Tóm tắt Luận án Nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng quận chúa (dianthus caryophyllus l.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ HOÀNG HIỆP NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, SAI KHÁC DI TRUYỀN CỦA CÁC DÒNG ĐỘT BIẾN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG QUẬN CHÚA (DIANTHUS CARYOPHYLLUS L.) CHUYÊN NGÀNH : KHOA HỌC CÂY TRỒNG Mà SỐ : 62.62.01.10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI – 2014 Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Thị Phương Thảo Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS. Lê Huy Hàm Viện Di truyền Nông nghiệp Phản biện 3: TS. Đặng Văn Đông Viện Nghiên cứu Rau quả Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi , ngày tháng năm 2014 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1 MӢ ĐҪU 1. Tính cҩp thiӃt cӫa đӅ tài Cẩm chướng là một trong bốn loài hoa cắt cành được trồng phổ biến trên thế giới, chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt (Nguyễn Thị Kim Lý, 2012). Đây cũng là loại hoa có nhiều triển vọng trong sản xuất nội tiêu cũng như xuất khẩu cӫa Việt Nam. Ӣ nước ta hiện nay, chӫ yếu trồng các giống cẩm chướng nhập nội từ nước ngoài do đó không chӫ động và chi phí sản xuất cao, đặc biệt là không thể mӣ rộng sản xuất và xuất khẩu bӣi không có bản quyền giống. Vì vậy, việc nghiên cӭu chọn tạo những giống hoa cẩm chướng mới đáp ӭng được nhu cầu thị trưӡng, phù hợp với điều kiện sinh thái và có bản quyền cӫa Việt Nam là yêu cầu bӭc thiết. Đối với cây hoa việc chọn tạo giống tập trung chӫ yếu là tạo giống có màu sắc mới. Điều này được thực hiện thông qua con đưӡng lai xa và gây tạo đột biến. Tuy nhiên đối với cây hoa cẩm chướng ӣ nước ta việc lai xa rất khó thực hiện bӣi khả nĕng thụ phấn thụ tinh rất khó. Vì vậy việc tạo giống có màu sắc mới chỉ có thể thực hiện thông qua con đưӡng gây tạo đột biến. Phương pháp chọn tạo giống bằng gây tạo đột biến được phát triển từ giữa thế kỷ 20 và ngày càng phát triển rộng rãi mang lại những thành tựu to lớn trong công tác chọn tạo giống cây trồng. Hơn thế nữa, việc gây tạo đột biến nhân tạo kết hợp với nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã trӣ thành công cụ hữu hiệu giúp giảm thiểu chi phí và thӡi gian chọn tạo giống cây trồng mới. Kỹ thuật này đã làm tĕng tần số xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ӣ các loài thực vật nói chung và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc cải tiến giống cây trồng. (Okamura, 2006; Shu, 2009; IAEA, 2009, 2013). Xuất phát từ những vấn đề nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cӭu tҥo đӝt biӃn in vitro vƠ đánh giá sinh trѭӣng, phát triển, sai khác di truyӅn cӫa các dòng đӝt biӃn giӕng hoa cẩm chѭớng Quұn Chúa (Dianthus caryophyllus L.)”. 2 2. Mục tiêu cӫa đӅ tài Nghiên cӭu phương pháp xử lý đột biến in vitro nhằm xác định được phương pháp xử lý đột biến hiệu quả và tạo được các dòng biến dị di truyền làm nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới. 3. Yêu cầu của đề tài - Xác định khả nĕng nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa, làm cơ sӣ cho việc tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh các mẫu xử lý đột biến in vitro bằng tác nhân gây đột biến. - Xác định hiệu quả xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng trong nuôi cấy mô mang lại hiệu quả cao: + Xác định nồng độ, thӡi gian xử lý EMS thích hợp cho chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng. + Xác định liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co thích hợp cho chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng. + Xác định hiệu quả cӫa xử lý phối hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng. - Phân lập các thể đột biến qua các thế hệ nhân chồi in vitro. - Sàng lọc các dạng biến dị cӫa cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên. - Đánh giá sự sai khác di truyền cӫa một số dòng đột biến có triển vọng đã phân lập bằng chỉ thị SSR. - Xác định phương pháp khử trùng mẫu, môi trưӡng nhân nhanh, môi trưӡng ra rễ và giá thể ra cây thích hợp cho một số dòng đột biến có tiềm nĕng được tuyển chọn. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiӉn cӫa đӅ tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cӭu cӫa đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về việc ӭng dụng nhân giống in vitro và phương pháp tạo giống mới thông qua xử lý đột biến in vitro cӫa cây hoa cẩm chướng. Các kết quả nghiên cӭu cӫa đề tài là cơ sӣ để tiếp tục nghiên cӭu tạo dòng đột biến làm nguồn nguyên liệu di truyền cho việc chọn tạo giống cẩm chướng mới. Đồng thӡi là tư liệu có giá trị cho việc nghiên cӭu lĩnh vực công nghệ sinh học và chọn tạo giống cây trồng. 3 4.2. Ý nghĩa thực tiӉn Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng, giống hoa cẩm chướng, góp phần giải quyết khó khĕn trong thực tiễn về nhân giống hiện nay; ӭng dụng thành công phương pháp xử lý đột biến in vitro và xây dựng được quy trình xử lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro cho cây hoa cẩm chướng bằng tác nhân EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co; tạo được các vật liệu khӣi đầu phục vụ cho công tác nghiên cӭu chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới và chọn lọc được một số dòng đột biến có triển vọng. 5. Những đóng góp mới cӫa luұn án Các kết quả nghiên cӭu đã xác định được tác nhân gây đột biến EMS và tia gamma cho hiệu quả cao trong việc gây tạo biến dị có tiềm nĕng có thể làm vật iệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới. Đề tài đã tạo ra các dòng đột biến có tiềm nĕng và đánh giá được đặc điểm sinh trưӣng phát triển cӫa các dòng đột biến mới về mầu sắc hoa trong điều kiện tự nhiên. Các dòng đột biến này cũng đã được đánh giá sự sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR và xác định mối quan hệ di truyền với cây mẹ. Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho 2 dòng đột biến có triển vọng (dòng H6 và dòng H7) trong số các dòng đột biến nêu trên, phục vụ cho các nghiên cӭu tiếp theo để phát triển hai dòng này thành giống hoa cẩm chướng mới. 6. Giới hҥn cӫa đӅ tài - Thӡi gian nghiên cӭu từ nĕm 2009 – 2013. - Địa điểm nghiên cӭu: Viện Sinh học Nông nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam. 7. Bӕ cục cӫa luұn án Nội dung chính cӫa luận án được thể hiện trong 130 trang, gồm: 4 trang mӣ đầu, 34 trang tổng quan, 17 trang vật liệu nội dung và phương pháp nghiên cӭu, 73 trang kết quả và thảo luận, 2 trang kết luận và kiến nghị. 126 tài liệu tham khảo, trong đó 32 tài liệu tiếng Việt, 94 tài liệu tiếng Anh. Kết quả nghiên cӭu có 34 bảng số liệu và 41 hình. Phần phục lục hình ảnh minh họa và kết quả xử lý số liệu. 4 Chѭѫng 1 TӘNG QUAN TÀI LIӊU Cẩm chướng là loại hoa có giá trị kinh tế cao, chiếm tỷ lệ lớn trong các loài hoa cắt cành trên thế giới (chiếm 17%) và trong các loài hoa xuất khẩu ӣ nước ta. Việc đẩy mạnh sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm hoa cẩm chướng ӣ Việt Nam còn nhiều hạn chế, trong đó đề bản quyền giống đang là khó khĕn trong việc tiếp cận thị trưӡng hoa thế giới. Đột biến đóng vai trò quan trọng trong chọn giống cây trồng, nhӡ vào quá trình đột biến mà chúng ta đã tạo ra nhiều giống hoa mới, đặc sắc có nĕng suất cao, khả nĕng chống chịu tốt, kháng sâu bệnh,... trên lĩnh vực hoa cảnh nói riêng và trong ngành chọn giống nói chung. Xử lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro có nhiều ưu điểm so với phương pháp chọn giống truyền thống: tần số đột biến cao và khả nĕng thu nhận những thể đột biến đồng nhất về kiểu gen dễ dàng hơn; có thể xử lý một số lượng lớn tế bào, mô, cây con mà không đòi hỏi diện tích lớn; có thể sử dụng nhiều bộ phận khác nhau cӫa cây (tế bào, mô sẹo, chồi in vitro, đoạn thân, hạt, ); có khả nĕng rút ngắn thӡi gian so phương pháp truyền thống (chỉ cần 3 - 6 thế hệ). Các kết quả nghiên cӭu cӫa các tác giả về chọn tạo giống đột biến hoa cẩm chướng cho thấy việc ӭng dụng kỹ thuật gây tạo đột biến nhân tạo đối với cây trồng nói chung và cây hoa cẩm chướng nói riêng mang lại hiệu quả rất lớn. Có rất nhiều giống hoa cẩm chướng mới với những tính trạng mới được tạo ra nhӡ xử lý gây tạo đột biến. Vì vậy, có thể nói rằng, phương pháp chọn giống cẩm chướng và các loại hoa nói chung bằng xử lý đột biến là một phương pháp đầy triển vọng trong công tác chọn tạo giống hoa mới cho sản xuất. Chѭѫng 2 ĐӔI TѬӦNG, NӜI DUNG VÀ PHѬѪNG PHÁP NGHIÊN CӬU 2.1. Vұt liӋu nghiên cӭu - Mắt ngӫ cӫa chồi in vitro cây hoa cẩm chướng thơm giống Quận Chúa (Tên khoa học Dianthus caryophyllus “Princess”; tên thương mại Princess). - Các thiết bị dụng cụ hóa chất trong nuôi cấy mô tế bào. 5 - Phản ӭng PCR-SSR được tiến hành 20 mồi SSR cӫa hãng Bioneer (theo Smulders et al., 2003, Tetsuya et al., 2009). - Hóa chất dùng trong nghiên cӭu sinh học phân tử như Tris bazơ, agarose, isopropanol, Ethanol, chloroform, isoamylalcohol, CH3COONa, SDS, CTAB, Nacl, ETDA, - Các hóa chất cho phản ӭng PCR gồm deoxynucleotit triphosphat (dNTPs) cӫa Sigma, Taq-DNA polymeraza cӫa Fermentas. 2.2. Nӝi dung nghiên cӭu. 2.2.1. Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa phương pháp khử trùng đến tỷ lệ sống cӫa mẫu. - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa môi trưӡng nuôi cấy đến hệ số nhân, sự sinh trưӣng cӫa chồi in vitro: + Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa BA và kinetin trong môi trưӡng MS đến hệ số nhân, sự sinh trưӣng cӫa chồi in vitro. + Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa tổ hợp cytokinin và auxin đến hệ số nhân, sự sinh trưӣng cӫa chồi in vitro. - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa α-NAA và than hoạt tính trong môi trưӡng MS tới khả nĕng ra rễ cӫa chồi in vitro. - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưӣng cӫa cây in vitro ngoài vưӡn ươm. 2.2.2. Nghiên cứu các phương pháp xử lý gây t̩o đột biến in vitro cho cây cẩm chướng - Nghiên cӭu xử lý EMS cho cây hoa cẩm chướng in vitro. - Nghiên cӭu xử lý tia gamma nguồn 60Co cho cây hoa cẩm chướng in vitro. - Nghiên cӭu xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho cây cẩm chướng in vitro. 2.2.3. Nghiên cứu phân lập các d̩ng chồi in vitro biến dị sau xử lý và đánh giá sự sinh trưởng phát triển của các d̩ng chồi - Nghiên cӭu phân lập các dạng chồi biến dị về mặt hình thái. - Nghiên cӭu khả nĕng ra rễ cӫa các dạng chồi phân lập sau xử lý. - Nghiên cӭu khả nĕng sinh trưӣng phát triển cӫa các dạng chồi 6 trong điều kiện vưӡn ươm. 2.2.4. Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và phân lập các d̩ng biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên Cây cẩm chướng sau xử lý được đưa ra trồng tại nhà lưới, theo dõi phân lập các dạng biến dị. 2.2.5. Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng biến dị có triển vọng đ̃ phân lập bằng chỉ thị SSR Chọn lọc một số dòng biến dị có tiềm nĕng đánh giá sự sai khác di truyền ӣ mӭc độ phân tử bằng chỉ thị SSR. 2.2.6. Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng đột biến được tuyển chọn - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa thӡi gian khử trùng đến tỷ lệ sống cӫa mẫu - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa môi trưӡng nuôi cấy đến hệ số nhân, sinh trưӣng cӫa chồi in vitro. - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa auxin trong môi trưӡng MS tới khả nĕng ra rễ cӫa chồi in vitro. - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưӣng cӫa cây in vitro ngoài vưӡn ươm. 2.3. Phѭѫng pháp nghiên cӭu. 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trưӡng cơ bản MS (Murahige and Skoog, 1962) với 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose và 100 mg/l innositol) có bổ sung các chất điều tiết sinh trưӣng. Các thí nghiệm nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh mẫu được nuôi cấy ӣ nhiệt độ 20 – 220C, cưӡng độ chiếu sáng 2.000 lux, thӡi gian chiếu sáng 16 giӡ/ngày. Các công thӭc thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thӭc thí nghiệm bố trí 150 mẫu, chia làm 3 lần nhắc lại. 2.3.3. Phương pháp gây t̩o đột biến in vitro Phương pháp gây tạo đột biến được tiến hành theo quy trình cӫa Novak and Brunner (1992) có cải tiến. Mỗi công thӭc thí nghiệm xử lý 3 lần nhắc lại mỗi lần 60 mẫu với liều lượng xử lý như sau: - Xử lý gây t̩o đột biến bằng tác nhân EMS: Mẫu được xử lý ӣ 7 các mӭc nồng độ EMS 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0% với 3 mӭc thӡi gian 1, 2 và 3 giӡ. - Xử lý gây t̩o đột biến bằng tia gamma nguồn 60Co: Mẫu được xử lý với các liều hấp thụ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 Gᵧ. - Xử lý gây t̩o đột biến bằng EMS kết hợp tia gamma nguồn 60Co: Mẫu được xử lý EMS với nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% trong thӡi gian 2 giӡ kết hợp tia gamma nguồn Co60 với liều hấp thụ 10, 20, 30 Gᵧ. 2.3.4. Phương pháp đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đột biến bằng chỉ thị phân tử SSR Để tiến hành phân tích và đánh giá sự sai khác di truyền cӫa các giống hoa cẩm chướng ӣ mӭc độ phân tử, DNA cӫa 7 mẫu hoa cẩm chướng được nhân bản bằng phương pháp PCR với 20 mồi SSR. Các sản phẩm được điện di trên gel agarose 3,5%. 2.3.4.1. Phương pháp chiết tách DNA Trong thí nghiệm này chúng tôi chiết tách DNA tổng số cӫa các mẫu cẩm chướng dựa theo phương pháp cӫa Obara – Okeyo P. and Kako (1998) có cải tiến. 2.3.4.2. Phương pháp PCR – SSR Phản ӭng PCR được thực hiện với nhiều chu kì, nhiệt độ biến tính DNA 950C, nhiệt độ gắn mồi 37- 550C tuỳ theo từng mồi, nhiệt độ tổng hợp chuỗi DNA 720C. 2.3.4.3. Phương pháp điện di trên gel agarose Sản phẩm cӫa phản ӭng PCR-SSR được kiểm tra trên gel agarose 1% và soi gel dưới ánh sáng đèn UV, nhận biết sản phẩm khuếch đại dựa vào thang chuẩn DNA 1Kb. 2.3.4.4. Phương pháp phân tích số liệu Các số liệu này được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc 2.1 cӫa Rohlf (2002) để tính ma trận tương đồng giữa các cặp mẫu. ảệ số PIC - Chỉ số thông tin đa hình (Nei, 1973). ��� = 1 − ∑ ��2 Trong đó: pi là tần số xuất hiện alen thӭ i. 8 Tỷ lệ dị hợp tử (ả%) H%= Số mồi xuất hiện ≥2 alen/ 1locus SSR Tổng số mồi sử dụng-Số mồi khuyết số liệu x 100 2.3.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá đặc điểm nông, sinh học Các chỉ tiêu đánh giá ngoài đồng ruộng theo Quy phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định cӫa Hiệp hội Quốc tế về bảo hộ giống cây trồng mới (Hiệp hội Quốc tế về bảo hộ giống cây trồng mới, 2008). 2.4. Phѭѫng pháp xử lý sӕ liӋu Số liệu được xử lý theo phương phân tích phương sai (ANOVA) theo chương trình Irristat 5.0S và Excel. Số liệu phân tích SSR được xử lý bằng phần mềm NTSYS pc2.1. Sử dụng thuật toán nội suy lagrange để xây dựng mô hình toán học. Sử dụng phương pháp Reed and Muench (1983), Behrens and Karber (1935) để xác định liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm (LD50). Chѭѫng 3 KӂT QUҦ NGHIÊN CӬU VÀ THҦO LUҰN 3.1. Nghiên cӭu nhân giӕng in vitro cho cây cẩm chѭớng giӕng Quұn Chúa 3.1.1. Nghiên cứu t̩o vật liệu khởi đầu Kết quả nghiên cӭu cho thấy, đối với cây cẩm chướng giống Quận Chúa sử dụng hóa chất HgCl2 0,1% để khử trùng mẫu có hiệu quả tốt hơn so với NaOCl (5%). Trong các công thӭc thí nghiệm được nghiên cӭu công thӭc 2 (sử dụng HgCl2 0,1% trong thӡi gian 7 phút) cho hiệu quả tốt nhất. 3.1.2. Nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro 3.1.2.1. ̪nh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng Kết quả nghiên cӭu cho thấy: các công thӭc có bổ sung kinetin hoặc BA đều cho sự phát sinh chồi cao hơn đối chӭng. Tuy nhiên, ӣ mỗi nồng độ BA hoặc kinetin bổ sung khác nhau thì số chồi phát 9 sinh và sự sinh trưӣng thân lá cӫa các chồi cũng có sự khác nhau khác nhau. Trong các công thӭc thí nghiệm công thӭc CT6 (MS + 1,0 mg/l kinetin) cho hệ số nhân chồi cao nhất. 3.1.2.2. ̪nh hưởng của của tổ hợp kinetin và auxin đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng Số liệu cho thấy, khi cố định nồng độ kinetin thay đổi nồng độ IAA và α-NAA với các mӭc 0,25; 0,50; 0,75 và 1,0 mg/l thì chiều cao và hệ số nhân chồi có xu hướng giảm dần (hệ số nhân chồi đạt từ 2,11 đến 2,72 chồi/tháng), thấp hơn so với đối chӭng. Từ kết quả thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 cho thấy môi trưӡng MS bổ sung 1,0 mg/l kinetin cho hệ số nhân chồi cao chất lượng chồi tốt nhất cho giống Quận Chúa. 3.1.3. Nghiên cứu t̩o cây hoàn chỉnh Các công thӭc thí nghiệm khác nhau cho tỷ lệ mẫu phát sinh rễ, số