Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hoá học và thăm dò hoạt tính sinh học của ba loài thực vật ngập mặn vùng ven biển Việt Nam: Cỏ chông (spinifex littoreus), hếp (scaevola taccada) và cóc đỏ (lumnitzera littorea)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA BA LOÀI THỰC VẬT NGẬP MẶN VÙNG VEN BIỂN VIỆT NAM: CỎ CHÔNG (SPINIFEX LITTOREUS), HẾP (SCAEVOLA TACCADA) VÀ CÓC ĐỎ (LUMNITZERA LITTOREA) Chuyên ngành : Hóa hữu cơ Mã số: 62440114 HÀ NỘI, 2017 Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TSKH. TRẦN VĂN SUNG 2. TS. TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO Phản biện 1: Phản biện 2: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học Viện họp tại Học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, hồi 14 giờ, ngày ... tháng...4 năm 2017 1I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Theo thống kê của tổ chức Y tế Thế giới (2015), Việt Nam đứng ở top 2 trên bản đồ ung thư thế giới, bình quân mỗi năm có khoảng 70.000 người chết và 200.000 người mắc bệnh mới, con số này đang tiếp tục gia tăng. Trước tình hình đó các nhà khoa học không ngừng tìm kiếm các hợp chất mới có thể tiêu diệt căn bệnh thời đại. Trong những năm gần đây một số quốc gia như Ấn Độ, Thái Lan, Indonesia, Brazin, Trung Quốc, Úc...đã tập trung nghiên cứu khai thác và sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ các loài cây ngập mặn. Tuy nhiên ở Việt Nam hiện nay các công trình nghiên cứu thăm dò về hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của các loài cây ngập mặn đã được ứng dụng trong dân gian để làm thuốc còn rất ít. Chính vì vậy, với mong muốn phát hiện các chất có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học lý thú từ các loài ngập mặn ven biển đã được người dân sử dụng làm thuốc nhưng chưa được nghiên cứu nhiều về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học, chúng tôi đã lựa chọn 3 loài cây vùng ngập mặn là loài Cỏ chông (S. littoreus (Burm. f.) Merr.), loài Hếp (S. taccada (Gaertn. Roxb.) và loài Cóc đỏ (L. littorea (Jack) Voigt.) làm đối tượng để nghiên cứu. Với mong muốn như trên, luận án đặt ra mục tiêu cụ thể như sau: 1. Chiết xuất phân lập các chất từ 3 loài cây ngập mặn Cỏ chông (Spinifex littoreus), Hếp (Scaevola taccada) và Cóc đỏ (Lumnitzera littorea). 2. Xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập. 3. Đánh giá được hoạt tính kháng vi sinh vật, gây độc tế bào, chống oxy hóa của các dịch chiết và một số chất phân lập được từ 3 loài cây kể trên. Đề tài: “Nghiên cứu thành phần hoá học và thăm dò hoạt tính sinh học của ba loài thực vật ngập mặn vùng ven biển Việt Nam: Cỏ chông (Spinifex littoreus), Hếp (Scaevola taccada) và Cóc đỏ (Lumnitzera littorea)” là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, đóng góp mới vào việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài ngập mặn ven biển, một lĩnh vực chưa có nhiều công trình nghiên cứu ở Việt Nam. Các kết quả của 2đề tài sẽ góp phần giải thích về bản chất hóa học của các vị thuốc dân gian, nâng cao giá trị sử dụng của các loài cây ngập mặn. 2. Những đóng góp mới của luận án  Lần đầu tiên ở Việt Nam và trên thế giới, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và loài Cỏ chông (Spinifex littoreus) được nghiên cứu. Từ loài Cỏ chông đã phân lập và xác định cấu trúc của 11 hợp chất trong đó có 2 chất lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên. Từ loài Cóc đỏ đã phân lập và xác định cấu trúc của 12 hợp chất. Luận án cho thấy dịch chiết từ hoa của loài Cỏ chông có hoạt tính chống ung thư vú (MCF7) và dịch chiết từ cành của loài Cóc đỏ có hoạt tính chống oxy hóa (theo phương pháp DPPH).  Lần đầu tiên ở Việt Nam thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Hếp (Scaevola taccada) được nghiên cứu. Đã phân lập và xác định cấu trúc của 9 hợp chất trong đó có 7 hợp chất lần đầu phân lập từ loài này. II. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU: Đề cập đến ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án.  CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần tổng quan tài liệu tập hợp các nghiên cứu trong nước và Quốc tế về các vấn đề liên quan đến 3 loài thực vật ngập mặn nghiên cứu.  CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng nghiên cứu - Loài Cỏ chông (Spinifex littoreus) thu hái tại bờ biển xã Tam Hải, tỉnh Quảng Nam: Cặn chiết n- hexan; n- butanol hoa Cỏ chông. - Loài Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) thu hại tại bờ biển Thuận An Thừa Thiên Huế: Cặn chiết ethyl acetate và methanol lá và cành Cóc đỏ. - Loài Hếp (Scaevola taccada) thu hái tại đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi: Cặn chiết n-hexan và ethyl acetate lá cây Hếp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật. 2.2.2. Phương pháp phân lập, tinh chế các hợp chất 3Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột (CC). 