Tóm tắt Luận án Nghiên cứu phơi nhiễm asen trước sinh và những biến đổi nhiễm sắc thể, đa hình một số gen trên trẻ sơ sinh ở Hà Nam

vực và có thể sử dụng làm tài liệu tham khảo cho công tác đào tạo, giảng dạy. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 142 trang được chia thành các phần: Mở đầu 3 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 35 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp 15 trang; Chương 3: Kết quả 34 trang; Chương 4: Thảo luận 25 trang; Kết luận và kiến nghị: 2 trang; Các công trình công bố của tác giả 1 trang; Tài liệu tham khảo 22 trang; Tóm tắt luận án bằng tiếng anh 5 trang; Phụ lục 25 trang. Luận án có 30 bảng số liệu, 22 hình và 181 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh. NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Ô nhiễm asen trong nguồn nước tại Việt Nam Ô nhiễm asen trong nước ngầm hiện là mối quan tâm lớn ở nhiều nước trên thế giới. Hàng triệu người đang bị phơi nhiễm với asen thông qua nguồn nước bị ô nhiễm asen. Việt Nam cũng là một trong những nước nằm trong vùng có ô nhiễm asen nguồn nước ngầm trên bản đồ thế giới. Cho đến nay đã có khá nhiều các nghiên cứu đánh giá mức độ ô nhiễm asen nguồn nước ngầm ở Việt Nam, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Hồng. Trầm trọng nhất là các tỉnh: Hà Nam, Nam Định, Hà Tây (cũ), An Giang, Đồng Tháp. Ở Hà Nam có tới 110/111 xã có trên 10% giếng có nồng độ asen vượt tiêu chuẩn cho phép (TCCP), trong đó 77 xã có trên 10% giếng có nồng độ As >50mg/L, đặc biệt có 50 xã có trên 10% giếng có nồng độ As >100mg/L, điển hình là các xã của huyện Bình Lục, Lý Nhân, Duy Tiên (UNICEF, 2004). 1.2. Chuyển hóa của asen trong cơ thể Các dạng asen vô cơ hòa tan trong nước được được hấp thụ qua đường tiêu hóa và phân phối đến các mô. Asen vô cơ vào máu chỉ vài giờ sau hấp thụ qua nước uống và được đưa đến trước hết là gan, thận, tụy, phổi, ruột và da. Vì cấu trúc tương tự như glycerol, AsIII có thể di chuyển vào tế bào thông qua cầu nối glycerol vận chuyển các hợp chất hữu cơ nhỏ như glycerol và ure. AsV tồn tại giống như gốc phosphate mang oxy âm như H2AsO2- và HAsO2- ở pH 5 -7 hoàn toàn có thể vào tế bào thông qua sự vận chuyển phosphat. Tại gan asen vô cơ (iAs) được chuyển hóa thành monomethylated arsenic (MMA) và tiếp tục thành dimethylated arsenic (DMA) thông qua quá trình methyl hóa khử liên tục và được đào thải ra nước tiểu ở dạng methyl asen hóa trị 5, một phần được tích lũy trong mô giàu keratin như tóc, móng (Maki-Paakkanen, 1998). Asen đào thải chủ yếu qua nước tiểu với thời gian bán hủy khoảng 4 ngày đối với người (WHO, 2000; NRC, 2001). Sự phức tạp trong chuyển hóa asen là hạn chế chính trong hiểu biết một cách khoa học về độc tính của asen. Ở người, asen được xác định trong mẫu sinh học, đặc biệt là nước tiểu ở các dạng AsIII, AsV, MMAV, DMAV, dạng monomethylated arsonous (MMAIII) cũng tìm thấy trong nước tiểu. Cơ chế gây độc của asen rất phức tạp và nó liên quan đến 5 chất chuyển hóa và tất cả các chất này đều có khả năng gây độc (AsIII, AsV, MMAV, MMAIII, DMAV). 1.3. Ảnh hưởng của ô nhiễm As trong nguồn nước lên sức khỏe và tổn thương vật chất di truyền ở người bị phơi nhiễm 1.3.1. Tác động của asen đối với vật chất di truyền Nhiều quan sát thực nghiệm cho rằng độc tính gây đột biến của asen chủ yếu liên quan đến tạo gốc tự do (Reactive Oxygen Species-ROS) trong quá trình chuyển hóa sinh học. Sản phẩm ROS có khả năng làm đứt gãy DNA, liên kết chéo và tổn thương nhiễm sắc thể. Cơ chế chính của tổn thường di truyền do asen thông qua cơ chế oxy hóa (Hình 1.1). Ức chế quá trình sửa chữa DNA cũng được coi là một trong những cơ chế chính gây độc đối với gen của asen. Hình 1.1. Sơ đồ tác động gây độc với vật chất di truyền của asen 1.3.2. Nghiên cứu biến đổi NST liên quan đến phơi nhiễm asen Asen, một chất gây ung thư, được coi là một trong những hóa chất nguy hiểm nhất thế giới. Phơi nhiễm lâu dài (như 5-10 năm) với asen từ nước uống và thức ăn có thể dẫn đến nhiễm độc asen, các bệnh liên quan bao gồm rối loạn sắc tố da, ung thư da, ung thư bàng quang, thận và phổi, bệnh về mạch máu ở chân và bàn chân, có thể mắc bệnh tiểu đường, tăng huyết áp, ảnh hưởng đến sinh sản (WHO, 2001; Santra, 2013). Trong nửa thế kỷ qua, người ta đã nhận thấy phơi nhiễm asen tác động đến sức khỏe con người phức tạp hơn nhiều so với dự đoán ban đầu. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các bằng chứng tổn thương di truyền tế bào ở người phơi nhiễm với asen. Đánh giá sự tổn thương DNA trong tế bào lympho máu ngoại vi của những cá thể nhạy cảm với độc tính của asen đã được tiến hành bằng sử dụng kỹ thuật phân tích tổn thương nhiễm sắc thể. Karen Harrington và cs (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của phơi nhiễm asen lên nhiễm sắc thể tế bào bạch cầu máu ngoại vi của những người làm việc tại Antofagasta, Chile. Kết quả cho thấy ở những người làm việc lâu năm bị phơi nhiễm asen cao có tần số biến đổi nhiễm sắc thể lớn hơn có ý nghĩa so với những người mới làm việc bị phơi nhiễm asen thấp (p<0,05) (Harrington, 1999). Mahata và cs 2003 tại tây Bengal, Ấn độ sử dụng kỹ thuật nhuộm đặc giemsa nhiễm sắc thể, thấy tần số bất thường nhiễm sắc thể ở nhóm phơi nhiễm asen (8,08%), cao hơn có ý nghĩa thống kê so nhóm chứng (1,96%) (Mahata, 2003). Pritha Ghosh và cs cho thấy bất thường nhiễm sắc thể có thể được sử dụng làm chỉ thị đánh giá nguy cơ ung thư ở những người bị nhiễm asen (Ghosh, 2007). 