[Tóm tắt] Luận án Nghiên cứu phân lập và chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- Cao Lệ Quyên NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀO GIỐNG LÚA Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2016 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Xuân Hội 2. PGS.TS. Đinh Đoàn Long Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án đƣợc bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Quốc gia họp tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội vào hồigiờ 00, ngàythángnăm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội Đặt vấn đề Gần đây, do ảnh hƣởng của hiện tƣợng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán xảy ra ngày càng thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, gây tác động lớn tới tổng sản lƣợng lƣơng thực quốc gia, ảnh hƣởng tới công tác xuất khẩu lúa gạo, đe doạ trực tiếp tới an ninh lƣơng thực trong khu vực và trên thế giới.Trong điều kiện khí hậu toàn cầu biến đổi mạnh mẽ, việc tạo ra các giống cây trồng có năng suất cao, đồng thời chống/chịu đƣợc với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng trở thành một trong những nhiệm vụ then chốt của khoa học nông nghiệp. Tuy nhiên, cho đến này tất cả những giống cây trồng chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi đƣợc sử dụng trong sản xuất đều đƣợc lai tạo dựa trên các phƣơng pháp chọn giống truyền thống, hầu nhƣ chƣa có giống cây trồng chịu hạn nào đƣợc tạo ra b ng phƣơng pháp công nghệ sinh học. Sang thế k I, với sự phát triển b ng nổ của sinh học phân tử và công nghệ tế bào, hai định hƣớng chọn giống chịu hạn đang đƣợc các nhà khoa học đặc biệt quan tâm là chọn giống phân tử và chọn giống chuyển gen. Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen (với sự tham gia của hàng trăm gen khác nhau), vì vậy định hƣớng chọn giống phân tử đang gặp khó khăn lớn trong việc quy tụ các tính trạng, gen quan trọng liên quan đến chịu hạn. Gần đây, dựa trên những thành tựu nghiên cứu về chức năng hệ gen thực vật, c ng với sự phát triển các kỹ thuật microaray, proteomic..., các nhà khoa học đã phát hiện và chứng minh vai trò quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc tăng cƣờng tính chịu hạn ở thực vật. Nhóm gen điều khiển mặc d không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn của thực vật nhƣng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác tham gia vào quá trình đáp ứng hạn, dẫn tới làm tăng cƣờng khả năng chịu hạn ở thực vật. Phát hiện này đã mở ra một hƣớng nghiên cứu rất mới cho lĩnh vực chọn giống chuyển gen ở thực vật, đó là ch cần chuyển một hay một vài gen điều khiển thay vì vài trăm gen chức năng vào cây để tăng cƣờng tính chống chịu của cây trồng. Chính vì lí do này mà các nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá các gen điều khiển liên quan đến tính chịu hạn đang trở thành định hƣớng nghiên cứu đầy tiềm năng trong việc chọn tạo giống chịu hạn. Ở Việt Nam, trong khoảng 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu về phân lập gen chịu hạn và tạo giống cây trồng chống chịu hạn b ng công nghệ chuyển gen thực vật đã bắt đầu đƣợc một số phòng thí nghiệm quan tâm. Tuy nhiên, hầu hết các chƣơng trình, dự án nghiên cứu về gen chống chịu stress môi trƣờng nói chung và chống chịu hạn nói riêng đều sử dụng các nguồn gen từ nƣớc ngoài hoặc các gen đã đƣợc công bố bởi các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới. Cho đến nay, chúng ta vẫn chƣa có một đề tài nghiên cứu cơ bản hoàn ch nh nào về phân lập gen liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật. Từ đó, chúng tôi đề xuất và tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập và chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa ở Việt Nam” với mục đích để tạo nguồn vật liệu, số liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu điều kiện hạn. Mục tiêu nghiên cứu i) Phân lập đƣợc gen mã hóa nhân tố phiên mã s R 1 /2 liên quan tính chịu hạn trên giống lúa Việt Nam. ii) Tối ƣu hoá đƣợc quy trình biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên một số