Tóm tắt Luận án Nghiên cứu sàng lọc, phân lập và nhận dạng các hoạt chất axit béo, axit arachidonic và prostaglandin từ rong đỏ biển

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ...*** LÊ TẤT THÀNH NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC, PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CÁC HOẠT CHẤT AXIT BÉO, AXIT ARACHIDONIC VÀ PROSTAGLANDIN TỪ RONG ĐỎ BIỂN Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 62 44 01 17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2016  Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TS. Phạm Quốc Long Người hướng dẫn khoa học 2: TSKH. Andrey B. Imbs. Phản biện 1: PGS.TS. Hoàng Thanh Hương Phản biện 2: GS.TS. Lã Đình Mỡi Phản biện 3: PGS.TS. Trần Thu Hương Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ tại Phòng họp tầng 2, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Vào hồi .. giờ , ngày tháng .. năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Tính cấp thiết Nhóm các axit béo C20 đa nối đôi, điển hình là axit arachidonic (AA) và axit eicosapentaenoic (EPA), có vai trò quan trọng nhất trong nhóm chất lipit của cơ thể động vật bậc cao vì chúng là tiền chất để sinh tổng hợp ra các eicosanoid là nhóm các phân tử dẫn truyền tín hiệu sinh học (còn gọi là các hoocmon tổ chức) như các prostaglandin, prostacyclin, leukotrien, và thromboxan. Axit arachidonic là thành phần chính của các phospholipit cấu tạo nên màng của tế bào não, cơ bắp và gan và thường được phân lập từ lipit của gan, trứng của các loài cá biển. AA cũng là thành phần chính trong lipit của một số loài rong biển. Axit arachidonic có tác dụng kích hoạt hệ enzyme NADPH oxygenase giúp hoạt hoá quá trình trao đổi oxi, kích hoạt các kênh ion K+, Ca2+ Các prostaglandin (PG) được hình thành từ các các axit béo C20 đa nối đôi qua quá trình chuyển hoá bằng enzym trong cơ thể và có chức năng sinh học quan trọng đối với động vật. Chúng là một mắt xích quan trọng trong chuỗi phản ứng miễn dịch của cơ thể, liên quan đến các hiện tượng quan trọng như viêm tấy và ung thư. Chúng cũng tác động lên khả năng chịu đựng của hệ cơ phẳng, hệ bài tiết, hệ tiêu hóa và hệ tuần hoàn trong cơ thể sống. Chính vì vậy, chúng cũng được sử dụng làm thuốc để điều tiết các quá trình thụ thai, mang thai và sinh đẻ và vì thế được coi như một chất hormon. Các prostaglandin được các nhà khoa học nghiên cứu tổng hợp hay tìm kiếm từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên, đặc biệt là nguồn sinh vật biển và đã được phát hiện trong một số loài rong Đỏ biển cùng với hàm lượng cao các axit béo không no đa nối đôi. Vì thế rong đỏ biển được đánh giá là nguồn nguyên liệu tự nhiên tiềm năng để khai thác các hoạt chất này. Trên cơ sở các phân tích nêu trên, chúng tôi đã lựa chọn rong Đỏ là đối tượng nghiên cứu với đề tài: “Nghiên cứu sàng lọc, phân lập và nhận dạng các hoạt chất axit béo, axit arachidonic và prostaglandin từ rong Đỏ biển”. 2. Mục tiêu của luận án Mục tiêu rộng của luận án là điều tra, khai thác tài nguyên lipit trong các loài rong đỏ biển đỏ của Việt Nam. Các mục tiêu cụ thể bao gồm: 1   2   Sàng lọc hóa học, xây dựng ngân hàng dữ liệu về hàm lượng lipit, thành phần axit béo và prostaglandin trong các mẫu rong đỏ biển đại diện cho các loài, các địa phương, các điều kiện sinh trưởng, nuôi trồng và thời kỳ thu hoạch khác nhau. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự tích lũy lipit và các thành phần nêu trên. - Tìm kiếm các loài rong Đỏ biển của Việt Nam có tiềm năng thu nhận các thành phần lipit có giá trị, đặc biệt là các axit béo C20 đa nối đôi và các prostaglandin. - Thử nghiệm nuôi trồng một số loài rong đỏ chọn lọc, trong đó có: một loài rong Đỏ có giá trị di thực từ LB Nga; một loài rong Đỏ của Việt Nam. Xác định động thái hình thành, tích luỹ axit béo và PG của nó trong quá trình nuôi trồng. - Xây dựng phương pháp phân lập các hoạt chất AA, PG từ các loài rong Đỏ biển. 3. Nội dung nghiên cứu của luận án - Phân tích hàm lượng lipit và thành phần axit béo của 68 mẫu rong đỏ Việt Nam và 01 mẫu rong đỏ LB Nga. - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và tích luỹ lipit và các axit béo của rong Đỏ. - Sử dụng phương pháp phân tích thành phần chính PCA và phương pháp phân tích chùm để xử lý tập dữ liệu về thành phần axit béo của các mẫu rong đỏ, tìm các mối quan hệ giữa các mẫu với nhau và với các thành phần axit béo. - Sàng lọc các hoạt chất prostaglandin và axit arachidonic trong các mẫu rong Đỏ biển thu thập được. - Khảo sát một số điều kiện sinh trưởng và phát triển của loài rong câu Gracilaria vermiculophylla thu từ vùng biển Viễn Đông - Liên bang Nga trong điều kiện PTN để theo dõi sự biến động hàm lượng các axit béo và prostaglandin trong quá trình nuôi trồng. - Phân lập, nhận dạng và chứng minh cấu trúc PGE2, PGE3 và axit arachidonic từ loài rong Đỏ có tiềm năng thu ở biển Việt Nam và biển Viễn Đông – Liên Bang Nga. 3   4. Những đóng góp mới của luận án 1. Tập dữ liệu về hàm lượng lipit, thành phần axit béo và prostaglandin của 69 mẫu đại diện cho 25 loài thuộc 9 họ rong đỏ biển của Việt Nam thu ở các địa phương, các điều kiện sinh trưởng, nuôi trồng và thời kỳ thu hoạch khác nhau cùng với 01 mẫu rong đỏ Liên bang Nga; Kết quả xác định và đánh giá các nhóm axit béo có giá trị cao thuộc các dãy omega-3, omega-6, các axit béo không no thiết yếu PUFA và HUFA, trong đó lần đầu tiên xác định được axit C22:6n-3 (DHA) có trong 5 mẫu rong đỏ. 2. Kết quả sử dụng phương pháp phân tích PCA và phân tích chùm xử lý tập số liệu 12 thành phần axit béo chính yếu của 69 mẫu rong đỏ thu được cho phép phân biệt khá rõ ràng các mẫu thuộc 3 họ Gracilariaceae, Hypneaeceae và Ceraminaceae và mối liên hệ của chúng với nhau. 3. Phương pháp xác định định tính và định lượng PGE2 từ các loài rong Đỏ biển. Từ đó đã sàng lọc tìm PGE2 trong 69 mẫu nghiên cứu và xác định được 3 loài rong Câu có hàm lượng PGE2 cao và có khả năng khai thác hoạt chất này. 4. Kết quả khảo sát sự biến động và tích luỹ hàm lượng các axit béo và prostaglandin của loài rong Gracilaria vermiculophylla LB Nga trong quá trình nuôi trong phòng thí nghiệm ở Việt Nam. 5. Phân lập, nhận dạng và chứng minh được cấu trúc của hoạt chất PGE2, PGE3 và AA từ nguyên liệu rong Đỏ biển. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án - Luận án đã bổ sung cho kho dữ liệu điều tra cơ bản tài nguyên HCTN biển của Việt Nam các số liệu về hàm lượng lipit, thành phần các axit béo và hàm lượng prostaglandin của 70 mẫu đại diện cho 25 loài thuộc 9 họ rong Đỏ biển của Việt Nam, có so sánh với 1 mẫu rong biển có giá trị kinh tế của LB Nga. - phương pháp phân lập, nhận dạng PGE2, PGE3 và axit arachidonic trong rong đỏ biển cùng với kết quả nghiên cứu động thái tích luỹ các hoạt chất này là cơ sở khoa học cho việc sàng lọc và định hướng khai thác nguồn hoạt chất này từ các nguồn rong biển Việt Nam. 4   6. Bố cục của luận án Luận án gồm 133 trang, trong đó có 37 hình, 15 bảng, 4 biểu đồ. Bố cục của luận án: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan (36 trang); Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (13 trang), Chương 3: Thực nghiệm (8 trang); Chương 4: Kết quả và thảo luận (60 trang); Kết luận và kiến nghị (3 trang); Tài liệu tham khảo (9 trang); Ngoài ra còn có 51 trang phụ lục với các hình phổ, kết quả phân tích TLC, GC và GC-MS, HPLC, NMR. II. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Trong phần tổng quan, luận án đã giới thiệu chung lớp chất lipit, các axit béo (đặc biệt là các axit béo có hoạt tính sinh học như axit arachidonic) và prostaglandin cũng như phương pháp nhận dạng, phân lập lớp chất lipit, axit béo và các hợp chất AA, PG. Luận án đã tổng hợp và đánh giá tiềm năng nguyên liệu rong biển Việt Nam từ một số công trình nghiên cứu về rong biển, trong đó tập trung vào đối tượng rong Đỏ biển. Việc đánh giá tổng quan tài liệu cho thấy, nguồn hoạt chất axit béo, đặc biệt là các eicosanoit như prostaglandin có hoạt tính mạnh ở nồng độ thấp và đã có nhiều ứng dụng làm thuốc. Việc tìm kiếm nguồn hoạt chất này từ nguồn nguyên liệu có khả năng tái tạo cao như rong biển có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Đây cũng là vấn đề mới trên thế giới và Việt Nam. Ở Việt Nam, nghiên cứu sẽ đóng góp thêm các số liệu điều tra cơ bản về lớp chất lipit và các hoạt chất sinh học từ lớp chất này của đối tượng rong Đỏ biển. Nghiên cứu cũng có giá trị thực tiễn cao mở ra triển vọng nuôi trồng, khai thác phát triển nguồn nguồn lợi rong biển phục vụ phát triển kinh tế vùng ven biển. 5   CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là 69 mẫu của 9 họ thuộc ngành rong đỏ Rhodophyta trong đó họ: Gracilariaceae (47 mẫu của 8 loài), Hypneaceae (10 mẫu của 7 loài), Ceramiaceae (4 mẫu của 3 loài), Bangiaceae (2 mẫu của 2 loài), Hylamaniaceae (2 mẫu của 1 loài), Bonnemaisioniaceae (1 mẫu), Phyllophoraceae (1 mẫu), Rhodymeniaceae (1 mẫu), Halymeniaceae (1 mẫu). Vị trí thu mẫu: 68 mẫu thu ở biển Việt Nam từ Quảng Ninh đến Ninh Thuận; 01 mẫu thu tại vùng biễn Viễn Đông – Liên bang Nga. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu Việc thu mẫu ở vùng triều dựa vào quy phạm tạm thời điều tra tổng hợp biển (phần rong biển) của Uỷ ban KHKT Nhà nước ban hành năm 1981. Khảo sát vùng dưới triều dựa vào tài liệu hướng dẫn của Wilkinson & Baker 1997 bằng thiết bị lặn SCUBA. Mẫu rong biển sau khi thu (khoảng 2 kg tươi) được rửa sạch bằng nước mặn sau đó rửa bằng nước ngọt và bảo quản ngay trong nhiệt độ≤ 4OC, sau đó chia đôi và bảo quản bằng tủ lạnh sâu ở -20OC và -47OC. 2.2.2. Phương pháp phân lập, tách chiết lipit, axit béo, AA, PG 2.2.2.1. Phương pháp chiết lipit tổng Chiết lipit tổng bằng phương pháp đặc hiệu Bligh&Dyer, 1959, sử dụng hệ dung môi CHCl3 : CH3OH với tỉ lệ 1/2 (v/v). 2.2.2.2. Phương pháp phân lập các axit béo, AA, PG Để phân lập các axit béo, axit arachidonic, prostaglandin từ rong đỏ sử dụng các phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc kí lớp mỏng điều chế, sắc kí cột áp xuất thường (CC), sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). 6   2.2.3. Phương pháp xác định thành phần, hàm lượng và cấu trúc các axit béo, AA, PG 2.2.3.1. Các phương pháp xác định thành phần, hàm lượng các hợp chất Thành phần và hàm lượng axit béo xác định theo phương pháp ISO/FDIS 659:1998, sử dụng GC-FID và GC-MS. Xác định hàm lượng prostaglandin (dạng đã được methyl và silyl hoá) bằng GC-MS. 2.2.3.2. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc các hợp chất Sử dụng phương pháp phổ khối lượng ion hoá phun mù điện tử ESI- MS, phổ khối bắn phá điện tử EI-MS, phổ khối phân giải cao LCMS-IT- TOF, các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều 1H-NMR, 13C- NMR, DEPT và các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều 1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY. 2.2.4. Phương pháp phân tích cấu tử chính Phương pháp phân tích cấu tử chính (PCA, Principle Component Analysis) và phân tích chùm (cluster analysis) được sử dụng để xử lý các số liệu đa biến về thành phần các axit béo của các mẫu rong đỏ nhằm tìm ra các mối tương quan của chúng với nhau. Phần mềm Statistica-PCA 69 được sử dụng để thực hiện phép phân tích cấu tử chính và phần mềm Surfer 32 được sử dụng để thực hiện phép phân tích chùm. Các số liệu được xử lý trước khi phân tích bằng phần mềm Microsof Excel. CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM Các mẫu được tiến hành nghiên cứu theo sơ đồ chung như sau: 7   3.1. Chiết tách và xác định hàm lượng lipit tổng Cân 100 gam mẫu rong biển tươi, nghiền nhỏ bằng máy xay, chiết bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH tỉ lệ 1:2 (100ml CHCl3: 200ml CH3OH), siêu âm trong 6 giờ. Bổ sung 100ml CHCl3, thêm 100ml nước cất, lắc đều, đợi phân lớp lấy phần dung dịch ở phía dưới, rửa lại bằng nước cất thêm 2 lần sau đó làm khan bằng Na2SO4. Cô cất loại dung môi thu lipit tổng (phương pháp chiết được lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình). 3.2. Xác định thành phần và hàm lượng các axít béo Lấy 10mg lipit tổng được hòa tan với 1ml n-hexan trong lọ nhỏ nút kín, bổ sung 25ml dung dịch CH3ONa 30% và lắc kĩ trong 1 phút. Thêm vào 20mg Na2SO4 loại sạch, lắc kĩ và đem ly tâm ở chế độ 5000 vòng/phút trong 1 phút. Dịch trong, sạch ở pha trên được tách riêng, kiểm tra trên sắc kí bản mỏng (TLC). Tiến hành phân tích trên máy sắc kí khí GC, nhận dạng axit béo bằng phần mềm chuyên dụng, tính toán chuyển đổi qua giá trị thời gian lưu tương đương ECL (Equivalent Chain Length) có sử dụng hệ chất chuẩn là các axit béo C16:0 và C18:0. Kết quả được tính theo công thức: ECL = ±16 2(lg RTx – log T16:0) lg RT18:0 – lg RT16:0 3.3. Sàng lọc định tính, định lượng prostaglandin 3.3.1. Phân tích định tính prostaglandin Lấy 25g rong tươi, nghiền trong nitơ lỏng, bổ sung 50ml nước cất, khuấy bằng máy khuấy từ trong thời gian 60 phút ở nhiệt độ 5-60C. Nhỏ từ từ axit HCl đặc và kiểm tra cho đến khi pH = 2-3, khuấy tiếp 60 phút. Chiết bằng etyl axetat 50ml (2 lần), để phân lớp thu phần dịch phía trên. Cô cất chân không ở nhiệt độ < 300C thu cặn chiết etyl axetat. Kiểm tra bằng bản mỏng silicagel 60 GF254 với hệ dung môi dioxan:benzen:axit axetic (30:50:2), thuốc thử là dung dịch H2SO4/MeOH 5%, phát hiện định tính PGE2 có màu vàng nhạt, sử dụng chất chuẩn PGE2 có độ tinh khiết 93% cung cấp bởi hãng sigma. 3.3.2. Phân tích định lượng PGE2 trong các mẫu rong Đỏ Dịch chiết etyl axetat được metyl và silyl hoá và xác định hàm lượng PGE2 bằng GC-MS. Nhận dạng prostaglandin bằng phần mềm chuyên dụng, tính toán chuyển đổi qua giá trị thời gian lưu tương đương ECL, sử dụng hệ chất 8   chuẩn là PGB2 và PGE2. Tính toán hàm lượng PGE2 có trong 1 g rong tươi (µg/g rong tươi). 3.3.3. Khảo sát sự biến động và tích luỹ prostaglandin và axit béo trong quá trình sinh trưởng và phát triển của loài rong câu Gracilaria vermiculophylla của Nga nuôi trong PTN ở Việt Nam Mô tả chi tiết cách bố trí thí nghiệm theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của loài rong G. vermiculophylla nuôi trong phòng thí nghiệm. Thu mẫu và phân tích đánh giá biến động hàm lượng PG, các axit béo. 3.4. Phân lập prsotaglandin từ rong Đỏ 3.4.1. Phân lập PGE2 từ loài rong câu Gracilaria vermiculophylla Sơ đồ phân lập PGE2 gồm các bước: Xử lí mẫu; Chiết dịch tổng bằng etyl axetat; Phân lập và tinh chế PGE2 bằng HPLC điều chế. • Các dữ liệu phổ của PGE2 phân lập được: Hợp chất phân lập được dạng bột, màu vàng. Điểm nóng chảy 65,5 – 660C. Rf = 0,5 (TLC, silica-gel, C6H6 : EtOAc 1:1, màu vàng, H2SO4 10%/ MeOH). Phổ khối ESI-MS: m/z = 375 [M+Na]+. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 & CD3OD), δ ppm: 5,62 (1H, m, H- 14); 5.58 (1H, m, H-13); 5,43 (1H, m, H-5); 5,34 (1H, m, H-6); 4,06 (2H, m, H-11, H-15); 2,70 (1H, ddd, J = 1.5, 7.5, 18.0 Hz, H-10a); 2,42 (1H, m, H-12); 2,35 (2H, m, H-7); 2,29 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-2); 2,18 (1H, m, H-8); 2,17 (1H, m, H-10b); 2,09 (2H, m, H-4); 1,67 (2H, qd, J = 2,0; 7,5 Hz, H- 3); 1,58 (1H, m, H-16a); 1,48 (1H, m, H-16b); 1,30-1,40 (6H, m, H-17, H- 18, H-19) và 0,91 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-20). Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3 & CD3OD), δ ppm: 216,7 (C-9); 177,0 (C-1); 137,4 (C-14); 131,8 (C-13); 131,6 (C-5); 127,3 (C-6); 73,4 (C- 15); 72,5 (C-11); 55,3 (C-8); 53,9 (C-12); 47,1 (C-10); 37,9 (C-16); 34,1 (C-2); 32,5 (C-18); 27,4 (C-4); 26,0 (C-17); 25,6 (C-3); 25,5 (C-7); 23,3 (C-19) và 14,3 (C-20). 3.4.2. Nhận biết PGE3 từ loài rong câu Gracilaria vermiculophylla Dịch chiết etyl axetat của loài rong câu Liên bang Nga Gracilaria tenuistipitata được tách thành các phân đoạn trên cột thường. Phân đoạn 5 giàu PGE3 (phát hiện bằng TLC) được phân tích bằng phương pháp HPLC 9   liên kết với MS/MS phân giải cao trên máy LCMS-IT-TOF của hãng Shimadzu. Chế độ HPLC: cột C18 (100mm x 2,1mm, ID 3 µm, Supelco, USA), hệ dung môi MeOH:AcOH:H2O biến đổi gradient, tốc độ dòng 2ml/phút. Chế độ MS: Mẫu đo được ion hóa bằng phương pháp APCI (positive-ion mode), quá trình phân mảnh của các ion giả phân tử được xác định bằng MS/MS dùng khí Argon để bắn phá. 3.5. Phân lập, tinh chế thu nhận axit arachidonic từ loài rong Câu Gracilaria tenuistipitata Sơ đồ phân lập AA gồm 4 bước: Chiết lipit tổng; Thuỷ phân lipit tổng; Làm giàu các axit béo không no bằng phương pháp tạo muối với LiOH; Phân lập và tinh chế AA. • Các dữ liệu phổ của hợp chất phân lập được (etyl arachidonat) Phổ khối EI-MS: m/z = 332 [M]+ Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 5,37 (8H, m, H-5, H-6, H- 8, H-9, H-11, H-12, H-14, và H-15); 4,12 (2H, q, J = 7,0; 14.0 Hz, H-21); 2,81 (6H, m, H-7, H-10, H-13); 2,30 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-2); 2,10 (2H, m, H-4); 2.06 (2H, m, H-16); 1,70 (2H, q, J = 7.5 Hz, H-3); 1.36 (2H, m, H- 19); 1,30 (4H, m, H-17, H-18); 1.27 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-22); 0,90 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-20). Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3,), δ ppm: 173,6 (C-1); 130,4 (C- 15); 129.0 (C-8); 128,8 (C-9); 128,5 (C-11); 128,2 (C-12 và C-14); 127,9 (C-5); 127,5 (C-6); 60,2 (C-21); 33,7 (C-2); 31,5 (C-18); 29,3 (C-17); 27,2 (C-16); 26,5 (C-4); 25,6 (C-3, C-7, và C-10); 24,8 (C-3); 22,5 (C-19); 14,2 (C-22); 14,0 (C-20). CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nghiên cứu sàng lọc lipit và axit béo của rong Đỏ 4.1.1. Khảo sát hàm lượng lipit tổng Kết quả xác định hàm lượng lipit tổng của 69 mẫu rong Đỏ, chúng tôi chia thành 4 nhóm: Nhóm I có hàm lượng lipit ≤0,2% (nhóm có hàm lượng lipit thấp); Nhóm II từ >0,2 đến ≤0,4% (nhóm có hàm lượng lipit trung bình); Nhóm III từ >0,4 đến ≤0,6% (nhóm có hàm lượng lipit cao); 10   Nhóm IV >0,6% (nhóm có hàm lượng lipit rất cao). Hàm lượng lipit tổng của 68 mẫu rong Đỏ ở Việt Nam dao động từ 0,118 đến 0,734% khối lượng tươi trong đó có 14 mẫu thuộc nhóm I, 45 mẫu thuộc nhóm II, 5 mẫu thuộc nhóm III và 4 mẫu ở họ rong Đông thuộc nhóm IV có 4 mẫu có hàm lượng lipit tổng đạt 0,604-0,734%. Riêng mẫu rong câu của LB Nga có hàm lượng lipit cao nhất, đạt 1,39% khối lượng tươi. 4.1.2. Khảo sát thành phần và hàm lượng các axit béo 4.1.2.1. Thành phần và hàm lượng axit béo của rong câu Đã xác định được 55 loại axit béo có mạch cacbon từ C12 đến C25. Axit béo no SFA: hàm lượng SFA trung bình là 69,886%, dao động từ 34,68% (mẫu TAX) đến 84,8% (mẫu N15). 50% số mẫu có hàm lượng SFA trong khoảng từ 66,025% đến 75,455%. PUFA: hàm lượng trung bình là 9,807% dao động từ 1,06 đến 49,41%. 50% số mẫu có hàm lượng PUFA trong khoảng từ 4,9 đến 12,43%. Trong số mẫu có hàm lượng PUFA cao phải kể đến mẫu TAX hàm lượng cao nhất đạt 49,41%, mẫu A3 là 22,52%, mẫu A5 là 21,33%, mẫu A16 là 17,86%. HUFA: hàm lượng trung bình là 7,191%, dao động từ 0 đến 35,53%. Chỉ trừ mẫu N15, tất cả các mẫu đều chứa HUFA, một số mẫu có hàm lượng HUFA rất cao như TAX là 35,53%, T28 là 19,47%, A5 là 18,76%, A16 là 15,51%, A3 là 14,93%. Omega-3: hàm lượng chỉ đạt 1,501%, dao động từ 0 đến 18,44%. Thành phần omega-3 chủ yếu là 2 axit béo C20:5n-3 (eicosapentaenoic axit - EPA) và axit C22:5n-3 (Docosapentaenoic acid, DPA). Tuy nhiên, EPA xuất hiện ở nhiều mẫu hơn và có hàm lượng cao hơn, cá biệt có mẫu T29 hàm lượng EPA là 8,17% tổng axit béo. Omega-6: hàm lượng trung bình là 8,174%, dao động từ 0,61% đến 46,34%. Omega-6 cao nhất là mẫu rong Câu Nga đạt 46,34%, gấp > 2 lần mẫu có hàm lượng cao nhất của Việt Nam (mẫu A5), đạt 21,08%. Thành phần omega-6 chủ yếu là 3 axit: C18:2n-6, C20:3n-6, C20:4n- 6, trong đó axit chiếm hàm lượng cao nhất trong tất cả các mẫu là C20:4n-6 (axit arachidonic). 11   Omega-9: Hàm lượng nhóm omega-9 trung bình đạt 10,389%, dao động trong khoảng 3,17 đến 19,79%. Trong đó chủ yếu là axit C18:1n-9 (axit oleic), trung bình đạt 9,39%. Về chỉ số PUFA/SFA: Giá trị trung bình đạt 2,454, dao động từ 0 đến 16,12. Theo khuyến cáo của WHO, yêu cầu cho thực phẩm lành là chỉ số PUFA/SFA >0,4 thì có đến 45/47 mẫu (chiếm 95,7%) đạt yêu cầu. Về chỉ số n3/n6: Giá trị trung bình đạt 0,176, dao động từ 0 đến 4,64. Theo khuyến cáo của WHO, thực phẩm có chỉ số n3/n6 >0,1 là tốt cho sức khoẻ con người. Kết quả phân tích cho thấy có 24 mẫu đạt yêu cầu, trong đó có một số mẫu có chỉ số n3/n6 cao như: T29 (2,17), A3 (2,11), A16 (1,3), T28 (0,93). 4.1.2.2. Thành phần và hàm lượng các axit béo của các loài thuộc chi Hypnea họ rong Đông Axit béo no: chiếm hàm lượng cao, trung bình là 67,53%, dao động từ 53,52% đến 78,44%. PUFA: Hàm lượng PUFA của họ rong Đông tương đương với họ rong Câu. Hàm lượng PUFA trung bình đạt 9,07%, dao động từ 3,88% đến 29,13%. HUFA: Hàm lượng HUFA của họ rong Đông thấp hơn họ rong Câu. Hàm lượng trung bình là 6,02%, doa động từ 1,57% đến 22,35%. Omega-3: Hàm lượng omega-3 của họ rong Đông cao hơn họ rong Câu xong hàm lượng vẫn thấp, đạt trung bình là 3,1%, dao động từ 0 đến 6,78%. Tiếp tục phát hiện 02 mẫu có DHA là N2 và N11 với hàm lượng tương ứng là 1,07% và 2,61%. Omega-6: Hàm lượng omega-6 của họ rong Đông thấp hơn họ rong Câu, đạt giá trị trung bình là 5,87%, dao động từ 1,38% đến 22,35%. Hai axit béo omega-6 xuất hiện phổ biến ở các mẫu là C18:2n-6 (9/10 mẫu), C20:4n-6 ( 8/10 mẫu). Khác với chi Gracilaria, họ rong Câu (Gracilariaceae), thành phần axit béo của các mẫu thuộc chi Hypnea, họ rong Đông (Hypneaceae) có sự khác biệt rõ rệt giữa các loài thậm chí cả trong quần chủng loài như các mẫu N6, N10 và N11 của loài H. flegilliformis hoặc ở các mẫu N12 và T11 12   của loài H. japonica. Ví dụ như đối với AA ở các mẫu N10 và N11 của loài H. flegelliformis hàm lượng chỉ đạt 0,33 và 0,1% thì ở cùng loài là N6 lại lên tới 22,35%. 4.1.2.3. Thành phần và hàm lượng các axit béo của 12 mẫu thuộc 7 họ rong Đỏ Ceramiaceae, Bangiaceae, Hylamaniaceae, Bonnemaisoniaceae, Phyllophoraceae, Rhodymeniaceae, Halymeniaceae Biểu đồ 4.2. Hàm lượng các họ axit béo của 12 mẫu thuộc 7 họ rong Đỏ Đã xác định được 47 axit béo C12 đến C24. Axit béo no: Hàm lượng SFA trung bình là 65,05%, dao động từ 40,18% đến 76,92%. PUFA: hàm lượng trung bình là 13,47%, dao động từ 3,35% đến 36,12%. 50% số mẫu trong khoảng 7,51% đến 12,78%. HUFA: hàm lượng trung bình là 9,48%, dao động từ 0 đến 30,8%. 