng phép xác định đồng thời penicilin và cephalexin cần tiến hành trên phổ đạo hàm bậc 1 với số PC=5 mới cho kết quả phù hợp. 6. Đã xây dựng được qui trình định tính và định lượng nhanh các hoạt chất kháng sinh trong thuốc viên nén và thuốc bột pha tiêm bằng phương pháp IR trên cơ sở mô hình xác định đồng thời. Mẫu rắn chỉ cần nghiền nhỏ, trộn với KBr và đo phổ IR mà không cần xử lý mẫu. Dữ liệu phổ IR toàn phần trong vùng phổ khảo sát được chuyển vào phần mềm Matlab R2015 với các câu lệnh tự lập. Kết quả áp dụng mô hình hồi quy đa biến tuyến tính PCR và PLS cho thấy độ lệch kết quả tìm được bằng phương pháp nghiên cứu với phương pháp đối chứng theo dược điển Việt Nam hoặc phương pháp tham chiếu LC-MS chỉ khoảng 0,2%-11,8% tùy mẫu. Nghiên cứu này cho thấy có thể xây dựng một mô hình hồi qui chứa đồng thời các chất nhưng xác định được một hoạt chất trong thuốc.  Hướng phát triển tiếp của đề tài: Các kết quả nghiên cứu ban đầu bằng cách ghép số liệu ma trận hàm lượng của 12 chất đã làm ở trên vào một ma trận hàm lượng (trong đó mẫu chuẩn nào không có chất phân tích thì hàm lượng nhập vào bằng 0) với ma trận số liệu độ hấp thụ quang tương ứng đã cho thấy có sự phù hợp rất tốt giữa kết quả phân tích với hàm lượng biết trước trong các mẫu kiểm tra. Điều này mở ra hướng phát triển tiếp theo của đề tài về việc xây dựng ngân hàng mẫu chuẩn theo cách cập nhật thông tin phổ từng mẫu để xác định các chất khác nhau trong mẫu và rất thuận lợi để có thể phát triển thiết bị đo hiện trường. Thành công của nghiên cứu này góp phần vào việc phát triển một phương pháp phân tích đơn giản, nhanh, xử lí mẫu đơn giản không sử dụng dung môi độc hại và hướng tới tự chế tạo được thiết bị phân tích ngay tại hiện trường. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Tạ Thị Thảo, Đoàn Thị Huyền, Bùi Xuân Thành (4/2016). Ứng dụng phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính để phân tích đồng thời các chất trong cùng hỗn hợp, Kỷ yếu hội thảo khoa học trường Đại học Sư phạm Hà Nội, tr.364-376 2. Đoàn Thị Huyền, Tạ Thị Thảo, Bùi Xuân Thành, Vũ Thị Huệ. Nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ hồng ngoại gần định lượng nhanh hoạt chất Sulfaguanidin trong thuốc viên nén. Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, 21(1/2016), tr.153-162. 3. Tạ Thị Thảo, Bùi Xuân Thành, Vũ Thị Huệ, Đoàn Thị Huyền. Định lượng đồng thời Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim trong thuốc viên nén sử dụng mô hình hồi quy cấu tử chính (PCR) từ dữ liệu phổ hồng ngoại gần. Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, 21(2/2016), tr.127-134 4. Đoàn Thị Huyền, Nguyễn Thu Thảo, Bùi Xuân Thành, Tạ Thị Thảo. Định lượng đồng thời cefotaxime và Ceftriaxone trong thuốc bột pha tiêm bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần kết hợp với mô hình bình phương tối thiểu từng phần(PLS), Tạp chí khoa học, Đại học ĐH Quốc Gia Hà Nội, Vol. 32, No. tr.167-174. 5. Đoàn Thị Huyền, Nguyễn Phương Hoa, Bùi Xuân Thành, Tạ Thị Thảo. Nghiên cứu định lượng nhanh cefadroxil, cephalexin, cefaclor trong thuốc viên nén bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần đối chứng bằng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ LC MS, Tạp chí Hóa, lý và Sinh học, 21(3/2016), tr.94-101 6. XUAN-THANH BUI, THI HUYEN DOAN,ANH-TUYET THI NGUYEN,THI-THAO TA,DOUGLAS N. RUTLEDGE,SI-HUNG LE. “FTIR combined with chemometric for fast simultaneous determination of Penicillin and Cefalexin in medicine”. Indian Chemical Society (đã xác nhận đăng).