giống lúa Việt Nam. iii) Tạo ra đƣợc một số dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã s R 1 /2 có kiểu hình tƣơng đồng cây đối chứng (cây không chuyển gen) trong điều kiện bình thƣờng và có khả năng chống/chịu (tiếp tục sinh trƣởng, cho thu hạt) khi bị xử l hạn trong điều kiện phòng thí nghiệm. Đối tƣợng v nội ung nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là các gen OsDREB1A/2A mã hóa nhân tố điều hòa phiên mã liên quan tới tính chịu hạn của giống lúa Việt Nam và vai trò, biểu hiện của các gen mã hóa nhân tố phiên mã này trong các dòng chuyển gen dƣới sự điều khiển của các promoter liên tục hoặc cảm ứng. ác n i ung nghiên cứu chính  Nội dung 1: Phân lập gen hai gen OsDREB1A và OsDREB2A liên quan đến tính chịu hạn từ thƣ viện c N của giống lúa Việt Nam; và thiết kế các cấu trúc chuyển gen thực vật (binary vector) cho gen OsDREB1A/OsDREB2A dƣới sự điều khiển của promoter liên tục (Ubiquitine)/cảm ứng (Lip9).  Nội dung 2: Tối ƣu hóa quá trình phát sinh callus và tái sinh cây từ callus của một số giống lúa Việt Nam; và hoàn thiện kỹ thuật biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên một số giống lúa Việt Nam có tiềm năng phát sinh callus và khả năng tái sinh cao.  Nội dung 3: iến nạp các cấu trúc biểu hiện nhân tố phiên mã vào giống lúa Việt Nam và sàng lọc các dòng cây chuyển gen (kiểu hình- so sánh với cây đối chứng, kiểu gen- xác định sự tồn tại ổn định và số lƣợng cấu trúc biến nạp trong cây chuyển gen).  Nội dung 4: Đánh giá biểu hiện (kiểu hình và kiểu gen) của các dòng chuyển gen (T3, một cấu trúc biến nạp) trong điều kiện xử l hạn tại phòng thí nghiệm. Địa điểm nghiên cứu Luận án đƣợc thực hiện tại 2 địa điểm chính: ộ môn ệnh học Phân tử, Viện i truyền Nông nghiệp (Viện hoa học Nông nghiệp Việt Nam) là địa ch uy tín, dẫn đầu trong cả nƣớc về công tác phân lập, nghiên cứu chức năng của các gen mã hóa nhân tố phiên mã; và Phòng Thí nghiệm tƣơng tác cây trồng-vi sinh vật thuộc Trung tâm nghiên cứu vì sự phát triển (IR ) tại ontpellier là phòng thí nghiệm có trang bị hiện đại, có các chuyên gia uy tín trong nghiên cứu chức năng, biểu hiện của gen/bộ gen thực vật (đặc biệt là lúa). Đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam thực hiện một cách có hệ thống về nghiên cứu cơ bản theo định hƣớng ứng dụng trên hai gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A và OsDREB2A liên quan tính chịu hạn. Trong nghiên cứu này, trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A dƣới sự điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục (Ubiquitin) hoặc promoter cảm ứng stress (Lip9) đã đƣợc nghiên cứu biểu hiện và ảnh hƣởng đến cây lúachuyển gen trong cả điều kiện thông thƣờng và điều kiện bất lợi. Luậnánđã chọn đƣợc 04 dòng lúa Chành trụi chuyển gen (OsDREB1A) kiểu hình bình thƣờng và có khả năng tăng cƣờng chịu hạn (đã duy trì đến T3). Ngoài ra, trong nghiên cứu này, lần đầu tiên ở Việt Nam chúng tôi tiến hành khảo sát chi tiết khả năng phát sinh callus và khả năng tái sinh cây hoàn ch nh từ callus của nhiều giống lúa Việt Nam (giống phổ biến, giống chịu hạn, giống địa phƣơng...). ết quả nghiên cứu đã ch ra một số giống lúa có tiềm năng để tiếp tục tối ƣu quy trình chuyển gen cho từng giống lúa sau này. Đây là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nh m tạo ra các giống lúa công nghệ sinh học b ng công nghệ ch nh sửa hệ gen không qua lai tạo có các đặc điểm nông sinh học vƣợt trội mà vẫn giữ các phẩm chất của giống gốc ban đầu. Luận án lần đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng phản ứng PCR định lƣợng trong việc ƣớc tính số lƣợng bản sao của cấu trúc chuyển gen và xác định các dòng chuyển gen đồng hợp ngay từ thế hệ T1. Với kết quả từ nghiên cứu này, chúng tôi tin r ng đây có thể là phƣơng pháp ph hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm còn nhiều hạn chế trong nƣớc khi tiến hành nghiên cứu, sàng lọc các dòng cây chuyển gen. Ứng ụng thực tiễn của luận án ết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra đƣợc các dòng T2 (đồng hợp, một bản sao gen OsDREB1A dƣới