50% số mẫu nằm trong khoảng từ 2,88% đến 11,67%. Omega-3: Đã phát hiện 9 axit omega-3 mạch cac bon từ C18 đến C22 có hàm lượng trung bình là 3,84%, dao động từ 0 đến 17,67%. Tiếp tục phát hiện 2 mẫu rong Đỏ có chứa DHA là mẫu N4, loài Liagora sp1, hàm lượng đạt 1,82% và mẫu T2, loài Grateloupia lithophila, hàm lượng đạt 0,6% tổng axit béo. Omega-6: Đã phát hiện 10 axit omega-3 mạch cac bon từ C18 đến C23 có hàm lượng trung bình là 9,6%%, dao động từ 2,1% đến 18,89%. Thành phần omega-6 quan trọng nhất là AA (11/12) mẫu, điển hình là mẫu T2, và N9 (loài Grateloupia lithophila) hàm lượng AA đạt lần lượt là 16,1% là 14,45%. 13   Về chỉ số PUFA/SFA: Giá trị của chỉ số này thấp hơn nhiều so với hai họ rong Câu và rong Đông, trung bình là 0,24, dao động từ 0,04 đến 0,9. Về chỉ số n3/n6: Giá trị trung bình là 0,54, dao động từ 0 đến 2,44. Trong 12 mẫu có 50% số mẫu đạt mức >0,1 là: N4 (2,44), CC1 (1,67), N9 (0,97), N7 (0,6), T12 (0,35) và N1 (0,24). 4.1.2.4. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự tích luỹ lipit và hình thành các axit béo của rong Đỏ Chúng tôi tìm hiểu sâu về biến động của sự tích luỹ lipit và axit béo cũng như sự hình thành chúng ở các mẫu đặc trưng cho các họ, các chi và các loài rong Đỏ thu ở một số vùng sinh thái trên biển. • Đúc kết các yếu tố ảnh hưởng trên cơ sở số liệu của các mẫu rong Đỏ thu tại đảo Cồn Cỏ - Quảng Trị. Cồn Cỏ - Quảng Trị đặc trưng của vùng biển miền Trung có khí hậu chủ yếu là nắng, nóng trong năm. Chúng tôi đã nghiên cứu 11 mẫu của 11 loài thuộc 8 họ rong Đỏ (bảng 4.3) là đặc trưng cho các họ rong Đỏ khác nhau trong một vùng sinh thái. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sinh tổng hợp axit béo không chỉ rất khác biệt giữa các mẫu khác họ mà còn ở những cặp mẫu của các loài có quan hệ phát sinh sinh vật gần gũi (cùng chi) như N2/N6, N4/N7 và N5/CC2. Minh chứng qua hàm lượng AA (C20:4n-6) và EPA (C20:5n-3). Chẳng hạn như trong khi ở mẫu N6 hàm lượng AA rất cao (22,35%) thì ở mẫu N2 lại vằng mặt hoạt chất này. Tương tự như vậy ở mẫu N7 không phát hiện được AA và EPA trong khi hàm lượng các hoạt chất này ở N4 lần lượt là 1,7 và 6,24% tổng axit béo. • Đúc kết các yếu tố ảnh hưởng trên cơ sở số liệu của các mẫu rong Đỏ thu tại khu vực Phù Long - Hải Phòng Khu vực Phù Long – Hải Phòng là khu vực điển hình cho vùng biển Đông Bắc, nơi có một mùa đông lạnh trong năm, tập trung nhiều loài thuộc chi rong Câu. Chúng tôi thu thập được 4 loài thuộc chi rong Câu tại khu vực này. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng lipit của các mẫu ở mức trung bình và thấp. Về thành phần axit béo, chúng có 3 đặc trưng tương tự như 8 họ rong Đỏ khác thu tại Cồn Cỏ - Quảng Trị là (1) hàm lượng axit 14   béo no rất cao, (2) tỷ lệ về hàm lượng axit béo no thấp thì hàm lượng axit béo không no PUFA và HUFA cao và ngược lại, (3) hàm lượng axit béo họ omega-6 cao hơn omega-3. Các tính chất này phù hợp với các đặc trưng chung của các họ thuộc ngành rong Đỏ công bố trước đây. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, trong một chi rong câu Gracilaria cũng có sự biến dị về thành phần các axit béo. Ví dụ thấy rõ nhất ở mẫu A22 (loài Gracilaria gigas) xuất hiện 4 axit mạch dài là C21:0, C22:2n-6, C22:5n-3, C22:6n-3 (DHA) trong khi đó không phát hiện ở 3 loài cùng thuộc chi rong Câu. • Đúc kết các yếu tố ảnh hưởng trên cơ sở số liệu của các mẫu rong Đỏ thu tại các tỉnh khác nhau khác nhau Nghiên cứu được tiến hành trên 8 mẫu của cùng loài rong Câu chỉ vàng thu ở 8 tỉnh, thành khác nhau (từ Quảng Ninh đến Bình Thuận) và 1 mẫu xuất xứ từ mẫu T28 được nuôi trong PTN của Viện (nhiệt độ phòng nuôi là 20-220C) để xem xét sự hình thành và tích luỹ axit béo của cùng 1 loài trong các điều kiện sinh thái khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy, mặc dù các mẫu rong Câu chỉ vàng thu trải dài trên 8 tỉnh khác nhau nhưng sự tích luỹ lipit và axit béo no không có nhiều biến động. Điều đáng chú ý nhất là axit C20:4n-6 có mặt ở 8/8 mẫu, song hàm lượng rất khác biệt nhau. Điều này cho thấy mặc dù sự hình thành và tích luỹ axit béo nhóm axit béo không no tuy được quyết định vào bản chất sinh học của loài song vẫn chịu tác động không nhỏ của điều kiện tự nhiên. Khi so sánh 2 mẫu rong Câu chỉ vàng (Gracilaria tenuistipitata) thu tự nhiên (mẫu T28) và mẫu nuôi trong PTN, hàm lượng lipit tổng thì không thay đổi đáng kể tuy nhiên thành phần các axit béo thì biến động rất đáng chú ý. Mẫu rong nuôi phát sinh thêm 5 axit là C15:1n-7, C15:1n-5, C16:1n- 9, C17:0 và C20:3n-6. Hàm lượng axit C16:0 đặc trưng cho họ axit béo no của mẫu rong thu tự nhiên giảm 23,2% so với tổng axit béo trong khi đó axit C20:4n-6 tăng 10,03%. Như vậy có thể nhận định điều kiện nhiệt độ trong quá trình sinh trưởng của rong ảnh hưởng lớn đến thành phần và hàm lượng axit béo theo hướng giảm axit béo no và tăng các axit béo không no. 15   4.1.3. Sử dụng phương pháp PCA và phương pháp phân tích chùm để xử lý tập dữ liệu về thành phần axit béo của các mẫu rong đỏ Từ 69 mẫu rong Đỏ chúng tôi đã xác định được 12 axit béo chính yếu là C14:0, C15:0, C16:0, C16:1n-7, C18:0, C18:1n-9, C18:1n-7, C18:2n-6, C20:3n-6, C20:4n-6, C20:5n-3 và C22:0. Các mẫu rong Đỏ phân bố trên giản đồ 2 chiều như hình 4.1 trong đó thể hiện rõ rệt nhất là các họ Gracilariaceae, Hypneaceae, Ceramiaceae. Hình 4.1. Kết quả phân tích PCA của các loài rong Đỏ Sử dụng phần mềm SURFER 32, chúng tôi biểu diễn biểu đồ phân loại hình đối với 69 mẫu rong đỏ theo các dữ liệu về thành phần và hàm lượng các axit béo chính yếu như hình 4.2 dưới đây. Hình 4.2. Sơ đồ cây phân loại 69 loài rong đỏ dựa