2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.2.3.1. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Sử dụng phương pháp giếng nồng độ trong môi trường lỏng để đánh giá mức độ kháng khuẩn của các mẫu thử. 2.2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH Sử dụng DPPH tạo gốc oxy hóa tự do để sàng lọc các chất chống oxy hóa. 2.2.3.3. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào Xác định hàm lượng protein tế bào dựa vào mật độ quang học (OD) đo được khi thành phần protein tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). 2.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc Xác định cấu trúc dựa trên các thông số vật lý kết hợp với các phương pháp phổ hiện đại gồm: Độ quay cực [α]D, phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR): 1H-NMR, 13C-NMR và hai chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC, COSY, NOESY. 2.3. Dữ liệu phổ của các chất phân lập được từ 3 loài cây nghiên cứu 2.3.1. Cây Hếp (S. taccada) 2.3.1.1. Các chất phân lập từ dịch chiết n-hexan lá cây Hếp  Glycerol 1,3-dihexadecanoate-2 (9Z,12Z-octadecadienoate) (ST1): Chất dạng dầu. (+)-ESI-MS (m/z): 853.5 [M + Na]+ (10%); 354.3 [M+2H-C15H31CO - C15H31CO]+ (100%). IR (KBr, υ = cm-1): 2937 (-CH alkan), 1744 (C=O ester), 1632 (C=C). 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 5.37 - 5.31 (4H, m, H-9’’, H-10’’, H-12’’, H-13’’), 5.26 - 5.25 (1H, m, H-2), 4.29 (2H, dd, J = 12; 4.5 Hz, H1a, H3a), 4.14 (2H, dd, J = 12.0; 6.0 Hz, H1b, H3b), 2.76 (2H, t, J = 6.5 Hz, -CH=CH-CH2-CH=CH-), 2.32 - 2.29 (6H, m, OCOCH2CH2), 2.06 - 1.99 (4H, m, CH2CH2-CH=CH-), 1.60 (6H, m, OCOCH2CH2), 1.36 - 1.25 (62H, m, CH2), 0.92 - 0.84 (9H, t, J = 6.5 Hz, CH3). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 173.29, 173.26, 172.85 (C=O- ester), 130.2 ; 129.72; 128.10; 127.92 (CH=CH); 68.91; 62.11; 34.07 - 22.57 (CH2), 14.10; 14.06 (CH3). 4 α-amyrin (ST2): Chất dạng bột trắng. IR (KBr, υ = cm-1): 3399.80 (- OH), 2925 (-C-H), 1651 (C=C). (+)-ESI-MS (m/z): 445.20 [M+H2O+H]+ (20%). 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 5.15 (1H, t, J = 3.5 Hz, H-12), 3.24 (1H, m, H-3), 2.02 (2H, dt, J =4.5; 13.5 Hz, H-2), 1.94 - 1.92 (2H, m, H-11), 1.65 (4H, m, H-1, H-15), 1.58 - 1.52 (1H, m, H-9), 0.75 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-5); 1.02 (s, H-23); 0.81 (s, H-24); 0.97 (s, H-25); 1.01 (s, H-26); 1.09 (s, H-27); 0.89 (s, H-28); 0.94 (d, J = 7.0 Hz, H-29), 0.80 (d, J = 7.0 Hz, H-30). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 38.83 (C-1), 28.14 (C-2), 79.09 (C-3), 38.83 (C-4), 55.22 (C-5), 18.38 (C-6), 32.97 (C-7), 40.05 (C-8), 47.76 (C-9), 36.93 (C-10), 23.40 (C-11), 124.46 (C-12), 139.62 (C-13), 42.12 (C-14), 27.3 (C-15), 26.65 (C-16), 33.78 (C-17), 59.11 (C-18), 39.70 (C-19), 39.64 (C-20), 31.28 (C-21), 41.56 (C- 22), 28.77 (C-23), 15.04 (C-24), 15.70 (C-25), 16.89 (C-26), 23.29 (C-27), 28.15 (C-28), 17.48 (C-29), 21.40 (C-30).  Stigmasterol (ST3): Chất hình kim. IR (KBr, ν = cm-1): 3397.79 (- OH), 2951.45 (-C-H), 1664.76 (C=C). (+)-ESI-MS (m/z): 413.05 [M+H]+ (100 %). 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 5.35 (1H, m, H-6), 5.15 (1H, dd, J = 15.2; 8.6 Hz, H-23), 5.02 (1H, dd, J = 15.2; 8.7 Hz, H-22), 3.52 (1H, m, H-3), 1.02 (s, H- 19), 1.01 (d, J = 6.7 Hz, H-21), 0.85 (d, J = 6.5 Hz, H-26), 0.84 (t, J = 7.1 Hz, H- 29), 0.81 (d, J = 6.6 Hz, H-27), 0.69 (s, H-18). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 37.28 (C-1), 31.68 (C-2), 71.80 (C-3), 42.32 (C-4), 140.77 (C-5), 121.70 (C-6), 31.88 (C-7), 31.88 (C-8), 50.18 (C-9), 36.53 (C-10), 21.22 (C-11), 39.70 (C-12), 42.23 (C-13), 56.88 (C-14), 24.37 (C-15), 28.91 (C-16), 55.98 (C-17), 12.05 (C- 18), 18.99 (C-19), 40.49 (C-20), 21.22 (C-21), 138.31 (C-22), 129.30 (C-23), 51.25 (C-24), 31.91 (C-25), 19.40 (C-26), 21.08 (C-27), 25.40 (C-28), 12.24 (C- 29).  Myricadiol (ST4): Chất dạng thạch mềm. IR (KBr, ν = cm-1): 3493.99; 3299.90 (-O-H), 2981.1 (-C-H), 1627.36 (C=C), 1088.85 (-C-O). (+)- ESI-MS (m/z): 443.18 [M+H]+ (15%); 413.14 [M+2H-CH2OH]+ (100%). 1H- NMR (DMSO, 500 MHz): 1.61; 1.59 (2H, m, H1α,H1β); 1.56; 1.53 (2H, m, H2α, H2β); 3.17 (1H, br s, H-3); 4.25 (1H, br s, 3-OH), 0.72 (1H, s, H-5), 2.17; 1.33 5(2H, m, H7α,H7β); 1.44 (1H, m, H-9);1.38; 1.35 (2H, m, H12α, H12β); 5.41 (1H, m, H-15); 2.12; 1.96 (2H, m, H16α, H16β); 0.47 (1H, m, H-18); 1.41; 1.13 (2H, m, H19α, H19β); 1.25; 1.23 (1H, m, H21α, H21β); 1.48; 1.46 (2H, m, H22α, H22β); 0.98 (3H, s, H-23); 0.7 (3H, s, H-24); 0.88 (3H, s, H-25); 1.01 (3H, s, H-26); 0.90 (3H, s, H-27); 2.98; 2.87 (2H, m, H28α, H28β); 4.25 (1H, br s, 28-OH); 0.93 (3H, s, H-29), 0.86 (3H, s, H-30). 