Tóm tắt Luận án Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme dat tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don ) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2017 Công trình được hoàn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM – ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm 2. GS.TS. Chu Hoàng Mậu Phản biện 1: . Phản biện 2: . Phản biện 2: . Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiều luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm học liệu - Đại học Thái Nguyên Thư viện Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Các bài báo 1. Bùi Thị Hà, Hồ Mạnh Tường, Hoàng Phú Hiệp, Lê Văn Sơn, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015), “Tách dòng phân tử và thiết kế vector chuyển gen DAT phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don), TAP CHI SINH HOC 37(2), pp. 236-243. 2. Bùi Thị Hà, Trần Thị Anh, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh đa chồi in vitro ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.).G.Don)”, Tạp chí KHĐHQGHN. Khoa học Tự nhiên và công nghệ, Tập 31, sô 4S , tr 56-62. 3. Bùi Thị Hà, Đỗ Huy Hoàng, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2016), “Nghiên cứu quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Tập 157, số 12/1 4. Bui Thi Ha, Nguyen Thi Ngoc Lan, Nguyen Thi Tam , Le Van Son, Chu Hoang Mau (2017), “Expression of the gen encoding deacetylvindoline 4-O-acetyl transferase (CrDAT) from Catharanthus roseus in transgenic tobacco plants”. (Gửi tại tạp chí Khoa học Quốc tế đang đợi đăng) Các trình tự gen đã đăng ký trên Ngân hàng Gen quốc tế [1]. Bui,H.T., Hoang,H.P., Nguyen,T.T. and Chu,M.H (2015), Catharanthus roseus mRNA for DAT enzyme (DAT gene), isolate TN1 (Pink-purple flower), GenBank: LN809930.1 [2]. Bui,H.T., Hoang,H.P., Nguyen,T.T. and Chu,M.H (2015), Catharanthus roseus mRNA for DAT enzyme (DAT gene), isolate TN2 (White flower), GenBank: LN809931.1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện nay, loài người trên thế giới đang phải đối mặt với rất nhiều căn bệnh nguy hiểm, ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe như: Ung thư, AIDS, tiểu đường, thoái hóa khớp, viêm gan B, C. Ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tỉ lệ người mắc ung thư năm 2012 là 14 triệu người. Đến năm 2015 đã có hơn 90 triệu người mắc ung thư và hàng năm có hơn 8 triệu người chết vì ung thư. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) là một trong những loại cây dược liệu quý. Cây dừa cạn có khả năng sản xuất các indol alkaloid có dược tính quan trọng trong sản xuất các loại thuốc chống ung thư, đặc biệt là ung thư máu. Ngoài ra, cây dừa cạn còn được chỉ dẫn trong điều trị bệnh bạch cầu lympho cấp và một số bệnh ung thư khác. Trong dân gian, dừa cạn được sử dụng trị cao huyết áp, bệnh tiểu đường, điều hòa kinh nguyệt, chữa tiêu hóa kém và chữa lị, lợi tiểu khá mạnh, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, tẩy giun, chữa sốt cao. Trong cây dừa cạn có chứa 2 loại alkaloid là vinblastine và vincristine được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh ung thư. Vinblastine và vincristine là những chất ức chế mạnh sự phân chia tế bào và do vậy ngăn cản sự tăng số lượng tế bào Hàm lượng vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn hoang dại rất thấp cho nên định hướng nghiên cứu làm tăng hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn được quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật hiện đại trong đó, xác định và tăng cường biểu hiện enzyme chìa khóa là rất quan trọng. Deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) là một trong những enzyme chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn. Biểu hiện mạnh enzyme DAT sẽ làm tăng các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp và hàm lượng vinblastine và vincristine trong dừa cạn sẽ được nâng cao. Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định đặc điểm và biểu hiện được gen mã hóa deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (CrDAT) phân lập từ cây dừa cạn. Tạo được cây dừa cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng alkaloid được cải thiện. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu thu thập thông tin về gen CrDAT, thiết kế cặp mồi PCR nhân bản gen CrDAT, khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen CrDAT. 