vào thành phần và hàm lượng các axit béo chính yếu. Gra1 Gra2 Gra3 Gra4Gra5 Gra6 Gra7 Gra8 Gra9 Gra10 Gra11 Gra12 Gra13 Gra14 Gra15 Gra16 Gra17 Gra18Gra19 Gra20Gra21 Gra22 Gra23Gra24 Gra25 Gra26 Gra27Gra28 Gra29 Gra30 Gra31 Gra32 Gra33 Gra34 Gra35 Gra36 r 37 Gra38 Gra39 Gra40 Gra41 Gra42 Gra43 Gra44 r 5Gra46 GraNga Hyp1 Hyp2 Hyp3 Hyp4 Hyp5 Hyp6 Hyp7 Hyp8 Hyp9 Hyp10 Cer1 Cer2 Cer3 Cer4 Ban1 Ban2 Hyl1 Hyl2 Bon Phy Rho Hal -1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 -2.50 -2.00 -1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 F2 F1 Tree Diagram for Variables Single Linkage Euclidean distances Gr aN ga Hy l2 Gr a15 Ban 2 Ban 1 Gr a11 Phy Hy l1 Ha l Rh o Hy p2 Gr a8 Hy p9 Hy p8 Hy p10 Gr a34 Hy p3 Gr a44 Hy p6 Hy p4 Hy p1 Hy p7 Hy p5 Bon Gr a23 Gr a25 Gr a9 Gr a7 Gr a4 Gr a3 Gr a38 Gr a41 Gr a33 Gr a40 Gr a29 Gr a1 Gr a10 Gr a6 Gr a5 Gr a2 Gr a45 Gr a46 Gr a42 Gr a39 Gr a37 Gr a21 Gr a26 Gr a31 Gr a32 Gr a36 Gr a30 Gr a28 Gr a24 Gr a27 Gr a19 Gr a35 Gr a18 Gr a43 Gr a20 Gr a17 Gr a12 Gr a13 Gr a16 Gr a14 Gr a22 Cer 2 Cer 1 Cer 3 Cer 40 5 10 15 20 25 Lin kag e D ista nce 16   4.2. Kết quả sàng lọc prostaglandin và axit arachidonic từ các loài rong đỏ thu thập được 4.2.1. Kết quả khảo sát định tính PGE2 Chúng tôi đã tiến hành khảo sát định tính PGE2 của các mẫu rong Đỏ bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC). Hình 4.3. Sắc kí lớp mỏng định tính PGE2 (a). Các mẫu có vết PGE2, (b). Các mẫu không có vết PGE2. Kết quả phân tích cho thấy có tín hiệu về sự xuất hiện PGE2 ở 39 mẫu, trong đó tín hiệu rõ ràng nhất ở mẫu rong Nga (kí hiệu TAX hay M0) và 38 mẫu rong Đỏ Việt Nam. Tuy nhiên, sự xuất hiện các tín hiệu này rất khác nhau, đa phần các mẫu chỉ xuất hiện tín hiệu dạng vết, chỉ có 4 mẫu xuất hiện tín hiệu PGE2 rõ ràng là các mẫu T5, A3, A7, A16. 4.2.2. Kết quả khảo sát định lượng PGE2 Kết quả phân tích định lượng PGE2 đã xác định được 15 mẫu (T5, T22, T28, A3, A4, A5, A6, A7, A16, N3, N6, N9, CC2, T2 và TAX) có hàm lượng PGE2 từ 0,3 – 21,52µg/g rong tươi. Trong đó hàm lượng cao nhất là mẫu rong Câu Nga TAX (loài Gracilaria vermiculophylla), tiếp theo là 2 mẫu rong Câu Việt Nam là mẫu A16 (loài Gracilaria gigas), mẫu T5 (loài Gracilaria tenuistipitata) với hàm lượng lần lượt là 3,6 và 3,4 µg/g rong tươi. So sánh tương quan giữa hàm lượng PGE2 và AA trong 39 mẫu rong Đỏ (bảng 4.6) cho thấy, các mẫu có hàm lượng AA cao thì có khả năng phát hiện PGE2 hàm lượng cao và ngược lại. Tuy nhiên, tỉ lệ tương quan giữa hàm lượng AA và PGE2 ở các họ rong Đỏ là không giống nhau. 17   4.2.3. Khảo sát sự biến động và tích luỹ hàm lượng các axit béo, prostaglandin trong quá trình sinh trưởng và phát triển của loài rong câu Gracilaria vermiculophylla của Nga nuôi trong PTN ở Việt Nam. 4.2.2.1. Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của loài rong câu Gracilaria vermiculophylla trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả nghiên cứu (bảng 4.7 và biểu đồ 4.3). Biểu đồ 4.3. Tốc độ tăng sinh khối của rong Câu G. vermiculophylla Kết quả khảo sát cho thấy rong có khả năng sống khi nuôi trong điều kiện thí nghiệm với thời gian 5 tháng. Đặc biệt là trong 3 tháng đầu, tốc độ tăng trọng đạt 1-3%/ngày, sau đó rong bị chết và ngừng sinh trưởng. 4.2.2.2. Khảo sát sự biến động hàm lượng lipit các axit béo trong quá trình sinh trưởng và phát triển của rong câu G. vermiculophylla Kết quả khảo sát (bảng 4.8) cho thấy, hàm lượng lipit tổng sau 5 tháng nuôi giảm dần từ 1,39% (mẫu M0, M1) xuống còn 0,55% (mẫu M5). Các axit béo no hàm lượng tăng từ 33,68 lên đến 55,76% tổng axit béo (tăng 60,4%). Hàm lượng các axit béo không no PUFA và omega-6 giảm tương ứng từ 49,41% và 46,34% xuống còn 15,91% tổng axit béo ở tháng thứ 5. Trong đó đặc biệt là AA giảm từ 33,3% xuống còn 11,44%. 4.2.2.3. Khảo sát sự biến động PGE2 của rong câu Gracilaria vermiculophylla nuôi trong phòng thí nghiệm Kết quả phân tích hàm lượng PGE2 của các mẫu rong nuôi từ tháng 1-5 lấy mẫu thêm 01 mẫu M6 ở tháng thứ 6 khi rong đã lụi ở bảng 4.9. Bảng 4.9. Hàm lượng PGE2 của các mẫu rong nuôi (µg/g rong tươi) Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Hàm lượng PGE2 21,52 18,33 - 8,26 5,21 3,16 - 18   Hàm lượng PGE2 giảm dần theo các tháng trong quá trình nuôi từ 21,52 (M0) xuống còn 3,16 (M5). Có 2 mẫu không phát hiện PGE2 là mẫu M2 (khi có sinh vật giáp xác phát triển mạnh) và M6 (sau khi rong đã lụi). 4.3. Phân lập hoạt chất prostaglandin từ rong Đỏ Phân lập các prostaglandin (PGE2, PGE3) theo sơ đồ hình 4.5. Hình 4.5. Sơ đồ phân lập PG từ rong câu Gracilaria vermiculophylla 4.3.1. Phân lập PGE2 từ loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla 4.3.1.1. Khảo sát các điều kiện phân lập PGE2. Đã xác định điều kiện nghiền mẫu: bằng nitơ lỏng, thêm nước cất và ủ trong các điều kiện tối ưu. Các thông số cho quá trình ủ để phân lập PGE2: nhiệt độ 3-60C, pH 2-3, thời gian: 2h. 4.3.1.2. Tinh chế PGE2 Tách PGE2 trên cột silica gel với hệ dung môi etyl axetat:hexan:axit axetic biến đổi gradient (30:70:2 – 50:50:2 – 70:30:2), thu được các phân đoạn E1-E7. Tiếp tục tinh chế phân đoạn E6 bằng HPLC điều chế thu được PGE2 ở phút thứ 39. Độ tinh sạch >90%. 