Tóm tắt Luận án Nghiên cứu tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt

24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Khả năng kháng mọt của 8 giống đậu xanh được đánh giá thông qua các chỉ tiêu như khối lượng hạt hao hụt, tỷ lệ nhiễm mọt, hệ số gia tăng quần thể. Giống đậu xanh Tằm TH có khả năng kháng mọt tốt nhất, chỉ số mẫn cảm với mọt C. chinensis là 634,63; giống đậu xanh ĐX22 có khả năng kháng mọt kém nhất, chỉ số mẫn cảm với mọt là 1058,72 và cao hơn ở giống Tằm TH 1,67 lần. 1.2. Gen VrPDF1 phân lập từ cây đậu xanh gồm 356 bp, có cấu trúc phân đoạn, gồm hai exon và một intron. Đoạn mã hóa của gen VrPDF1 có kích thước 228 bp, mã hóa 75 amino acid. 1.3. Vector chuyển gen thực vật pBetaPhaso-VrPDF1 biểu hiện ở hạt đã được thiết kế thành công và hoạt động tốt trên cây thuốc lá. Gen chuyển VrPDF1 đã hợp nhất vào hệ gen của cây thuốc lá chuyển gen và được di truyền từ thế hệ T0 sang thế hệ T1. Protein tái tổ hợp VrPDF1 có kích thước khoảng 10 kDa được biểu hiện ở hạt thuốc lá và có khả năng ức chế -amylase của ruột ấu trùng mọt. 1.4. Biến nạp thành công cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 và tạo được dòng cây đậu xanh chuyển gen ở thế hệ T1 từ giống đậu xanh ĐX22. Xác định được protein tái tổ hợp VrPDF1 biểu hiện ở hai dòng cây đậu xanh chuyển gen thế hệ T1 (DX1-3 và DX1-7) có kích thước khoảng 10 kDa. Hiệu suất chuyển gen ở giống đậu xanh ĐX22 đạt 0,32%. Protein tái tổ hợp VrPDF1 biểu hiện ức chế -amylase của ấu trùng mọt, hiệu suất ức chế -amylase ở hai dòng đậu xanh chuyển gen DX1-3 và DX1-7 thế hệ T1 tăng 166,40 % và 178,19% so với cây không chuyển gen. 2. Đề nghị Tiếp tục theo dõi, đánh giá hai dòng đậu xanh DX1-3 và DX1-7 ở các thế hệ tiếp theo, thử nghiệm khả năng kháng mọt thông qua lây nhiễm nhân tạo nhằm chọn tạo dòng đậu xanh chuyển gen ổn định về khả năng kháng mọt cao. 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu xanh là một trong ba cây đậu đỗ chính trong nhóm các cây đậu ăn hạt, đứng sau đậu tương và lạc. Hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm. Hạt đậu xanh vừa cung cấp protein cho con người, vừa có giá trị trong y học, và cũng là cây có giá trị trong cải tạo đất. Việt Nam là quốc gia có điều kiện tốt để phát triển sản xuất nông nghiệp, tuy nhiên cũng là yếu tố thuận lợi cho sâu hại phát sinh, phát triển gây tổn thất nghiêm trọng tới năng suất và phẩm chất của nông sản. Theo ước tính, tổn thất sau thu hoạch khoảng từ 10% - 30% sản lượng cây trồng nông nghiệp. Điều này có nghĩa là khoảng 10% - 30% lượng lương thực không bao giờ được sử dụng và cũng là tỷ lệ tổn thất của công sức và tài chính đầu tư trong sản xuất nông nghiệp. Do đó, việc đánh giá và hạn chế tổn thất sau thu hoạch là công tác rất có ý nghĩa trong việc đảm bảo lương thực trong điều kiện hạn chế diện tích trồng trọt và dân số đang gia tăng hiện nay. Đối với nhóm nông sản là hạt thì một trong những nguyên nhân chính gây tổn thất đến số lượng và chất lượng hạt là côn trùng mà chủ yếu là một số thuộc Bộ cánh cứng (thường gọi là mọt). Các loài mọt gây hại chủ yếu cho đậu đỗ là: mọt đậu xanh (Callosobruchus chinensis L.), mọt đậu đỏ (Callosobruchus maculatus F.), mọt đậu nành (Ancanthoscelides obtectus) Trong đó, mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis L. thuộc họ Bruchid, bộ Coleoptera là loài gây hại chủ yếu cho hạt đậu xanh. Sự tổn hại do mọt gây ra là rất lớn, do đó công tác phòng trừ mọt đậu nói chung và mọt đậu xanh nói riêng đang là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu. Hiện nay, đã có một số nghiên cứu bước đầu đánh giá về khả năng kháng mọt, kháng nấm, kháng virus trên một số loại cây trồng trong đó có đậu xanh. Theo các nghiên cứu đã công bố, đặc tính kháng mọt hại hạt của cây trồng rất phức tạp và liên quan đến hoạt động của protein defensin. Defensin thực vật là nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trưng bởi cấu trúc gấp cuộn ba chiều qua 8 cầu nối disulfide của các cystein. Defensin thực vật hoạt động mạnh sẽ tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến kênh trao đổi ion, tác động đến hoạt động của α-amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật Cơ chế gây độc của defensin đối với mọt đậu xanh là sự cản trở hoạt động phân giải tinh 2 bột của -amylase trong ruột mọt và ngăn chặn sự tiêu hoá tinh bột của mọt, ức chế sự sinh trưởng phát triển của mọt. Defensin trong hạt đậu xanh có hàm lượng thấp và khác nhau giữa các giống, vì thế để tăng hiệu quả ức chế α-amylase của ruột ấu trùng mọt, việc ứng dụng công nghệ gen nhằm tăng cường biểu hiện, nâng cao hàm lượng defensin trong hạt được quan tâm nghiên cứu. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi lựa chọn đề tài cho luận án là: “Nghiên cứu tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt”. 2. Mục tiêu nghiên cứu (i) Phân tích được đặc điểm của gen defensin 1 (VrPDF1) phân lập từ các giống đậu xanh Việt Nam có khả năng kháng mọt khác nhau. (ii) Biểu hiện được gen defensin 1 trên cây thuốc lá chuyển gen. (iii) Tạo được cây đậu xanh chuyển gen chứa gen liên quan đến tính kháng mọt Callosobruchus chinensis L. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng mọt của một số giống đậu xanh trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam. 3.2. Nghiên cứu thông tin, tách dòng và xác định trình tự gen VrPDF1 phân lập từ cây đậu xanh. Phân tích đặc điểm trình tự nucleotide, trình tự amino acid suy diễn của gen VrPDF1 phân lập từ giống đậu xanh có khả năng kháng mọt tốt nhất và giống đậu xanh kháng mọt kém nhất. 3.3. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen VrPDF1 và phân tích hoạt động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và T1. 3.4. Nghiên cứu chuyển cấu trúc chứa gen VrPDF1 và tạo cây đậu xanh chuyển gen. Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp rVrPDF1 ở cây đậu xanh chuyển gen ở thế hệ T1. 4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ đánh giá và phân nhóm các giống đậu xanh có khả năng kháng mọt khác nhau; phân lập, tách dòng gen VrPDF1 đến thiết kế vector chuyển gen, tạo cây chuyển gen và phân tích sự biểu hiện gen chuyển VrPDF1, cụ thể là: 1) Đã phân lập được gen VrPDF1 từ DNA hệ gen của hai giống đậu xanh có khả năng kháng mọt khác biệt nhau. Gen VrPDF1 có kích thước 356 bp gồm 23 DX1-3, DX1-7 ở bảng 3.10 cho thấy hiệu suất hoạt động của -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ cây chuyển gen giảm so với dịch protein chiết từ cây không chuyển gen, chỉ bằng 33,60% (DX1-3) và 21,81% (DX1-7). Như vậy có thể thấy trong nghiên cứu này, protein tái tổ hợp rVrPDF1 của hai dòng đậu xanh chuyển gen T1 đã ức chế hoạt động - amylase của ấu trùng mọt đậu xanh. So với cây không chuyển gen, hiệu suất ức chế -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh của rVrPDF1 ở dòng đậu xanh chuyển gen DX1-3 tăng 166,40% và 178,19% ở dòng DX1-7 (Hình 3.24). Defensin ở hạt đậu xanh có khả năng ức chế -amylase của mọt đậu xanh. Gen VrPDF1 (gen nội tại) mã hóa protein defensin ở đậu xanh có kích thước 356 bp, gen chuyển VrPDF1 có kích thước 228 bp cùng hoạt động phiên mã và dịch mã tổng hợp protein defensin VrPDF1 và protein VrPDF1 đều ức chế hoạt động -amylase của ấu trùng mọt đậu xanh. Kết quả so sánh hiệu suất ức chế -amylase ở từ ấu trùng mọt đậu xanh của rVrPDF1 ở dòng đậu xanh chuyển gen DX1-3 tăng 166,40% và 178,19% ở dòng DX1-7 so với cây không chuyển gen đã chứng minh sự tăng cường biểu hiện defensin trong hạt bằng ứng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen là biện pháp nâng cao khả năng kháng mọt hại hạt của cây đậu xanh. 100 100 33,60 166,40 21,81 178,19 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0 180,0 200,0 Hiệu suất hoạt động của alpha- amylase của dòng cây chuyển gen giảm so với cây WT Hiệu suất ức chế alpha- amylase của dòng cây chuyển gen tăng so với cây WT % WT ĐX1-3 ĐX1-7 Hình 3.24. Biểu đồ so sánh hiệu suất hoạt động -amylase và hiệu suất ức chế -amylase của protein defensin trong hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ cây chuyển gen, cây không chuyển gen. 22 Phân tích định tính hoạt độ của -amylase từ ấu trùng mọt phân giải cơ chất tinh bột được thể hiện ở hình 3.23. Hình 3.23. Hình ảnh phân tích định tính khả năng ức chế α-amylase ấu trùng mọt đậu xanh của protein tái tổ hợp rVrDEF1 từ hạt cây đậu xanh chuyển gen ĐX22 thế hệ T1 và hạt cây đậu xanh ĐX22 đối chứng không chuyển gen. 3.3.5. Thảo luận kết quả tăng cường biểu hiện protein VrPDF1 ở cây đậu xanh chuyển gen Gen chuyển biểu hiện trong cây chuyển gen được kiểm tra dựa trên kết quả phân tích hoạt động phiên mã và dịch mã của gen chuyển bằng sử dụng các kỹ thuật RT-PCR, Real time RT-PCR, Western blot. Tương tự các phân tích biểu hiện gen của các nghiên cứu trước đây, trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi, protein tái tổ hợp VrPDF1 được biểu hiện ở cả cây mô hình và cây chuyển gen với kích thước khoảng 10 kDa. Khác với các nghiên cứu trên, trong phân tích protein tái tổ hợp ở cây chuyển gen chúng tôi sử dụng kỹ thuật ELISA để so sánh mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp giữa các dòng cây chuyển gen. Theo đó, kết quả phân tích ELISA ở 2 dòng đậu xanh chuyển gen DX1-3 và DX1-7 đã xác định được hàm lượng protein tái tổ hợp VrPDF1 ở dòng DX1-7 cao hơn dòng DX1-3 (Hình 3.22). Như vậy, theo hướng tiếp cận khả năng kháng mọt tương quan với hàm lượng protein defensin VrPDF1 thì kết quả phân ELISA ở trên có thể dự đoán ở thế hệ đậu xanh chuyển gen T1 dòng DX1-7 có khả năng kháng mọt cao hơn dòng DX1-3. Tuy nhiên, điều này cần được kiểm chứng bằng thực nghiệm phân tích hoạt động ức chế - amylase của protein tái tổ hợp VrPDF1 và so sánh khả năng kháng mọt giữa các dòng đậu xanh chuyển gen và giữa dòng chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen. Trong kết quả đánh giá hoạt động ức chế -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh của protein tái tổ hợp rVrPDF1 của hai dòng đậu xanh 3 1 intron (128 bp) xen giữa 2 exon (228 bp); cDNA của gen VrPDF1 có 228bp, mã hóa 75 amino acid. 2) Protein tái tổ hợp rVrPDF1 được biểu hiện trên cây thuốc lá chuyển gen và dịch chiết chứa protein rVrPDF1 từ dòng thuốc lá chuyển gen T1 có khả năng ức chế -amylase của ruột ấu trùng mọt. 3) Tạo được cây đậu xanh của giống ĐX22 mang gen chuyển VrPDF1 ở thế hệ T1 và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp rVrPDF1. Chứng minh được dịch chiết chứa protein tái tổ hợp rVrPDF1 biểu hiện ức chế -amylase của ấu trùng mọt, hiệu suất ức chế -amylase ở hai dòng chuyển gen DX1-3 và DX1- 7 tăng 166,40 % và 178,19% so với cây không chuyển gen. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.1. Về mặt khoa học Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen VrPDF1 phân lập từ các giống đậu xanh Việt Nam có khả năng kháng mọt khác nhau. Sự tăng cường biểu hiện protein tái tổ hợp rVrPDF và biểu hiện khả năng ức chế -amylase của ruột ấu trùng mọt của protein này từ cây chuyển gen là những cơ sở khoa học để khẳng định hiệu quả của việc ứng dụng công nghệ gen nhằm nâng cao khả năng kháng mọt của đậu xanh nói riêng và cây trồng thu hạt nói chung. 5.2. Về mặt thực tiễn Các trình tự gen VrPDF1 phân lập được, cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen VrPDF1, các dòng cây chuyển gen ở T1, dịch chiết chứa rVrPDF1 có khả năng ức chế -amylase của ruột ấu trùng mọt đã góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng kháng mọt của cây đậu xanh, mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại vào thực tiễn chọn giống cây trồng thu hạt ở Việt Nam. 6. Cấu trúc của luận án: Luận án có 119 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được chia thành các chương, phần: Mở đầu (4 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (31 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (22 trang); Chương 3: Kết quả và thảo luận (42 trang); Kết luận và đề nghị (1 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (18 trang). Luận án có 21 bảng, 31 hình và tham khảo 158 tài liệu. 4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo và tổng kết 158 tài liệu, trong đó có 27 tài liệu tiếng Việt, 126 tài liệu tiếng Anh và 5 địa chỉ trang web về 3 vấn đề cơ bản liên quan, như: (1) Đặc điểm của mọt hại đậu xanh và sự thiệt hại của mọt gây ra cho đậu xanh; (2) Defensin thực vật; (3) Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen và biểu hiện gen defensin thực vật ở một số loài thuộc chi Vigna. Đậu xanh là cây thực phẩm ngắn ngày giá trị kinh tế cao, dễ canh tác, là nguồn thực phẩm chứa đầy thành phần dinh dưỡng cho con người và vật nuôi. Hiện nay, đậu xanh đóng vai trò quan trọng sau đậu tương và lạc, bởi vậy là nhóm cây trồng được ưu tiên khuyến khích sản xuất. Nhằm nâng cao năng suất, sản lượng đậu xanh, nhiều công trình tập trung nghiên cứu, chọn tạo và đưa ra các giống có chất lượng, chống chịu điều kiện bất lợi và phù hợp với mọi vùng đất canh tác. Sâu bệnh là nguyên nhân trực tiếp ảnh hưởng tới năng suất và bảo quản sau thu hoạch các loài cây lấy hạt như đậu xanh, đậu tương,, làm giảm chất lượng và giá trị thương phẩm của sản phẩm, trong đó có mọt hại đậu xanh. Mọt gây hại đậu xanh (Callosobruchus chinensis L.) không những gây hại trong kho dự trữ mà chúng còn lan truyền và gây hại cả ở ngoài đồng ruộng. Mọt đậu xanh gây hại trên các loại đậu: đậu xanh, đậu tằm, đậu đũa, đậu Hà Lan, đậu đen trong đó hại nặng nhất là đậu xanh với tỷ lệ hại 100% (Bùi Công Hiển, 1995). Sự thiệt hại do chúng gây ra là rất lớn, do đó công tác phòng trừ sâu mọt đậu nói chung và mọt đậu xanh nói riêng đang là một vấn đề cấp thiết cần được quan tâm nghiên cứu. Trong những năm qua có nhiều công trình nghiên cứu chọn tạo các loại cây trồng có khả năng kháng các loại côn trùng, nấm và virus. Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính kháng mọt hại hạt của cây trồng rất phức tạp và liên quan đến hoạt động của protein defensin. Defensin thực vật là nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trưng bởi cấu trúc gấp cuộn ba chiều qua tám cầu nối disulfide của các cystein. Defensin thực vật hoạt động mạnh sẽ tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến chức năng kênh ion, tác động đến hoạt động của α-amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật (Cavalho et al., 2011). Cơ chế gây độc của defensin đối với côn trùng ở hạt đậu xanh được mô tả như là sự cản trở enzyme phân giải tinh bột, làm cho 21 3.3.4. Kiểm tra hoạt động ức chế -amylase từ ấu trùng mọt của protein tái tổ hợp rVrPDF1 ở thế hệ T1 Dịch chiết protein từ hạt đậu xanh của hai dòng chuyển gen DX1-3, DX1-7 ở thế hệ T1 đã kiểm tra sự biểu hiện protein defensin tái tổ hợp bằng Western blot và ELISA và dịch chiết protein từ hạt của cây không chuyển gen WT được sử dụng thử nghiệm kiểm tra khả năng ức chế -amylase của ấu trùng mọt đậu xanh. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.10. Bảng 3.10. Hoạt độ của -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh trong các mẫu ủ với dịch chiết protein từ hạt của các dòng đậu xanh chuyển gen T1 và từ hạt cây không chuyển gen Mẫu Chỉ có - amylase từ ấu trùng mọt ĐC Hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ các dòng cây chuyển gen DX1-3 DX1-7 Hoạt độ α- amylase (ĐVHĐ/mg) 9,47 ± 0,29 6,19 ± 0,09 2,08 ± 0,06 1,35 ± 0,05 Bảng 3.10 cho thấy hoạt độ của -amylase trong thí nghiệm chỉ có - amylase từ ấu trùng mọt và cơ chất tinh bột là 9,47 (ĐVHĐ/mg), trong khó đó hoạt độ của -amylase trong hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ cây không chuyển gen là 6,19 (ĐVHĐ/mg). Đối với hai dòng cây chuyển gen, hoạt độ của -amylase trong hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ dòng cây chuyển gen DX1-3 là 2,08 (ĐVHĐ/mg), từ dòng DX1-7 là 1,35 (ĐVHĐ/mg). Như vậy có thể thấy, dịch chiết protein từ cây chuyển gen và cây không chuyển gen đều có hiện tượng làm giảm hoạt độ -amylase so với thí nghiệm chỉ có -amylase từ ấu trùng mọt và cơ chất tinh bột. Kêt quả phân tích cho thấy hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ hai dòng cây chuyển gen (DX1-3 và DX1-7) có hoạt độ -amylase thấp hơn ở cây không chuyển gen. Điều này cho thấy protein tái tổ hợp rVrPDF1 trong hai dòng đậu xanh chuyển gen ở thế hệ T1 có khả năng ức chế -amylase từ ấu trùng mọt. 20 và cây WT không xuất hiện băng protein. Kết quả phân tích Western blot đã chứng minh protein tái tổ hợp rVrPDF1 đã được biểu hiện thành công trên hai dòng đậu xanh chuyển gen DX1-3 và DX1-7 có nguồn gốc từ giống đậu xanh ĐX22. Như vậy có thể nhận xét rằng, gen chuyển VrPDF1 đã di truyền qua sinh sản hữu tính từ thế hệ T0 sang T1, hoạt động ổn định và biểu hiện ở cả hai thế hệ cây chuyển gen. Hình 3.21. Kết quả phân tích Western blot từ 3 dòng đậu xanh chuyển gen thế hệ T1 và cây đối chứng không chuyển gen. Hàm lượng protein tái tổ hợp rVrPDF1 trong hạt của hai dòng DX1-3 và DX1-7 ở thế hệ T1 được phân tích bằng ELISA, kết quả được thể hiện ở hình 3.22. Biểu đồ cho thấy hai dòng đậu xanh chuyển gen tổng hợp rVrPDF1 với hàm lượng protein dao động từ 6,23 µg/mg đến 9,26 µg/mg. Dòng DX1-7 là hàm lượng protein rVrPDF1 cao hơn protein rVrPDF1 của dòng DX1-3. Kết quả này đã chứng minh rằng ở hai dòng đậu xanh chuyển gen, protein VrPDF1 được tăng cường biểu hiện. Hình 3.22. Kết quả phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợp VrPDF1 của ba dòng đậu xanh chuyển gen (DX1-3, DX1-4, DX1-7) và cây đối chứng không chuyển gen (WT). 5 mọt không thể tồn tại được. Khi mọt ăn hạt đậu xanh, defensin đã ức chế hoạt động của α-amylase, do đó ngăn chặn sự tiêu hóa tinh bột, kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển và dần mọt sẽ chết (Henrik et al., 2009; Liu et al., 2006). Trong những năm gần đây đã có một số nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của defensin thực vật, đề xuất ứng dụng trong công nghệ sinh học trong nghiên cứu chức năng của gen defensin và nâng cao khả năng kháng mọt ở cây đậu xanh (Cavalho et al., 2009, 2011; Dos et al., 2010; Henrik et al., 2009; Tavars et al, 2008). Defensin thực vật biểu hiện ở nhiều cơ quan khác nhau của cây và tạo ra tuyến phòng vệ đầu tiên trước các đối tượng sâu bệnh. Mặc dù sự tác động giữa defensin thực vật và nhiều đối tượng sâu bệnh còn chưa được hiểu rõ, nhưng những defensin có thể được sử dụng để tạo ra cây trồng biến đổi gen, giúp cải thiện khả năng chống chịu mọt. Chuyển gen defensin ở đậu xanh là biện pháp công nghệ làm tăng hàm lượng defensin nhằm tăng cường khả năng ức chế α-amylase của ấu trùng mọt, từ đó nâng cao khả năng kháng mọt ở đậu xanh. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Sử dụng hạt 8 giống đậu xanh, trong đó 6 giống (Tằm TH, ĐX11, ĐX22, ĐXVN5, ĐXVN6, ĐX14) do Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ, Viện Cây Lương thực và Thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp, hai giống (ĐX17, V123) do Viện nghiên cứu Ngô Đan Phượng cung cấp. Giống thuốc lá K326 do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam cung cấp. Các chủng vi khuẩn E. coli DH5α và A. tumefaciens CV58 do phòng Công nghệ tế bào thực vật của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp. Các loại vector: Vector tách dòng pBT, vector pBeta-Phaseolin và vector pDON201-SLHEP do Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp. 2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 6 Hoá chất, các bộ KIT được mua tại các hãng nổi tiếng Thế giới như Bio-Neer, Fermentas, Invitrogen...; Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng mọt của 8 giống đậu xanh nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang. Các thí nghiệm phân lập gen, thiết kế vector chuyển gen vào cây thuốc lá và phân tích cây chuyển gen được tiến hành tại phòng Công nghệ ADN ứng dụng, phòng Công nghệ Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thí nghiệm chuyển gen vào cây đậu xanh được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp đánh giá kháng mọt của các giống đậu xanh nghiên cứu Phương pháp lây nhiễm mọt nhân tạo theo Tomooka và cs (1992), Hà Quang Hùng (2005). 2.3.2. Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự nucleotide Kỹ thuật tách dòng gen được thực hiện theo Sammbrook và cs (2001). Trình tự nucleotide của gen VrPDF1 được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing. 2.3.3. Thiết kế vector chuyển gen (1) Tạo cấu trúc độc lập mang gen chuyển pDON201-SLHEP-VrPDF1; (2) Gắn cấu trúc mang gen chuyển VrPDF1 vào vector chuyển gen thực vật pBetaphaso-VrPDF1. 2.3.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens Tạo cây thuốc lá chuyển gen: Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua A. tumefaciens được tiến hành theo phương pháp của Topping (1998). Tạo cây đậu xanh chuyển gen: Phương pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm nhờ A. tumefaciens được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Sonia và cs (2007) và tham khảo hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen vào đậu xanh của Nguyễn Thị Luyện (2009), Chu Hoàng Mậu (2010) và Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2012). 19 Hiệu suất chuyển gen VrPDF1 ở giai đoạn này được xác định đạt 0,79% (5/630 =0,79%). Sử dụng Southern blot kiểm tra kết quả gắn gen chuyển VrPDF1 vào hệ gen của tế bào chủ. Năm dòng đậu xanh chuyển gen T0 dương tính với PCR DX0-1, DX0-3, DX0-4, DX0-7, DX0-8 và cây đối chứng không chuyển gen WT đã được sử dụng để phân tích Southern blot, kết quả thể hiện ở hình 3.20. Kb M (+) WT 1 2 3 4 5 1,5 2,0 3,0 4,0 5,0 7,0 10,0 Hình 3.20. Kết quả phân tích Southern blot của DNA tổng số các cây đậu xanh chuyển gen VrPDF1 với đoạn dò nptII được đánh dấu bằng biotin. M: Marker 1kb, (-): cây đậu xanh ĐX22 không chuyển gen; DX0-1, DX0-3, DX0-4, DX0-7 và DX0-8: các dòng đậu xanh chuyển gen T0 dương tính với PCR Như vậy, những bằng chứng về sự có mặt và dung hợp của gen chuyển trong hệ gen của các cây chuyển gen ở thế hệ T0 bằng PCR và Southern blot chính là kết quả bước đầu tạo cơ sở cho sự thành công của quy trình chuyển gen VrPDF1 vào cây đậu xanh. Các dòng cây đậu xanh chuyển gen được chăm sóc và ưu tiên phát triển phục vụ những phân tích tiếp theo về khả năng hoạt động và biểu hiện mạnh của gen chuyển VrPDF1 trong cây chuyển gen. 3.3.3. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển VrPDF1 trong các dòng cây đậu xanh chuyển gen T1 Kết quả lai Western phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp từ hạt của 3 dòng cây đậu xanh chuyển gen và cây WT trên hình 3.21 cho thấy, trên màng lai xuất hiện băng màu ở vị trí kích thước khoảng gần 10 kDa ở 2 dòng cây đậu xanh chuyển gen (DX1-3, DX1-7) ở thế hệ T1. Dòng chuyển gen DX1-4 18 Bảng 3.9. Kết quả biến nạp cấu trúc pPhaso-dest-VrPDF1 vào giống đậu xanh ĐX22 Đối chứng và thí nghiệm Tổng số mẫu Số mẫu tạo chồi Số chồi kéo dài Số chồi ra rễ Số cây sống trên giá thể Số cây sống sót trong nhà lưới ĐC0* 30 0 0 0 0 0 ĐC1* 30 30 45 25 10 10 Thí nghiệm 3 lần 630 247 107 46 35 23 Ghi chú: ĐC0* lá mầm đậu xanh không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1* lá mầm đậu xanh không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh 3.3.2. Xác định sự có mặt và sự dung hợp của gen chuyển VrPDF1 trong hệ gen cây đậu xanh chuyển gen Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển VrPDF1 trong hệ gen của các dòng cây đậu xanh được chuyển gen, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, kết quả thể hiện ở hình 3.19. M (+) (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 0,5 kb  0,25 kb   ~ 0,35 kb  ~ 0,25 kb Hình 3.19. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 từ các dòng cây đậu xanh được chuyển gen ở thế hệ T0 bằng cặp mồi VrPDF1-HinIII- F/VrPDF1-SalI-R. M: thang DNA chuẩn 1 kb; (+): đối chứng dương là plasmid pBT-VrPDF1; (-) sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 cây đậu xanh không chuyển gen; 1-8: các dòng cây đậu xanh được chuyển gen VrPDF1 Kết quả trên đã chỉ ra rằng, trong hệ gen của cây đậu xanh chuyển gen tương ứng với làn điện di số 1, 3, 4, 7, 8 đã có mặt của gen chuyển VrPDF1. Trong 630 mẫu biến nạp thu được 5 cây đậu xanh T0 dương tính với PCR và 5 dòng cây đậu xanh chuyển gen T0 được ký hiệu là DX0-1; DX0-3, DX0-4, DX0-7, DX0-8. 7 2.3.5. Nhóm phương pháp phân tích cây chuyển gen Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR. Phân tích cây đậu xanh chuyển gen bằng Southern blot ở thế hệ T0 0 được thực hiện theo Southern EM (1975). Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp VrPDF1 trong hạt cây chuyển gen ở thế hệ T1 bằng phương pháp điện di protein theo Laemmli (1970) và Western blot. Định lượng protein VrPDF1 tái tổ hợp bằng kỹ thuật ELISA theo phương pháp của Sun và cs (2006). Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT VÀ PHÂN LẬP GEN VrPDF1 CỦA CÂY ĐẬU XANH 3.1.1. Khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh nghiên cứu Chỉ số mẫn cảm mọt được xác định thông qua các chỉ tiêu: khối lượng đậu xanh hao hụt, tỷ lệ nhiễm mọt và hệ số gia tăng quần thể mọt. Giống có chỉ số mẫn cảm mọt nhỏ thì khả năng kháng mọt cao và ngược lại. Kết quả được thể hiện qua bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả đánh giá khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh qua các thời gian nhiễm mọt Giống Tằm TH ĐX11 ĐX22 ĐXVN5 ĐXVN6 ĐX14 ĐX17 V123 Chỉ số mẫn cảm mọt 634,63 828,89 1058,71 760,35 792,55 961,54 902,88 687,76 Bảng 3.1 cho thấy, giống đậu xanh Tằm TH có chỉ số mẫn cảm mọt thấp nhất (634,63) và giống ĐX22 có chỉ số mẫn cảm mọt cao nhất (1058,72). Kết hợp các các kết quả phân tích trên có thể nhận thấy giống đậu xanh Tằm TH có khả năng kháng mọt tốt nhất và giống ĐX22 kháng mọt kém nhất. Lựa chọn 2 giống này để tiếp tục phân lập, tách dòng gen. 8 3.1.2. Khuếch đại và tách dòng gen VrPDF1 từ giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22 Lựa chọn hạt của giống Tằm TH (kháng mọt tốt nhất) và giống ĐX22 (kháng mọt kém nhất) làm đối tượng để phân tích đặc điểm của gen VrPDF1. RNA tổng số, DNA tổng số được tách từ mầm hạt đậu xanh và được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2. Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 của hai giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22 (M: Thang DNA chuẩn 1 kb plus; 1, 3: sản phẩm PCR nhân từ mRNA và DNAhệ gen của Tằm TH ; 2, 4: sản phẩm PCR nhân từ mRNA và DNA hệ gen của ĐX22 ). Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR nhân gen VrPDF1 từ các dòng khuẩn lạc E. coli DH5. (M: Thang DNA chuẩn 1 kb; 1, 2, 5, 6: các dòng khuẩn lạc chứa vector mang cDNA và DNA gen VrPDF1 của giống Tằm TH; 3, 64, 7, 8: các dòng khuẩn lạc chứa vector mang cDNA và DNA VrPDF1 của giống ĐX22) Hình 3.2 cho thấy, băng DNA có kích thước khoảng 0,25 kb và 0,35 kb đúng như tính toán lý thuyết về kích thước cDNA và kích thước của gen VrPDF1. Sản phẩm PCR được tách khỏi bản gel, tinh sạch và gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT, sau đó được nhân dòng trong tế bào E. coli DH5. Tiến hành chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm colony-PCR xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 0,22 kb và 0,35 kb đúng như tính toán lý thuyết (Hình 3.3). Kết quả ở hình 3.3 cũng cho thấy kết quả chọn dòng thành công và các dòng khuẩn lạc dương tính với PCR được sử dụng tách chiết plasmid tái tổ hợp phục vụ việc xác định trình tự nucleotide. 1 2 M 3 4  0,25 kb Gen (DNA) cDNA  0,5 kb  1 2 3 4 M 5 6 7 8  0,35 kb 0,22 kb  17 3.3. TẠO CÂY ĐẬU XANH CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP rVrPDF1 Ở GIỐNG ĐẬU XANH ĐX22 3.1.1. Chuyển cấu trúc pPhaso-dest-VrPDF1 và tạo cây đậu xanh chuyển gen Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-dest-VrPDF1 vào giống đậu xanh ĐX22 được thực hiện nhờ A.tumefaciens lây nhiễm qua nách lá mầm. Kết quả được thể hiện ở hình 3.18 và bảng 3.9. BA C D E F G H I L J M N OK Hình 3.18. Hình ảnh quá trình biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 qua mô nách lá mầm và tái sinh cây đậu xanh chuyển gen. A: Hạt đậu xanh ĐX22; B: Khử trùng hạt bằng khí clo; C: Gieo hạt trên môi trường GM; D: Nảy mầm hạt sau 3 ngày; E: lá mầm và nách lá mầm làm nguyên liệu biến nạp; F: Nhiễm khuẩn trong 30 phút; G: Đồng nuôi cấy trên CCM; H: Cảm ứng tạo chồi trên SIM 1; I: Sau 2 tuần trên SIM 1; J: Cảm ứng tạo chồi 2 tuần trên SIM 2; K: Chọn lọc và kéo dài chồi trên SEM; L: Ra rễ; M: Cây ra giá thể; N-O: Cây trồng trong chậu ở điều kiện nhà lưới 16 0 3,57 5,35 8,57 5,69 0 2 4 6 8 10 WT T1-7 T1-8 T1-10 T1-11 Hình 3.16. Biểu đồ so sánh hàm lượng protein rVrPDF1 tái tổ hợp (g/mg protein tổng số) giữa các dòng thuốc lá chuyển gen. WT: cây thuốc lá không chuyển gen, T1-7, T1-8, T1-10, T1-11: bốn dòng thuốc lá chuyển gen. Các số liệu trên mỗi cột biểu đồ là hàm lượng protein rVrPDF1 (g/mg protein tổng số). Thanh đứng trên mỗi cột biểu đồ là sai số chuẩn. Thử nghiệm hoạt động ức chế -amylase của protein tái tổ hợp rVrPDF1 Để phân tích chức năng sinh học của protein tái tổ hợp rVrDEF1 trong hạt của các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1. Dịch chiết chứa enzyme -amylase của ấu trùng mọt đậu xanh được ủ với dịch chiết protein từ hạt các dòng cây chuyển gen và dịch chiết protein từ hạt cây đối chứng không chuyển gen để kiểm tra ảnh hưởng của protein tái tổ hợp rVrDEF1 đến hoạt động của -amylase phân giải tinh bột, kết quả được trình bày ở hình 3.17. 100,00 32,12 29,40 19,24 27,95 0 20 40 60 80 100 120 WT T1-7 T1-8 T1-10 T1-11 Hoạt độ của alpha-amylase từ ấu trùng mọt khi ủ với dịch chiết protein của cây chuyển gen so với khi ủ với dịch chiết protein của cây đối chứng Hình 3.17. Biểu đồ so sánh kết quả thử nghiệm hoạt động ức chế của rVrPDF1 đối với -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh. Kết quả biểu hiện gen ở cây thuốc lá mô hình thành công là cơ sở để chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc vào cây đậu xanh. 9 3.1.3. Đặc điểm của gen VrPDF1 phân lập từ hai giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22 Đặc điểm của đoạn mã hóa thuộc gen VrPDF1 phân lập từ mRNA Kết quả đọc trình tự nucleotide cho thấy: Đoạn cDNA gen VrPDF1 có 228 nucleotide và bằng BLAST trong NCBI cho thấy: So