sự điều khiển của promoter cảm ứng Lip9) có kiểu hình tƣơng đồng cây đối chứng không chuyển gen và đặc biệt có khả năng phục hồi và kết hạt sau 3 tuần ngừng tƣới nƣớc. Đây là kết quả quan trọng, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của OsDREB1A và điều hòa biểu hiện của gen mã hóa nhân tố phiên mã dƣới sự điều khiển của promoter cảm ứng trong công tác tạo giống cây chuyển gen chịu hạn. Trên cơ sở kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen OsDREB1A và OsDREB2A do luận án tạo ra đang đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng nhƣ ngô, đậu tƣơng, bông để chọn tạo các giống cây chuyển gen chịu hạn nh m đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu. Các dòng chuyển gen đƣợc duy trì theo dõi trong nhà lƣới để làm nguyên liệu cho công tác lai tạo giống khi điều kiện thực tế cho phép (chấp nhận cây lúa chuyển gen và vật liệu di truyền do sự kiện chuyển gen tạo ra). 1. Bố cục của luận án Luận án gồm 137 trang, bao gồm: Phần mở đầu (06 trang); Tổng quan tài liệu (32 trang); Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (18 trang); Kết quả nghiên cứu và thảo luận (36 trang); Kết luận (02 trang); Kiến nghị (01 trang); Các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (12 trang) với 135 tài liệu gồm 2 thứ tiếng: tiếng Việt (12 tài liệu) và tiếng Anh (123 tài liệu); Phụ lục (14 trang). Luận án có 18 bảng, 24 hình. Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ẢNH HƢỞNG CỦA HẠN HÁN ĐẾN NÔNG NGHIỆP & THỰC VẬT Hạn đối với thực vật là khái niệm đƣợc d ng để ch trạng thái thiếu nƣớc do môi trƣờng gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn sống, làm ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật. ôi trƣờng khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển. Để đối phó với điều kiện hạn hán, thực vật sẽ khởi động cơ chế phòng vệ chống lại sự thiếu hụt nƣớc, sau đó sẽ là một loạt các cơ chế ở các cấp độ khác nhau. Đáp ứng chống chịu stress hạn của thực vật đƣợc thực hiện thông qua một chuỗi các quá trình rất phức tạp với sự tham gia của hàng loạt các yếu tố và có thể chia thành 3 giai đoạn: nhận tín hiệu – dẫn truyền tín hiệu – đáp ứng chống chịu khởi đầu chuỗi truyền tín hiệu. 1.2. PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TR NG ĐIỀU KIỆN HẠN Thực vật thích nghi với môi trƣờng sống nhờ khả năng điều hòa nhanh biểu hiện của các gen chức năng. Quá trình điều hòa biểu hiện gen đóng một vai trò quan trọng trong đáp ứng của thực vật với các điều kiện stress phi sinh học, trong đó có hạn hán. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh stress hạn tác động tới tất cả các bƣớc trong quá trình điều hòa hoạt động gen của thực vật, bao gồm: điều hòa quá trình phiên mã, điều hòa sau phiên mã, điều hòa quá trình dịch mã, điều hòa sau dịch mã, điều hòa hoạt động gen thông qua các phân tử RNA không mã hóa và yếu tố di truyền ngoại sinh (ví dụ nhƣ quá trình methyl hóa DNA hay quá trình biến đổi histone). 1.3. VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN Ã TR NG ĐÁP ỨNG STRESS HẠN Trong hệ gen thực vật có khoảng 7% gen mã hóa nhân tố phiên mã (TF), trong số đó có rất nhiều gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress. Các TF tham gia trong mạng lƣới điều hòa hoạt động gen đáp ứng stress hạn đã biết cho tới nay đƣợc xác định thuộc hầu hết các nhóm TF lớn của thực vật, trong đó đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là các nhóm AP2/ERF, NAC, WRKY, MYB/MYC, bZIP hay ZF. 