13C-NMR (DMSO, 125 MHz): 37.32 (C-1), 26.85 (C-2), 76.79 (C-3), 38.50 (C-4), 55.09 (C-5), 18.43 (C-6), 41.05 (C-7), 39.02 (C- 8), 48.69 (C-9), 37.49 (C-10), 16.95 (C-11), 33.13 (C-12), 36.89 (C-13), 157.70 (C-14), 115.85 (C-15), 30.15 (C-16), 40.09 (C-17), 44.54 (C-18), 35.51 (C-19), 28.19 (C-20), 32.40 (C-21), 27.32 (C-22), 28.06 (C-23), 15.84 (C-24), 15.15 (C- 25), 25.77 (C-26), 21.42 (C-27), 63.20 (C-28), 33.65 (C-29), 29.69 (C-30). 2.3.1.2. Các chất phân lập từ cặn chiết ethyl acetate lá cây Hếp  n-tritriacontane (ST5): Chất dạng tinh thể màu trắng. Rf = 0.3 (n- hexane : CH2Cl2, 85:15). (+)-ESI-MS (m/z): 465 [M+H]+ (6%). Công thức phân tử: C33H68, M = 464. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 0.81 (6H, t, J = 6.7 Hz), 1.19 (60H, br s), 1.48 (2H, br s). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 14.12 (CH3), 29.37 (CH2), 22.70 (CH2), 29.67 - 29.71 (nhiều CH2), 31.94 (CH2).  n-tetracosane (ST6): Chất dạng tinh thể màu trắng. Rf = 0.3 (n- hexane : EtOAc, 93:7). (+)-ESI MS (m/z): 339 [M+H]+ (6%). Công thức phân tử: C24H50, M = 338. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 0.87 (6H, t, J = 7.1 Hz), 1.25 (44H, br s). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 14.12 (CH3), 22.7 (CH2), 29.38 - 29.45 (nhiều CH2), 31.94 (CH2).  β-sitosterol (ST7): Chất dạng tinh thể hình kim. Rf = 0.4 (n-hexane : EtOAc, 8:2). 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 5.38 - 5.36 (1H, m), 3.56 - 3.52 (1H, m), 2.33 - 2.25 (2H, m), 2.05 - 1.97 (2H, m), 1.89 - 1.82 (3H, m), 1.70 - 1.65 (2H, m), 1.54 - 1.11 (24H, m), 1.07 (3H, s), 1.00 (3H, d, J = 6.7 Hz), 0.87 (3H, t, J = 7.1 Hz), 0.86 (6H, br s), 0.70 (3H, s).  Acid ursolic (ST8): Chất dạng bột màu trắng. Rf = 0.4 (CH2Cl2 : MeOH, 96:4). (+)-ESI-MS (m/z): 479.23 [M+Na]+; (-)-ESI-MS (m/z): 455.08 [M-H]-. IR (KBr, ν = cm-): 3414 (-OH), 1692 (C=O, acid), 2928 (C-H). 1H 6NMR (DMSO, 500 MHz): 5.11 (1H, br s, H-12), 4.25 (1H, m, 3-OH), 3.01 - 2.99 (1H, m, H-3), 2.10 (1H, d, J = 11.5 Hz, H-18), 0.89 (3H, s, H-23), 0.67 (3H, s, H-24), 0.86 (3H, s, H-25), 0.75 (3H, s, H-26), 1.04 (3H, s, H-27), 0.81 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-29), 0.90 (3H, d, J = 9.5 Hz, H-30). 13C-NMR (DMSO, 125 MHz): 38.24 (C-1), 26.98 (C-2), 76.85 (C-3), 38.37 (C-4), 54.79 (C-5), 18.00 (C-6), 30.19 (C-7), 39.10 (C-8), 47.02 (C-9), 36.53 (C-10), 23.81 (C-11), 124.58 (C-12), 138.19 (C-13), 41.64 (C-14), 32.71 (C-15), 22.85 (C-16), 46.83 (C-17), 52.38 (C-18), 38.44 (C-19), 38.50 (C-20), 27.54 (C-21), 36.32 (C-22), 28.26 (C- 23), 16.91 (C-24), 16.07 (C-25), 15.22 (C-26), 23.27 (C-27), 178.23 (C-28), 17.01 (C-29), 21.07 (C-30).  β-sitosterol glucoside (ST9): Chất dạng tinh thể màu trắng. 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 5.32 (1H, br s), 4.83 (3H, m); 4.39 (1H, t, J = 5.7 Hz); 4.22 (1H, d, J = 7.8 Hz); 3.64 (1H, dd, J = 5.5; 10.1 Hz); 3.48 - 3.38 (2H, m); 3.14 - 3.10 (2H, m); 3.08 - 3.05 (2H, m); 2.91 - 2.87 (1H, m); 2.38 - 2.34 (1H, m); 2.17 - 2.10 (1H, m); 1.97 - 1.90 (3H); 1.62 - 1.49 (m, 1H); 1.49 - 1.43 (m, 4H); 1.41 - 1.38 (m, 5H); 1.23 (3H, s); 1.00 (3H, d, J = 6.7 Hz); 0.96 (6H, br s); 0.90 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.81 (3H, d, J = 6.8 Hz); 0.80 (3H, d, J = 6.9 Hz); 0.65 (3H, s). 2.3.2. Cây Cóc đỏ (L.littorea) 2.3.2.1. Các chất phân lập từ dịch chiết ethyl acetate cành cây Cóc đỏ  Hỗn hợp β-sitosterol và stigmassterol (tỷ lệ 1:1) (CĐ1): 1H NMR (500 MHz, CDCl3): 5.35 - 5.34 (1H, m, H-6), 5.16 (0.6H, dd, J = 8.5 Hz; 15.0 Hz, H-22), 5.02 (0.6H, dd, J = 8.5; 15.0 Hz, H-23), 3.54 - 3.50 (1H, m), 2.31 - 2.23 (2H, m), 2.09 - 1.95 (4H, m), 1.86 - 1.83 (2H, m), 1.72 - 1.66 (2H, m), 1.66 - 1.63 (2H, m), 1.58 - 1.39 (15H, m), 1.38 - 1.20 (16H, m), 1.17 - 1.06 (5H, m), 1.02 (3H, d, J = 6.6 Hz), 1.01 (3H, s), 0.91 (3H, d, J = 6.3 Hz), 0.81 (3H, d, J = 7.4 Hz), 0.83 - 0.75 (6H, m), 0.69 (3H, s). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): 140.68; 138.30; 129.29; 121.71; 71.8; 56.87; 56.77; 55.97; 51.24; 50.15; 45.90; 42.32; 42.21; 42.13; 40.47; 39.78; 39.69; 37.25; 36.50; 34.06; 32.40; 31.91; 31.77; 31.49; 24.72; 24.70; 22.68; 21.07; 19.79; 19.04; 14.08; 14.04. 7 2-methyl-1,3-dihydroxy-5-tridecylbenzene (CĐ2): Chất dạng dầu màu vàng. HR-(-)-ESI-MS (m/z): 305.2486 [M-H]-. Công thức phân tử: C20H34O2, M= 306. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 6.23 (1H, s, H-4, H-6), 4.87 (1H, br s, 1-OH, 3-OH), 2.45 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-1’), 2.08 (3H, s, CH3-Ar), 1.67 – 1.53 (5H, m, CH2), 1.28 – 1.25 (17H, m, CH2), 0.87 (3H, t, J = 6.5 Hz, H- 13’). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 154.57 (C-1, C-3), 142.03 (C-5), 107.78 (C- 4, C-6), 107.34 (C-2), 35.54 (C-1’), 31.93; 31.20; 29.69; 29.69; 29.66; 29.60; 29.54; 29.36; 29.31; 22.69; 22.69 (CH2); 14.11 (C-13’); 7.72 (CH3-Ar).  1,3-dihydroxy-5-nonadecylbenzene (CĐ3): Chất dạng dầu màu vàng. (-)-ESI-MS (m/z) 375.35 [M-H]- (100%). Công thức: C25H44O2, M = 376. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 6.23 (2H, s, H-4, H-6), 6.17 (1H, s), 4.82 (2H, s, OH), 2.48 (2H, t, J = 8.0 Hz, H-1’), 1.60 (2H, m), 1.29 – 1.16 (32H, m, CH2), 0.86 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-19’). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 156.5 (C-1, C-3), 146.1 (C-5), 107.99 (C-4, C-6), 100.17 (C-2), 35.85 (C-1’), 31.93; 30.07 - 22.70 (CH2); 14.11 (C-19’).  2-methyl-1,3-di-O-acetyl-5-tridecylbenzene (CĐ2a): 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 6.76 (1H, s, H-4, H-6), 2.55 (2H, t, J = 7.5 Hz; H-1’), 2.03 (3H, s, 1- CH3CO-, 3-CH3CO-), 1.94 (3H, s, CH3-Ar), 1.61 – 1.25 (22H, m, - CH2), 0.88 (3H, t, J = 6.5 Hz, H-13’).13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 168.98 (C=O ester), 149.78 (C-1, C-3), 141.98 (C-5), 120.28 (C-2), 119.61 (C-4, C-6), 35.32; 31.93; 30.87; 29.69; 29.66; 29.55; 29.46; 29.36; 29.28; 22.69 (12xCH2), 20.80 (CH3CO-); 14.11 (C-13’), 7.72 (CH3-Ar). 2.3.2.2. Các chất phân lập từ cặn chiết ethyl acetate lá cây Cóc đỏ  Quercetin (CĐ4): Dạng bột màu vàng. IR (KBr, υ = cm-1): 3450 cm-1 (OH), 1662 cm-1 (C=O), 1614 cm-1 (C=C). 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): 7.75 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2’), 7.65 (1H, dd, J = 2.0; 8.5 Hz, H-6’), 6.91 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5’), 6.40 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8); 6.20 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): 94.4; 99.4; 104.5; 116; 121.7; 124.1; 137.2; 146.2; 148; 158.2; 162.5; 165.6; 177.3. 8 β-sitosterol glucoside (CĐ5): Chất rắn dạng bột màu trắng. Rf = 0.38 (EtOAc : MeOH, 98:2). Chất CĐ5 được xác định là β-sitosterol glucoside dựa vào sắc ký bản mỏng so sánh với các chất chuẩn có trong phòng thí nghiệm và so sánh phổ 1H NMR. 2.3.2.3. Các chất phân lập từ cặn chiết methanol cành cây Cóc đỏ  Astragalin (CĐ6): (+)-ESI-MS (m/z) 448 [M]+ (80%). 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): Aglycon: 8.07 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2’, H- 6’); 6.91 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-3’, H-5’), 6.42 (1H, br s, H-8); 6.23 (1H, br s, H-6). Glucose: 5.26 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1”), 3.71 (1H, dd, J = 12.0; 2.0 Hz, H6’’α); 3.55 (1H, dd, J = 12.0; 5.5 Hz, H6’’β); 3.45 – 3.22 (4H, m, H-2’’,3’’,4’’, 5’’). 13C NMR (CD3OD, 125 MHz): Aglycon: 179.2 (C-4), 165.7 (C-7), 162.6 (C-5), 161.2 (C- 4’), 159.1 (C-9), 158.2 (C-2), 135.4 (C-3), 132.1 (C-6’), 132.0 (C-2’), 122.4 (C- 1’), 115.9 (C-5’), 115.9 (C-3’), 105.5 (C-10), 99.9 (C-6), 94.7 (C-8). Glucose: 104.5 (C-1’’), 78.7 (C-5’’), 78.5 (C-2’’), 75.3 (C-3’’), 70.9 (C4’’), 62.4 (C-6’’).  1-acetyl-D-mannitol (CĐ7): [αD]29 = +39 (MeOH, c = 0.1). HR-(+)- ESI-MS (m/z): 247.0783 [M+ Na]+ (100%). 1HNMR (CD3OD, 500 MHz), δH (ppm), J (Hz): 4.40 (1H, dd, J = 3.0 Hz; 11.5, H1a), 4.19 (1H, dd¸ J = 6.5; 11.5 Hz, H1b), 3.90- 3.84 (2H, m, H-2, H6a); 3.82- 3.79 (2H, m, H-3, H-4), 3.72-3.64 (2H, m, H-5, H6b), 2.10 (3H, s, CH3CO-). 13CNMR (CD3OD, 125 MHz), δC (ppm): 173.24 (COO), 72.88 (C-5), 71.02 (C-3), 70.90 (C-4), 70.33 (C-2), 67.94 (C-1), 65.13 (C-6), 21.0 (CH3).  D-Mannitol (CĐ8): (-)-ESI-MS (m/z): 217.3 [M +Cl]- (60%, C6H14O6Cl). t0nc = 162 – 166 0C. 1H NMR (DMSO, 500 MHz): 3.53 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-3, H-4), 3.47 – 3.43 (2H, m, H-2; H-5), 3.62 – 3.58 (2H, m, H1a; H6a), 3.39 – 3.37 (2H, m, H1b; H6b). 13C-NMR (DMSO, 125 MHz): 71.32 (C-2, C-5), 69.70 (C-3, C-4), 63.84 (C-1, C-6).  Hexa-O-acetyl-D-manitol (CĐ8a): (+)-ESI-MS (m/z) 457.9 [M + Na]+ (80%). 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 5.45 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-3, H-4), 5.07 (2H, m, H-2, H-5), 4.22 (2H, dd, J = 12.5; 2.0 Hz, H1a, H6a), 4.07 (2H, dd, J = 12.5; 5.5 Hz, H1b, H6b), 2.09; 2.07; 2.04 (18H, s, CH3CO). 13C NMR (CDCl3, 9125 MHz): 170.52; 169.86; 169.66 (COO), 67.92 (C-2, C-5); 67.47 (C-3, C-4), 61.86 (C-1, C-6), 20.82; 20.64; 20.56 (-CH3). 2.3.2.4. Các chất phân lập từ cặn chiết methanol lá cây Cóc đỏ  2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl-2’,3’,4’,6’-tetra-O- acetyl-β-D-glucopyranoside (CĐ9): 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 6.33 (1H, d, J = 3.5 Hz, H-1), 5.72 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1’), 5.47 (1H, t, J = 10 Hz, H-4’), 5.25 (1H, t, J = 9.5 Hz, H-3’), 5.16 – 5.08 (4H, m,H-2; H-2’; H-3; H-4), 4.29 (2H, dd, J = 4.5; 12.5 Hz, H6a), 4.27 (1H, dd, J = 2.0; 10.5 Hz, H6’a), 4.13 – 4.08 (3H, m, H6b, H6’b, H-5), 3.85 (1H, ddd, J = 2.5; 4.5; 10.3 Hz, H-5’). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 91.68 (C-1’), 89.05 (C-1), 72.77 (C-3’), 72.70 (C-5’), 70.22 (C-3), 69.81 (C-5), 69.18 (C-2’), 67.88 (C-2), 67.75 (C-4; C-4’), 61.44 (C-6; C- 6’), 20.84, 20.78, 20.67, 20.63, 20.53, 20.41 (-CH3).  1,3,4,5-tetra-O-acetyl fructopyranose (CĐ10): (+)-ESI-MS (m/z): 371 [M+Na]+ (100%). 1H NMR (MeOD, 500 MHz): 4.13 (1H, d, J = 11.5 Hz, H1α), 3.91 (1H, d¸ J = 11.5 Hz, H1β), 5.34- 5.41 (3H, m, H-3, H-4, H-5), 3.75 (1H, dd, J = 13; 1.0 Hz, H6α), 4.22 (1H, dd, J = 13.5; 1.0 Hz, H6β), 2.16; 2.09; 2.07; 1.97 (12H, s, CH3COO). 13C NMR (CD3OD, 125 MHz): 172.08; 172.07; 171.75; 171.74 (-COO), 66.17 (C-1), 97.32 (C-2), 68.57 (C-3), 70.11 (C-4), 70.68 (C-5), 62.21 (C-6), 20.78; 20.67; 20.65; 20.60 (CH3). 2.3.3. Cây Cỏ chông (S. littoreus) 2.3.3.1. Các chất phân lập từ cặn chiết n-hexane hoa Cỏ chông  Neomotienone (SL1) (lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên): Dạng tinh thể hình kim màu trắng. Rf = 0.4. (n-hexane : CH2Cl2, 4:6). IR (KBr, ν = cm-1): 1695.32 (C = O), 2946.97 (C-H). t0nc = 180 - 1850C. (+)ESI-MS (m/z): 425 [M+H]+ (21%), 447 [M+Na]+ (72%).H NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): bảng 3.13.  Glycerol-1,2-di-(9Z,12Z-octadecadienoate)-3-dodecanoate (SL2): Chất dạng dầu màu vàng. Rf = 0.3 (n-hexane : CH2Cl2, 4:6). IR (KBr, cm-1): 2928, (-CH alkan), 1741 (C=O ester). (+)-ESI-MS (m/z): 799.39 [M+H]+ (30%), 354.3 [M+2H-C11H23CO-C17H31CO]+ (100%). Công thức: C51H90O6 (M = 798). 10 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 5.39 – 5.31 (8H, m, -CH=CH-), 5.26 (1H, m, H-2), 4.29 (2H, dd, J = 12.0; 4.5 Hz, H1a, H3a), 4.14 (2H, dd, J = 12.0; 5.5 Hz, H1b, H3b), 2.80 - 2.75 (4H, m, -CH=CH-CH2-CH=CH-), 2.32 - 2.29 (6H, m, OCOCH2CH2), 2.07 – 2.00 (8H, m, CH2CH2-CH=CH-), 1.61 - 1.56 (6H, m, OCOCH2CH2), 1.38 - 1.22 (44H, br s), 0.90 - 0.83 (9H, m). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 173.29; 173.24; 172.85 (COO), 131.97, 130.24, 130.03, 129.68, 128.31, 128.26, 127.77, 127.13 (CH=CH), 68.91 (CH-O), 62.12 (2xCH2-O), 38.77 - 20.56 (CH2), 14.27, 14.11, 14.07 (CH3).  n-hexacosanyl acetate (SL3): (+)-ESI-MS (m/z): 448 [M+Na+H]+. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 4.05 (2H, t, J = 6.5 Hz, -CH2-OCOCH3), 2.04 (3H, s, CH3-COO), 1.60 (2H, m, CH2CH2OCO), 1.28 (46H, br s), 0.88 (3H, t, J = 6.5 Hz, -CH3). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): 171.27 (CH3COO), 64.70 (CH2OH), 31.94- 22.71 (CH2), 21.02 (CH3CO),14.13 (CH3). 2.3.2.3. Các chất phân lập từ cặn chiết n-butanol hoa Cỏ chông  (S)-(1,4- Dioxaspiro [4.5]decan-2-yl) methanol (lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên) (SL7): Dạng dầu màu vàng, [α]D25 (MeOH, c = 0.1): - 3.8. HR-(+)-ESI-MS (m/z): 173.1173 [M+H]+ (95%); 195.0993 [M+Na]+ (80%). 1H NMR (CDCl3, CD3OD, 500 MHz): Glycerol: 4.24 – 4.20 (1H, m, H-2), 4.04 (1H, dd, J = 6.5; 11.5 Hz, H3α), 3.76 (1H, dd, J = 6,5; 8.5 Hz, H3β), 3.66 (1H, dd, J = 4.0; 11.5 Hz, H1α), 3.59 (1H, dd, J = 5.0; 11.5 Hz, H1β). Cyclohexane: 1.66 – 1.55 (8H, m, H-2’, 3’, 5’, 6’), 1.66 – 1.55 (2H, m, H-4’).13C NMR (CDCl3, CD3OD, 125 MHz): Glycerol: 75.7 (C-2), 65.45 (C-3), 62.94 (C-1). Cyclohexane: 109.91 (C-1’), 36.23 (C-2’), 34.63 (C-6’), 24.97 (C-4’), 23.85 (C- 5’), 23.63 (C-3’).  n-butyl-D-fructofuranoside (SL8): Rf = 0.3 (n-hexane : EtOAc : MeOH, 2:8:0.5). [α]25D =+ 950 (c 0.1, MeOH). (+)-ESI-MS (m/z): 255.2 [M+H2O+H]+. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 4.13 (1H, m, H-3), 4.10 (1H, m, H-5), 3.92 (1H, m, H-4), 3.86 (1H, d, J = 12.5 Hz, H-1a), 3.77 (1H, d, J = 12.5 Hz, H-1b), 3.75 (2H, m, H-6). 3.57 (1H, m, H-1’a), 3.48 (1H, m, H-1’b), 1.52 (2H, m, H-2’), 1.35 (2H, m, H-3’), 0.91 (3H, t, J = 7.5 Hz, H-4’). 13C NMR 11 (CDCl3, 125 MHz): 107.7 (C-2), 82.78 (C-5), 81.61 (C-3), 76.63 (C-4), 61.38 (C-6), 60.74 (C-1), 60.50 (C-1’), 32.09 (C-2’), 19.24 (C-3’), 13.79 (C-4’).  Thymidine (SL9): Chất dạng rắn màu trắng. Rf = 0.4 (n-hexane : aceton, 4:6). (-)-ESI-MS (m/z): 240.9 [M-H]-. 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): 7.82 (1H, s, H-6), 6.29 (1H, t, J = 7.0 Hz, H-1´), 4.41 (1H, br s, H-3´), 3.90 (1H, m, H-4´), 3.81 (1H, d, J = 11.5 Hz, H5´α), 3.74 (1H, dd, J = 12.0, 3.0 Hz, H5´β), 2.24 (2H, m, H-2´), 1.90 (3H, s, CH3). 13C NMR (CD3OD, 125 MHz): 166.41 (C-4), 152.39 (C-2), 138.17 (C-6), 111.55 (C-5), 88.82 (C-4´), 86.27 (C-1´), 72.2 (C-3´), 62.84 (C-5´),41.18 (C-2´), 12.42 (CH3).  