1.4. Nghiên cứu đa hình gen và mối liên quan đến phơi nhiễm asen trong nguồn nước Những nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng có sự khác biệt lớn giữa các cá thể trong nhiễm độc asen. Điều này cho thấy, yếu tố di truyền có vai trò tạo ra sự khác biệt trong đáp ứng nhiễm độc asen. Một số nghiên cứu cho thấy vai trò của đa hình di truyền đến nhiễm độc asen liên quan đến các gen mã hóa enzyme chuyển hóa asen và khử độc, bao gồm các enzyme AS3MT (asen(III) methyltransferase), GST (glutathioneS-transferase) và MTHFR (methylenetetrahydrofolate reductase). Ngoài ra, một số đa hình nucleotid đơn có tính đặc hiệu ở các gen tham gia mã hóa yếu tố sửa chữa DNA được chứng minh là giảm khả năng sửa chữa do các tổn thương oxy hóa gây ra bởi asen. Các phân tích về SNP của các gen mã hóa các enzyme xúc tác quá trình methyl hóa được nghiên cứu để đánh giá sự khác biệt trong trao đổi chất hay độc tính của asen ở cấp độ cá thể và quần thể. Những kết quả này chỉ ra rằng đa hình di truyền của gen GSTO1 và AS3MT có liên quan đến sự methyl hoá asen trong nhiều động vật bao gồm cả con người và có thể là yếu tố liên quan đến sự khác biệt về thành phần asen trong nước tiểu. Hiệu quả của quá trình methyl hoá asen có thể bị ảnh hưởng bởi đa hình gen. Nghiên cứu gần đây trên ở những đứa trẻ sơ sinh từ các bà mẹ bị phơi nhiễm asen của Mahidol, Thái Lan cho thấy asen liên quan đến dấu hiệu biểu hiện của gen, trong đó đã phát hiện được 11 gen liên quan tới phơi nhiễm asen trong đó có CXCL1 (Fry, 2007). CXCL có thể xem như là biomarker trong phơi nhiễm asen trước sinh. 1.5. Nghiên cứu về ảnh hưởng của asen đến trẻ sơ sinh và mối liên quan đến phơi nhiễm trước sinh Phơi nhiễm với asen trong nước uống là vấn đề toàn cầu nhưng vẫn còn nhiều chưa biết về sự nhạy cảm trong cộng đồng, đặc biệt là trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh. Các nghiên cứu dịch tễ học và nghiên cứu trên các mô hình động vật đã cho thấy phơi nhiễm với asen từ lúc mang thai ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe của thai nhi. Tuy nhiên các cơ chế phân tử vẫn chưa được hiểu một cách rõ ràng. Một số nghiên cứu khác đề cập đến biểu hiện các protein và ảnh hưởng miễn dịch khi phơi nhiễm với asen. Nghiên cứu thuần tập trên 200 cặp mẹ con ở Gomez Palacio, Mexico phơi nhiễm với iAs qua nguồn nước (0,5-236 µg/L) cho thấy hàm lượng MMA trong nước tiểu mẹ có mối liên quan nghịch với cân nặng của trẻ và tuổi thai. Hàm lượng iAs trong nước tiểu mẹ có mối liên quan đến tuổi thai và chiều dài trẻ sơ sinh (Laine, 2015). Phơi nhiễm với asen từ những thời gian đầu đời có mối liên quan đến sức khỏe của trẻ sơ sinh, trẻ em và đến khi trưởng thành. Nghiên cứu thuần tập 130 phụ nữ mang thai tại Bangladesh cho thấy phơi nhiễm với asen trước sinh có liên quan đến giảm chức năng tuyến ức thông qua cảm ứng oxi hóa stress và chết theo chu trình tế bào, điều này gợi ý cho thấy những đứa trẻ đã bị ức chế miễn dịch từ thơ ấu (Ahmed, 2012). Những phân tích phản ứng của toàn bộ hệ gen với phơi nhiễm asen từ trong bào thai đã chỉ ra sự kích hoạt mạnh mẽ của một mạng lưới tích hợp của các con đường liên quan đến NF- kB, phản ứng viêm, sự tăng sinh tế bào, stress và chết theo chu kỳ tế bào. Mười một gen được cho là những gen quan trọng liên quan đến đáp ứng trước sinh của trẻ với asen và có thể là biomarker tiềm năng cho phơi nhiễm asen: CXCL1, DUSP1, EGR-1, IER2, JUNB, MIRN21, OSM, PTGS2, RNF149, SFRS5 và SOC3. Có mối liên quan về chức năng phân tử của 11 gen này gồm đáp ứng stress và điều hòa chu kỳ tế bào. Hiện nay ở Việt Nam, những nghiên cứu về tình trạng sức khỏe người dân sử dụng nguồn nước ngầm ô nhiễm asen đa số là khảo sát tình trạng ô nhiễm asen và biểu hiện triệu chứng lâm sàng nhiễm độc asen. Một vài nghiên cứu của Agusa và cộng sự (2009, 2010, 2011) gần đây đánh giá mối liên quan đa hình trên gen AS3MT và GST với chuyển hóa asen ở cộng đồng người Việt Nam sinh sống tại đồng bằng sông Hồng. Hiện nay, chưa có nghiên cứu nào đánh giá về thực trạng phơi nhiễm asen ở phụ nữ mang thai và trẻ sơ sinh cũng như xác định đa hình gen, một số biến đổi nhiễm sắc thể ở trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh và mối liên quan. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích so sánh, phối hợp với điều tra dịch tễ học. 2.2. Đối tượng và các chỉ số nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Huyện Lý Nhân, huyện Kim Bảng, tỉnh Hà Nam. Đối tượng nghiên cứu: - Nhóm đối chứng (asen trong nước ăn uống ≤10µg/L, hàm lượng asen niệu ≤ 60 µg/L): 50 bà mẹ và trẻ sơ sinh của họ - Nhóm nghiên cứu (asen trong nước ăn uống >10µg/L, hàm lượng asen niệu >60 µg/L): 100 bà mẹ và trẻ sơ sinh của họ Thời gian nghiên cứu: tháng 12/2012- 6/2014 Cỡ mẫu nghiên cứu: theo công thức tính cỡ mẫu nghiên cứu cắt ngang n=Z2(1-α2).p1-pd2 Các chỉ số nghiên cứu - Nồng độ asen trong nước dùng sinh hoạt, ăn uống của từng gia đình các bà mẹ (nước giếng khoan sau lọc bằng bể cát sỏi) - Hàm lượng asen toàn phần trong nước tiểu mẹ - Hàm lượng asen thành phần trong nước tiểu mẹ (AsV, AsIII , MMA, DMA, AB) - Hàm lượng asen toàn phần trong tóc mẹ - Hàm lượng asen toàn phần trong máu cuống rốn (máu con) - Hàm lượng asen toàn phần trong tóc con - Hàm lượng creatinine niệu - Mối liên quan giữa phơi nhiễm asen ở mẹ và ô nhiễm asen trong nguồn nước sử dụng - Mối liên quan giữa phơi nhiễm asen ở trẻ sơ sinh với phơi nhiễm asen ở mẹ - Biến đổi NST và mối liên quan với phơi nhiễm asen - Đa hình gen AS3MT, GSTO1, đột biến trên gen CXCL1 và mối liên quan đến phơi nhiễm asen 2.3. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu Hóa chất - Các loại axit HNO3, H2SO4, HClO4, HCl đặc, H2O2, NaOH, NaBH4, KI, Amonioxxalat, axit ascorbic, dung dịch chuẩn As (Merck) dùng cho phân tích. - Các hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử thuộc các hãng Sigma, Merck, Fermentas, New England Biolabs. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu Kỹ thuật lấy mẫu và bảo quản mẫu Mẫu nước: Các mẫu nước giếng sau lọc được chứa trong chai nhựa 500 ml để phân tích asen. Các mẫu nước sẽ được bảo quản ở 4-8oC cho đến khi phân tích. Mẫu tóc: Cắt 0,5 -1g từ chân tóc của các bà mẹ mang thai. Tóc của trẻ sơ sinh được lấy ngay khi sinh hoặc sau sinh 1- 3 tháng. Bảo quản trong các túi có khóa kéo ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích. Mẫu nước tiểu: 1 ml nước tiểu lấy vào tuýp có chứa sẵn 8µmol DDDC để xác định các chất chuyển hóa trong nước tiểu. 30ml nước tiểu để phân tích hàm lượng asen tổng số. Bảo quản lạnh khi vận chuyển và lưu mẫu ở tủ -20oC. Mẫu máu cuống rốn: Lấy mẫu máu cuống rốn sau khi đã chuyển trẻ mới sinh đi và trước khi sổ nhau trong vòng 2 – 3 phút. Kỹ thuật phân tích - Kỹ thuật phân tích asen tổng số trong nước, asen tổng số trong nước tiểu, asen trong tóc (mẹ, con) bằng Quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) - Kỹ thuật phân tích asen thành phần trong nước tiểu bằng hệ thống Khối phổ plasma cảm ứng kết nối sắc ký lỏng hiệu năng cao (ICP/MS-HPLC) - Kỹ thuật phân tích asen trong máu cuống rốn bằng hệ thống Khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS) - Kỹ thuật phân tích nhiễm sắc thể bằng phương pháp nhuộm giemsa tế bào máu - Kỹ thuật xác định đa hình gen bằng Đa hình độ dài đoạn giới hạn (PCR-RFLP) - Kỹ thuật phân tích giải trình tự gen 2.4. Phương pháp xử lý và phân tích số liệu Nhập số liệu bằng phần mềm EpiData. Xử lý, phân tích số liệu trên phần mềm SPSS. Các giá trị thống kê: Trung bình, độ lệch chuẩn, trung vị, tỷ lệ phần trăm. Các kiểm định thống kê: Test khi bình phương, t- test, One way ANOVA, so sánh nhiều giá trị trung bình, phân tích hồi quy đơn biến. Kết quả đọc trình tự được phân tích và so sánh với trình tự gen trong ngân hàng gen (ENSEMBL: ENSG00000160882) bằng phần mềm BioEdit4.7. 