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNxG LÚA CHUYỂN GEN CHỊU HẠN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM Việc phát triển các giống lúa chịu hạn và giảm lƣợng nƣớc tiêu thụ trong sản xuất lúa gạo có nghĩa vô c ng to lớn để tăng sản lƣợng và đảm bảo an ninh lƣơng thực. Một hƣớng nghiên cứu phổ biến và rất đƣợc quan tâm hiện nay là tăng cƣờng biểu hiện các gen đáp ứng hoặc liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn trong cây lúa chuyển gen. o cơ chế chống chịu hạn phức tạp của thực vật, việc sử dụng các gen điều hòa (mã hóa các protein tham gia vào mạng lƣới điều hòa đáp ứng stress) trong nghiên cứu chuyển gen tạo giống lúa chịu hạn thƣờng mang lại hiệu quả cao hơn so với các gen chức năng (mã hóa protein/enzyme trực tiếp tham gia vào đáp úng chống chịu stress). Tuy nhiên, cho đến nay mới ch có một vài nghiên cứu chứng minh khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen trong điều kiện thử nghiệm trên đồng ruộng. Ở Việt Nam, cho đến nay chƣa có một nghiên cứu hoàn ch nh nào về các gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress ở thực vật, đặc biệt là nhóm gen mã hoá nhân tố phiên mã liên quan tới tăng cƣờng đáp ứng chống chịu hạn ở lúa. Chƣơng 2. VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Thƣ viện c N sơ cấp của lúa Oryza sativaL.xử lý hạn và mặn đƣợc cung cấp bởi Bộ môn Bệnh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp. 47 giống lúa đƣợc cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Di truyền. 2.1.2. Chủng vi sinh vật Chủng vi khuẩn Escherichia coli H5α đƣợc mua từ hãng Fermentas (Mỹ); chủng vi khuẩn E. coli XLOR, XL1-Blue MRF và phage “trợ giúp” đƣợc mua từ Công ty Agilent Technologies (Mỹ); chủng vi khuẩn E. coli Rosetta (DE3) khả biến đƣợc mua từ Công ty Merck Millipore (Mỹ); chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 khả biến. 2.1.3. Vector và oligonucleotide Các cặp mồi sử dụng làm mồi và các mẫu oligonucleotide đầu dò đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ). 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Xử lý mẫu thực vật theo phƣơng pháp của Qin (2007), Dubouzet (2003) và Tran (2004). - Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA. - Nhân dòng trình tự mã hóaOsDREB1A/OsDREB2Avào vectorpUC19. - Thiết kế vector biểu hiện OsDREB1A/OsDEB2A. Hình 2.2 | Giản đồ quy trình thiết kế vector chuyển gen - Đánh giá khả năng tạo callus và tái sinh chồi từ callus của một số giống lúaở Việt Nam - Khảo sát một số quy trình chuyển gen cho lúa indica - Tạo cây chuyển gen biểu hiện OsDREB1A/OsDREB2A. - Sàng lọc kiểu gen, kiểu hình của các cây chuyển gen - Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen ở giai đoạn sinh trƣởng, ra hạt Chƣơng 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LẬP THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN OSDREB1A/OSDREB2A 3.1.1. Phân lập trình tự mã hóa gen OsDREB1A/OsDREB2A Trình tự mã hóa gen OsDREB1A đã đƣợc phân lập b ng phản ứng PCR với cặp mồi gen OsDREB1A-Fw/Rv từ DNA hệ gen giống Cƣờm Dạng và thƣ viện cDNA xử lý hạn của giống lúa Mộc tuyền. Trình tự mã hóa s R 2 đã đƣợc phân lập b ng phản ứng PCR với cặp mồi gen OsDREB2A-Fw/Rv từ khuôn cDNA xử lý hạn của giống lúa Cƣờm Dạng. Sản phẩm khuếch đại trình tự mã hóa của hai gen đã đƣợc nhân dòng vào vector pUC19. Vector tái tổ hợp đã đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng H5α, sàng lọc b ng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn các lạc màu trắng(hình 3.5) và tiếp đó đƣợc giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger với cặp mồi vector . Hình 3.5 | Kết quả PCR kiểm tra trực tiếp khuẩn lạc mang vector pUC19 tái tổ hợp Ghi chú: ên trái- i h ợc biến n p vector tái tổ hợ i giế g - 5: sản ph h h n l c biến n p sản ph m ghép n i với o n chèn là sản ph m khuế h i trình tự mã hóa OsDREB1A t DNA tổng s gi g ú ờm D ng; (ii) giếng 6-9: sản ph h h n l c biến n p sản ph m ghép n i với o n chèn là sản ph m khuế h i trình tự mã hóa OsDREB1A t cDNA xử lý h n của gi ng lúa M c Tuyề giế g i chứng âm (không có DNA khuôn). ên ph i- i h ợc biến n p vector tái tổ hợp pUC19/OsDREB2A: giế g i chứng âm (không có DNA khuôn); 12-15: sản ph h h n l c biến n p sản ph m ghép n i giữa pUC19 và sản ph m khuế h i trình tự mã hóa OsDREB2A t cDNA của gi g ú ờm D ng. 3.1.2. Thiết kế vector chuyển gen Trình tự mã hoá OsDREB1A/OsDREB2A trong vector pUC19 và vector chuyển gen pBIG - Lip9/Ubi đƣợc cắt và xử lý b ng enzyme giới hạn BamHI, rồi đƣợc ghép nối b ng enzyme T4 ligase theo quy trình giản lƣợc trong hình 2.2. Vector pBIG-Lip9/Ubi tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng DH5α, sử