2,4-dimethoxyphenyl-1-β-D-glucopyranoside (SL10): Chất dạng bột, màu trắng. Rf = 0.3 (CH2Cl2 : MeOH, 85:15). HR-(-)ESI-MS (m/z): 351.0872 [M+Cl]- (40%). (+)-ESI-MS (m/z): 339 [M+Na]. 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): Glucose: 4.80 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-anomer), 3.48 – 3.35 (7H, m), 3.88 – 3.87 (1H, m), 3.93 (1H, d, J = 12.0 Hz, H6’α), 3.70 (1H, d, J = 12.0 Hz, H6’β). Vòng benzen: 6.87 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6), 6.84 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-3), 6.69 (1H, dd, J = 3.0; 8.5 Hz, H-5), 3.83 (3H, s, 2-OCH3), 3.80 (3H, s, 4-OCH3). 13C NMR (CD3OD, 500 MHz): Glucose: 103.46 (C-anomer), 78.24 (C-2’), 74.95 (C-3’), 71.56 (C-4’), 78.04 (C-5’), 62.64 (C-6’). Vòng benzen: 153.94 (C- 1’), 151.15 (C-2’), 146.06 (C-4’), 114.06 (C-6’), 109.35 (C-5’), 104.14 (C-3’), 57.17 (4’-OCH3), 56.43 (2’-OCH3).  2,4-dimethoxyphenyl-1-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyran- oside) (SL10a): (+)-ESI-MS (m/z): 507.16 [M+Na]+ (35%), 523.13 [M+K]+ (100%). 1H NMR (CH3OD, 500 MHz): Glucose: 5.29 (1H, t, J = 9.5 Hz), 5.24 (1H, t, J = 7.5 Hz), 5.16 (1H, t, J = 9.5 Hz), 5.00 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1’ anomer), 4.28 (1H, dd, J = 12; 5.0, H6’α), 4.18 (1H, dd, J = 12.5; 2.0, H6’β), 3.82 (1H, m), 2.08 (3H, s, CH3COO), 2.07 (3H, s, CH3COO), 2.04 (3H, s, CH3COO), 2.03 (3H, s, CH3COO). Vòng benzen: 6.77 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-6), 6.61 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-3), 6.54 (1H, dd, J = 9.0; 2.5 Hz, H-5), 3.85 (3H, s, 2-CH3O), 3.84 (3H, s). 12 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Các nghiên cứu về cây Hếp 3.1.1. Kết quả thử hoạt tính sinh học Dịch chiết n-hexane âm tính với các dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU), ung thư biểu mô (KB) và ung thư vú (MCF7) (IC50 > 128 μg/ml). 3.1.2. Cấu trúc các chất phân lập từ loài Hếp Thứ tự Kí hiệu Tên chất Cấu trúc Triterpenoid 1 ST2 α-amyrin 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 30 29 R HO ST2: R = CH3 ST8: R = COOH H H 2 ST8 Acid ursolic 3 ST4 Myricadiol Sterol 4 ST7 β-sitosterol 5 ST9 Daucosterol 6 ST3 Stigmasterol 13 Ester 7 ST1 Glycerol 1,3- dihexadecanoate-2 (9Z,12Z- octadecadienoate) 9'' 10'' 11' 12'' 13'' 18'' OH2C HC H2C O O (CH2)14CH3 O O O CH21'' 1' '' 1' 1 2 3 (CH2)6 2'' (CH2)14CH3 CH CH CH2 CH CH (CH2)4 CH3(Z)(Z) 16' 16''' Hydrocarbon 8 ST5 n-tritriacontane C33H68 9 ST6 n-tetracosane C24H50 3.2. Các nghiên cứu về cây Cóc đỏ 3.2.1. Kết quả thử hoạt tính sinh học 3.2.1.1.Hoạt tính chống oxy hóa Dịch chiết cành có hoạt tính chống oxy hóa yếu với EC50 = 81.92; 80.81 μg/ml, dịch chiết lá không thể hiện hoạt tính. 3.2.1.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định Dịch chiết n-hexane, ethyl acetate và methanol của lá và cành Cóc đỏ đều không thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định trên các loài vi khuẩn S. aureus, B. subtilis, L. fermentum, S. enterica, E. coli, P. aeruginosa và nấm Candida albicans. 3.2.2. Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ loài Cóc đỏ Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của cây Cóc đỏ Dịch lá n-hexan EC50 > 128 μg/ml ethyl acetate EC50 > 128 μg/ml methanol EC50 128 μg/ml Dịch cành n-hexan EC50 > 128 μg/ml ethyl acetate EC50 = 81.92 μg/ml methanol EC50 = 80.81 μg/ml Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH (EC50 , μg/ml) 14 TT Kí hiệu Tên chất Cấu trúc Resorcinolic lipid 1 CĐ2 1,3-dihydroxy-2-methyl-5-tridecylbenzene 2 CĐ2a 1,3-di-O-acetyl-2-methyl-5-tridecylbenzene 3 CĐ3 1,3-dihydroxy-5- nonadecylbenzene Hexitol 4 CĐ7 1-mono-acetyl-D-mannitol. 5 CĐ8 D-mannitol 6 CĐ8a hexa-O-acetyl-D-mannitol Đường 7 CĐ9 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D- glucopyranosyl-2’,3’,4’,6’- tetra-O-acetyl-β-D- glucopyranoside 8 CĐ10 1,3,4,5- tetra-O-acetyl fructopyranose Flavonoid 9 CĐ4 Quercetin 10 CĐ6 Astragalin Stetol 11 CĐ1 Hỗn hợp β-sitosterol và stigmasterol (1:1) 12 CĐ5 Daucosterol 15 3.3. Các nghiên cứu về cây Cỏ chông 3.3.1. Kết quả thử hoạt tính sinh học 3.3.1.1. Hoạt tính chống ung thư - Dịch chiết MeOH hoa có hoạt tính trên dòng tế bào ung thư vú MCF7 (IC50 = 75.64 μg/ml). - Dịch chiết n-hexane hoa có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư gan - HepG2 (IC50 = 70.4 μg/ml), ung thư vú – MCF7 (IC50 = 45.09 μg/ml) và ung thư biểu mô – KB (IC50 = 128 μg/ml). - Dịch chiết n-hexane thân có hoạt tính trên dòng tế bào ung thư vú MCF7 (IC50 = 99.76 μg/ml). -Dịch chiết từ rễ không có hoạt tính với các dòng tế bào ung thư được thử nghiệm. -Một số hợp chất như n-butyl-α-D-fructofuranoside (SL8), thymidine (SL9) không thể hiện hoạt tính chống ung thư với 4 dòng tế bào - HepG2 , KB, MCF7, Lu (IC50 > 128 g/ml) 3.3.1.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định - Dịch chiết từ các bộ phận hoa, thân, rễ Cỏ chông không thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định (IC50>128 μg/ml). - Các hợp chất neomotienone (SL1), (S)-(1,4- dioxaspiro [4.5]decan-2- yl)methanol (SL7), n-butyl-α-D-fructofuranoside (SL8), thymidine (SL9) cũng không thể hiện hoạt tính. 3.3.1.3. Hoạt tính chống oxy hóa DPPH Dịch chiết từ các bộ phận hoa, thân, rễ không thể hiện hoạt tính chống oxy (EC50 > 128 μg/ml). 3.3.2. Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ loài Cỏ chông Thứ tự Kí hiệu Tên chất Cấu trúc Dẫn xuất đường 1 SL8 n-butyl-α-D- fructofuranoside 16 2 SL9 Thymidine 3 SL10 2,4-dimethoxyphenyl-1-β-D-glucopyranoside 4 SL10A 2,4-dimethoxyphenyl- 1-(2,3,4,6-tetra-O- acetyl-β-D- glucopyranoside) Terpennoid 5 SL1 Neomotienone (chất lần đầu phân lập từ thiên nhiên) Dẫn xuất glycerol 6 SL2 Glycerol 1,2-di- (9Z,12Z- octadecadienoate) 3- dodecanoate 7 SL7 (S)-(1,4- dioxaspiro [4.5]decan-2- yl)methanol (chất lần đầu phân lập từ thiên nhiên) Ester của alcol béo 8 SL3 n-hexacosanyl acetate Sterol 9 SL4 β-sitosterol 10 SL6 Daucosterol 17 11 SL5 Stigmasterol PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ CHẤT TIÊU BIỂU  Neomotienone (SL1) (Chất lần đầu tiên phân lập từ thiên nhiên) Chất SL1 kết tinh từ phân đoạn đầu của cột tổng của cặn n-hexan hoa dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng. Phổ IR cho đỉnh hấp thụ mạnh ở bước sóng (cm-1) 2946 (-CH alkan), 1695 (-C=O). Phổ (+)-ESI-MS cho peak ion giả phân tử tại m/z 425 [M+H]+ (21%), 447 [M+Na]+ (72%) phù hợp với công thức phân tử của SL1 là C30H48O, M= 424. Phổ 1H NMR cho tín hiệu doublet của proton olefine tại δH 5.15 (1H, d, J = 6.0 Hz), 6 tín hiệu methyl singlet tại δH 1.34; 1.12; 1.05; 1.04; 1.03, 0.74 cùng với hai tín hiệu methyl doublet tại δH 0.94 (d, J = 6.5 Hz), 0.85 (d, J = 6.5 Hz). Ngoài ra còn có các tín hiệu của các nhóm methylene (-CH2) và methine (-CH) trong khoảng δH 2.71-1.14 ppm. Phổ 13C NMR và DEPT cho tín hiệu của một triterpenoid qua tín hiệu cộng hưởng của 30 carbon gồm một nhóm xeton tại δC 217.78, hai carbon olefine tại δC 144.6 (=C); 118.2 (=CH), tám nhóm methyl tại δC 25.61; 25.56; 22.61; 22.50; 21.99; 20.98; 19.61; 18.70 ppm, năm carbon bậc bốn tại δC 47.65; 42.55; 40.52; 39.97; 38.65 ppm, năm nhóm methine tại δC 59.67; 52.31; 48.33; 45.99; 31.76 ppm và 9 nhóm methylene tại δC 35.74; 34.91; 34.11, 29.66, 28.58, 26.82, 26.02, 22.69, 20.04 ppm. Số liệu phổ NMR được gán trên cơ sở phân tích số liệu phổ NMR 2 chiều (HSQC, COSY và HMBC). Hình 3.33. Các tương tác COSY (─) và HMBC (→) chính của chất SL1 18 Trên phổ COSY xuất hiện các tương tác giữa proton olefin H-12 (δH 5.15 d, J = 6.0 Hz) với H11α (δH 2.19 m) và H11β (δH 1.95 m), giữa H2α (δH 2.69 m) với H1α (δH 2.10 m), H1β (δH 1.45 m) và H2β (δH 2.33 td, 5.0; 14.5 Hz), giữa H-18 (δH 2.14m) với H19β (δH 1.33 m), giữa H16α (δH 1.95 m) với H15β (δH 1.27 m), giữa H-22 (δH 1.49 m) với H-29 (δH 0.94, d, J = 6.5 Hz), H-30 (δH 0.85, d, J = 6.5 Hz) đã cho phép ghép nối các mảnh H-11 - H-12, H-1 - H-2, H-18 - H-19, H-15 - H-16, H-22 - H-29 - H-30. Vị trí của các nhóm methyl 29-CH3, 30-CH3 được khẳng định qua các tương tác giữa H-29 (δH 0.94 d, J = 6.5 Hz), H-30 (δH 0.85 d, J = 6.5 Hz) với C-21 (δC 59.67) và C-22 (δC 31.76) trên phổ HMBC. Vị trí nhóm methyl 26-CH3 được khẳng định qua tương tác giữa H-26 (δH 1.12 s) với C-7 (δC 29.66), C-9 (δC 48.34), C-14 (δC 42.55). Vị trí nhóm methyl 28-CH3 được xác định qua tương tác giữa H-28 (δH 0.74 s) với C-16 (δC 34.11) C-17 (δC 39.97 ), C-18 (δC 52.31), C-21 (δC 59.67). Vị trí của nhóm methyl 25-CH3 được khẳng định qua tương tác giữa H-25 (δH 1.34 s) với C-1 (δC 35.74), C-5 (δC 45.99) và C-9 (δC 48.34). Ngoài ra tương tác giữa H-12 (δH 5.15 d, 6.0 Hz) với C-9 (δC 48.34), C-11 (δC 26.82), C-14 (δC 42.55) đã xác định vị trí nối đôi trong vòng. Tương tác giữa H16α (δH 1.95) với carbon bậc 3 gắn gốc isopropyl (CH3)2CH- là C-21 (δC 59.67) đã khẳng định cấu trúc neohopane của chất SL1. Hình 3.34. Phổ 1H 1H COSY của chất SL1 Hình 3.35. Phổ HMBC vùng trường cao của chất SL1 19 Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của chất SL1 C DEPT δa,bC δa,cH dạng pic (J = Hz) HMBC (H→C) COSY 1 CH2 35.74 H1α: 2.10 m/H1β: 1.45 m 3 2 CH2 34.91 H2α: 2.69 m H2β: 2.3 td (5.0; 14.5) 3 H1α, H1β,H2β 3 C 217.78 - 4 C 47.65 - 5 CH 45.99 1.51 - 1.39 m 3 6 CH2 20.04 H6α: 1.65 - 1.53 m H6β: 1.42 - 1.39 m 7 CH2 29.66 1.29 - 1.23 m 8 C 40.52 9 CH 48.34 1.77 - 1.73 m 5, 8, 10 10 C 38.65 11 CH2 26.82 H11α: 2.19 m H11β: 1.97 m 8, 9, 12, 13 H11β, H-9 12 CH 118.26 5.15 d (6.0) 9, 11, 14 H11α, H11β 13 C 144.60 14 C 42.55 15 