lượng, chiều dài rễ, chiều cao cây, số cặp lá trên cây ӣ các công thӭc thí nghiệm rất khác nhau. Tỷ lệ mẫu phát sinh rễ ӣ các công thӭc thí nghiệm đều cao hơn so với đối chӭng (đạt 92,22 đến 100%). Công thӭc thí nghiệm MS bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính và 0,25 mg/l α-NAA cho tỷ lệ phát sinh rễ, số rễ và chiều dài rễ cao hơn và thӡi gian ra rễ sớm hơn so với các công thӭc thí nghiệm khác. 3.1.4. Nghiên cứu ̫nh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm Qua kết quả nghiên cӭu chúng tôi thấy công thӭc cho tỷ lệ sống cao thì đồng thӡi cây cũng sinh trưӣng phát triển tốt. Trong các loại giá thể được sử dụng giá thể đất cho tỷ lệ sống thấp (83,33%), giá thể đất + trấu hun (1:1) cho tỷ lệ sống cao và chất lượng tốt. 3.2. Nghiên cӭu xử lý gây tҥo đӝt biӃn cho cây hoa cẩm chѭớng in vitro bằng EMS và chiӃu xҥ tia gamma nguӗn 60Co 3.2.1. Nghiên cứu xử lý gây t̩o đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in vitro bằng EMS 3.2.1.1. Nghiên cứu ̫nh hưởng của EMS tới sự sinh trưởng của chồi in vitro cây hoa cẩm chướng EMS đã có ảnh hưӣng đến khả nĕng sống cӫa mẫu. Ӣ các công 10 thӭc xử lý EMS, tỷ lệ mẫu sống giảm mạnh khi tĕng nồng độ EMS và thӡi gian xử lý. Tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất tại công thӭc xử lý nồng độ 0,2% trong thӡi gian 1 giӡ (91,11%) và tỷ lệ mẫu sống thấp nhất tại công thӭc xử lý nồng độ 1,0% trong thӡi gian 3 giӡ (18,89%). Trong các công thӭc xử lý EMS ӣ mӭc thӡi gian 1 và 2 giӡ tỷ lệ phát sinh chồi đạt cao nhất khi xử lý ӣ mӭc nồng độ 0,4%. Bằng thuật toán nội suy chúng tôi đã xây dựng được mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS xử lý và tỷ lệ mẫu chết với các mӭc thӡi gian 1, 2 và 3 giӡ như sau: Y = - 62,16x + 1157,07x2 – 4145,10x3 + 5626,30x4 – 2508,33x5 Y = 1,17 + 52,91x-57,06x2+563,85x3-1107,81x4+581,77x5 Y = 2,22+195,48x-997,26x2+2299,84x3-2109,11x4+689,48x5 Trong đó: x là nồng độ EMS xử lý ; Y là tỷ lệ mẫu chết. Từ kết quả nghiên cӭu đã xác định được liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm (LD50) với các mӭc thӡi gian 1, 2 và 3 giӡ như sau: LD50, EMS,1 giӡ = 0,79%; LD50, EMS,2 giӡ = 0,76%; LD50, EMS, 3 giӡ = 0,71%. 3.2.1.2. ̪nh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái và kh̫ nĕng sinh trưởng của các d̩ng chồi in vitro của cây cẩm chướng Sau xử lý chúng tôi đã phân lập được 5 dạng chồi (Dạng A, dạng b, dạng C, dạng D và dạng E). Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E Hình 3.1. Các dҥng chӗi thu đѭӧc sau xử lý EMS EMS có ảnh hưӣng rất lớn đến khả nĕng sinh trưӣng phát triển 11 cӫa chồi cũng như sự biến đổi hình thái cӫa chồi. Ӣ các công thӭc thí nghiệm, tỷ lệ chồi biến dị tĕng dần theo sự tĕng cӫa nồng độ và thӡi gian xử lý EMS. Sự phân bố cӫa các dạng chồi ӣ các công thӭc không giống nhau. Khi xử lý ӣ nồng độ 0,2% xuất hiện 4 dạng chồi: A, B, C và D. Khi tĕng nồng độ EMS lên 0,4; 0,6; 0,8% thì kết quả cho cả 5 dạng chồi A, B, C, D, E. Ӣ nồng độ xử lý 1,0 % số dạng chồi xuất hiện lại giảm chỉ có 4 dạng: A, B, C và D. Bҧng 3.1. Ҧnh hѭӣng cӫa EMS đӃn sự phát sinh hình thái cӫa chӗi in vitro cây cẩm chѭớng với thӡi gian xử lý 1 giӡ Công thӭc Nồng độ EMS (%) Tỷ lệ các dạng chồi (%) Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E Tỷ lệ chồi biến dị ĐC CT1.1 CT1.2 CT1.3 CT1.4 CT1.5 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 97,76 86,75 74,40 64,91 54,62 47,50 2,24 8,10 17,32 22,32 33,25 34,72 0,00 2,16 2,54 4,78 6,12 15,45 0,00 3,00 4,19 4,28 3,82 2,33 0,00 0,00 1,55 3,70 2,19 0,00 2,24 13,20 15,60 34,75 45,72 52,50 Bҧng 3.2. Ҧnh hѭӣng cӫa EMS đӃn sự phát sinh hình thái cӫa chӗi in vitro cây cẩm chѭớng với thӡi gian xử lý 2 giӡ Công thӭc Nồng độ EMS (%) Tỷ lệ các dạng chồi (%) Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E Tỷ lệ chồi biến dị ĐC CT2.1 CT2.2 CT2.3 CT2.4 CT2.5 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 95,81 81,82 70,24 61,36 51,15 42,12 4,19 10,08 17,55 27,11 32,51 36,42 0,00 3,13 3,75 5,42 10,63 21,46 0,00 3,29 4,64 3,69 3,47 0,00 0,00 1,69 3,81 2,41 2,25 0,00 4,19 18,51 28,25 38,53 49,53 57,88 12 Khi xử lý ӣ nồng độ cao và thӡi gian dài cho tỷ lệ chồi biến dị nhiều tuy nhiên số dạng chồi biến dị xuất hiện lại giảm, đa số các chồi bị chết. Dạng biến dị tĕng chӫ yếu ӣ dạng biến dị B, C, trong đó dạng chồi C có khả nĕng sinh trưӣng phát triển kém. Nồng độ EMS thích hợp cho xử lý gây tạo đột biến in vitro đối với cây cẩm chướng giống Quận Chúa là 0,4% trong thӡi gian 2 giӡ. Bҧng 3.3. Ҧnh hѭӣng cӫa EMS đӃn sự phát sinh hình thái cӫa chӗi in vitro cây cẩm chѭớng với thӡi gian xử lý 3 giӡ Công thӭc Nồng độ EMS (%) Tỷ lệ các dạng chồi (%) Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E Tỷ lệ chồi biến dị ĐC CT3.1 CT3.2 CT3.3 CT3.4 CT3.5 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 94,13 69,71 66,33 53,59 44,71 34,76 5,87 19,71 21,73 31,46 38,06 35,44 0,00 4,69 5,39 9,31 14,33 29,80 0,00 3,50 4,36 3,57 2,90 0,00 0,00 2,39 2,20 2,08 0,00 0,00 5,87 29,93 33,33 46,01 56,33 64,49 Từ kết quả thu được, chúng tôi đã xác định được hệ số tương quan giữa nồng độ EMS xử lý và tỷ lệ chồi biến dị và xây dựng được mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS và tỷ lệ biến dị cӫa chồi với các mӭc thӡi gian xử lý 1, 2 và 3 giӡ như sau: Y = 2,24 + 266,34x-1823,63x2+4983,33x3-5431,25x4+2061,46x5 Y = 4,19+99,15x-192,33x2+311,72x3-201,04x4+36,20x5 Y = 5,87+327,25x-1665,40x2+3870,73x3-3865,10x4+1391,15x5 Trong đó : Y là tỷ lệ chồi biến dị; x