dụng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc để sàng lọc các thể tái tổ hợp trong đó trình tự mã hóa n m cùng chiều với promoter điều khiển trong cấu trúc chuyển gen (hình 3.10). Hình 3.10 | Điện i sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% i- Sản ph m PCR t các khu n l c mang pBIG-Lip9-OsDREB1A. Giếng M: Thang chu n DNA 1kb; giếng 1, 2: khu n l c 1 và 2; giế g 3 i chứng âm B- Sản ph m PCR t các khu n l c mang pBIG-Lip9-OsDREB2A. Giếng M: Thang chu n DNA 1kb; giế g i chứng âm; giếng 2-5: khu n l c 1-4 3.2. NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CHUYỂN G N VÀ GIỐNG LÚ Ở VIỆT N 3.2.1. Khả hình th nh callus của tập đo n giống lúa Việt Nam Sử dụng 03 loại môi trƣờng MS (nồng độ 2,4D từ 1,5 mg/l đến 2,5 mg/l) để khảo sát khả năng tạo callus của 47 giống lúa ở Việt Nam chúng tôi nhận thấy có 26 giống có khả năng tạo callus tốt. Trong đó, có 05 giống bao gồm giống 20, 26, 34, 44 và 47 có tiềm năng tạo callus cao nhất. Cụ thể là với giống 20 môi trƣờng có bổ sung 1,5mg/l 2,4 (môi trƣờng S1) cho tỷ lệ tạo callus cao nhất (78,49%) còn môi trƣờng có bổ sung 2mg/l 2,4 ( môi trƣờng S2) là thích hợp nhất cho sự hình thành callus của giống lúa 26, 34, 44 và 47 (tƣơng ứng 84,94, 76,53%, 79,61% và 90,06%). 3.2.2. Khả năng tái sinh của tập đo n giống lúa Việt Nam 26 giống lúa có khả năng tạo callus tốt trong mục 3.2.1 đã đƣợc nghiên cứu đánh giá khả năng tái sinh chồi từ callus trên 04 loại môi trƣờng trên nền MS có bổ sung BAP và kinetin. Kết quả khảo sát cho thấy, có 05 giống bao gồm YUNLU103-1 , giống LUYIN46, LP- 5M, IR80416-B-152-4 và Chành trụi có khả năng tạo callus tốt nhất đƣợc lựa chọn tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen và hoàn thiện quy trình chuyển gen. 3.2.3. Khảo sát khả năng tiếp nhận gen của giống lúa Việt Nam Bảng 3.5 | hả năng tiếp nhận gen của 5 giống lúa Việt Nam Qui trình Ch nh trụi YUNLU10 3-1B LUYIN46 LP-5M IR80416-B- 152-4 Phòng Bệnh học phân tử Chọn lọc 1 50 ± 2,04 20,33± 1,67 15,53± 1,78 19,39± 1,57 21,53± 1,98 Chọn lọc 2 38 ± 1,53 5,26± 1,01 2,34± 0,67 4,33± 0,51 6,21± 0,62 Tái sinh 27,67± 1,62 0 0 0 0 PCR 17,33± 1,12 Rahman (2011) Chọn lọc 1 55,05± 1,94 20,13± 1,94 10,53± 1,94 17,32± 1,94 11,06± 1,94 Chọn lọc 2 15,12± 1,94 7,05± 1,94 1,12± 1,94 3,54± 1,94 4,57± 1,94 Tái sinh 0 0 0 0 PCR Hiei (2008) Chọn lọc 1 40 20,33 15,53 19,39 9,34 Chọn lọc 2 15,24 5,19 4,31 8,03 3,47 Tái sinh 0 0 0 0 0 PCR 0 05 giống có khả năng tạo callus và tái sinh tạo chồi tốt nhất đƣợc nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens với 03 quy trình khác nhau (Bảng 3.5) bao gồm: 01 quy trình đã phát triển bởi chính tác giả và 01 quy trình cho lúa japonica (Hiei, 2008) và 01 quy trình cho lúa india (Rahman, 2011). ết quả nghiên cứu cho thấy ch có giống Chành Trụi có khả năng tiếp nhận gen lạ thông qua vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng quy trình đã đƣợc phát triển bởi chính nghiên cứu sinh (Hình 3.15). Hình 3.15 | Quy trình chuyển gen Ch nh trụi nền môi trƣờng MS Q y ì h ợc thiết lập cho gi ng Chành trụi t i hó về thời gian t g b ớc, nồ g các chất bổ sung, nhiệ . Chú ý nồ g vi khu . ef ie ã i 600 = 0,03, sử dụng vi khu n ở nồ g o hơ ,5 h t s nghiên cứ ớ ó ó h gây giảm hiệu quả củ i ờng chọn lọ b ớc ra rễ (7) có th sử dụ g i ờng MS giảm m t nửa nồ g (MS/2) giúp rễ xuất hiện sớm (rễ mảnh và phân chia nhiề hơ , y hiê ở b ớc tiếp theo (8) cầ hú ý hi ây v o ù hè hó i o m và nhiệ ). Cây sau khi h ới 03 tuần sẽ ợc thu mẫu lá, tách DNA tổng s sàng lọc bằ g x ịnh ây d ơ g í h MS: i ờng Murashige and Skoog. 