3.2. Thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa gen CrDAT và đánh giá hoạt động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá. 3.3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium tumafaciens ở cây dừa cạn. 3.4. Nghiên cứu chuyển gen CrDAT vào dừa cạn, phân tích cây chuyển gen và đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển CrDAT ở cây dừa cạn. 4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân lập, tách dòng phân tử đến thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện gen CrDAT ở cây thuốc lá và cây dừa cạn, cụ thể là: 1) Đã phân lập được gen CrDAT từ mRNA của cây dừa cạn, gen CrDAT (cDNA) có kích thước 1320 bp, mã hóa 439 amino acid. 2) Xây dựng được quy trình tái sinh, quy trình chuyển gen thông qua A.tumefaciens và tạo được 4 dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT ở thế hệ T1 (T1-1; T1-3; T1-6; T1-7) có hàm lượng alkaloid tổng số tăng từ 3,16 lần đến 15,57 lần so với đối chứng không chuyển gen. 3) Protein tái tổ hợp rCrDAT được biểu hiện trên cây thuốc lá, cây dừa cạn chuyển gen và kết quả được kiểm chứng bằng Western blot và ELISA. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Về mặt khoa học Kết quả nghiên cứu trong luận án góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn màu hoa hồng tím và màu hoa trắng thu thập tại Thái Nguyên. Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ thuật tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid nhằm nâng cao hàm lượng alkaloid của cây dừa cạn. Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học cùng với 2 trình tự gen công bố trên Ngân hàng gen quốc tế là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy sinh học và công nghệ sinh học. Về mặt thực tiễn Các trình tự gen CrDAT được phân lập, cấu trúc vector chuyển gen, các dòng cây chuyển gen góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen để cải thiện hàm lượng alkaloid trong cây dược liệu nói chung và cây dừa cạn nói riêng. Kết quả nghiên cứu đã mở ra triển vọng ứng dụng kỹ thuật biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme vào việc nâng cao hàm lượng dược chất trong cây dược liệu. 6. Cấu trúc luận án: Luận án có 120 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được chia thành các chương, phần: Mở đầu (03 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (21 trang), Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (21 trang); Chương 3: Kết quả và thảo luận (49 trang); Kết luận và đề nghị (01 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang). Phụ lục (4 trang). Luận án có 20 bảng, 31 hình và tham khảo 121 tài liệu. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo 22 tài liệu tiếng Việt; 99 tài liệu tiếng Anh để tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Alkaloid ở cây dừa cạn, (2) Sinh tổng hợp alkaloid và hoạt động của DAT ở cây dừa cạn, ( 3) Nghiên cứu cải thiện hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn. Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có dược tính mạnh. Trong lĩnh vực y học, alkaloid cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo. Theo Đỗ Tất Lợi (1977), cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don.) hay hải đằng, dương giác, bông dừa, trường xuân hoa là một loài thực vật trong chi Catharanthus thuộc họ La bố ma (Apocynaceae). Dừa cạn là cây bản địa và đặc hữu của Madagascar. Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang dại, phân bố khắp nơi trong nước. Dừa cạn là nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại alkaloid terpenoid indole được tách chiết từ ba giống, đó là roseus với hoa màu hồng tím, albus với hoa màu trắng vàng và ocellatus với hoa màu trắng đỏ, trong đó hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristine và vinblastine cao nhất. Trong cây dừa cạn có khoảng 130 loại alkaloid, trong đó vinblastine và vincristine là hai hợp chất quan trọng nhất. Alkaloid có nhân indol được tìm thấy trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất trong lá và rễ. Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37% - 1,15%, thân 0,40%, rễ chính 0,7% - 2,4%, rễ phụ 0,9% - 3,7%, hoa 0,14% - 0,84%, vỏ quả 1,14%, hạt 0,18%. Trong khoảng 130 loại alkaloid đã được chiết từ cây dừa cạn, người ta đặc biệt chú ý 20 nhóm alkaloid dimeric là những nhóm có hoạt tính chống ung  thư bao gồm vincristine và vinblastine. DAT là enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng cuối cùng trong chuỗi tổng hợp vindoline từ deacetylvindoline ở cây dừa cạn. Theo St-Pierre và cs (1998) protein DAT có khối lượng phân tử là 51 kDa, gồm 9 chuỗi polypeptid. Gen DAT ở cây dừa cạn mã hóa cho enzyme acetyl CoA: deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) tham gia vào bước cuối cùng trong quá trình sinh tổng hợp vindoline. Gen DAT có kích thước 1320bp, gồm 439 amino acid, tham gia xúc tác chuỗi phản ứng cuối cùng trong quá trình tổng hợp vindoline. Để cải thiện hàm lượng vinblastine và vincristine, các hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, kỹ thuật chuyển gen đã được đề xuất. Nhiều nghiên cứu theo hướng tăng sinh khối như việc thu nhận huyền phù tế bào nuôi cấy, nuối cây mô tế bào thực vật, nuôi cấy tạo dòng rễ tơ để làm tăng hàm lượng alkaloid, đặc biệt là vinblastine và vincristine. Trong những năm gần đây, ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tăng hàm lượng alkaloid trong cây dừa cạn được quan tâm nghiên cứu. Nghiên cứu tạo dòng rễ tơ chuyển gen ở cây dừa cạn nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogens của Mohsen Zargar và cs (2010) cho thấy các dòng cây dừa cạn chuyển gen có hàm lượng alkaloid tăng đáng kể so với các cây không chuyển gen. Kỹ thuật biểu hiện mạnh một gen mã hóa enzyme chìa khóa trong chuỗi phản ứng tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn chuyển gen còn ít được tập trung nghiên cứu . Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Hạt của giống dừa cạn màu hoa hồng tím và màu hoa trắng thu thập tại tỉnh Thái Nguyên. Giống thuốc lá Nicotinana tabacum K326 có nguồn gốc từ Viện Kinh tế kỹ thuật thuốc lá, do Phòng tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học cung cấp. Các chủng vi khuẩn E. Coli (DH5α), chủng A. tumefaciens CV58 do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp. 2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được mua từ những hãng nổi tiếng trên thế giới như hãng Fermentas, Bio-Neer, Invitrogen, như Trizol Reagents, kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis, .. Các thí nghiệm được thực hiện trên các trang thiết bị hiện đại của Phòng công nghệ gen, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên và Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng và Phòng công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Luận án được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại&Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các phương pháp nghiên cứu chia thành 4 nhóm chính: (1) nhóm phương pháp sinh học phân tử, (2) nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật, (3) nhóm phương pháp tạo cây chuyển gen, (4) nhóm phương pháp phân tích cây chuyển gen. Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ tổng quát mô tả ở hình 2.1. Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.3.1. Các phương pháp sinh học phân tử Phân lập gen CrDAT bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế DAT-NcoI-F/DAT-NotI-R. RNA tổng số được tách chiết bằng Trizol Reagent Kit. cDNA được tổng hợp theo quy trình của nhà sản xuất. Tách dòng và giải trình tự gen qua các bước: i) Tinh sạch sản phẩm PCR, ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT; iii) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α; iv) Chọn dòng khuẩn lạc bằng colony PCR; v) Tách chiết plasmid và cắt kiểm tra bằng BamHI; vi) Xác định và phân tích trình tự nucleotide. Kết quả nghiên cứu về các trình tự gen, amino acid được xử lý bằng phần mềm BioEdit, 2.3.2. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT Vector chuyển gen mang gen CrDAT được thiết kế theo hai bước cơ bản (1) Thiết kế cấu trúc độc lập mang gen chuyển CrDAT; (2) Gắn cấu trúc chứa gen CrDAT vào vector chuyển gen thực vật pBI121 (Hình 2.2). Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrDAT 2.3.3. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào cây thuốc lá: Phương pháp chuyển cấu trúc chứa gen CrDAT vào cây thuốc lá trong môi trường tái sinh in vitro được thực hiện theo Topping (1998). 