2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu Tất cả đối tượng được giải thích rõ mục đích, ý nghĩa của nghiên cứu. Tất cả các đối tượng nghiên cứu đều có bản cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu, đồng ý để con cái của họ tham gia nghiên cứu và họ có thể rút lui khỏi nghiên cứu bất cứ lúc nào họ muốn. Nghiên cứu được sự chấp thuận của lãnh đạo địa phương, trung tâm y tế dự phòng tỉnh, các huyện, trạm y tế các xã được chọn vào nghiên cứu. Thông tin thu được của các đối tượng nghiên cứu được giữ bí mật và chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ Phơi nhiễm asen của các bà mẹ đang mang thai Kết quả thể hiện ở bảng 3.1 cho thấy: Hàm lượng asen trung bình trong nước tiểu của bà mẹ nhóm nghiên cứu là 94,25 ± 33,96 µg/L, trung vị là 86,73 µg/L, cao hơn mức thâm nhiễm (60- 80µg/L) và cũng cao hơn hẳn hàm lượng asen trung bình trong nước tiểu của bà mẹ nhóm đối chứng là 22,27µg/L ± 10,74, trung vị là 20,06 µg/L. Sự khác biệt giữa hai nhóm có ý nghĩa thống kê với p<0,001. Bảng 3.1. Hàm lượng asen tổng số trong tóc, nước tiểu mẹ và asen thành phần Các chỉ số Nhóm ĐC (n=50) Nhóm NC (n=100) p Trung vị Trung bình SD Trung vị Trung bình SD Hàm lượng As tóc (µg/g) 0,24 0,33 0,26 0,30 0,40 0,28 >0,05 Hàm lượng As niệu (µg/L) 20,06 22,27 10,74 86,73 94,25 33,96 <0,001 Hàm lượng As niệu (µg/g creatinin) 32,66 36,18 13,26 99,69 120,79 74,06 <0,001 AB trong nước tiểu (%) - 4,70 12,19 - 9,07 14,14 >0,05 DMA trong nước tiểu (%) - 68,71 17,53 - 71,62 16,15 >0,05 MMA trong nước tiểu (%) - 14,24 11,03 - 12,25 8,14 >0,05 iAs (AsV+AsIII) trong nước tiểu (%) - 12,34 13,85 - 7,05 9,40 <0,01 DMA/MMA trong nước tiểu (n=98) - 4,46 2,55 - 7,93 4,39 <0,001 MMA/iAs trong nước tiểu (n=89) - 1,54 1,34 - 6,30 17,95 >0,05 Hàm lượng asen trung bình trong tóc bà mẹ nhóm nghiên cứu là 0,4 ± 0,28 µg/g cao hơn hàm lượng asen trung bình trong tóc mẹ nhóm đối chứng là 0,33 µg/g ± 0,26. Tuy nhiên sự khác biệt giữa 2 nhóm chưa có ý nghĩa thống kê (p >0,05). Kết quả phân tích asen thành phần trong nước tiểu cho thấy tỷ lệ trung bình DMA, MMA nhóm đối chứng là 68,71%, 14,24% nhóm nghiên cứu là 71,62%, 12,25% sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê với p>0,05; Sự methyl hóa thứ cấp từ MMA thành DMA thể hiện ở tỷ lệ DMA/MMA. Kết quả cho thấy tỷ lệ trung bình DMA/MMA của nhóm đối chứng (4,46 ± 2,55) thấp hơn nhóm nghiên cứu (7,93 ± 4,39), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,001. Bảng 3.2. Hàm lượng asen trong nước tiểu, tóc mẹ theo mức độ ô nhiễm asen trong nước Mức độ ô nhiễm As trong nước £ 10 μg/L (1) > 10 - £ 50 μg/L (2) >50 μg/L (3) P n M SD n M SD n M SD As nước tiểu mẹ (μg/L) 50 22,27 10,74 78 92,80 30,97 22 99,42 43,38 P1-2<0,001 P1-3<0,001 As tóc mẹ (μg/g) 50 0,33 0,26 78 0,37 0,13 22 0,50 0,38 P 1-3<0,01 P2-3<0,05 n: số đối tượng; M: trung bình; SD: độ lệch chuẩn Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng asen trong nước tiểu bà mẹ nhóm phơi nhiễm asen trong nước từ >10- £ 50 μg/L và > 50 μg/L cao hơn có ý nghĩa với p50 μg/L cao hơn có ý nghĩa với p<0,01 so với nhóm đối chứng và với p<0,05 so với nhóm phơi nhiễm với asen trong nước £ 50 μg/L. Bảng 3.3. Hàm lượng asen trong tóc mẹ theo mức độ phơi nhiễm asen trong nước tiểu mẹ Nhóm asen nước tiểu mẹ (μg/L) Nhóm đối chứng (<60) (1) Nhóm NC1 (60-86,73) (2) Nhóm NC2 (>86,73) (3) P n M SD n M SD n M SD Asen tóc mẹ (μg/g) 50 0,33 0,26 50 0,37 0,25 50 0,43 0,30 P1-3<0,05 P2-3>0,05 n: số đối tượng; M: trung bình; SD: độ lệch chuẩn Hàm lượng asen trung bình trong tóc nhóm NC1 là 0,37 ± 0,25 μg/g thấp hơn so với nhóm NC2 là 0,43 ± 0,30 μg/g. Như vậy, hàm lượng asen trong tóc có xu hướng tăng dần theo mức độ hàm lượng asen trong nước tiểu, tuy nhiên chỉ có sự khác biệt giữa nhóm NC2 với nhóm ĐC là có ý nghĩa thống kê với p<0,05. 3.2. Phơi nhiễm asen trước sinh của trẻ sơ sinh Bảng 3.4. Hàm lượng asen tổng số trong máu cuống rốn và tóc của trẻ sơ sinh Các chỉ số Nhóm nghiên cứu Nhóm đối chứng P n Trung vị M SD n Trung vị M SD As tóc con (µg/g) 100 0,40 0,51 0,43 50 0,19 0,30 0,34 <0,01 As máu cuống rốn (µg/L) 100 7,12 6,81 2,54 50 3,28 3,62 1,88 <0,001 n: số đối tượng; M: trung bình; SD: độ lệch chuẩn Hàm lượng As trung bình trong tóc trẻ nhóm nghiên cứu cao hơn hẳn nhóm đối chứng (0,51 µg/g và 0,3 µg/g). Sự khác biệt giữa hai nhóm có ý nghĩa thống kê với p<0,01. Hàm lượng As tổng số trung bình trong máu cuống rốn của con nhóm nghiên cứu là 6,81 ± 2,54 µg/L, trung vị là 7,12 µg/L, cao hơn hẳn hàm lượng As tổng số trung bình trong máu cuống rốn của con nhóm đối chứng là 3,62 ± 1,88 µg/L, trung vị là 3,28 µg/L. Sự khác biệt giữa hai nhóm có ý nghĩa thống kê với p< 0,001. Bảng 3.5. Hàm lượng asen trong máu cuống rốn và tóc trẻ sơ sinh phân bố theo mức độ phơi nhiễm asen trong nước của bà mẹ nhóm nghiên cứu Mức độ phơi nhiễm As nước ≤ 50,0 µg/L > 50,0 µg/L P n M SD n M SD As tóc con (μg/g) 78 0,51 0,44 22 0,52 0,43 >0,05 As máu con (µg/L) 78 7,06 2,55 22 5,92 2,37 >0,05 n: số đối tượng; M: trung bình; SD: độ lệch chuẩn Kết quả cho thấy hàm lượng asen trung bình trong tóc và máu cuống rốn con giữa hai nhóm phơi nhiễm không có sự khác biệt. Bảng 3.6. Hàm lượng asen trong máu cuống rốn và tóc trẻ sơ sinh phân bố theo mức độ phơi nhiễm asen trong nước tiểu mẹ Chỉ số Nhóm nước tiểu n M SD Độ tin cậy 95% P As trong tóc con (μg/g) Nhóm chứng 50 0,30a 0,34 0,20 - 0,39 <0,01 (a,b) Nhóm NC1 50 0,54b 0,49 0,40 - 0,68 Nhóm NC2 50 0,48 0,37 0,38 - 0,59 Tổng 150 0,44 0,42 0,37-0,51 As trong máu con (µg/L) Nhóm chứng 50 3,62a 1,88 3,08 - 4,15 <0,001 (a,b) <0,001 (a,c) Nhóm NC1 50 6,61b 2,53 5,89 - 7,33 Nhóm NC2 50 7,01c 2,56 6,28 - 7,73 Tổng 150 5,74 2,78 5,29 - 6,19 a,b,c là ký hiệu của hàm lượng asen trung bình của nhóm khác nhau có ý nghĩa thống kê; n: số đối tượng; M: trung bình; SD: độ lệch chuẩn Hàm lượng asen trung bình trong tóc trẻ sơ sinh nhóm NC1 (0,54 μg/g) và nhóm NC2 (0,48 μg/g) cao hơn nhóm đối chứng (0,3 μg/g). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm đối chứng và nhóm NC1 với p<0,01. Hàm lượng asen trung bình trong máu cuống rốn nhóm NC2 (7,01 μg/L) lớn hơn không có ý nghĩa so với nhóm NC1 (6,61 μg/L) nhưng hàm lượng asen trong máu cuống rốn trẻ sơ sinh ở cả hai nhóm đều lớn hơn nhóm đối chứng (3,62 μg/L) với p<0,001. Hàm lượng asen trong máu cuống rốn trẻ sơ sinh tăng theo mức độ phơi nhiễm asen trong nước tiểu mẹ. 3.3. Một số biến đổi về nhiễm sắc thể ở tế bào máu cuống rốn trẻ sơ sinh và mối liên quan với phơi nhiễm asen trước sinh Bảng 3.7. Tần số tổn thương nhiễm sắc thể ở nhóm NC và nhóm ĐC Chỉ số NC Nhóm ĐC(n) Nhóm NC(n) P Số tế bào 4500 8700 Lệch bội 17 (0,38%) 72 (0,83%) <0,001 Bất thường cấu trúc kiểu NStử Gap 1 73 <0,0001 p<0,05 Isogap 11 4 >0,05 Đứt 4 11 >0,05 Trao đổi NStử 0 0 Tổng số 16 (0,36%) 88 (1,01%) Bất thường cấu trúc kiểu NST Mất đoạn 0 1 Gãy không tâm 0 1 Minus 0 1 Dic 0 0 Tri 0 0 R 0 0 Tổng số bất thường 33 163 p<0,0001 Tỉ lệ (%) 0,73 1,87 Tần số tổng các loại tổn thương nhiễm sắc thể tính trên 100 tế bào ở nhóm trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh (1,87%) cao gấp 2,56 lần nhóm đối chứng (0,73%), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,0001. Tỷ lệ lệch bội ở nhóm phơi nhiễm (0,83%) cao gấp 2,18 lần nhóm đối chứng (0,38%). Sự khác biệt này cũng có ý nghĩa thống kê với p< 0,001. Tỷ lệ tổng bất thường kiểu nhiễm sắc tử ở nhóm phơi nhiễm (1,01%) cao gấp 2,83 lần nhóm đối chứng (0,36%). Sự khác biệt này cũng có ý nghĩa thống kê với p< 0,05. Không thấy có sự khác biệt về tỷ lệ bất thường cấu trúc kiểu nhiễm sắc thể giữa hai nhóm nghiên cứu và nhóm đối chứng. Hình 3.1. Hình ảnh bộ nhiễm sắc lệch bội (n=45) ở mẫu NT41 Hình 3.2. Hình ảnh minus ở mẫu HT22 Bảng 3.8. Tỷ lệ đối tượng có bất thường nhiễm sắc thể ở hai nhóm có phơi nhiễm (nhóm NC) và không phơi nhiễm (nhóm ĐC) Chỉ số nghiên cứu Nhóm NC Nhóm ĐC p; OR(CI 95%) n % n % Bất thường NST Có 51 58,6 15 33,3 p<0,01; OR= 2,83 (CI 95%: 1,34-6,01) Không 36 41,4 30 66,7 Bất thường số lượng NST Có 28 32,2 9 20,0 >0,05 Không 59 67,8 36 80,0 Bất thường cấu trúc NStử Có 41 47,1 10 22,2 p<0,01; OR= 3,12 (CI 95%: 1,38-7,08) Không 46 52,9 35 77,8 Bất thường cấu trúc NST Có 3 3,4 0 0,0 *p>0,05 Không 84 96,6 45 100,0 Số lượng các bất thường Không 36 41,4 30 66,7 p<0,05 1 BT 32 36,8 11 24,4 2 BT 17 19,5 4 8,9 3 BT 2 2,3 0 0,0 * Fisher's exact test Kết quả tỷ lệ đối tượng có bất thường nhiễm sắc thể ở hai nhóm có phơi nhiễm và đối chứng cho thấy: Nhóm NC có tỷ lệ số đối tượng có bất thường NST là 58,6% cao hơn so với nhóm đối chứng là 33,3% với OR=2,83, p<0,01. Bất thường cấu trúc NStử ở nhóm NC chiếm tỷ lệ 47,1% cao hơn so với nhóm ĐC (22,2%) với OR=3,12, p<0,01. Không phát hiện thấy sự khác biệt về tỷ lệ đối tượng có bất thường về số lượng nhiễm sắc thể, bất thường cấu trúc kiểu nhiễm sắc thể. Bảng 3.9. Hàm lượng asen nước tiểu mẹ, tóc con, máu cuống rốn ở các đối tượng có và không có bất thường NST trong nhóm nghiên cứu Chỉ số nghiên cứu Nhóm có bất BT NST Nhóm không có BT NST p n M SD n M SD As nước tiểu mẹ (µg/L) 51 95,05 33,84 36 93,87 34,31 >0,05 As tóc con (µg/g) 51 0,45 0,38 36 0,61 0,48 >0,05 As máu cuống rốn (µg/L) 51 7,66 2,26 36 6,31 2,35 <0,01 n: số đối tượng; M:trung bình; SD: độ lệch chuẩn So sánh bất thường NST trong nhóm NC cho thấy: Hàm lượng asen máu cuống rốn ở nhóm trẻ sơ sinh có bất thường NST là 7,66 ± 2,26 µg/L cao hơn nhóm không có bất thường NST 6,31±2,35 có ý nghĩa với p<0,01. Không thấy có sự khác biệt về hàm lượng asen trong nước tiểu mẹ, asen trong tóc trẻ sơ sinh giữa hai nhóm. 3.4. Kết quả xác định đa hình gen, đột biến gen ở tế bào máu cuống rốn trẻ sơ sinh và mối liên quan với phơi nhiễm asen trước sinh Nhân các đoạn gen AS3MT, GSTO1 Hình 3.3. Một số hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen AS3MT bằng cặp mồi E9 M: Marker- thang DNA chuẩn 100 bp; 1: NS19, 2:OL15, 3: NS22, 4: HT49, 5: HT68, 6: HT69, 7: 71, 8: BS09, 9: CL71, 10: CL76 Để tiến hành nhân các đoạn gen AS3MT và GSTO1 bằng kỹ thuật PCR, 6 cặp mồi đặc hiệu Up, I3, E9, G1, G4, G5 đã được sử dụng. Sản phẩm PCR được tiến hành kiểm tra trên gel agarose 1,5%. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR thu được đặc hiệu, các băng rõ ràng, không bị đứt gãy. Nhân gen CXCL1 Sản phẩm PCR của gen CXCL1 sử dụng hai cặp mồi C3 và C4 được kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Đoạn CXCL1-3 có kích thước khoảng 0,75 kb; Đoạn CXCL1-4 có kích thước khoảng 0,85 kb. Kết quả điện di cho thấy các băng thu được có kích thước tương đương với kích thước theo tính toán lý thuyết và sản phẩm không có băng phụ. A B Hình 3.4. Kết quả nhân gen CXCL1 A: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen CXCL1-3. B: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen CXCL1-4. M: Marker 100 bp; 1B: VL07, 2B: VL18, 3B: VL28, 4B: CL11, 5B: Cl37, 6B: Cl54, 7B: CL60, 8B: HT31, 9B: HT38, 1C: VL07, 2C: VL18, 3C: VL28, 4C: CL11, 5C: Cl37, 6C: Cl54, 7C: CL60, 8C: HT31, 9C: HT38, 10C: HT03, 11C: HT08, 12C: HT09, 13C: HT12, 14C: HT27. Sản phẩm PCR của gen CXCL1 sau đó được tiến hành tinh sạch qua cột tinh sạch của hãng Fermantas để loại bỏ những thành phần còn dư lại trong quá trình chạy PCR như mồi hay dNTP. Sản phẩm tinh sạch được đo quang phổ để xác định nồng độ và độ tinh sạch cho giải trình tự gen. Hình 3.5. Ảnh điện di đại diện một số sản phẩm PCR cắt bằng enzyme giới hạn Cac8I M: marker 100bp, 1: BS09, 2: CL100, 3: NS08, 4: NS17, 5:TS04, 6: NT102, 7: TS11, 8: NT68, 9: NS25, 10: VL18, 11: VL07 Bảng 3.10. Tần xuất xuất hiện các kiểu gen tại các điểm đa hình nghiên cứu trên gen AS3MT và GSTO1 Gen AS3MT Gen GSTO1 