3.3. TẠO GIỐNG LÚA CHÀNH TRỤI CHUYỂN GEN Các cấu trúc p IG-Lip9:OsDREB1A, pBIG-Ubi:OsDREB1A, pBIG-Lip9:OsDREB2A và pBIG-Ubi: s R 2 , các vector trống p IG- Lip9 và pBIG-Ubi đã đƣợc biến nạp vào giống lúa Chành trụi theo quy trình giản lƣợc trong hình 3, kết quả từ 600 callus ban đầu đã thu đƣợc 99 chồi tái sinh. ết quả theo dõi cây chuyển gen và sử dụng phƣơng pháp PCR, qRT- PCR với cả mồi đặc hiệu gen và mồi vector đã xác định đƣợc 44 dòng chuyển gen một bản copy và trong đó ch có 10 dòng cho hạt ( ảng 3.7). Bảng 3.1 | Kết quả kiểm tra các cây chuyển gen T0 Cấu trúc gen chuyển Tái sinh PCR ƣơng tính Số bản copy qRT-PCR 1 bản copy > 1 bản copy Lip9: OsDREB2A 15 12 5 7 Ubi: OsDREB2A 12 10 6 4 Lip9: OsDREB1A 23 19 13 6 Ubi: OsDREB1A 20 15 11 4 pBIG-Lip9 16 10 5 5 pBIG-Ubi 13 9 4 5 Tổng 99 75 44 31 Tiếp tục đánh giá cây chuyển gen T1 b ng kỹ thuật qRT-PCR, nảy mầm trên Hygromycin đã lựa chọn đƣợc 9 dòng chuyển gen đồng hợp một bản copy để tiếp tục theo dõi đánh giá khả năng chịu hạn trong các thế hệ tiếp theo. Tuy nhiên trong số đó có 03 dòng là L4, U2 và U3 không cho hạt T2 nên ch còn 06 dòng đƣợc tiếp tục nghiên cứu trong các thí nghiệm đánh giá kiểu hình kế tiếp ( ảng 3.10). Bảng 3.2 | Kết quả sinh trƣởng các òng chuyển gen đồng hợp Cấu trúc gen Số cây Sinh trƣởng bình thƣờng Trổ bông Kết hạt Thu hạt T2 Lip9: OsDREB1A L1 2 2 1 1 1 L2 2 2 2 1 1 L3 2 2 2 2 2 L4 1 0 L5 2 1 1 1 1 Ubi: OsDREB1A U1 3 2 2 2 2 U2 1 0 U3 2 1 1 0 U4 2 2 2 2 2 Tổng 17 12 11 9 9 3.4. ĐÁNH GIÁ IỂU HÌNH C Y CHUYỂN GEN Các cây chuyển gen T2 đƣợc nghiên cứu đánh giá kiểu hình so sánh với cây đối chứng trong cả điều kiện hạn và điều kiện hạn. Kết quả so sánh đánh giá trong điều kiện bình thƣờng có 04 dòng chuyển gen một bản copy có kiểu hình tƣơng đồng với cây đối chứng không chuyển gen (Bảng 3.11). Bảng 3.3 | Một số chỉ tiêu sinh trƣởng của cây chuyển gen và cây đối chứng Cây Chỉ tiêu sinh trƣởng Số nhánh/ khóm Chiều cao cây (cm) Lƣợng hạt chắc trên bông Thời gian sinh trƣởng (ngày) Cây đối chứng 5,02 ± 1,21 110,65 ± 3,51 110 ± 3,5 110 ± 3 L1 4,51 ± 1,09 90,12 ± 1,56 100 ± 1,2 105 ± 5 L2 4,49 ± 0,82 115,68 ± 2,02 100 ± 3,5 116 ± 4 L3 5,12 ± 0,89 105,79 ± 2,50 115 ± 2,5 107 ± 5 L5 5,09± 0,95 108,54 ± 1,59 116 ± 1,8 106 ± 4 U1 4,99 ± 0,32 105,12 ± 2,01 107± 3,5 106 ± 5 U4 5,16 ± 0,98 112,46 ±1,58 109± 2,5 108 ± 3 Khả năng giữ nƣớc là một trong những ch tiêu quan trọng để đánh giá tính chịu hạn ở thực vật và khả năng này phụ thuộc vào các đặc tính nhƣ: sự cuộn lá, đóng mở khí khổng, tham gia cơ chế giảm áp suất trƣơng của lá, giảm lƣợng nƣớc bị mất của cây và hoạt hoá sự biểu hiện hàng loạt các gen liên quan đến tính chịu hạn. Trong thí nghiệm của chúng tôi, mặc d các gen điều khiển chịu hạn đã đƣợc xác định sự tồn tại và có thể đã biểu hiện tốt trong các cây chuyển gen. Tuy nhiên, nghiên cứu khả năng giữ nƣớc cho kết quả có sự khác biệt rất ít giữa cây chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen (Bảng 3.12). Bảng 3.4 | Khả năng giữ nƣớc của các òng lúa chuyển gen Độ hụt khối lƣợng tƣơng đối (%) Tỷ lệ sống sót (%) Sau 1 giờ Sau 4 giờ Sau 7giờ Cây đối chứng 10,00 ± 0,25 14,55 ± 0,45 30,55 ± 0,36 30,55 ± 0,36 L3 9,67 ± 0,36 14,01 ± 0,56 27,08 ± 0,52 80,08 ± 0,52 L5 8,67 ± 0,32 13,98 ± 0,49 26,57 ± 0,78 90,57 ± 0,78 U1 9,67 ± 0,23 14,01 ± 0, 32 28,45 ± 0,62 78,45 ± 0,62 U4 8,99 ± 0,36 13,95 ± 0,28 27,45 ± 0,54 83,45 ± 0,54 Hình 3.20 | Khả năng giữ nƣớc của các òng lúa chuyển gen Ngƣợc lại về thí nghiệm đánh giá khả năng phục hồi cho thấy có sự khác biệt lớn giữa cây chuyển gen và cây đối chứng. Các cây sau thí nghiệm đánh giá khả năng giữ nƣớc đƣợc trồng trở lại trong điều kiện bình thƣờng, khả năng phục hồi đƣợc ghi nhận ở ngày thứ 1. Kết quả cho thấy các cây đối chứng phát triển rất yếu xuất hiện các lá vàng và xoăn; các cây chuyển gen phát triển khỏe mạnh bình thƣờng các lá xanh khỏe mạnh. Tỷ lệ sống sót giữa cây đối chứng và các dòng chuyển gen có sự khác biệt rất lớn trong khi cây đối chứng ch sống sót có 30,55% còn các dòng chuyển gen có tỷ lệ sống sót rất cao từ 78,45 – 90,57%. Kết quả này cho thấy các cây chuyển gen OsDREB1A có khả năng phục hồi rất tốt sau quá trình mất nƣớc (Hình 3.20). Bảng 3.5 | Khả năng phục hồi v kết hạt của các òng lúa chuyển gen sau xử lý hạn Đối chứng L3 L5 U1 U4 Xử lý hạn 3 tuần Số cây sống 0/30 7/30 (23,3%) 9/30 (30%) 6/30 (20%) 7/30 (23,3%) Sinh trƣởng - 7/30 (23,3%) 9/30 (30%) 6/30 (20%) 7/30 (23,3%) Kết hạt - 7/30 (23,3%) 9/30 (30%) 6/30 (20%) 7/30 (23,3%) Thu hạt - 5/7 (71,43%) 6/9 (66,67%) 4/6 66,67%) 5/7 (71,43%) Xử lý hạn 6 tuần Số cây sống 0/30 0/30 4/30 (13,33%) 