là Nồng độ EMS xử lý. 3.2.2. Nghiên cứu xử lý gây t̩o đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in vitro bằng chiếu x̩ tia gamma nguồn 60Co 3.2.2.1. Nghiên cứu ̫nh hưởng của xử lý chiếu x̩ tia gamma nguồn 60Co tới sự phát sinh và sinh trưởng của cây hoa cẩm chướng in vitro Kết quả nghiên cӭu cho thấy, ӣ các công thӭc thí nghiệm cho 13 thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa liều lượng xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co và tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi. Khi liều lượng xử lý tĕng, tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi giảm. Trong các công thӭc thí nghiệm, tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi đạt cao nhất tại CT1 (tỷ lệ sống đạt 91,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt 91,99%), khi xử lý ӣ liều hấp thu 70 Gᵧ thì 100% mẫu bị chết. Từ kết quả thu được, bằng thuật toán nội suy Lagrange chúng tôi đã xây dựng mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa liều lượng xử lý gamma với tỷ lệ mẫu chết. Y= 57,83.10-10x7 + 1,42.10-6x6 - 1,38.10-4x5 + 6,65.10-3x4 - 0,166x3 + 1,995x2 - 8,096x + 2 Trong đó: Y : Tỷ lệ mẫu chết (%); x: Liều lượng xử lý gamma (Gᵧ) Bằng phương pháp Behrens and Karber (1935), đã xác định được liều lượng gây chết 50% mẫu thí nghiệm LD50= 38,57Gᵧ 3.2.2.2. ̪nh hưởng của chiếu x̩ tia gamma nguồn 60Co đến sự phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro cây cẩm chướng Sau xử lý chúng tôi đã phân lập được 6 dạng chồi (Dạng A, dạng F, dạng G, dạng H, dạng I và dạng K). Dạng A Dạng F Dạng G Dạng H Dạng I Dạng K Hình 3.2. Các dҥng chồi thu được sau xử lý tia gamma nguồn 60Co Số liệu thực nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính cӫa tỷ lệ các chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng càng cao tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. Sự phân bố cӫa các dạng chồi ӣ các công thӭc thí nghiệm không giống nhau. Khi xử lý ӣ liều hấp thu 20Gᵧ đến 14 50Gᵧ xuất hiện 6 dạng chồi: A, F, G, H, I và K. Ӣ liều hấp thu thấp 10Gᵧ chỉ thu được 3 dạng chồi A, F, H. Đặc biệt khi tĕng liều lượng xử lý lên 60Gᵧ chỉ thu được 2 dạng chồi I và K. Ӣ liều lượng xử lý cao, tỷ lệ chồi biến dị cao tuy nhiên số dạng chồi biến dị lại giảm. Đặc biệt dạng chồi G, H (chồi có khả nĕng sinh trưӣng phát triển tốt) có xu hướng giảm mạnh. Bҧng 3.4. Tỷ lӋ chӗi biӃn dӏ vƠ các dҥng chӗi sau xử lý tia gamma nguӗn 60Co Liều hấp thu (Gᵧ) Dạng A (%) Dạng F (%) Dạng G (%) Dạng H (%) Dạng I (%) Dạng K (%) Tỷ lệ biến dị (%) 0 96,20 3,80 0,00 0,00 0,00 0,00 3,80 10 89,68 6,53 0,00 3,79 0,00 0,00 10,32 20 64,04 9,53 7,39 7,39 6,35 5,29 35,96 30 52,99 10,72 13,69 8,93 6,54 7,14 47,01 40 41,54 18,00 8,92 6,77 10,16 14,61 58,46 50 22,34 25,12 8,37 8,37 13,71 22,09 77,66 60 0,00 0,00 0,00 0,00 16,67 83,33 100,0 70 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Từ kết quả nghiên cӭu chúng tôi cũng đã xây dựng được mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co và tỷ lệ chồi biến dị. Y= 7,255.10-8x6 - 15,533.10-6x5 + 12,865.10-4x4 - 5,05.10-2x3 + 0,92x2 - 4,639x + 3,80 Trong đó: Y là tỷ lệ chồi biến dị (%); X liều hấp thu (Gᵧ). 3.2.3. Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và chiếu x̩ tia gamma nguӗn 60Co cho cây hoa cẩm chướng in vitro 3.2.3.1. Nghiên cứu ̫nh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co tới sự sinh trưởng của chồi in vitro cây hoa cẩm chướng Kết quả thí nghiệm cho thấy khi tĕng liều xử lý lên thì tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi giảm dần. Trong các công thӭc thí 15 nghiệm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt cao nhất tại công thӭc CT1 (Tỷ lệ mẫu sống 87,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 89,33%), tỷ lệ mẫu sống thấp nhất tại công thӭc CT12 (Tỷ lệ mẫu sống 24,67%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 60,00%). 3.2.3.2. ̪nh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co đến sự phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro Sau xử lý chúng tôi đã phân lập 8 dạng chồi (Dạng A, dạng F, dạng G, dạng L, dạng M, dạng N, dạng O và dạng P). Dạng A Dạng E Dạng G Dạng L Dạng M Dạng N Dạng O Dạng P Hình 3.3. Các dҥng chӗi sau xử lý kӃt hӧp EMS vƠ tia gamma nguӗn 60Co Số liệu thực nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính cӫa tỷ lệ các chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng càng cao tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. Sự biến động về số dạng chồi biến dị cũng có xu hướng tương tự như khi xử lý riêng rẽ EMS hoặc chiếu xạ tia gamma. Khi tĕng liều xử lý thì tỷ lệ chồi biến dị có xu hướng tĕng lên, tuy nhiên số dạng chồi lại có xu hướng giảm ӣ các công thӭc xử lý với liều lượng cao. Đặc biệt dạng chồi G (chồi có khả nĕng sinh trưӣng phát triển tốt) chỉ xuất hiện ӣ công thӭc CT4 đến CT10. Công thӭc CT5 xuất hiện nhiều dạng chồi, trong đó dạng chồi tiềm nĕng có tỷ lệ cao (Dạng G: 9,12%). Xử lý kết hợp EMS và tia gamma xuất hiện nhiều dạng chồi biến dị hơn hơn so với xử lý riêng rẽ hai tác nhân này (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009). 