4.3.1.3. Xác định cấu trúc hoá học của PGE2 19   Từ các kết quả phân tích dữ liệu phổ thu được nêu trên cộng với so sánh với tài liệu tham khảo [89,91] cho phép xác định chính xác cấu trúc hóa học của hợp chất thu được là prostaglandin E2 (PGE2). Bảng 4.12. Các dữ liệu phổ 1H, 13C, COSY and HMBC NMR của PGE2 TT Hợp chất PGE2 1H (δ, J in Hz) 13C (δ, ppm) HMBC COSY 1 177,0 , H-3 2 2,29, t, 7.5 34,1 H-3, H-4 H-3 3 1.67, qd, 3.0, 7.5 25,6 H-4, H-2 H-2, H-4 4 2,09, m 27,4 H-6, H-2, H-3 H-3, H-5 5 5,43, m 131,6 H-7, H-3, H-4 H-4, H-6 6 5,34, m 127,3 H-7, H-8 H-5, H-7 7 2,35, m 25,5 H-5, H-8 H-6, H-8 8 2,18, m 55,3 H-7 H-7, H-12 9 216,7 H-10, H-7 H-10b, H-11 10 2,70, ddd, 1.5, 7.5, 18.0 2,17, m 47,1 H-11 11 4,06, m 72,5 H-13, H-10 H-10, H-12 12 2,42, m 53,9 H-14,H-10 H-11, H-13, H-8 13 5,58, m 131,8 H-11, H-12, H-15 H-12, H-14 14 5,62, m 137,4 H-12, H-15 H-13, H-15 15 4,06, m 73,4 H-13 H-14, H-16 16 1,58, m 1,48, m 37,9 H-15, H-17 17 1,33, m 26,0 H-16 H-16, H-18 18 1,33 m 32,5 H-19, H-20, H-17 H-17, H-19 19 1,35 m 23,3 H-20 H-18, H-20 20 0,91, t, 7.5 14,3 H-19 H-19 Prostaglandin E2 20   4.3.2. Nhận biết prostaglandin E3 Trên phổ khối phân giải cao LCMS-IT-TOF đã xác định hợp chất phân lập được từ phân đoạn E5 là PGE3. Hình 4.16. Phổ LCMS của PGE3 4.3.3. Bàn luận về sự chuyển hoá của axit béo họ eicosanoit thành các prostaglandin bằng enzyme nội sinh từ rong Đỏ Các kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu rong Nga Gracilaria vermiculophylla ngoài hàm lượng AA rất cao (33% tổng axit béo) còn chứa một lượng đáng chú ý EPA (2,08% tổng axit béo). Đây là 2 tiền chất cho quá trình sinh tổng hợp các prostaglandin có 2 và 3 nối đôi. Điều này là nguyên nhân trực tiếp phát sinh PGE2 và PGE3 thu được trong quá trình phân lập các hoạt chất từ mẫu rong này. Đây cũng là mẫu được xem như một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho việc thu nhận các prostaglandin. 4.4. Phân lập axit arachidonic từ loài rong Câu chỉ vàng Gracilaria tenuistipitata 4.4.1. Quy trình phân lập axit arachidonic (hình 4.17) 4.4.2. Thuỷ phân lipit tổng Quá trình thủy phân sử dụng KOH và dung môi là etanol. Điều kiện tiến hành phản ứng thủy phân như sau: Thời gian 120 phút; Nồng độ cồn 70%; Nhiệt độ 750C. Hàm lượng AA sau khi thuỷ phân là 12,18%. ! 21   4.4.3. Nghiên cứu làm giàu AA bằng phương pháp tạo muối với LiOH Hỗn hợp các axit béo được tạo muối với LiOH trong axeton, các muối của axit béo no sẽ kết tủa và được lọc để loại ra. Các điều kiện tối ưu cho phản ứng là: Thời gian là 60 phút; Tỉ lệ LiOH/axit béo là 2:1; Nhiệt độ phản ứng từ 35oC ÷ 40oC. Hàm lượng AA sau phản ứng là 69,71%. Hình 4.17. Sơ đồ phân lập axit arachidonic từ loài rong Câu chỉ vàng Gracilaria tenuistipitata 4.3.4.4. Tinh chế axit arachidonic và chứng minh cấu trúc Tinh chế axit arachidonic từ hỗn hợp axit béo sau khi làm giàu bằng HPLC Shimadu – LC8A, cột SDSH C-18 (250mm x 50mm, ID 10µm) thu được axit arachidonic dưới dạng etyl este. 22   Các dữ liệu phổ thu được nêu trên cộng với so sánh với tài liệu tham khảo [96,107] cho phép xác định chính xác cấu trúc hóa học của hợp chất thu được là etyl arachidonat như dưới đây. Bảng 4.14. Các dữ liệu phổ 1H, 13C, COSY and HMBC NMR của etyl arachidonat STT 1H (δ, J in Hz) 13C (δ, ppm) HMBC COSY 1 173,5 H-21; H-2; H-3 2 2,30 33,7 H-3, H-4 H-3 3 1,70 25,6 H-2, H-4, H-5 H-2, H-4 4 2,10 26,5 H-2, H-3, H-5 H-3, H-5 5 5,37 127,8 H-7, H-4 H-4, H-6 6 5,37 127,5 H-7 H-5, H-7 7 2,80 25,6 H-8, H-9 H-6, H-8 8 5,37 128,9 H-7, H-10 H-7, H-9 9 5,37 128,8 H-10 H-8, H-10 10 2,80 25,6 H-12 H-9, H-11 11 5,37 128,5 H-10, H-12 12 5,37 128,1 H-13 H-13 13 2,80 24,8 H-12, H-14 14 5,37 128,1 H-13 H-13, H-15 15 5,37 130,4 H-13, H-16 H-14, H-16 16 2,06 27.2 H-17 H-15, H-17 17 1,35 29,3 H-16 H-16, H-18 18 1,30 31,5 H-6, H-17, H20 H-19, H-20 19 1,30 22,5 H-17,H-20,H-18 H-18, H-20 20 0,90 14,1 H-18 H-19 21 4,12 60.2 H-22 H-22 22 1,27 14,2 H-21 H-21 23   KẾT LUẬN Lần đầu tiên ở Việt Nam, đã nghiên cứu sàng lọc toàn diện hàm lượng lipit tổng, thành phần các axit béo, axit arachidonic và prostaglandin trong 70 mẫu rong Đỏ thu ở biển Việt Nam và 01 mẫu rong Đỏ thu ở biển Viễn Đông - Liên bang Nga. 1. Đã xác định được hàm lượng lipit tổng của 70 mẫu của 25 loài thuộc 9 họ rong Đỏ, trong đó 64 mẫu của 21 loài hàm lượng nằm trong khoảng từ 0,118-0,449% khối lượng tươi, 4 mẫu của 3 loài thuộc họ rong Đông (Hypneaceae) hàm lượng lipit tổng lên đến 0,6-0,73%. Riêng mẫu của loài rong Câu Nga hàm lượng lipit tổng là 1,39 khối lượng rong tươi, gấp 2-10 lần so với các mẫu rong của Việt Nam. 2. Đã xác định thành phần và hàm lượng các axit béo của 70 mẫu nghiên cứu và đánh giá các nhóm axit béo có giá trị cao thuộc các dãy omega-3, omega-6, các axit béo không no thiết yếu PUFA và HUFA. Trong đó đặc biệt là tìm thấy các axit C20:4n-6 (AA), C20:5n-3 (EPA) có hàm lượng cao ở nhiều mẫu rong Đỏ. Lần đầu tiên xác định được axit C22:6n-3 (DHA) có trong 5 mẫu rong Đỏ, mẫu cao nhất là loài Hypnea flagelliformis (Grev.) có hàm lượng là 2,61% tổng axit béo. Các kết quả này cũng cho phép phát hiện ra một số cá thể đặc biệt trong mỗi họ, cụ thể là các mẫu A5, A3, T28, T5, T29, A16, A17 (thuộc họ Gracilariaceae), mẫu N6 (họ Hypneaceae), mẫu N9 họ Hylamaniaceae. Các mẫu này hoặc có hàm lượng các axit béo quý vượt trội (mẫu N9, N6, A5, A3, T28, T5), hoặc có các chỉ số PUFA/SFA và omega-3 / omega-6 cao, thích hợp làm chất bổ sung dinh dưỡng (mẫu T29, N6, A3, A16, A17, T28), xứng đáng được nghiên cứu kỹ lưỡng hơn để chọn ra các giống có tính chất ưu việt cho thu hái và nuôi trồng. 