0/30 0/30 Sinh trƣởng - - 4/30 (13,33%) - - Kết hạt - - 4/30 (13,33%) - - Thu hạt - - 2/30 (6,67%) - - Các dòng chuyển gen đồng hợp tử thế hệ T2 sinh trƣởng gần tƣơng đƣơng với cây đối chứng đƣợc chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng chịu hạn và khả năng ra bông tạo hạt sau khi xử l hạn. ết quả kiểm nghiệm cho thấy cây đối chứng gần nhƣ không có khả năng phục hồi sau 3 tuần ngừng tƣới, tỷ lệ chồi sinh lá mới rất thấp và không có khả năng tạo hạt; các dòng chuyển gen có khả năng phục hồi từ 20 – 30% trong đó có dòng L5 có khả năng phục hồi cao nhất (30%), các dòng chuyển gen dƣới sự điều khiển promoter Lip9 có phục hồi cao hơn các dòng chuyển gen dƣới sự điều khiển promoter Ubiquitin (Ngƣợc lại về thí nghiệm đánh giá khả năng phục hồi cho thấy có sự khác biệt lớn giữa cây chuyển gen và cây đối chứng. Các cây sau thí nghiệm đánh giá khả năng giữ nƣớc đƣợc trồng trở lại trong điều kiện bình thƣờng, khả năng phục hồi đƣợc ghi nhận ở ngày thứ 1. ết quả cho thấy các cây đối chứng phát triển rất yếu xuất hiện các lá vàng và xoăn; các cây chuyển gen phát triển khỏe mạnh bình thƣờng các lá xanh khỏe mạnh. Tỷ lệ sống sót giữa cây đối chứng và các dòng chuyển gen có sự khác biệt rất lớn trong khi cây đối chứng ch sống sót có 30,55% còn các dòng chuyển gen có tỷ lệ sống sót rất cao từ 78,45 – 90,57%. ết quả này cho thấy các cây chuyển gen OsDREB1A có khả năng phục hồi rất tốt sau quá trình mất nƣớc (Hình 3.20). ảng 3.5). Sau khi đánh giá khả năng chịu hạn các dòng tiếp tục đƣợc trồng ở điều kiện bình thƣờng trong nhà lƣới, kết quả cho thấy các dòng chuyển gen có khả năng phục hồi tốt, sinh trƣởng gần nhƣ bình thƣờng hiện tƣợng lá bị vàng và bị cháy rất ít, các dòng ra hoa kết quả bình thƣờng. Tỷ lệ hạt chắc ch đạt từ 66,67% đến 71,43%, điều này cho thấy hạn có khả năng ảnh hƣởng khá lớn đến năng suất của cây trồng. - Hình 3.21 | Khả năng phục hồi, tạo hạt của các òng T2 chuyển gen khi xử lý hạn 3 tuần Ghi chú: 1: Cây đối chứng; 1: Dòng L3; 3: Dòng L5; 4: Dòng U1; 5: Dòng U4 Các cây thế hệ T3 của các dòng chuyển gen U1, U4, L3 và L5 đƣợc gieo trong điều kiện nhà lƣới, tiến hành xử lý hạn ở giai đoạn 3 lá mạ để đánh giá mức độ biểu hiện của các gen quan tâm trong hai điều kiện xử lý hạn 48h và không xử lý hạn. Kết quả nghiên cứu biểu hiện OsDREB1A trong cây không chuyển gen, cây chuyển gen trong điều kiện thƣờng và điều kiện hạn b ng kỹ thuật RT-PCR sử dụng hai cặp mồi OsDREB1A-RT-Fw/Rv và mồi Actin-Fw/Rv (sử dụng để nội chuẩn mức độ biểu hiện của OsDREB1A trong tất cả các điều kiện) đƣợc biểu đồ hóa trong Hình 3.. Kết quả đánh giá cho thấy OsDREB1A biểu hiện thấp ở cả cây Chành trụi không chuyển gen và dòng chuyển gen L3 và L5 trong điều kiện không xử lý hạn và ngƣợc lại với các cây thuộc dòng U1 và U4 gen có mức độ biểu hiện cao hơn đáng kể (LogFC2 >2). Điều này chứng tỏ với nền cây Chành Trụi OsDREB1A không có mức biểu hiện cao mặc d đây là giống lúa nƣơng và dƣới sự điều khiển của promoter Lip9 gen này cũng có 1 2 3 4 5 mức biểu hiện tƣơng đƣơng cây không chuyển gen trong điều kiện bình thƣờng. Ngƣợc lại, dƣới sự điều khiển của promoter liên tục gen này có mức độ biểu hiện mạnh (Hình 3.22). Hình 3.22 | Nghiên cứu mức độ biểu hiện OsDREB1A trong cây chuyển gen T3 KẾT LUẬN 1. Luận án đã phân lập đƣợc trình tự mã hóa OsDREB1A từ DNA tổng số giống Cƣờm dạng và cDNA của giống Mộc Tuyền và trình tự mã hóa OsDREB2A từ cDNA giống Cƣờm dạng. Đã nhân dòng thành công hai trình tự mã hóa riêng rẽ vào vector pUC19. Kết quả giải trình tự sau đó cho thấy hai trình tự mã hóa nhân tố phiên mã của hai giống lúa Việt Nam có trình tự và kích thƣớc (720 bp và 825 bp) tƣơng đồng với hai gen tƣơng ứng trong ngân hàng gen thế giới là OsDREB1A (AF300970) và OsDREB2A (AM495895) của giống Nipponbare. Hai trình tự này sau đó đã đƣợc đƣa thành công một cách riêng rẽ vào hai hệ vector pBIG/Ubi (promoter Ubiquitine - nguốc gốc từ ngô, là promoter biểu hiện liên tục) và pBIG/Lip (promoter Lip9 - nguồn gốc từ lúa, là promoter cảm ứng hạn) để tạo 04 vector biểu hiện (binary