16 Bҧng 3.5. Tỷ lӋ chӗi biӃn dӏ vƠ các dҥng chӗi in vitro sau xử lý kӃt hӧp EMS vƠ tia gamma nguӗn 60Co Công thӭc Nồng độ EMS (%) Liều hấp thụ gamma (Gᵧ) Dạng A (%) Dạng F (%) Dạng G (%) Dạng L (%) Dạng M (%) Dạng N (%) Dạng O (%) Dạng P (%) Tỷ lệ chồi biến dị (%) ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10 CT11 CT12 0,0 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 0,0 10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30 95,92 86,79 79,65 71,26 72,66 57,50 37,89 45,96 34,34 29,49 39,62 28,90 27,77 0,00 4,73 5,33 11,63 8,48 7,98 18,40 13,27 15,48 18,49 16,36 25,52 27,87 0,00 0,00 0,00 0,00 3,26 9,12 6,90 6,60 7,16 5,44 4,36 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 4,78 6,54 7,38 7,82 8,96 4,08 8,50 10,18 10,95 8,36 11,30 13,80 11,18 11,13 12,04 12,26 15,65 18,15 0,00 0,00 4,84 6,17 7,26 8,72 9,20 11,18 11,45 12,04 11,12 7,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6,90 2,49 6,26 6,02 0,00 3,91 8,62 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 5,37 6,90 9,32 9,39 9,95 8,90 10,36 8,62 4,08 13.21 20,35 28,74 27,34 42,50 62,11 54,04 65,66 70,51 60,38 71,10 72,23 16 17 3.3. Nghiên cӭu khҧ nĕng sinh trѭӣng cӫa các dҥng chӗi in vitro 3.3.1. Nghiên cứu kh̫ nĕng ra rễ của các d̩ng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý Trong môi trưӡng ra rễ, trừ dạng chồi G, các dạng chồi biến dị có khả nĕng ra rễ thấp hơn so với dạng chồi bình thưӡng. Khả nĕng ra rễ cao nhất là dạng G (100%) thấp nhất là dạng chồi C (37,78%), đặc biệt dạng chồi I và dạng chồi M không có khả nĕng sống khi cấy sang môi trưӡng ra rễ. 3.3.2. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các d̩ng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện khí canh Các dạng chồi biến dị có khả nĕng sống và sinh trưӣng thân lá thấp hơn rất nhiều so với dạng chồi bình thưӡng. Tỷ lệ sống cӫa các dạng chồi rất khác nhau, cao nhất là chồi dạng G (100%) sau đó là chồi dạng A, B, H, D, E, F, L, P, K,. Chồi dạng C, K có khả nĕng sống rất thấp (Dạng C: 3,33%; dạng K: 13,33%). Chồi dạng I, M, O không có khả nĕng sống ngay cả trong điều kiện vưӡn ươm. 3.3.3. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các d̩ng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý giai đo̩n ngoài đồng ruộng Hầu hết các dạng chồi khả nĕng trong điều kiện vưӡn ươm kém (dạng C, K, P) đều bị chết sau khi trồng ra ngoài ruộng. Khả nĕng sống và sinh trưӣng cӫa các dạng chồi ӣ giai đoạn ngoài đồng ruộng cũng có sự tương đồng với giai đoạn trong phòng thí nghiệm và giai đoạn khí canh. Cụ thể dạng chồi G, A có khả nĕng sinh trưӣng phát triển tương đối tốt, cho tỷ lệ sống cao trên 80%, thân lá phát triển tốt. Các dạng chồi D, E, F, H, L, N có tỷ lệ sống thấp. 3.4. Nghiên cứu ҧnh hưởng của xử lý gây tҥo đột biến đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đoҥn ngoài đồng ruӝng Để đánh giá hiệu quả cӫa sự tác động cӫa các tác nhân gây đột biến chúng tôi đã tiến hành phân lập các dạng biến dị về mặt hình thái và khả nĕng sinh trưӣng phát triển cӫa cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng. Qua theo dõi chúng tôi đã phân lập được một số dạng biến dị về thӡi gian sinh trưӣng, hình thái lá và màu sắc hoa và được phân thanh 3 nhóm như sau: 18 Nhóm 1: Biến dị về hình thái lá: lá cuộn, lá hình ống. Nhóm 2: Chồi nách phát triển. Nhóm 3: Biến dị về màu sắc hoa: H1: Hoa màu tím; H2: Hoa màu phấn hồng viền tím; H3: Hoa màu trắng viền đỏ; H4: Hoa màu trắng sọc tím; H5: Hoa màu trắng viền tím nhẹ, một số cánh hoa không có viền tím; H6: Hoa trắng viền phấn hồng; H7: Hoa màu tím nhạt viền tím đậm. Đối chӭng Lá hình ống Đầu lá cuộn Chồi nách phát triển Hình 3.10. Mӝt sӕ dҥng biӃn dӏ vӅ hình thái thơn lá Đối chӭng H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 Hình 3.4. Hình ҧnh mӝt sӕ dҥng biӃn dӏ vӅ màu sắc hoa 3.4.1. ̪nh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đo̩n ngoài đồng ruộng Khi xử lý EMS xuất hiện cả 3 nhóm biến dị, trong đó có 5 dạng biến dị về màu sắc hoa (H1, H2, H4, H5, H7), dạng H3, H6 không xuất hiện khi xử lý EMS. Ӣ các công thӭc xử lý nồng độ cao và thӡi gian dài, các biến dị về hình thái thân lá xuất hiện nhiều hơn, biến dị về hoa tĕng chӫ yếu ӣ dạng H5 (dạng biến dị không có lợi). Trong các công thӭc thí nghiệm công thӭc CT7 (xử lý EMS nồng độ 0,4% trong thӡi gian 2 giӡ) cho biến dị về màu sắc hoa nhiều nhất. Đặc biệt là dạng hoa H7 chỉ xuất hiện ӣ công thӭc này. 19 3.4.2. Ҧnh hưởng của xử lý chiếu xҥ tia gamma nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoҥn ngoài đồng ruộng Kết quả nghiên cӭu cho thấy khi xử lý chiếu xạ gamma xuất hiện 2 nhóm biến dị (biến dị về hình thái lá và biến dị về màu sắc hoa), biến dị khả nĕng phát triển chồi nách mạnh không xuất hiện. Trong nhóm biến dị về màu sắc hoa chỉ thu được 3 dạng (H4, H5, H6), dạng H1, H2, H3 và H7 không xuất hiện khi xử lý chiếu xạ gamma riêng rẽ. Trong các công thӭc thí nghiệm công thӭc CT3 (xử lý liều 30Gᵧ) cho biến dị về màu sắc hoa nhiều nhất. Đặc biệt là dạng hoa H7 chỉ xuất hiện ӣ công thӭc này. 3.4.3. ̪nh hưởng của xử lý kết hợp EMS và chiếu x̩ tia gamma nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đo̩n ngoài đồng ruộng Kết quả nghiên cӭu cho thấy việc xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ gamma đã làm tĕng tỷ lệ biến dị lên rất nhiều so với xử lý riêng rẽ EMS hoặc gamma. Tỷ lệ biến dị đạt cao nhất tại công thӭc CT5 (24,66%) và thấp nhất tại công thӭc CT1 (4,0%). Xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ gamma cho kết quả xuất hiện cả 3 nhóm biến dị (biến dị về hình thái lá, biến dị về phát triển chồi nách và biến dị về màu sắc hoa). Tuy nhiên, trong nhóm biến dị về màu sắc hoa chỉ thu được 5 dạng (H1, H3, H4, H5 và H7), dạng H2 và H6 không xuất hiện. Kết quả nghiên cӭu cho thấy khi xử lý kết hợp làm xuất hiện thêm một dạng mới (H3). Kết quả thực nghiệm cho thấy, các dạng biến dị về màu sắc tập chung chӫ yếu ӣ dạng chồi A (dạng chồi bình thưӡng), một số ít xuất hiện ӣ dạng chồi B, F, G, H. Dạng biến dị H5 chiếm tỷ lệ cao ӣ dạng chồi F. Các dạng chồi D, E, L chỉ xuất hiện các biến dị về hình thái lá và khả nĕng phát triển chồi nách mạnh. 3.4.4. Đặc điểm hình thái một số d̩ng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý giai đo̩n ngoài đồng ruộng Về đặc điểm hình thái cӫa một số dạng biến dị về màu sắc hoa ӣ các chỉ tiêu khác nhau có sự khác nhau. Trong các giai đoạn phát triển khác nhau, các cá thể trong các dòng đột biến có tốc độ tĕng trưӣng tương tự nhau. Trong giai đoạn 20 chuyển sang giai đoạn sinh trưӣng sinh thực các dòng bắt đầu có tốc độ phát triển khác nhau dẫn đến chiều cao trung bình cӫa các dòng bắt đầu có sự thay đổi. Chiều cao cây cӫa các dạng H1, H3, H4, H6, H7 và dạng đối chӭng tương đối đồng đều. Dạng H5 có chiều cao cây trung bình thấp hơn (98 ± 9,23cm). Kích thước hoa khi nӣ dao động từ 5,2 đến 7,1 cm. Dạng H2, H3, H4 có kích thước lớn hơn dạng đối chӭng và các dạng còn lại. Cấu trúc cánh hoa có sự khác biệt, bề mặt cánh hoa dạng đối chӭng, H4 và H5 gấp nếp, dạng H1, H2, H3, H6, H7 bề mặt cánh hoa phẳng; Rìa cánh hoa dạng H2 và dạng H7 có sự khác biệt so với đối chӭng và các dạng còn lại (rìa cánh hoa rĕng cưa nhẹ, nông). Độ rộng cӫa cánh hoa ngoài cùng cӫa các dạng đột biến cũng có sự khác nhau, các dạng H2, H3 và H4 có độ rộng trên 3 cm, các dạng còn lại biến động từ 2,1 đến 2,8 cm. Số lượng vòi nhụy ӣ các dạng không có sự khác nhau tuy nhiên độ dài cӫa vòi nhụy cӫa dạng H1 và dạng H3 vòi nhụy dài hơn. 3.5. Nghiên cӭu đánh giá sự sai khác di truyӅn cӫa mӝt sӕ dòng cẩm chѭớng bằng kỹ thuұt SSR 3.5.1. Kết qu̫ phân tích sự nhân b̫n DNA với các cặp mồi Kết quả phân tích và đánh giá sự sai khác di truyền cӫa các giống hoa cẩm chướng ӣ mӭc độ phân tử, DNA cӫa 7 mẫu hoa cẩm chướng (gồm 6 dòng đột biến H1, H2, H3, H4, H6, H7 và giống Quận Chúa) được nhân bản bằng phương pháp PCR với 20 mồi SSR thu được tổng số 150 bĕng với kích thước chiều dài nhỏ nhất khoảng 100bp và bĕng có kích thước lớn nhất khoảng 1200bp. Kết quả nghiên cӭu cho thấy: Các dòng đột biến đều có sự khác biệt về mặt di truyền so với giống gốc, trong đó sự sai khác lớn nhất là dòng H3 (hệ số tương đồng di truyền H3-H1: 0,5098) và thấp nhất là dòng H4 (hệ số tương đồng di truyền H4-ĐC: 0,8293). Trong 20 cặp mồi SSR được lựa chọn để nghiên cӭu, mồi CB001a, CDB221 không phân biệt được sự sai khác về mặt di truyền giữa các dòng, giống hoa cẩm chướng được nghiên cӭu. Mồi CB016a 21 chỉ cho sự sai khác giữa mẫu đối chӭng và các dòng khác, không có sự sai khác giữa các dòng biến dị được nghiên cӭu. Mồi DCA221, CB047a, có thể sử dụng để phân biệt dòng H7 với các dòng khác và đối chӭng. Cặp mồi cho kết quả đa hình cao nhất là CB004a, CB026a với tổng số bĕng thu được tương ӭng là 13 và 11. 3.5.2. Kết qu̫ phân tích hệ số PIC với các cặp mồi Kết quả cho thấy hệ số PIC dao động từ 0,0 (các cặp mồi chỉ có đơn hình) đến giá trị cao nhất là 0,83 ӣ cặp mồi CB004a. Hệ số PIC trung bình cӫa 20 cặp mồi trên 7 dòng cẩm chướng nghiên cӭu là 0,26 cho thấy các locus gen khá đa dạng. 3.5.3. Đánh giá độ thuần di truyền của các dòng cẩm chướng nghiên cứu Các dòng, giống cẩm chướng nghiên cӭu có tỷ lệ dị hợp tử (H%) thay đổi từ 14,29% đến 29,41%. Tỷ lệ dị hợp tử cao nhất ӣ dòng đột biến H3 (29,41%) tiếp theo là dòng H2, H6, H1, H4, ĐC và H7. Tỷ lệ dị hợp tử thấp nhất ӣ dòng H7 (14,29%). Kết quả này cho thấy các dòng, giống cẩm chướng nghiên cӭu có độ thuần di truyền rất cao. 3.5.4. ảệ số đồng d̩ng và mối quan hệ di truyền giữa các dòng, giống cẩm chướng Kết quả nghiên cӭu cho thấy hệ số tương đồng di truyền cӫa 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa dao động trong khoảng 0,5098 đến 0,8293. Mӭc sai khác di truyền lớn nhất là dòng H1-H3 (khoảng cách di truyển là 0,4902). Cặp giống ĐC và dòng H4 có sự tương đồng di truyền cao nhất (khoảng cách di truyền 0,1707) Từ sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống cẩm chướng cho thấy mӭc độ sai khác di truyền giữa các giống có sự khác nhau. Ӣ mӭc tương đồng 0,75 có thể chia 7 dòng, giống cẩm chướng thành 6 nhóm: Nhóm 1: Gồm giống ĐC và dòng H4; Nhóm 2: Dòng H1; Nhóm 3: Dòng H2; Nhóm 4: Dòng H3; Nhóm 5: Dòng H6; Nhóm 6: Dòng H7. Kết quả phân tích DNA hoàn toàn phù hợp với sự khác biệt giữa các dòng, giống được nghiên cӭu về mặt hình thái như đặc điểm thân lá, màu sắc, cấu trúc cánh hoa. 22 Hình 3.5. Mối quan hệ di truyền giữa các dòng, giống cẩm chướng 3.6. Nghiên cӭu nhân giӕng in vitro mӝt sӕ dòng đӝt biӃn đѭӧc tuyển chọn 3.6.1. ̪nh hưởng chế độ khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu Ӣ cả 2 dòng H6 và H7, trong các công thӭc thí nghiệm, công thӭc sử dụng HgCl2 0,1% trong thӡi gian 7 phút cho hiệu quả tốt nhất (tỷ lệ mẫu sống đạt 76,33%; tỷ lệ mẫu nhiễm chỉ có 7,67%; thӡi gian phát sinh chồi sớm). 