3. Qua nghiên cứu việc hình thành tích luỹ lipit và axit béo ở các mẫu đặc trưng cho họ, chi và loài của ngành rong Đỏ ở các vùng sinh thái khác nhau rút ra kết luận sơ bộ: Sự hình thành và tích luỹ lipit và axit béo của rong Đỏ chịu tác động không nhỏ của điều kiện tự nhiên như vùng biển thu mẫu, dinh dưỡng, độ sâu mà rong phân bố và đặc biệt 24   là nhiệt độ theo hướng giảm hàm lượng các axit béo không no và tăng axit béo no khi nhiệt độ môi trường sống của rong giảm. 4. Kết quả phân tích PCA và phân tích chùm trên tập số liệu 12 thành phần axit béo chính yếu (là C14:0, C15:0, C16:0, C16:1n-7, C18:0, C18:1n-9, C18:1n-7, C18:2n-6, C20:3n-6, C20:4n-6, C20:5n-3, C22:0) của 69 mẫu rong đỏ thu được cho phép phân biệt khá rõ ràng các mẫu thuộc 3 họ Gracilariaceae, Hypneaceae và Ceraminaceae và mối liên hệ của chúng với nhau. 5. Đã xác định hàm lượng PGE2 của loài rong Câu Nga Gracilaria vermiculophylla (Ohmi) Papenf. là 21,52 µg/g rong tươi cao gấp 6-20 lần, trung bình là 10 lần các mẫu rong Đỏ Việt Nam. Đã xác định định lượng PGE2 có trong 14 mẫu rong Việt Nam có hàm lượng từ 0,3 đến 3,6 µg/g rong tươi. Từ đó đã xác định được một số loài rong có tiềm năng để khai thác các hoạt chất prostaglandin như là loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla (Ohmi, Papenf.) (Liên bang Nga), 02 loài rong Câu của Việt Nam là Gracilaria tenuistipitata (Zhang et Xia) và Gracilaria gigas (Harv.). 6. Đã khảo sát sự biến động các axit béo và prostaglandin của loài rong Gracilaria vermiculophylla (Ohmi) Papenf. thu từ biển Viễn Đông – LB Nga trong quá tình nuôi (từ 8/11/2011 đến 30/3/2012) trong phòng thí nghiệm ở Việt Nam. Trong đó: Hàm lượng các axit béo no tăng dần theo thời gian nuôi từ 33,68% lên đến 68,89%; Hàm lượng các axit béo không no đặc biệt là các PUFA trong đó có AA), giảm dần theo thời gian nuôi từ 49,41 xuống còn 15,91% tổng axit béo; Hàm lượng PGE2 trong quá trình nuôi loài rong Câu trên trong phòng thí nghiệm giảm từ 21,52 xuống còn 3,16 µg/g rong tươi. 7. Đã xây dựng được quy trình phân lập prostaglandin E2 từ loài rong Gracilaria vermiculophylla (Ohmi, Papenf.). 8. Lần đầu tiên chiết xuất, làm giàu và nhận dạng được prostaglandin E3 từ loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla (Ohmi, Papenf.). 9. Đã xây dựng đươc quy trình phân lập axit arachidonic từ loài rong Câu chỉ vàng Gracilaria tenuistipitata Zhang et Xia. 25   KIẾN NGHỊ - Các loài rong có khả năng tích lũy lipit cao A5, A3, T28, T5, T29, A16, A17 (thuộc họ Gracilariaceae), mẫu N6 (họ Hypneaceae), mẫu N9 họ Hylamaniaceae, có hàm lượng PUFA và các chỉ số PUFA/SFA cũng như n-3/n-6 cao (các mẫu T29, N6, A3, A16, A17, T28) cần được nghiên cứu kỹ để làm nguồn nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng và cho các mục đích kinh tế khác. - Các loài rong Việt Nam có hàm lượng PGE2 cũng như hàm lượng AA cao cần được nghiên cứu thu hái và nuôi trồng để làm nguồn nguyên liệu sản xuất prostaglandin E2 thực vật. - Cần tiếp tục nghiên cứu sâu về thành phần hoá học, các chất có hoạt tính sinh học cao của một số loài rong Đỏ có tiềm năng để có cơ sở khai thác chế biến các sản phẩm từ rong Đỏ nhằm phát triển kinh tế vùng ven biển Việt Nam. CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. A.B.Imbs N.A., Latyshev V.I., Svetashev A.V., A. Skriptsova, Thanh L.T., Quan P.M., Son N.V. and Long P.Q., (2012), Distribution of polyunsaturated fatty acids in red algae of the genus Gracilaria, a promising source of prostaglandins, Russian Journal of Marine Biology, ISSN :1063- 0740, Vol: 38, Issue: 4, pp 318-325. 2. V.G. Rybin, V.I. Svetashev, A.B. Imbs, T.T. Le, L.Q. Pham, and H.V. Ha (2013), Detection of prostaglandin E3 in the red alga Gracilaria vermiculophylla, Chemistry of Natural Compounds Vol. 49, No. 3, July. 3. Lê Tất Thành, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Nguyễn Thị Hương Liên, Nguyễn Văn Trung, Đàm Đức Tiến, A.V. Skriptsova, A.B. Imbs, Phạm Quốc Long (2012), Bước đầu khảo sát một số điều kiện sinh trưởng và phát triển của rong biển Gracilaria vermiculophylla nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm, Tạp chí Khoa học Công nghệ số 50, tập 3A, trang 320-326. 4. Lê Tất Thành, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Nguyễn Thanh Hòa, Nguyễn Thị Nguyệt, Đàm Đức Tiến, Đoàn Lan Phương, Phạm Quốc Long (2013), Khảo sát hàm lượng lipit và thành phần axit béo của rong biển chi Hypnea, Tạp chí hóa học tập 6ABC, trang 49-53. 26   5. Lê Tất Thành, Hoàng Thị Bích, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Nguyễn Thị Thủy, Đinh Thị Thu Thủy, Vũ Thị Oanh, Đỗ Trung Sỹ, Đàm Đức Tiến, Phạm Quốc Long (2013), Nghiên cứu thu nhận lipit giàu axit béo họ eicosanoid từ quá trình sản xuất agar, Tạp chí khoa học và công nghệ số 51, tập 6A, trang 183-188. 6. Lê Tất Thành, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Trần Quốc Toàn, Hoàng Thị Bích, Hà Việt Hải, Lê Xuân Hưng, Dương Nghĩa Bang, Đàm Đức Tiến, Đỗ Trung Sỹ, Phạm Quốc Long (2014), Nghiên cứu quy trình phân lập axit Arachidonic từ rong câu Việt Nam, Tuyển tập Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh học biển và phát triển bền vững lần thứ hai, trang 729- 734. 7. Lê Tất Thành, Trần Quốc Toàn, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Hoàng Thị Bích, Hà Việt Hải, Đàm Đức Tiến, Nguyễn Thị Kiều Oanh, A.B. Imbs, Đỗ Trung Sỹ, Phạm Quốc Long (2014), Nghiên cứu quy trình công nghệ phân lập prostaglandin E2 từ rong câu chỉ vàng Việt Nam (Gracilaria tennuispititata Zhang et xia), Tuyển tập Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh học biển và phát triển bền vững lần thứ hai, trang 717- 723. 8. Lê Tất Thành, Phạm Minh Quân, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Đàm Đức Tiến, Đỗ Trung Sỹ, Phạm Thu Huế, Phạm Quốc Long (2015), Nghiên cứu sử dụng dữ liệu các axit béo trong phân loại hóa thực vật (Chemotaxonomy) đối với các loài rong đỏ, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Biển số 3/2015.