2.3.4. Tái sinh và chuyển gen gus ở cây dừa cạn: Hạt dừa cạn rửa sạch dưới vòi nước, hạt được đưa vào trong box cấy. Sau khi khử trùng, cấy hạt lên môi trường MS (Murashige, Skoog 1962). Sử dụng gen chỉ thị gus để xây dựng quy trình chuyển gen cho cây dừa cạn. Thông qua chuyển gen gus, mật độ tế bào A. tumefaciens, nồng độ acetosyringone, thời gian nhiễm khuẩn và nồng độ kanamycin được tối ưu làm cơ sở cho chuyển gen đích vào cây dừa cạn. 2.3.5. Chuyển gen CrDAT vào cây dừa cạn thông qua A.tumefaciens Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển CrDAT vào cây thuốc lá N. tabacum K326 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và tạo cây thuốc lá chuyển gen qua hệ thống tái sinh phù hợp theo mô tả của Topping - 1998. Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển CrDAT vào cây dừa cạn hoa hồng tím nhờ vi khuẩn A. tumefaciens. Quy trình tạo cây dừa cạn chuyển gen được thực hiện dựa trên kết quả nghiên cứu chuyển gen gus. 2.3.6. Phương pháp phân tích cây chuyển gen Xác định sự có mặt và sự hợp nhất gen chuyển CrDAT vào hệ gen tế bào chủ của cây thuốc lá và cây dừa cạn chuyển gen bằng PCR và Sothern blot. Các cây chuyển gen dương tính với kết quả lai Southern được sử dụng cho phân tích sự biểu hiện protein tái tổ hợp CrDAT bằng Western blot. Định lượng protein tái tổ hợp rCrDAT được tiến hành theo phương pháp của Sun và cs (2006). Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN CrDAT PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN 3.1.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen CrDAT Kết quả khuếch đại và tách dòng cDNA RNA tổng số được tách chiết từ lá cây dừa cạn TN1, TN2 và cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số bằng phản ứng phiên mã ngược. Phản ứng PCR khuếch đại cDNA của gen CrDAT với cặp mồi đã thiết kế DAT-NcoI-F/DAT-NotI-R. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1% cùng với thang DNA 1 kb được thể hiện ở hình 3.1. Kết quả thu được ở hình 3.1A cho thấy, mẫu dừa cạn TN1 và TN2 cho sản phẩm PCR với một băng DNA với kích thước ước tính khoảng 1,3 kb. Các băng đều sáng, rõ nét và không có sản phẩm phụ. Kích thước này phù hợp theo tính toán lý thuyết và tương ứng với kích thước của đoạn mã hoá của gen DAT ở dừa cạn mang mã số AF053307 trên Ngân hàng gen. Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen CrDAT. A: Sản phẩm PCR nhân gen CrDAT (cDNA) từ hai mẫu dừa cạn TN1 và TN2. M: thang DNA 1 kb; 1,2: gen CrDAT (cDNA) khuếch đại từ mẫu TN1; 3,4: gen CrDAT (cDNA) khuếch đại từ mẫu TN2). B: Sản phẩm colony-PCR từ 12 dòng khuẩn lạc. 1-6: đoạn gen DAT (cDNA) khuếch đại từ khuẩn lạc của mẫu TN2; 7-12: đoạn gen DAT (cDNA) khuếch đại từ khuẩn lạc của mẫu TN1. M: thang DNA 1 kb. Xác định trình tự gen CrDAT Kết quả giải trình tự nucleotide của gen CrDAT (cDNA) phân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1 (hoa hồng tím) và TN2 (hoa trắng) cho thấy gen CrDAT có kích thước 1320 bp. Gen CrDAT phân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1 và TN2 có độ tương đồng so với trình tự gen DAT mang mã số AF053307 là 99,5% và 99% là tỷ lệ tương đồng của trình tự gen CrDAT giữa hai mẫu TN1 và TN2. Như vậy có thể kết luận rằng, gen CrDAT phân lập từ mẫu dừa cạn TN1 và TN2 đã được tách dòng thành công. Trình tự nucleoitde của gen CrDAT phân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1, TN2 đã được đăng ký trên Ngân hàng Gen quốc tế với mã số LN809930 và LN809931. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của DAT ở hai mẫu dừa cạn TN1, TN2 và DAT mang mã số AAC99311 trên Ngân hàng Gen (protein suy diễn từ gen DAT mang mã số AF053307) cho thấy protein DAT gồm 439 amino acid và có độ tương đồng cao so với protein mang mã số AAC99311 trên Ngân hàng gen (99,3% và 99,4%); còn trình tự amino acid suy diễn của hai mẫu TN1 và TN2 tương đồng là 97,7%. 3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN CrDAT TRÊN CÂY THUỐC LÁ 3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT Trình tự nucleotid gen CrDAT màu hoa hồng tím được sử dụng để thiết kế vector chuyển gen thực vật thông qua A. tumefaciens. Sử dụng enzyme giới hạn HindIII xử lý vector pRTRA7/3-CrDAT để thu nhận cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-KDEL-polyA. Gắn cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-KDEL-polyA vào vector chuyển gen pBI121 bằng DNA T4 ligase tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen chuyển CrDAT (pBI121-CrDAT. Plasmid tái tổ hợp pBI121-35S-DAT-cmyc được tách chiết, kiểm tra và biến nạp vào A. tumefaciens. Cấu trúc vector chuyển gen pBI121 – CrDAT bao gồm các thành phần chính được thể hiện ở hình 3.8A. Hình 3.8. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT và kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR. A: Cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT. LB: bờ trái của T-DNA; RB: bờ phải của T-DNA; nptII: gen kháng kanamycin; 35S: promoter CaMV35S. B: Kết quả kiểm tra sản phẩm colony-PCR các dòng A. tumefaciens chứa vector chuyển gen pBI121-DAT. Các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp chứa vector chuyển gen pBI121-35S-DAT-cmyc được kiểm tra bằng colony-PCR và kết quả phân tích ngẫu nhiên 10 dòng khuẩn lạc thu được 8 dòng dương tính với colony-PCR (Hình 3.8B). Các dòng A.tumefaciens tái tổ hợp chứa vector chuyển gen pBI121-CrDAT được lưu giữ và sử dụng cho các thí nghiệm chuyển gen tiếp theo. 3.2.2. Phân tích biểu hiện gen CrDAT trên cây thuốc lá chuyển gen Biến nạp cấu trúc chứa gen CrDAT và tạo cây thuốc lá chuyển gen nhờ A.tumefacinens Các mảnh lá cây thuốc lá giống K326 có kích thước khoảng 1cm2 được sử dụng làm vật liệu nhận gen. Thí nghiệm chuyển gen CrDAT vào thuốc lá được trình bày ở hình 3.9. Hình 3.9. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp, chọn lọc và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen. A: Mảnh lá sau khi rửa khuẩn được cấy trên môi trường chọn lọc; B, C: Tái sinh đa chồi; D: Kéo dài chồi; E: Tạo rễ; G: Ra cây trong bầu ở điều kiện nhà lưới. Bảng 3.3 cho thấy, sau 3 lần biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào các mảnh thuốc lá, kết quả có 235/ 249 mảnh lá sống sót sau 4 tuần, phát sinh 205 chồi và thu được 186 cây con in vitro sống sót trên môi trường MS có bổ sung kháng sinh. Số cây ra bầu đất là 113 cây và có 65 cây trồng tại nhà lưới có biểu hiện xanh tốt, mập mạp. Bảng 3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào mảnh lá thuốc lá Đối chứng và thí nghiệm Tổng số mảnh lá Số mảnh lá sống sót sau 4 tuần Số mảnh lá cảm ứng tạo chồi Số cây ra rễ trên môi trường chọn lọc Số cây ra bầu Số cây trồng trong nhà lưới ĐC0* 30 0 0 0 0 0 ĐC1* 30 30 40 25 15 15 Thí nghiệm Lần 1 82 79 68 55 34 22 Lần 2 90 86 74 61 44 25 Lần 3 77 70 63 52 35 18 Tổng 249 235 205 186 113 65 Phân tích sự có mặt và sự hợp nhất của gen chuyển CrDAT trong hệ gen cây thuốc lá chuyển gen Các dòng cây thuốc lá chuyển gen T0 sau khi trồng trong nhà lưới được 4 tuần thì tiến hành thu lá để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi CrDATF -Xba/CrDATR-Sac để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển CrDAT (Hình 3.10). Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen DAT trong các cây thuốc lá chuyển gen và đối chứng. Từ làn 1 đến làn 19: các dòng cây thuốc lá chuyển gen; M: thang DNA 1 kb; wt: cây thuốc lá không chuyển gen. Hình 3.10 cho thấy, trong 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen thì có 12 dòng cây thuốc lá chuyển gen dương tính với phản ứng PCR là các dòng T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15, T0-16, T0-17, T0-19 (các dòng ở làn điện di số 1, 2, 4, 5, 6, 8, 12, 13, 15, 16, 17, 19). Để khẳng định gen chuyển CrDAT đã được hợp nhất vào hệ gen cây thuốc lá, DNA của 9 cây thuốc lá chuyển gen (T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15) cho kết quả PCR dương tính được lựa chọn ngẫu nhiên để sử dụng phân tích bằng Southern blot. Hình 3.11 cho thấy tất cả 9 dòng thuốc lá chuyển gen cho kết quả lai Southern (T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15), trong đó hai dòng T0-5 và T0-15 cho 2 băng DNA (2 bản copy), bảy dòng còn lại đều có một băng DNA ở các kích thước khác nhau. Bảy dòng thuốc lá chuyển gen (T0-1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13) cho kết quả lai Southern có một bản copy được sử dụng phân tích Western blot. Hình 3.11. Kết quả phân tích Southern blot các mẫu thuốc lá chuyển gen CrDAT. M: Marker 1kbplus, (+) Plasmid pBI121- CrDAT cắt bởi SacI, 1-15: các cây chuyển gen T0 (1: T0-1 ; 2 : T0-2 ; 4 : T0-4 ; 5 : T0-5 ; 6 : T0-6 ; 8 : T0-8 ; 12 : T0-12 ; 13 : T0-13; 15 : T0-15), wt: cây đối chứng không chuyển gen. Phân tích sự biểu hiện protein tái tổ hợp CrDAT trên cây thuốc lá chuyển gen Protein tổng số của 7 dòng thuốc lá chuyển gen T0-1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13 xuất hiện 1 băng DNA từ kết quả lai Southern được