Điểm đa hình Kiểu gen n % Điểm đa hình Kiểu gen n % E9 (rs11191439) 14458 TC 14 9,46 G5 (rs11509439) CC 146 97,99 TT 134 90,54 TT 3 2,01 CC 0 0 TC 0 0 Tổng 148 100 Tổng 149 100 UP (rs7085104) 4602 AA 21 14,19 G4 (rs15032) CC 150 100 AG 77 52,03 TT 0 0 GG 50 33,78 TC 0 0 Tổng 148 100 Tổng 150 100 I3 (rs 4917989) 5913 CC 3 2,00 G1 (rs4925) AA 17 11,64 TC 28 18,67 AC 28 19,18 TT 119 79,33 CC 101 69,18 Tổng 150 100 Tổng 146 100 Với điểm đa hình rs11191439 trên gen AS3MT, kiểu gen TT chiếm chủ yếu (90,54%), còn lại là kiểu gen TC (9,46%), không có kiểu gen CC trên các mẫu nghiên cứu và đối chứng. Xét về allele, allele T chiếm 95,27%, allele C chỉ chiếm 4,73%. Điểm đa hình rs4917989 trên gen AS3MT cũng đa phần xuất hiện kiểu gen TT (79,33%), kiểu gen CC chỉ xuất hiện ở 3 mẫu chiếm 2%, còn lại kiểu gen dị hợp tử TC chiếm 18,67%. Xét về allele, allele C chiếm 11,33% trong khi allele T chiếm 88,67%. Điểm đa hình AS3MT rs7085104 có kiểu gen đồng hợp tử AA và GG lần lượt chiếm 14,19% và 33,78% trong khi dị hợp tử AG chiếm 52,03%. Allele A và G có tần xuất xuất hiện tương đối đồng đều hơn 2 điểm đa hình trên, allele A chiếm 40,20%, allele G chiếm 59,80%. Điểm đa hình GSTO1 rs15032 chỉ xuất hiện duy nhất 1 kiểu gen CC ở tất cả 150 mẫu trong nghiên cứu (100%). Điểm đa hình GSTO1 rs11509439 cũng đa phần là kiểu gen CC (97,99%), tương ứng allele C chiếm 97,99% còn kiểu gen TT chiếm 2,01% tương ứng allele T cũng chiếm 2,01%, không xuất hiện dị hợp tử ở đa hình này. Điểm đa hình GSTO1 rs4925 có tần xuất xuất hiện kiểu gen đồng hợp tử AA chiếm 11,64%, đồng hợp tử CC chiếm 69,18%, dị hợp tử AC chiếm 19,18%. Xét về allele, allele A chiếm 21,23% và allele C chiếm 78,77%. Phân tích trình tự gen CXCL1 Kết quả giải trình tự gen CXCL1 được phân tích bằng phần mềm tin học BioEdit4.7. Trên phần mềm này, chúng tôi so sánh trình tự DNA đã được đọc với trình tự gen CXCL1 chuẩn trên ngân hàng gen người Hình 3.6. Kết quả giải trình tự gen CXCL1 ở một số mẫu Kết quả phân tích trình tự cho thấy có 3 vị trí có sự sai khác về kiểu gen. Các vị trí này được xác định thuộc các điểm đa hình rs2071425, rs765355 và rs4074 của gen CXCL1. Bảng 3.11. Tần xuất kiểu gen của các điểm đa hình trên gen CXCL1 Điểm đa hình Kiểu gen n % rs2071425 AA 7 23,3 AG 18 60,0 GG 5 16,7 Tổng 30 100 rs765355 CG 8 26,7 GG 22 73,3 Tổng 30 100 rs4074 AA 5 16,7 AG 19 63,3 GG 6 20,0 Tổng 30 100 Với điểm đa hình CXCL1 rs2071425, kiểu gen AG chiếm 60%, kiểu AA chiếm 23,3% và GG chiếm 16,7% trên toàn bộ 30 đối tượng được phân tích trình tự. Xét về allele, allele A chiếm 53,3% cao hơn so với allele G (chiếm 46,7%). Điểm đa hình CXCL1 rs765355 xuất hiện 2 kiểu gen GG (73,3%) và CG (26,7%). Allele G chiếm ưu thế với tỷ lệ 86,65%, allele C chiếm 13,33%. Điểm đa hình CXCL1 rs4074 có kiểu gen dị hợp tử AG chiếm ưu thế (63,3%), sau đó là 2 dạng đồng hợp tử AA và GG lần lượt chiếm 16,7% và 20,0%. Allele A và G có tần xuất xuất hiện tương đối đồng đều 48,35% và 51,65% tương ứng Mối liên quan giữa từng điểm đa hình gen AS3MT, GSTO1 và CXCL1 với phơi nhiễm trước sinh Trên gen GSTO1, tại cả 3 điểm đa hình chúng tôi chưa tìm thấy mối liên quan giữa hàm lượng asen trung bình trong máu cuống rốn và asen trong tóc con với các kiểu gen. Trên gen CXCL1, tại 2 điểm đa hình rs765355 và rs4074 chưa tìm thấy sự khác biệt về hàm lượng asen trong máu cuống rốn và tóc con. Tại điểm đa hình rs2071425 chưa tìm thấy sự khác biệt giữa các điểm đa hình và hàm lượng asen trong máu con, nhưng có sự khác biệt giữa kiểu gen với hàm lượng asen trong tóc con: Trẻ mang đồng hợp tử AA có hàm lượng asen trung bình trong tóc (0,61 µg/g) cao hơn dạng đồng hợp tử GG (0,43 µg/g) và cao hơn hẳn dạng dị hợp tử AG (0,32 µg/g) có ý nghĩa với p <0,05. Bảng 3.12. Mối liên quan giữa hàm lượng asen trong tóc, máu con với các vị trí đa hình ở nhóm nghiên cứu AS3MT 14458 (rs11191439) Chỉ số TT TC CC Tổng P n M SD N M SD N M SD As tóc con (µg/g) 90 0,52 0,45 10 0,40 0,27 0 100 >0,05 As máu con (µg/L) 90 6,71 2,57 10 7,70 2,19 0 100 >0,05 AS3MT 4602 (rs7085104) Chỉ số GG AG AA Tổng P n M SD N M SD N M SD As tóc con (µg/g) 35 0,46 0,35 51 0,51 0,44 12 0,69 0,59 98 >0,05 As máu con (µg/L) 35 7,67 2,49 51 6,63 2,54 12 5,52 1,97 98 <0,05 AS3MT 5913 (rs 4917989) Chỉ số TT TC CC Tổng P n M SD n M SD N M SD As tóc con (µg/g) 75 0,54 0,48 23 0,46 0,22 2 0,20 0,13 100 >0,05 As máu con (µg/L) 75 6,77 2,56 23 7,08 2,56 2 4,94 1,47 100 >0,05 GSTO132630 (G5) (rs11509439) Chỉ số CC TT TC Tổng P n M SD n M SD N M SD As tóc con (µg/g) 97 0,51 0,43 3 0.61 0,72 0 100 >0,05 As máu con (µg/L) 97 6,74 2,54 3 8.89 2,05 0 100 >0,05 GSTO128279 (G1) (rs4925) Chỉ số CC AC AA Tổng P n M SD n M SD N M SD As tóc con (µg/g) 68 0,46 0,36 22 0,63 0,54 8 0,68 0,65 98 >0,05 As máu con (µg/L) 68 6,87 2,57 22 6,96 2,57 8 6,55 2,42 98 >0,05 CXCL1 rs2071425 Chỉ số AA AG GG Tổng p n M SD n M SD N M SD As tóc con (µg/g) 7 0,61 0,28 18 0,32 0,20 5 0,43 0,36 30 <0,05 As máu con (µg/L) 7 7,43 1,73 18 6,13 3,48 5 7,89 2,53 30 >0,05 CXCL1 rs765355 Chỉ số CG GG CC Tổng P n M SD n M SD N M SD As tóc con (µg/g) 8 0,42 0,25 22 0.40 0.28 0 30 >0,05 As máu con (µg/L) 8 7,56 2,74 22 6.42 3.13 0 30 >0,05 CXCL1 rs4074 Chỉ số AA AG GG Tổng P n M SD n M SD N M SD As tóc con (µg/g) 5 0,43 0,37 19 0,36 0,26 6 0,52 0,18 30 >0,05 As máu con (µg/L) 5 6,98 2,78 19 6,67 3,27 6 6,69 2,89 30 >0,05 n: số đối tượng; M: trung bình; SD: độ lệch chuẩn Trên gen AS3MT, tại 2 điểm đa hình 14458 (rs11191439) và 5913 (rs 4917989) so sánh hàm lượng asen trung bình trong máu cuống rốn và tóc trẻ sơ sinh giữa các kiểu gen chưa thấy sự khác biệt. Tại điểm đa hình 4602 (rs7085104), chưa tìm thấy sự khác biệt giữa các kiểu gen về hàm lượng asen trong tóc con, nhưng có sự khác biệt có ý nghĩa giữa kiểu gen về hàm lượng asen trong máu cuống rốn con với p<0,05. Bảng 3.13. Hàm lượng asen trong máu con và tóc con với nhóm các điểm đa hình phổ biến trên AS3MT và GST01 Số điểm đa hình n Hàm lượng asen trong máu con (µg/L) Hàm lượng asen trong tóc con (µg/g) M SD P* M SD P* 6 SNPs 33 5,08 2,62 >0,05 0,48 0,44 >0,05 Các SNPs khác 117 5,93 2,80 0,44 0,41 6SNPs trừ E9 (TT) 37 5,31 2,84 >0,05 0,42 0,43 >0,05 Các SNPs khác 113 5,88 2,75 0,45 0,41 6SNPs trừ Up (AG) 66 5,18 2,81 < 0,05 0,42 0,42 >0,05 Các SNPs khác 84 6,18 2,69 0,46 0,41 6SNPs trừ I3 (TT) 37 5,11 2,60 >0,05 0,46 0,42 >0,05 Các SNPs khác 113 5,95 2,81 0,43 0,415 6SNPs trừ G5 (CC) 36 5,19 2,70 >0,05 0,46 0,45 >0,05 Các SNPs khác 114 5,91 2,79 0,43 0,40 6SNPs trừ G4 (CC) 33 5,07 2,62 >0,05 0,46 0,45 >0,05 Các SNPs khác 117 5,93 2,80 0,44 0,41 6SNPs trừ G1 (CC) 59 5,56 2,60 >0,05 0,46 0,43 >0,05 Các SNPs khác 91 5,79 2,89 0,43 0,407 P* kiểm định của số điểm đa hình so với các kiểu còn lại n: số đối tượng; M: trung bình Kết quả phân tích số cá thể mang 6 SNPs trừ rs7085104 (AG) tức là gen AS3MT có điểm đa hình rs11191439 (TT), rs4917989 (TT), trên gen GSTO1 có điểm đa hình rs4925 (CC), rs11509439 (CC) và rs15032 (CC) có 66 cá thể. Các cá thể mang đồng thời 5 kiểu đa hình này có hàm lượng asen trong máu cuống rốn là 5,18 µg/L thấp hơn so với các cá thể còn lại (6,18 µg/L). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05. BÀN LUẬN 4.1. Phơi nhiễm asen của các bà mẹ đang mang thai và mối liên quan đến ô nhiễm asen nguồn nước sử dụng Asen tổng số trong nước tiểu được phân tích tuần 8 và tuần 30 của 1578 phụ nữ mang thai ở Bangladesh. Ở tuần 8, tuần 30, trung vị hàm lượng asen trong nước tiểu mẹ là 79 µg/L và 80 µg/L, trung bình là 152 µg/L, 167 µg/L (Rahman, 2009). Cũng ở Bangladesh, 2112 phụ nữ mang thai phơi nhiễm với asen được xét nghiệm asen trong nước tiểu tuần 30 có trung vị là 96 µg/L (Hamadani, 2010). Kết quả trung vị hàm lượng asen trong nước tiểu của đối tượng nghiên cứu của chúng tôi tương tự như các nghiên cứu trên tuy nhiên chúng tôi chỉ lấy mẫu được một lần trong suốt thời kỳ mang thai. Hàm lượng creatine trong nước tiểu bị phụ thuộc vào giới, chủng tộc, tuổi và khối lượng cơ của cơ thể do đó cũng ít nhiều ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu (Marchiset-Ferlay, 2012). Ở nghiên cứu của chúng tôi, hàm lượng asen trung bình nhóm nghiên cứu là 120,79 ± 74,06 µg/g creatinin cao hơn rõ rệt so với nhóm đối chứng (36,18 ± 13,26 µg/g creatinin) có ý nghĩa với p<0,001. Hàm lượng asen trung bình của các phụ nữ mang thai trong nghiên cứu của chúng tôi, hàm lượng asen tổng số dân Hòa Hậu (92,6 µg/g creatinin), xã Liêm Chính (97,9 µg/g creatinin) thấp hơn so với hàm lượng asen trong nước tiểu của dân Campuchia (201 µg/g creatinin) (Agusa, 2009). Trong cơ thể, sự methyl hóa asen được coi như là quá trình giải độc, bởi hợp chất được methyl hóa sẽ ít độc hơn và được đào thải nhanh chóng qua nước tiểu hơn là dạng asen vô cơ. Các nghiên cứu bệnh học đã chỉ ra rằng những cá thể có phần trăm DMA (% DMA) cao trong nước tiểu thì có khả năng bài tiết asen nhiều hơn bởi những cá thể này có khả năng methyl hóa asen cao hơn. Các chất chuyển hóa asen thường thay đổi tùy từng cá thể nhưng thông thường dao động DMA (60-70%) > MMA (10-20%) > iAs (10%) (Valter, 2001). Công trình nghiên cứu này của chúng tôi cũng có kết quả tương tự như tỷ lệ trên. Kết quả phân tích asen thành phần trong nước tiểu của các bà mẹ đang mang thai cho thấy tỷ lệ % DMA trong nước tiểu cao nhất (71,62%) và giảm dần ở các tỷ lệ %MMA (12,25%), % iAs (7,5%). Điều này chứng tỏ rằng cơ thể đã có sự chuyển hóa iAs thành các dạng As hữu cơ ít độc hơn và đào thải ra khỏi cơ thể. Kết quả phân tích asen trong tóc trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, hàm lượng asen trung bình trong tóc bà mẹ mang thai nhóm nghiên cứu là 0,4 µg/g ± 0,28 cao hơn hàm lượng asen trung bình trong tóc nhóm đối chứng (Bảng 3.1), nhưng chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Điều này có thể do một số bà mẹ trong nhóm đối chứng trước khi lấy chồng sống ở vùng bị ô nhiễm asen, asen đã tích lũy vào tóc. Ngược lại, có một số bà mẹ trong nhóm nghiên cứu trước khi lấy chồng đẻ con thì ở vùng không bị ô nhiễm asen, asen trong tóc chỉ được tích lũy lại từ khi ở nhà chồng. Tuy nhiên, nếu chia nhóm nghiên cứu thành 2 nhóm phụ theo mức độ phơi nhiễm asen trong nguồn nước và mức độ phơi nhiễm asen trong nước tiểu mẹ (Bảng 3.2, Bảng 3.3) sẽ thấy: hàm lượng asen trong tóc mẹ (0,5 μg/g) ở nhóm sử dụng nước bị ô nhiễm asen >50 µg/L cao hơn nhóm sử dụng nước ô nhiễm asen >10 - ≤ 50 µg/L (0,37 μg/g) và cũng cao hơn nhóm đối chứng sử dụng nước không bị ô nhiễm asen (0,33μg/g). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,05 và p<0,01 (Bảng 3.2). Cũng thấy như vậy nếu chia các bà mẹ trong nhóm nghiên cứu thành 2 nhóm bị phơi nhiễm ít (NC1) và nhóm bị phơi nhiễm nhiều (NC2) theo mức độ hàm lượng asen trong nước tiểu (Bảng 3.3) Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy có mối liên quan chặt chẽ giữa phơi nhiễm và đào thải. Cơ thể mẹ đã tăng cường methyl hóa đào thải asen khi phơi nhiễm với asen trong nguồn nước. 4.2. Phơi nhiễm asen của trẻ sơ sinh và mối liên quan đến phơi nhiễm asen của mẹ Trong thời gian mang thai, khi người mẹ phơi nhiễm với asen vô cơ, hóa chất này nhanh chóng theo máu tới bào thai. Kết quả phân tích asen trong máu cuống rốn và tóc của trẻ sơ sinh đánh giá rất rõ thực trạng phơi nhiễm của trẻ ngay từ khi trong bào thai. Kết quả của chúng tôi cho thấy sự phơi nhiễm với asen trong nguồn nước của mẹ trước sinh đã truyền cho con thông qua nhau thai tới máu cuống rốn và tích lũy tại tóc ngay từ thời kỳ bào thai. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng asen trung bình trong máu cuống rốn tăng rõ rệt từ nhóm chứng (3,62 μg/L) đến nhóm NC1 (6,61 μg/L) và nhóm NC2 (7,01 μg/L). Sự khác biệt giữa cả 2 nhóm nghiên cứu với nhóm đối chứng có ý nghĩa thống kê với p<0,001. Sở dĩ có tương quan rõ rệt như vậy là vì mối liên quan giữa hàm lượng asen trong máu và nước tiểu của mẹ với asen máu của con là mối liên quan tức thời. Kết quả này nói lên rằng, mẹ phơi nhiễm với asen càng nhiều thì con cũng bị phơi nhiễm càng nhiều (Bảng 3.4). Hàm lượng asen trung bình trong tóc trẻ sơ sinh của cả 2 nhóm NC1 (0,54 μg/g) và nhóm NC2 (0,48 μg/g) đều cao hơn nhóm đối chứng (0,3 μg/g), tuy nhiên sự khác biệt này chỉ có ý nghĩa thống kê khi so sánh giữa nhóm NC1 với nhóm đối chứng (p<0,01) (Bảng 3.6). Theo chúng tôi asen niệu chỉ phản ánh tình trạng phơi nhiễm asen tức thời của các bà mẹ, không phải ngày nào các đối tượng nghiên cứu cũng sử dụng nguồn nước ô nhiễm asen, mà họ dùng xen kẽ khi thiếu nước mưa trong khi thời gian bán thải asen khoảng 4 ngày. Lượng asen trong nước tiểu của các đối tượng nghiên cứu sẽ dao động trong suốt thời kỳ mang thai: khi sử dụng (ăn, uống) bằng nguồn nước ô nhiễm thì asen niệu cao lên, khi không sử dụng thì asen niệu lại thấp đi. Mặt khác, lượng asen tóc trẻ sơ sinh lại hình thành trong phần lớn thời gian thai nhi nằm trong bụng mẹ. Do đó nếu chỉ xét nghiệm asen niệu có một lần thì khó thấy mối tương quan giữa asen niệu của mẹ với asen trong tóc con. Chúng tôi chưa tìm thấy liên quan giữa hàm lượng asen trong máu cuống rốn, tóc trẻ sơ sinh với hàm lượng asen trong tóc mẹ (p>0,05). Điều này cũng phản ánh một thực tế là hàm lượng asen trong tóc mẹ thể hiện sự phơi nhiễm lâu dài còn hàm lượng asen trong máu cuống rốn, tóc trẻ sơ sinh phản ánh sự phơi nhiễm chỉ trong thời kỳ mang thai. 4.3. Một số biển đổi nhiễm sắc thể ở tế bào máu cuống rốn trẻ sơ sinh và mối liên quan với phơi nhiễm asen trước sinh Theo kết quả trình bày ở bảng 3.7, trong số các bất thường nhiễm sắc thể, loại bất thường thường gặp là lệch bội (72/163 chiếm 44,17%) và bất thường cấu trúc kiểu nhiễm sắc tử (73/163 chiếm 53,99%). Tỷ lệ lệch bội ở nhóm phơi nhiễm (0,83%) cao gấp 2,18 lần nhóm đối chứng (0,38%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,001. Tỷ lệ tổng bất thường kiểu nhiễm sắc tử ở nhóm phơi nhiễm (1,01%) cao gấp 2,83 lần nhóm đối chứng (0,36%), sự khác biệt này cũng có ý nghĩa thống kê với p< 0,05. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Julie Mahata và cs (2004) trên các đối tượng thuộc cả ba nhóm: nhóm chứng, nhóm phơi nhiễm asen không triệu chứng và nhóm phơi nhiễm asen có triệu chứng đều cho thấy tần số bất thường kiểu nhiễm sắc tử nhiều gấp hàng chục lần cho tới vài chục lần so với bất thường cấu trúc kiểu nhiễm sắc thể (Mahata, 2004). Về cơ chế gây tổn thương nhiễm sắc thể, một số tác giả nghiên cứu cho thấy nếu xử lý tế bào với asen tại G2 làm chậm quá trình phân bào, làm tích tụ các tế bào đang phân chia và kéo dài thời gian phân chia. Ngoài ra asen còn gây bất thường phân bố và rối loạn quá trình phân ly của nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào dẫn đến dẫn đến lệch bội. Cơ chế này khác với cơ chế của các chất độc ức chế hình thành thoi vô sắc. Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy khi xử lý tế bào bạch cầu với asen nồng độ cao thấy đứt gãy nhiễm sắc tử. Như vậy, khi phân tích bất thường nhiễm sắc thể trong nhiễm độc asen cũng cần đặc biệt chú ý đến bất thường dạng lệch bội và bất thường cấu trúc kiểu nhiễm sắc tử. Tổn thương cơ thể do asen còn phụ thuộc vào tính nhạy cảm của từng cá thể, chính vì vậy người có nồng độ asen thấp nhưng nếu có tính nhạy cảm cao có thể có tần số bất thường NST cao hơn một cách tương đối so với người có tính nhạy cảm thấp và ngược lại. Nghiên cứu cho thấy tính chất tổn thương di truyền tế bào ở trẻ sơ sinh có mối liên quan trực tiếp hơn đối với giá trị hàm lượng As trong máu cuống rốn, As trong tóc con và trong nước tiểu mẹ. Điều này có thể được giải thích là dường như bất thường NST trên dòng tế bào bạch cầu máu cuống rốn bị ảnh hưởng trực tiếp từ việc phơi nhiễm asen trong suốt thời kỳ mang thai nên sự khác biệt giữa hai nhóm có ý nghĩa thống kê. 4.4. Kết quả xác định đa hình gen, đột biến gen ở tế bào máu cuống rốn trẻ sơ sinh và mối liên quan với phơi nhiễm asen trước sinh Đa hình AS3MT 4602 (rs7085104) có tần xuất xuất hiện các allele A và G giống với các nghiên cứu ở Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Gana, tuy nhiên ở các nhóm đối tượng thuộc Srilanka, Mông Cổ hay Nepal thì chủ yếu là allele A chiếm tới 70 đến 85%. Đa hình AS3MT 5913 (rs4917986) trong nghiên cứu của chúng tôi (Bảng 3.10) chủ yếu là allele T chiếm hơn 88%, kết quả này giống với nghiên cứu của Agusa ở quần thể người Việt Nam trên đồng bằng sông Hồng (Agusa, 2009). Đa hình AS3MT 14458 (rs1119143) có tần xuất allele T là 95,27%, giống với hầu hết các nghiên cứu tại các quốc gia khác, allele T chiếm từ 90 đến 100% (Agusa, 2011). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã không tìm thấy sự thay đổi nucleotide nào tại SNP GSTO1 rs15032 phù hợp với nghiên cứu của Agusa và cộng sự (2009), ông đã không tìm được allele đột biến xuất hiện ở SNP GSTO1 rs15032 trên dân cư sống vùng Đồng bằng Sông Hồng. Tuy nhiên lí do chúng tôi vẫn chọn để nghiên cứu SNP này vì theo nghiên cứu của Tanaka-Kagawa năm 2003, ông đã tìm được thể đột biến tại SNP rs15032 và thấy rằng thể đột biến CA có hoạt tính khử MMAV thấp hơn so với với các thể hoang dại sử dụng trong in vitro (Tanaka-Kagawa, 2003). Trong nghiên cứu này, tại điểm đa hình GSTO1 rs15032 và GSTO1 rs11509439 có tần xuất allele C lần lượt là 100% và 97,99%. Hầu như không có sự thay đổi nucletide ở SNP rs11509439 đối với các mẫu trong nghiên cứu. Kết quả này giống với nghiên cứu của Agusa và cs (2009), ông đã không tìm được allele đột biến xuất hiện ở SNP rs11509439 trên dân cư sống vùng đồng bằng sông Hồng. Tuy nhiên, Baidehi Mukherjee và cs (2006) đã tìm ra được tần số đột biến gen trên SNP rs11509439 ở người Mỹ gốc Mexico là 0,05% nhưng không tìm được đột biến ở người Mỹ gốc Phi và người Mỹ gốc Trung Quốc (Mukherje, 2006). Với đa hình GSTO1 28276 (rs4925), nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tần xuất allele C là chủ yếu, chiếm 78,77% thấp hơn một chút so với nghiên cứu của Agusa, tần xuất allele này chiếm đến 84%. Kết quả giải trình tự gen CXCL1 chúng tôi chưa thấy điểm đột biến nào. Tuy nhiên, từ hệ thống dữ liệu dbSNP trên ngân hàng gen người, các sự sai khác này được xác định là thuộc ba điểm đa hình SNP rs2071425, rs765355 và rs4074 của gen CXCL1 ở người. Theo nhiều nghiên cứu trước đây, đa hình nucleotide đơn của AS3MT 14458 (rs11191439) liên quan mật thiết với sự methyl hóa. Theo Valenzuela ở Mexico thì tỷ lệ AsV và MMAIII+V của người có 14458 (rs11191439) CT + CC cao hơn đáng kể so với những người có AS3MT 14458 (rs11191439) TT (Valenzuela, 2009). Theo các công trình nghiên cứu ở Châu Âu thì những thay đổi kiều gen tại điểm đa hình AS3MT 14458 (rs11191439) là một trong những yếu tố chính có thể ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa asen trong cơ thể: kiểu gen TC + CC có %MMAV cao và %DMAV thấp hơn so với kiểu gen TT (Lindberg, 2007), xu hướng này rõ rệt ở nam hơn ở phụ nữ. Điều này cho thấy rằng AS3MT 14458 ( rs11191439) CT + CC có khả năng chuyển hóa từ asen vô cơ thành MMA cao hơn AS3MT 14458 (rs11191439) TT (Agusa, 2011). Theo Valenzuela và cs (2009), biến thể AS3MT 4602 (rs7085104) không liên quan tới nguy cơ tổn thương da. Tuy nhiên, đa hình AS3MT 4602 (rs7085104) có liên quan tới sự khác biệt tỷ lệ DMA/MMA trong nước tiểu. Nghiên cứu trên người Mehico và Achentina cho thấy AS3MT 4602 (rs7085104) GG (allele G) có tỷ lệ % MMAIII+V thấp hơn, nhưng % DMAIII+V và tỷ lệ DMAIII+V/MMAIII+V cao hơn so với AS3MT 4602 (rs7085104) AA + AG (allele A) (Agusa, 2011). Cho nên allele G có khả năng methyl hóa từ MMA sang DMA cao hơn so với allele A (AA + AG) và có sự liên quan giữa AS3MT 4602 (rs7085104) với quá trình trao đổi chất của asen vô cơ (Valenzuela, 2009). Tuy nhiên theo nghiên cứu của Agusa trên quần thể người Việt Nam ở đồng bằng sông Hồng thì lại cho kết quả ngược lại, đồng hợp tử GG có phần trăm DMAV thấp hơn AA và AG. AS3MT 5913 (rs4917986) có một mối tương quan với %MMAV. Theo nghiên cứu với AS3MT 5913 (rs4917986), dị hợp tử TC có MMAV/iAs cao hơn đồng hợp tử TT, cho thấy rằng SNP này có thể liên quan đến quá trình methyl hóa của asen (Agusa, 2009). Sự gia tăng %MMA trong nước tiểu liên quan đến nguy cơ ung thư đã được đề xuất trong nghiên cứu ở Mehico (Valenzuela,2005), Achentina và Mỹ (Steinmaus, 2006), Đài Loan (Tseng, 2007). Kết quả nghiên cứu cho thấy tại vị trí đa hình AS3MT 4602 trẻ sơ sinh mang kiểu gen đồng hợp tử GG có hàm lượng As máu cuống rốn trung bình (7,67µg/L) cao hơn trẻ mang kiểu gen dị hợp tử AG (6,63µg/L) và đồng hợp tử AA (5,52µg/L) có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Ngoài ra tại điểm đa hình CXCL1 rs2071425 trẻ sơ sinh mang kiều gen đồng hợp tử AA có hàm lượng As tóc (0,61µg/g) cao hơn trẻ mang kiểu gen dị hợp tử AG (0,32µg/g) và đồng hợp tử GG (0,43µg/g) có ý nghĩa thống kê với p< 0,05. Tuy nhiên với đa hình của gen CXCL1, cỡ mẫu nghiên cứu còn nhỏ nên vẫn cần có thêm nghiên cứu để kết luận về vấn đề này. Các cá thể mang đồng thời 5 kiểu gen đồng hợp tử có hàm lượng asen trong máu cuống rốn là 5,18 µg/L thấp hơn so với các cá thể còn lại (6,18 µg/L). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05. Cần có nghiên cứu mối liên quan trực tiếp giữa các biến đổi đa hình gen với hàm lượng và tỷ lệ các asen thành phần trong máu hoặc nước tiểu của trẻ sơ sinh thì sẽ có nhiều ý nghĩa và giá trị hơn. KẾT LUẬN Phụ nữ đang mang thai sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm asen có hàm lượng asen trong nước tiểu, tóc cao hơn so với phụ nữ mang thai sử dụng nguồn nước không bị ô nhiễm asen với p<0,001. Trong nhóm nghiên cứu, DMA (71,62%) chiếm tỷ lệ cao nhất và giảm dần ở các tỷ lệ %MMA (12,25%), % iAs là ít nhất (7,5%). Trẻ sơ sinh của các bà mẹ sử dụng nguồn nước ô nhiễm asen trong thời kỳ mang thai cũng bị phơi nhiễm cao với asen trước sinh (As máu, As tóc) so với nhóm đối chứng với p <0,001và p<0,01. Có mối liên quan thuận rõ rệt giữa phơi nhiễm asen ở mẹ và trẻ sơ sinh: hàm lượng asen tóc và máu trẻ sơ sinh của các bà mẹ bị phơi nhiễm nhiều cao hơn trẻ sơ sinh của các bà mẹ bị phơi nhiễm ít và cao hơn rõ rệt so với nhóm đối chứng không phơi nhiễm với p<0,01, p<0,001. Phơi nhiễm As trước sinh có thể gây biến đổi vật chất di truyền ở trẻ sơ sinh: Tần số bất thường nhiễm sắc thể ở nhóm trẻ sơ sinh có phơi nhiễm asen trước sinh (1,87%), cao gấp 2,56 lần so với nhóm chứng (0,73%), có ý nghĩa với p<0,001. Có mối liên quan thuận rõ rệt giữa bất thường nhiễm sắc thể với mức độ phơi nhiễm asen trước sinh. Đã xác định được tần xuất xuất hiện các điểm đa hình trên gen AS3MT, GSTO1 và CXCL1 ở trẻ sơ sinh và mối liên quan của đa hình gen với chỉ số phơi nhiễm trước sinh. KIẾN NGHỊ Cần nghiên cứu mối tương quan về asen thành phần giữa máu bà mẹ mang thai và trẻ sơ sinh Cần nghiên cứu asen trong nước tiểu của bà mẹ ở các thai kỳ và mối tương quan với asen trong máu, tóc, móng của trẻ sơ sinh Cần mở rộng các nghiên cứu về biển đổi nhiễm sắc thể, gen ở người phơi nhiễm với asen, đặc biệt là trẻ con, trẻ sơ sinh bị phơi nhiễm asen trước sinh để xác định được loại bất thường nào, gen nào có thể sử dụng là những biomarker tiên lượng về sức khỏe, tiên lượng các bệnh lý của trẻ có thể phát triển sau này. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Trần Phương Thảo, Tạ Thị Bình, Nguyễn Huy Hoàng (2012) Mối tương quan giữa methyl hóa asen vô cơ và đa hình gen AS3MT. Tạp chí Y học thực hành ISSN 1859-1663 12(855):18-23. Trần Phương Thảo, Tạ Thị Bình, Nguyễn Huy Hoàng (2013) Đột biến trên gen CXCL1 ở trẻ sơ sinh bị phơi nhiễm Asen trước sinh. Hội nghị Khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2013 1 : 729-732. Tạ Thị Bình, Trần Phương Thảo, Nguyễn Thị Thu Minh, Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Kim Liên, Nguyễn Huy Hoàng (2013) Bước đầu nghiên cứu những biến đổi đa hình gen GST01 ở trẻ sơ sinh bị phơi nhiễm asen trước sinh. Tạp chí Khoa học và Phát triển 11 (6): 784-789. Nguyễn Khắc Hải, Trần Văn Khoa, Tạ Thị Bình, Ngô Trường Giang, Nguyễn Thị Thanh Nga, Nguyễn Thị Việt Hà, Nguyễn Thúy Huyền, (2014) Áp dụng một số kỹ thuật di truyền tế bào trong phân tích bất thường nhiễm sắc thể ở tế bào máu dây rốn trẻ sơ sinh phơi nhiễm arsen trước sinh. Tạp chí Y học Việt Nam 424 (11): 147-152. Lê Bắc Việt. Trần Phương Thảo, Tạ Thị Bình, Nguyễn Khắc Hải, Nguyễn Huy Hoàng (2014) Nghiên cứu một số đột biến thay thế amino axit (missense mutation) trên gen CXCL1 ở người bị phơi nhiễm asen. Tạp chí Y dược học Quân sự 39(2): 48-56. Doãn Ngọc Hải, Tạ Thị Bình, Nguyễn Khắc Hải (2015) Thực trạng phơi nhiễm asen của phụ nữ mang thai ở Hà Nam 2013-2014. Tạp chí Y học dự phòng XXV 8(168):485-491. Trần Phương Thảo, Tạ Thị Bình, Nguyễn Huy Hoàng (2015) Mối tương quan giữa đa hình gen AS3MT và phơi nhiễm asen trước sinh. Tạp chí Công nghệ sinh học 13(4):1007-1015. Tạ Thị Bình, Doãn Ngọc Hải, Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Khắc Hải, (2016) Nghiên cứu phơi nhiễm asen trước sinh của trẻ sơ sinh. Tạp chí Y học thực hành 2 (6):225-228.