3.6.2. Đánh giá kh̫ nĕng nhân nhanh in vitro của các dòng cẩm chướng đột biến đ̃ chọn lọc sau xử lý in vitro. Kết quả cho thấy trong đối với dòng H6, công thӭc bổ sung 0,5 mg/l kinetin + 0,5 mg/l BA thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro. Đối với dòng H7, công thӭc bổ sung 1,0 mg/l kinetin là thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro. 3.6.3. Nghiên cứu ̫nh hưởng của auxin đến kh̫ nĕng t̩o cây in vitro hoàn chỉnh của hai dòng cẩm chướng H6 và H7 Môi trưӡng tạo rễ tối ưu cӫa 2 dòng H6 và H7 có sự khác nhau. Đối với dòng H6 công thӭc 1 (MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA) là tốt nhất đối với sự ra rễ cӫa dòng đột biến này, còn với dòng H7 môi trưӡng tốt nhất cho sự ra rễ in vitro là MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,75 mg/l α-NAA. Trên các môi trưӡng này chồi in vitro không chỉ ra rễ thuận lợi mà chồi sinh trưӣng phát triển tốt. 23 3.6.4. Nghiên cứu ̫nh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm Qua kết quả nghiên cho thấy công thӭc cho tỷ lệ sống cao thì đồng thӡi cây cũng sinh trưӣng phát triển tốt. Trong các loại giá thể được nghiên cӭu trong phương pháp địa canh sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1) cho cả 2 dòng H6 và H7 cho kết quả tốt nhất. KӂT LUҰN VÀ Đӄ NGHӎ 1. KӃt luұn 1) Để nhân giống in vitro cho cây hoa cẩm chướng giống Quận Chúa sử dụng quy trình nuôi cấy như sau: Khử trùng mẫu dùng HgCl2(0,1%) trong thӡi gian 7 phút; giai đoạn nhân nhanh dùng môi trưӡng MS có bổ sung 1,0 mg/l kinetin; giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh dùng môi trưӡng dinh dưỡng MS có bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA; khi thích ӭng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên bằng phương pháp địa canh sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1) sẽ cho hiệu quả tốt nhất. 2) Xử lý gây tạo đột biến in vitro bằng tác nhân gây đột biến EMS và tia gamma làm giảm khả nĕng sống, khả nĕng phát sinh chồi, sự sinh trưӣng cӫa đoạn thân mang mắt ngӫ cây cẩm chướng giống Quận Chúa (tỷ lệ sống giảm so với đối chӭng từ 8,89 đến 78,89% khi xử lý bằng EMS; từ 6,67 đến 98,0% khi xử lý bằng chiếu xạ tia gamma; từ 8,00 đến 70,66% khi xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co. 3) Xử lý gây tạo đột biến in vitro bằng tác nhân gây đột biến EMS và tia gamma nguồn 60Co làm làm tĕng tỷ lệ biến dị cho cây cẩm chướng nuôi cấy in vitro (từ 2,0 đến 18,66 lần so với đối chӭng khi xử lý bằng EMS; từ 2,67 đến 16,67 lần so với đối chӭng khi xử lý bằng chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co; từ 1,5 đến 9,24 lần so với đối chӭng khi xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co). 4) Để gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng in vitro giống Quận Chúa đạt hiệu quả cao đối với phương pháp xử lý bằng hóa chất EMS, nồng độ và thӡi gian xử lý thích hợp là 0,4% trong thӡi gian 2 giӡ; đối với phương pháp xử lý tia gamma nguồn 60Co, xử lý với liều 24 hấp thu 30 Gγ; đối với phương pháp xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co nên xử lý EMS nồng độ 0,2% trong thӡi gian 2 giӡ kết hợp chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co với liều hấp thu 20 Gγ. Trong các phương pháp gây tạo đột biến in vitro được nghiên cӭu, phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro bằng hóa chất EMS cho hiệu quả tốt hơn, cho tỷ lệ biến dị cao và xuất hiện nhiều biến dị có tiềm nĕng. 5) Đề tài đã chọn lọc được 6 dòng đột biến về màu sắc có tiềm nĕng phát triển thành giống mới (dòng H1, H2, H3, H4, H6 và H7). Đánh giá sự sai khác di truyền các dòng đột biến bằng chỉ thị phân tử SSR cho thấy, các dòng đột biến về màu sắc có sự khác biệt về mặt di truyền so với giống gốc. Trong đó dòng H3 có sự sai khác di truyền lớn nhất (hệ số tương đồng di truyền H3 - H1: 0,5098) và sự sai khác di truyền thấp nhất là dòng H4 (hệ số tương đồng di truyền H4 - ĐC: 0,8293). 6) Do có sự khác nhau về cấu trúc di truyền nên sự cảm ӭng với môi trưӡng nuôi cấy in vitro giữa dòng H6 và H7 có sự khác nhau. Để nhân giống in vitro cho 2 dòng đột biến H6 và H7 sử dụng môi trưӡng như sau: Đối với dòng H6: Khử trùng mẫu dùng HgCl2(0,1%) trong thӡi gian 7 phút; môi trưӡng nhân nhanh phù hợp là MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l kinetin; môi trưӡng phù hợp để tạo cây hoàn chỉnh là MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA. Khi đưa ra ngoài vưӡn ươm nên trồng sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1); Đối với dòng H7: Khử trùng mẫu dùng HgCl2 (0,1%) trong thӡi gian 7 phút; các môi trưӡng nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh thích hợp lần lượt là: MS + 1,0 mg/l kinetin và MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,75 mg/l α-NAA. Khi đưa ra ngoài vưӡn ươm nên trồng sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1). 2. ĐӅ nghӏ 1) Bổ sung kết quả nghiên cӭu nuôi cấy in vitro vào quy trình vi nhân giống cây hoa cẩm chướng. 2) Ӭng dụng các dòng đột biến đã gây tạo được vào công tác chọn giống hoa cẩm chướng. 3) Mӣ rộng phổ xử lý EMS và tia gamma cho các giống khác nhau để tìm được chế độ xử lý thích hợp cho từng giống nhằm tạo nguồn vật liệu cho ý nghĩa cho công tác chọn tạo giống cây cẩm chướng. DANH MỤC CÔNG TRÌNH Đà CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Vũ Hoàng Hiệp và Nguyễn Thị Lý Anh (2013). Ảnh hưởng của xử lý đột biến in vitro bằng chiếu xạ gamma đối với cây hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.), Báo cáo khoa học Proceedings, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Quyển 2: Công nghệ sinh học Vi sinh, công nghệ sinh học Thực vật, NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ: 817 - 821. 2. Vũ Hoàng Hiệp và Nguyễn Thị Lý Anh (2013). Ảnh hưởng của xử lý đột biến in vitro bằng Ethyl methane sulphonate (EMS) kết hợp chiếu xạ tia gamma đến sự biến dị ở cây hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.), Tạp chí Khoa học phát triển, 8: 1092 - 1100.