phân tích điện di SDS-PAGE và chuyển các phân đoạn protein lên màng nitrocellulose và thực hiện phản ứng lai Western. Kết quả phân tích PCR, Southern blot và Western blot các dòng cây thuốc lá chuyển gen CrDAT ở thế hệ T0 đã chứng minh gen chuyển CrDAT đã hợp nhất vào hệ gen của cây thuốc lá và gen chuyển CrDAT đã hoạt động phiên mã và dịch mã cho kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp CrDAT. Hình 3.12. Kết quả phân tích western blot các dòng cây thuốc lá chuyển gen CrDAT. M: thang protein chuẩn ; (+) đối chứng dương ; T0-1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13: các cây chuyển gen; WT: cây đối chứng không chuyển gen. 3.3. NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN Ở CÂY DỪA CẠN 3.3.1. Nuôi cấy in vitro cây dừa cạn Kết quả nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây dừa cạn cho nhận xét là khử trùng hạt dừa cạn bằng cồn 70% trong 1 phút và dung dịch javen 60% trong 15 phút cho hiệu quả cao nhất. Môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l; agar 8,5g/l; BAP 1,0mg/l và IBA 0,6mg/l; nước dừa 100ml/l; pH = 5,8 thích hợp cho sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên. Môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l; agar 8,5g/l; BAP 0,5mg/l và IBA 0,4mg/l; nước dừa 100ml/l; pH = 5,8, thích hợp cho sự phát sinh chồi và sinh trưởng chồi từ nách lá mầm. Gây tổn thương bằng cách chẻ dọc hoặc dùng mũi dao châm vào đoạn thân mang mắt chồi bên đều cho hiệu quả đa chồi cao. Môi trường tối ưu tạo đa chồi là cơ sở cho những thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu chuyển gen ở cây dừa cạn. 3.3.2. Xây dựng quy trình chuyển gen thông qua gen chuyển gus Tiến hành biến nạp gen gus vào dừa cạn thông qua A.tumefaciens. Các mẫu biến nạp sau khi nhiễm khuẩn được nuôi trong tối 3 ngày và nhuộm X-gluc để xác định hiệu suất chuyển gen gus (Hình 3.16). Kết quả chọn lọc sau 2 tuần thu được 84 mẫu tạo chồi (đạt 23,3 %), sau 4 tuần số chồi sống sót là 34 mẫu (đạt 9,45%), trong đó có 21 chồi ra rễ. Khi đưa cây ra môi trường thu được 15 cây sống sót. Lấy ngẫu nhiên lá và rễ của 15 cây đem nhuộm X-gluc để kiểm tra biểu hiện của gen gus. Tất cả 15 cây này đều cho kết quả dương tính khi xuất hiện màu xanh chàm đặc trưng Hình 3.16. Kết quả biểu hiện tạm thời gen gus. A: Lá mầm chuyển gen; B: Đoạn thân chuyển gen; C: Lá mầm không chuyển gen; D: Đoạn thân không chuyển gen Hình 3.17. Kết quả biểu hiện gen gus ở cây dừa cạn chuyển gen. A: Lá cây chuyển gen gus; B: Rễ cây chuyển gen gus; C: Lá cây không chuyển gen; D: Rễ cây không chuyển gen. Như vậy thông qua chuyển gen gus, quá trình chuyển gen vào cây dừa cạn được tối ưu là (i) Vật liệu chuyển gen là lá mầm; (ii) Nồng độ vi khuẩn OD600nm= 0,8; (iii) Nồng độ acetosyringone là 100µM; (iv) Thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút; (v) Nồng độ kanamycin để chọn lọc chồi chuyển gen là 50 mg/l. Quy trình chuyển gen gus vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được tóm tắt ở hình 3.18. Hình 3.18. Sơ đồ quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. 3. 4. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CrDAT VÀ TẠO CÂY DỪA CẠN CHUYỂN GEN 3.4.1. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT và tái sinh cây dừa cạn chuyển gen Lá mầm thu từ hạt dừa cạn nảy mầm được sử dụng làm mẫu biến nạp. Cấu trúc mang gen CrDAT được chuyển vào cây dừa cạn thông qua A.tumefaciens bằng lây nhiễm qua nách lá mầm (Hình 3.19). Kết quả biến nạp 390 mẫu, qua các giai đoạn tái sinh và sinh trưởng chồi, chọn lọc bằng kháng sinh tạo được 19 cây được chuyển gen CrDAT trong điều kiện nhà lưới, chiếm 4,87% (Bảng 3.13). Hình 3.19. Hình ảnh biến nạp và tái sinh cây dừa cạn chuyển gen. A: Hạt dừa cạn; B: Hạt nảy mầm trên môi trường MS; C: Lá mầm dừa cạn; D: Nhiễm khuẩn trong 30 phút; E. Đồng nuôi cấy trong tối; F: Cảm ứng tạo đa chồi; G: Tái sinh đa chồi sau 2 tuần ; H: Tái sinh đa chồi sau 4 tuần; I: Chọn lọc và kéo dài chồi; K, L: Ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh; M: Cây trồng trên giá thể. Các cây dừa cạn chuyển gen ra bầu có lá xanh tốt được đưa trồng ở vườn thực nghiệm, kết quả trong 19 cây chuyển gen T0 đem trồng trong môi trường tự nhiên chỉ có 7 cây sinh trưởng, phát triển bình thường (36,84%). Bảng 3.13. Kết quả biến nạp cấu trúc CrDAT vào cây dừa cạn hoa hồng tím Đối chứng