với trình tự gen PDF1 mang mã số AB020613.1 với gen VrPDF1 phân lập từ mRNA của giống Tằm TH và DX22 có độ tương đồng tương ứng là 99% và 96% (Hình 3.4). Trình tự nucleotide của gen VrPDF1 (cDNA) phân lập từ mRNA của hai giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22 đã được đăng ký trên ngân hàng gen với mã số LN913082.1 và LN913083.1. So với AB020613.1 gen VrPDF1 của Tằm TH có 5 vị trí nucleotide sai khác và ĐX22 có 8 vị trí nucleotide . Hình 3.4. Trình tự nucleotide của gen VrPDF1 (cDNA) ở hai giống đậu xanh Tằm TH, ĐX22 và trình tự mang mã số AB020613 trên GenBank Tiếp tục phân tích, so sánh trình tự amino acid suy diễn từ trình tự cDNA của giống Tằm TH và ĐX22 với protein suy diễn từ AB020613.1 trên Ngân hàng Gen, kết quả được thể hiện ở hình 3.5. Hình 3.5. Trình tự amino acid suy diễn từ gen VrPDF1 của hai giống đậu xanh Tằm TH, ĐX22 và đoạn trình tự mang mã số AB020613. 10 Từ hình 3.5 cho thấy, protein VrPDF1 gồm 75 amino acid và có độ tương đồng cao. So với protein mang mã số AB020613 thì trình tự amino acid suy diễn của giống Tằm TH có độ tương đồng 96%, của mẫu ĐX22 có độ tương đồng 92%; còn trình tự amino acid suy diễn VrPDF1 của hai giống đậu xanh tương đồng là 88%. Trình tự gen VrPDF1 (cDNA) phân lập từ mRNA của giống Tằm TH kháng mọt tốt nhất được sử dụng để thiết kế vector chuyển gen VrPDF1 nhằm mục đích nâng cao khả năng kháng mọt của cây đậu xanh. Đặc điểm của gen VrPDF1 phân lập từ DNA tổng số Kết quả giải trình tự nucleotide của gen VrPDF1 phân lập từ DNA tổng số của giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22 cho thấy: Gen VrPDF1 có kích thước 356 nucleotide và bằng BLAST trong NCBI độ tương đồng của gen VrPDF1 so với gen PDF1 mang mã số AB020613.1 trên GenBank từ 95% đến 99%. Việc so sánh trình tự gen VrPDF1 phân lập từ DNA và từ cDNA ở hai giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22 cho phép xác định được đặc điểm cấu trúc của gen. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen VrPDF1 phân lập từ DNA hệ gen và gen VrPDF1 phân lập từ mRNA đã khẳng định gen VrPDF1 đã phân lập thành công từ hệ gen hai giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22. Hai trình tự gen VrPDF1 của giống Tằm TH và ĐX22 đã được công bố trên Ngân hàng Gen với các mã số LT797533, LT797534. 3.1.4. Thảo luận về cấu trúc của protein defensin Kết quả so sánh vùng chức năng của VrPDF1 giữa giống đậu xanh kháng mọt tốt và kháng mọt kém không thấy có sự thay đổi ở các cầu nối disunfide giữa 4 cặp Cys trong vùng chức năng của defeinsin (Hình 3.7) và cấu trúc không gian giữa hai protein VrPDF1 không có sự khác nhau. Tam TH DX22 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 a b c d Hình 3.7. Sơ đồ các cầu nối disulfide giữa các cặp Cys trong vùng chức năng của protein VrPDF1. Các cầu nối disulfide: a-Cys14 - Cys35; b-Cys20 - Cys41; c- 15 vào cây thuốc lá và gen chuyển VrPDF1 đã được hợp nhất vào hệ gen cây thuốc lá. 3.2.4. Phân tích sự biểu hiện protein VrPDF1 tái tổ hợp trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1 Trong 7 dòng thuốc lá chuyển gen cho kết quả lai Southern có 5 cây chuyển gen thu được hạt. Hạt của các cây T0 chính là thế hệ cây chuyển gen T1 và các dòng thuốc lá chuyển gen T0 thu được hạt ký hiệu là T1-4, T1-7, T1-8, T1-10, T1-11. Sử dụng 5 dòng thuốc lá chuyển gen T1 và cây đối chứng không chuyển gen để phân tích sự biểu hiện protein VrPDF1 tái tổ hợp trong hạt. Kết quả thể hiện qua hình 3.15. M WT T1-4 T1-7 T1-8 T1-10 T1-11 35 kDa  25 kDa  15 kDa  10 kDa   Hình 3.15. Kết quả lai Western của protein hạt từ một số dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 với kháng thể cmyc. M: thang protein chuẩn từ 10 đến 180 kDa; WT: protein cây thuốc lá đối chứng (không chuyển gen); T1-4, T1- 7, T1-8, T1-10, T1-11: protein của các dòng cây thuốc lá chuyển gen dương tính với lai Southern. Hình 3.15 cho thấy, trên màng lai nitrocellulose xuất hiện băng màu ở vị trí kích thước khoảng gần 10 kDa ở 4 dòng cây thuốc lá chuyển gen (T1-7, T1-8, T1-10, T1-11) ở thế hệ T1. Để đánh giá mức độ biểu hiện protein tái tổ hơp sử dụng kỹ thuật ELISA, kết quả được thể hiện ở biểu đồ trên hình 3.16. Trên hình 3.16 các dòng thuốc lá chuyển gen có hàm lượng protein rVrPDF1 dao động từ 3,57 g/mg protein tổng số đến 8,57 g/mg protein tổng số và dòng T1-10 có hàm lượng protein VrPDF1 cao nhất (8,57 g/mg protein tổng số). 14 tuần thì tiến hành thu lá để thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển. 3.2.3. Kết quả phân tích sự có mặt của gen chuyển VrPDF1 ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR và Southern blot Chọn 12 cây thuốc lá được chuyển gen ở thế hệ T0 cây thuốc lá không chuyển gen (cây WT) để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển VrPDF1 trong cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR. Kết quả thể hiện ở hình 3.13. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (+) M WT 10 11 12  0,25 kb Hình 3.13. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 từ dòng cây thuốc lá được chuyển gen ở thế hệ T0. M: thang DNA 1 kb; (+): đối chứng dương là plasmid pBT-VrPDF1; WT: cây đối chứng không chuyển gen; 1-12: các dòng cây thuốc lá được chuyển gen VrPDF1 ký hiệu là T0-1, T0-2, T0-3, T0-4, T0-5, T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-11, T0-12. Để kiểm chứng gen chuyển VrPDF1 đã được gắn vào hệ gen thuốc lá, kỹ thuật lai Southern được sử dụng để xác định sự có mặt của gen chuyển trong hệ gen của cây thuốc lá chuyển gen. Kết quả được thể hiện qua hình 3.14. M T0-1 T0-2 T0-4 T0-6 T0-7 T0-8 T0-10 T0-11 T0-12 Hình 3.14. Kết quả phân tích cây thuốc lá chuyển gen bằng lai Southern ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen dương tính với PCR với đoạn dò VrPDF1 được đánh dấu bằng biotin. M: thang DNA 1 kb; T0-1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-7, T0-8, T0-10, T0-11, T012: các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0. Southern blot đã thu được 7 dòng cây cho kết quả lai dương tính, đó là các dòng T0-4, T0-6, T0-7, T0-8, T0-10, T0-11, T0-12. Như vậy, có thể khẳng định rằng cấu trúc pPhaso-dest -VrPDF1 đã được chuyển thành công 11 Cys24 - Cys43; d-Cys3 - Cys47. L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7: Các vòng lặp trong cấu trúc không gian của protein VrPDF1 Như vậy, có giả thuyết rằng sự khác nhau về mức độ kháng mọt giữa hai giống có liên quan đến hàm lượng defensin dự trữ trong hạt; rất có thể giống đậu xanh có hàm lượng VrPDF1 trong hạt cao thì khả năng kháng mọt tốt và ngược lại giống có hàm lượng VrPDF1 trong hạt thấp thì khả năng kháng mọt kém. Chính vì vậy, ứng dụng kỹ thuật biểu hiện gen để nâng cao hàm lượng defensin1 trong hạt là biện pháp công nghệ nhằm tăng cường khả năng kháng mọt gây hại ở đậu xanh. 3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN VrPDF1 VÀ PHÂN TÍCH HOẠT ĐỘNG CỦA VECTOR CHUYỂN GEN TRÊN CÂY THUỐC LÁ 3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện ở hạt thực vật mang gen VrPDF1 bằng kỹ thuật Gateway Trình tự nucleotide của gen VrPDF1 (cDNA) phân lập từ giống đậu xanh Tằm TH (kháng mọt tốt nhất) có kích thước 228 nucleotide, mã hóa 75 amino acid được sử dụng để thiết kế vector chuyển gen thực vật, biểu hiện ở hạt. Kết quả được thể hiện ở hình 3.10. A 0,25 kb   1,0 kb  M 1 2 3 4 5 6 B Hình 3.10. Sơ đồ cấu trúc vector pDON201-SLHEP-VrPDF1 (A) và kết quả điện di sản phẩm colony-PCR kiểm tra vector pDON201-SLHEP-VrPDF1 (B). M: 12 thang DNA 1 kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6: các dòng khuẩn lạc được kiểm tra bằng colony- PCR. Vector pBetaPhaso-dest chứa promoter Phaseolin điều khiển biểu hiện protein tái tổ hợp ở hạt mang gen VrPDF1 được tạo thành bằng kỹ thuật Geteway. Kết quả thể hiện qua hình 3.11A. Cấu trúc pBetaPhaso-dest- VrPDF1 được nhân dòng trong E.coli DH5α trên môi trường có chứa kanamycin và được chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu VrPDF1-F/VrPDF1-R, kết quả thể hiện ở hình 3.11B. 6 dòng khuẩn lạc bằng phản ứng colony-PCR cho thấy 3 dòng (dòng số 1, 5, 6) cho sản phẩm PCR đúng với kích thước gen chuyển VrPDF1. Các dòng này được sử dụng tách plasmid tái tổ hợp pBetaPhaso-dest-VrPDF1. Cấu trúc vector chuyển gen pBetaPhaso-dest-VrPDF1 được biến nạp vào A. tumefeciens CV58 bằng kỹ thuật xung điện. Vi khuẩn A. tumefaciens được nuôi cấy trên môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin, kiểm tra A. tumefaciens tái tổ hợp bằng colony -PCR, lưu giữ và sử dụng trong chuyển gen. A M 1 2 3 4 5 6  0,25 kb0,25 kb  1,0 kb  B Hình 3.11. A: Sơ đồ một đoạn trong cấu trúc vector pPhaso-dest-VrPDF1(A); B: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra vector chuyển gen pPhaso-dest-VrPDF1. M: thang DNA 1 kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6: các dòng khuẩn lạc được kiểm tra bằng colony-PCR 13 3.2.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen in vitro mang gen VrPDF1 Để đánh giá hoạt động của cấu trúc mang gen chuyển VrPDF1 đã thiết kế và làm cơ sở tạo cây đậu xanh chuyển gen VrPDF1, cấu trúc pBetaPhaso-dest -VrPDF1 được biến nạp vào cây thuốc lá mô hình. Kết quả các giai đoạn biến nạp vào mô lá thuốc lá thể hiện qua hình 3.12. A B C D E G H K Hình 3.12. Hình ảnh quá trình biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 vào mô lá thuốc lá giống K326 và tái sinh cây thuốc lá chuyển gen. Bảng 3.7. Kết quả biến nạp cấu trúc pPhaso-dest -VrPDF1 vào mô lá thuốc lá Đối chứng và thí nghiệm Tổng số mảnh lá Số mảnh lá sống sót sau 4 tuần Số mảnh lá cảm ứng tạo chồi Số cây ra rễ trên môi trường chọn lọc Số cây ra bầu Số cây sống sót trong nhà lưới ĐC0* 30 0 0 0 0 0 ĐC1* 30 30 27 15 10 10 Thí nghiệm 3 lần 130 114 93 80 37 28 Ghi chú: ĐC0 * mô lá thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1 * mô lá thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh Tổng số cây sống sót trong nhà lưới là 28 cây cùng với 10 cây đối chứng thu được tiếp tục chăm só để phục vụ phân tích sự biểu hiện gen. Các dòng cây thuốc lá chuyển gen sau khi trồng trong nhà lưới được khoảng 3-4