vector): Ubi:OsDREB1A, Ubi:OsDREB2A, Lip9:OsDREB1A và Lip9:OsDREB2A làm vật liệu phục vụ công tác tạo giống cây trồng chịu hạn theo định hƣớng chuyển gen. 2. Luận án đã thành công bƣớc đầu trong việc đánh giá khả năng phát sinh callus (trên 04 nền môi trƣờng MS có bổ sung 2,4D nồng độ từ 1,5 – 2,5 mg/l) của 47 giống lúa nƣơng Việt Nam và khả năng tái sinh chồi từ callus (trên 04 nền môi trƣờng MS bổ sung BAP và kinetine có nồng độ khác nhau từ 0,5 – 2 mg/l) của 26 giống lúa nƣơng Việt Nam có khả năng tạo callus trên 50%. Kết quả cụ thể cho thấy, tập đoàn 47 giống lúa nƣơng đã khảo sát có khả năng tạo calus không cao, ch có 05 giống lúa có khả năng tạo callus trên 75% (giống LP-5 trên môi trƣờng MS + 1,5 mg/l 2,4D, giống IR80416-B-152-4, YUNLU103-1B và Nếp hau Để Dỏn trên môi trƣờng S + 2 mg/l 2,4 , đặc biệt có giống Chành Trụi có khả năng tạo callus lớn hơn 80% trên cả 3 môi trƣờng MS bổ sung 2,4D). Khả năng tái sinh chồi từ callus của các giống lúa nƣơng đã khảo sát trong luận án không cao, khó phát triển quy trình chuyển gen cho các giống lúa. Ch có 05/26 giống lúa (LUYIN46, IR80416-B-152-4, LHY-4, YUNLU103- 1B và Chành Trụi) có khả năng tái sinh chồi từ callus đạt trên 70% trên môi trƣờng tái sinh TS2 (MS + 2mg/l BAP + 0,5mg/l kinetine). Luận án đã thành công trong việc thiết lập quy trình chuyển gen cho giống lúa Chành Trụi là giống lúa nƣơng địa phƣơng của Việt Nam và đây là kết quả chuyển gen thành công đầu tiên cho một giống lúa bản địa của Việt Nam đã đƣợc công bố. 3. Luận án đã thành công trong việc biến nạp 04 vector biểu hiện Ubi:OsDREB1A, Ubi:OsDREB2A, Lip9:OsDREB1A và Lip9:OsDREB2A vào giống lúa Chành Trụi. Tỷ lệ chuyển gen trên giống Chành Trụi dao động từ 9% đến 15%, trung bình là 10%. Luận án cũng đã lần đầu tiên áp dụng thành công kỹ thuật PCR định lƣợng (qRT-PCR) ở Việt Nam để thay thế cho: kỹ thuật lai Southern Blotting trong việc ƣớc tính số lƣợng bản sao của cấu trúc chuyển gen ở các cây chuyển gen thế hệ T0, T1; t lệ nảy mầm trên môi trƣờng Hygromycin để xác định cây chuyển gen T1 đồng hợp. 4. Luận án đã thành công trong việc sàng lọc đƣợc 04 dòng Chành Trụi (Lip9:OsDREB1A) một bản sao, đồng hợp ở thế hệ T2 có kiểu hình (chiều cao cây, số nhánh, thời gian sinh trƣởng) tƣơng đồng với cây đối chứng không chuyển gen trong điều kiện thông thƣờng và 100% có khả năng phục hồi, kết hạt (tỷ lệ hạt chắc đạt 40-60%) sau 03 tuần ngừng cung cấp nƣớc. Luận án cũng đã thành công trong việc sử dụng PCR định lƣợng và bán định lƣợng cho gen chuyển (OsDREB1A) và gen ch thị khả năng chịu hạn Dehydration-Induced Protein (DIP)/Salt-induced protein (SALT) trong các cây chuyển gen T2. Kết quả cho thấy cả gen chuyển và gen ch thị đều ch đƣợc tăng cƣờng biểu hiện trong điều kiện gây hạn nhân tạo so với cây đối chứng (Fold change-FC: 2,5-3,3). KIẾN NGHỊ Dựa trên các kết luận rút ra từ kết quả nghiên cứu trên đây, chúng tôi đƣa ra một số hƣớng nghiên cứu tiếp theo nhƣ sau: - Tiếp tục nghiên cứu khả năng duy trì tính ổn định ở các thế hệ T3, T4 của 04 dòng chuyển gen Chành Trụi đã tạo ra trong nghiên cứu trong các thế hệ tiếp theo (tính bền vững di truyền, khả năng duy trì tính chống chịu, năng suất). - Mở rộng nghiên cứu chuyển gen OsDREB2A vào các đối tƣợng cây trồng khác với các promoter điều khiển hoạt động cảm ứng điều kiện stress để phục vụ công tác chọn tạo giống. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Cao Lệ Quyên, Phạm Thị Vân, Phạm uân Hội (2011), “Nghiên cứu khả năng tạo callus và tái sinh cây từ một số giống lúa nƣơng Việt Nam nhập nội phục vụ cho công tác chuyển gen”, hí Si h họ , 33(1), tr. 80-85. 2. Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Phạm Thị Vân, Phạm uân Hội (2012), “Thiết kế vector chuyển gen điều khiển OsDREB1A có tiềm năng tăng cƣờng khả năng chịu điều kiện bất lợi”, hí g ghệ Si h họ , 10(2), tr. 271-279. 3. Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Đinh Đoàn Long, Phạm uân Hội (2016), “Nghiên cứu chuyển gen nhân tố phiên mã MtOsDREB1A liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa Việt Nam”. hí N g ghiệ v h i N g h , 8, tr. 13- 19.