và thí nghiệm Tổng số mẫu Số mẫu tạo chồi Số chồi kéo dài Số chồi ra rễ Số cây ra bầu Số cây sống và trồng tại vườn thực nghiệm ĐC0* 30 0 0 0 0 0 ĐC1* 30 25 20 13 12 9 Thí nghiệm Lần 1 80 55 36 28 15 5 Lần 2 120 86 65 45 20 6 Lần 3 180 92 63 47 35 8 Tổng 390 233 164 120 70 19 3.4.2. Xác định sự có mặt và hợp nhất của gen chuyển CrDAT trong hệ gen của các cây dừa cạn được chuyển gen ở thế hệ T0 Kết quả kiểm tra các cây dừa cạn được chuyển gen bằng PCR Cây dừa cạn chuyển gen được trồng tại vườn thực nghiệm, chọn 7 cây sinh trưởng, phát triển tốt để xác định sự có mặt của gen chuyển CrDAT bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu XbaI-DAT-F/cmyc-KDEL-SacI-R (Hình 3.20). Kết quả cho thấy cả 7 dòng cây dừa cạn kiểm tra đều có băng DNA có kích thước ứng với kích thước của gen chuyển CrDAT là 1383 bp. Gen CrDAT nội tại của cây dừa cạn có kích thước 1320 bp, không có đuôi cmyc và KDEL; gen chuyển CrDAT chứa điểm cắt của enzyme giới hạn XbaI và SacI, đuôi cmyc và KDEL có kích thước là 1383 bp. Điểm phân biệt giữa gen nội tại CrDAT và gen chuyển CrDAT ở kết quả PCR nhân bản đoạn gen DAT với cặp mồi XbaI-DAT-F/cmyc-KDEL-SacI-R và PCR chỉ nhân bản được cấu trúc CrDAT-cmyc-KDEL. Hình 3.20. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen CrDAT từ các cây dừa cạn chuyển gen. M: thang DNA chuẩn 1 kb; (+) đối chứng dương (+) là plasmid pBT-CrDAT; (-) Đối chứng âm (-) kết quả PCR nhân gen CrDAT từ cây dừa cạn không chuyển gen; 1-7 các dòng cây dừa cạn chuyển gen CrDAT. Bảy cây dừa cạn chuyển gen dương tính với PCR và cây đối chứng không chuyển gen đã được sử dụng để phân tích Southern blot. DNA tổng số của các cây dừa cạn chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen, được xử lý bằng enzyme giới hạn SacI. Kết quả ở hình 3.21 cho thấy băng DNA xuất hiện ở các dòng chuyển gen T0-1, T0-2, T0-3, T0-4, T0-6 và T0-7; dòng dừa cạn chuyển gen T0-5 và cây đối chứng không chuyển gen không xuất hiện băng DNA. Dòng T0-2 và T0-4 xuất hiện 2 băng DNA (2 bản copy), các dòng còn lại T0-1, T0-3, T0-6, T0-7 có một bản copy. Hiệu suất chuyển gen tính đến thời điểm phân tích lai Southern là 1,54% (6/390). Các dòng chuyển gen cho kết quả lai Southern tiếp tục được đánh giá sự sinh trưởng và phát triển thu hạt phục vụ các thí nghiệm phân tích cây chuyển gen ở thế hệ gen T1. 3.4.3. Phân tích biểu hiện protein DAT tái tổ hợp ở thế hệ T1 Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của 6 cây dừa cạn ở thế hệ T0 (T0-1, T0-2, T0-3, T0-4, T0-6, T0-7) cho thấy có 4 cây ra hoa và kết quả (T0-1, T0-3, T0-6, T0-7) được thế hệ T1, còn 2 cây ra hoa nhưng không cho quả (T0-2, T0-4). Thu quả và hạt của 4 dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 (T1-1, T1-3, T1-6, T1-7) đem gieo trồng, thu lá sử dụng cho phân tích biểu hiện và đánh giá hoạt động của protein tái tổ hợp CrDAT của các dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1. Hình 3.21. Kết quả phân tích Southern blot DNA tổng số các cây dừa cạn chuyển gen CrDAT với đoạn dò nptII được đánh dấu bằng biotin. M: thang DNA chuẩn 1 kb, (+): vector pBI121-CrDAT; 1-7: các dòng dừa cạn chuyển gen dương tính với PCR (T0-1; T0-2; T0-3; T0-4; T0-5; T0-6; T0-7); (-): cây dừa cạn không chuyển gen, Hình 3.22. Kết quả phân tích Western blot từ 4 dòng dừa cạn chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen. (+): protein đối chứng dương; M: thang protein chuẩn; T1-1, T1-3, T1-6, T1-7: protein của bốn cây dừa cạn chuyển gen dương tính với southern blot; (-) protein cây dừa cạn đối chứng không chuyển gen. Kết quả phân tích Western blot ở hình 3.22 cho thấy, trên màng lai nitrocellulose xuất hiện một băng màu ở vị trí kích thước khoảng 51 kDa ở cả 4 dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1, tương ứng với kích thước phân tử của protein CrDAT tái tổ hợp và đã cho kết quả biểu hiện ở cây thuốc lá chuyển gen. Điều đó chứng tỏ rằng gen chuyển CrDAT ở bốn dòng dừa cạn chuyển gen T1 đã biểu hiện dịch mã cho protein CrDAT tái tổ hợp. Hiệu suất chuyển gen đến giai đoạn dịch mã là 1,02% (4/390). Hình 3.23 biểu thị kết quả phân tích hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT từ 4 dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật ELISA cho thấy 4 dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng protein tái tổ hợp dao động từ 2,86 µg/mg đến 5,12 µg/mg, dòng dừa cạn chuyển gen T1-1 có hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT cao nhất (5,12 µg/mg) và dòng T1-3 có hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT thấp nhất (2,86 µg/mg) (Hình 3.24). Hình 3.23. Kết quả phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT của 4 dòng dừa cạn chuyển gen T1 (T1-1, T1-3, T1-6, T1-7 ) và cây đối chứng không chuyển gen (WT). Tuy nhiên, bốn dòng cây dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 có sự sinh trưởng, phát triển bình thường, không có sự khác biệt về hình thái giữa cây chuyển gen và cây không chuyển gen (Hình 3.24). Hình 3.24. Các dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 và cây đối chứng không chuyển gen. WT: cây dừa cạn đối chứng không chuyển gen; T1-1; T1-3; T1-6; T1-7: các dòng dừa cạn chuyển gen T1. Tiến hành phân tích hàm lượng alkaloid tổng số của 4 dòng cây dừa cạn chuyển gen T1-1; T1-3; T1-6; T1-7 và cây đối chứng không chuyển gen (WT) kết quả thu được được thể hiện ở hình 3.25. Hình 3.25. Hàm lượng alkaloid tổng số (g/100g khối lượng khô) của 4 dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 và cây đối chứng không chuyển gen. WT: dừa cạn không chuyển gen; T1-1; T1-3; T1-6; T1-7: các dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT ở thế hệ T1. 3.4.4. Thảo luận về kết quả sự tăng cường biểu hiện gen CrDAT ở cây dừa cạn chuyển gen Dừa cạn (Catharanthus roseus) cây thuốc có giá trị dược học, sản sinh ra nhiều TIA như vindoline, ajamlicine, serpentine, catharanthine, vinblastine và vincristine và nhiều hợp chất thứ cấp khác. Vinblastine và vincristine là những chất chuyển hóa thứ cấp từ cây dừa cạn, có giá trị dược học rất cao được sử dụng trong điều trị ung thư, tuy nhiên các hợp chất này được tổng hợp trong cây dừa cạn rất ít. Để nâng cao hiệu suất tổng hợp các alkaloids trong cây dừa cạn, nhiều nghiên cứu tiếp cận theo hướng tăng sinh khối bằng nuôi cấy mô, tế bào hoặc nuối cấy rễ tơ. Ở cây dừa cạn, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật gen nhằm tăng hàm lượng alakloid được quan tâm bởi DAT tham gia ở khâu cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp vindoline. DAT là enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng cuối cùng trong quá trình sinh tổng hợp vindoline ở cây dừa cạn và bằng sự biểu hiện mạnh gen CrDAT làm tăng hàm lượng protein DAT và dẫn đến hiệu quả hoạt động của enzyme DAT được tăng cường. Nghiên cứu của chúng tôi chuyển gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn hoa hồng tím vào chính cây dừa cạn qua nách lá mầm nhờ A.tumefaciens nhằm chứng minh sự tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme chìa khóa DAT sẽ cải thiện được hàm lượng alakaloid ở cây dừa cạn. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn đã được tách dòng phân tử và xác định trình tự nucleotide. Gen CrDAT (cDNA) có kích thước 1320 bp, mã hóa cho 439 amino acid. 1.2. Vector chuyển gen thực vật pBI121-CrDAT đã thiết kế được chuyển vào hệ gen của cây thuốc lá và cây dừa cạn chuyển gen đã biểu hiện được protein tái tổ hợp CrDAT có kích thước khoảng 51 kDa. 1.3. Môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 10 g/l; BAP 1,0 mg/l và IBA 0,6 mg/l; nước dừa 100 ml/l; pH = 5,8 thích hợp cho sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên. Môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 10 g/l; BAP 0,5 mg/l và IBA 0,4 mg/l; nước dừa 100 ml/l; pH = 5,8, thích hợp cho sự phát sinh chồi và sinh trưởng chồi từ nách lá mầm. 1.4. Hiệu quả chuyển gen CrDAT vào cây dừa cạn qua nách lá mầm được tối ưu ở mật độ A.tumefaciens là OD600nm= 0,8; AS 100 µM và thời gian nhiễm khuẩn 30 phút; chọn lọc bằng kháng sinh Km thích hợp ở nồng độ 50 mg/l. 1.5. Chuyển thành công cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc vào các dòng cây dừa cạn với hiệu suất chuyển gen là 1,02%. Protein tái tổ hợp CrDAT được biểu hiện ở 4 dòng dừa cạn T1 chuyển gen có khối lượng phân tử khoảng 51 kDa, hàm lượng dao động từ 2,86 µg/mg đến 5,12 µg/mg. Các dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng alkaloid tổng số tăng so với dừa cạn đối chứng không chuyển gen từ 3,16 - 15,57 (lần) 2. Đề nghị Tiếp tục phân tích và đánh giá bốn dòng dừa cạn chuyển gen (T1-1, T1-3, T1-6, T1-7) ở các thế hệ T2, T3,... nhằm chọn được dòng dừa cạn chuyển gen có hàm lượng alkaloid cao và ổn định.