CH2 26.02 H15α: 1.63 m H15β: 1.27 m 16 CH2 34.11 H16α: 1.95 m H16β: 1.65 m 14, 21 H16β, H15β 17 C 39.97 18 CH 52.31 2.14 m H19β 19 CH2 22.69 H19α: 1.65 - 1.53 m H19β: 1.32 m 17 20 CH2 28.58 H20α: 1.87 m H20β: 1.29 - 1.23 m 21 CH 59.67 1.18 m 17 22 CH 31.76 1.49 m H-29, H-30 23 CH3 25.56 1.04 s 3 24 CH3 20.98 1.04 s 3 25 CH3 25.61 1.34 s 1, 5, 9 26 CH3 21.99 1.12 s 7, 9, 14 27 CH3 19.61 1.04 s 28 CH3 18.70 0.74 s 16, 17, 18, 21 29 CH3 22.50 0.94 d (6.5) 21, 22 30 CH3 22.61 0.85 d (6.5) 21, 22 ađo trong CDCl3, b500 MHz, c125 MHz 20 Số liệu của chất SL1 có sự tương đồng với neomotiol (C-3 của neomotiol gắn -OH) [155]. Theo tài liệu tham khảo [156] cho thấy chất SL1 là neomotienone. Hợp chất này đã được bán tổng hợp từ neomotiol (năm 1965), nhưng cho đến nay vẫn chưa tìm thấy tài liệu phổ được công bố. Chất SL1 được phân lập từ hoa cỏ chông là chất lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên. Các số liệu phổ NMR của chất SL1 cũng lần đầu tiên được chúng tôi công bố. Các hợp chất neohopane là một dạng hopane chuyển vị hiếm gặp có nhóm methyl (28-CH3) gắn với C-17 (các hopane thông thường nhóm methyl gắn với C-18).  (S)-(1,4- dioxaspiro [4.5]decan-2-yl)methanol (SL7) (chất lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên) Phổ 1H và 13C NMR của chất SL7 ghi trong hỗn hợp CDCl3 và CD3OD cho các tín hiệu của một phân tử glycerin tạo liên kết acetal qua các tín hiệu cộng hưởng của 2 nhóm oxymethylene (-CH2-O-) tại δH 4.04 (1H, dd, J = 6.5; 11.5 Hz); 3.76 (1H, dd, J = 6.5; 8.5 Hz)/ δC 65.44 và δH 3.66 (1H, dd, J = 4.0; 11.5 Hz); 3.59 (1H, dd, J = 5.0; 11.5 Hz)/ δC 62.94 cùng với tín hiệu của nhóm oxymethine tại δH 4.24 – 4.20 (1H, m)/ δC 75.7 ppm. Mặc khác trên phổ HR-(+)- ESI-MS xuất hiện của các peak ion giả phân tử tại m/z 173.1173 [M+H]+ (95%) và 195.0993 [M+Na]+ (80%). Tính toán lý thuyết cho công thức phân tử C9H17O3 là M = 173.1178, cho công thức C9H16O3Na là M = 195.097. Như vậy phần còn lại của phân tử là hợp phần C6H10. Trong số carbon còn lại có một carbon acetal tại δC 109.91 ppm và 5 nhóm methylene (-CH2) tại δC 36.23; 34.62; 23.84; 23.62; 24.96 ppm phù hợp với tín hiệu trong phổ 1H NMR tại δH 1.65 – 1.54 (8H, m) và 1.42 – 1.37 (2H, m). Điều này cho thấy chất SL7 là một ketal của cyclohexanon với glycerin. Việc gán chính xác các tín hiệu cộng hưởng của proton H và C–13 được thực hiện dựa trên việc phân tích phổ NMR 2 chiều gồm HSQC, COSY, HMBC và NOESY. 21 Hình 3.40. Các tương tác COSY, HMBC và NOESY (chính) của chất SL7 Phổ COSY đã chứng minh sự có mặt của hợp phần glycerol [HO─CH2─CH(OH)-CH2─OH]. Trên phổ COSY cho thấy tín hiệu tương tác giữa proton oxymethine H-2 (δH 4.24 – 4.20)/ H3α (δH 4.04); H3β (3.76); H1α (δH 3.66); H1β (δH 3.59) đã ghép nối các mảnh cấu trúc H-1-H-2-H-3 của hợp phần glycerol. Hình 3.39. Phổ 1H NMR của chất SL7 Hình 3.41. Phổ 1H 1H COSY của chất SL7 Hình 3.42. Phổ HMBC của chất SL7 Hình 3.43. Phổ NOESY của chất SL7 22 Trên phổ HMBC cho các tương tác giữa H3α (δH 4.04)/ C-1’ (δC 109.91), C-1 (δC 62.94); giữa H3β (δH 3.76)/ C-1 (δC 62.94), C-2 (δC 75.7), C-1’ (δC 109.91); giữa H1α (δH 3.66)/ C-3 (δC 64.55), C-2 (δC 75.7); giữa H1β (δH 3.59)/ C- 3 (δC 64.55), C-2 (δC 75.7). Ngoài ra còn thấy các tương tác giữa proton methylene ở vòng cyclohexane với carbon của vòng này. Trên phổ NOESY thấy rõ các tín hiệu tương tác của các proton gần nhau trong không gian gồm tương tác giữa H-2 (δH 4.24 – 4.20) với H3α (δH 4.04) và H1β (δH 3.59), giữa H3α (δH 4.04) với H3β (3.76); giữa H1α (δH 3.66) với H1β (δH 3.59). Từ các dữ liệu phổ NMR 1 chiều, 2 chiều, phổ MS và so sánh với tài liệu [161] cho phép khẳng định chất SL7 là (S)-(1,4- dioxaspiro [4.5]decan-2- yl) methanol. Cấu hình tuyệt đối của SL7 được xác định là (S) khi so sánh giá trị [α]D của chất SL7 với tài liệu tham khảo khảo [161]. Chất (S)-(1,4- dioxaspiro [4.5]decan-2-yl)methanol có [α]D = - 4.2 (c 1.0, CHCl3), trong khi chất SL7 có [α]D = - 3.8 (c 1.0, MeOH). Chất SL7 được dùng làm phụ gia cho nhiên liệu động cơ [160]. Ngoài ra theo tài liệu [161], SL7 là sản phẩm chính của phản ứng giữa cyclohexanone và glycerol. Từ chất SL7 đã tổng hợp được (R)-2,3-O-cyclohexylidene-D-glyceraldehyde, một chất có hoạt tính bảo vệ hệ thần kinh trung ương, có tác dụng trong điều trị bệnh mất trí nhớ Alzheimer (năm 2017). Chất SL7 lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên. KẾT LUẬN Luận án đã đóng góp những hiểu biết mới về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài: Hếp, Cóc đỏ và Cỏ chông. Tổng cộng 28 hợp chất đã được phân lập, trong đó có 2 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên. Cấu trúc của các chất được xác định bằng việc phân tích kết hợp các phổ IR, MS, HR-ESI-MS, NMR một chiều, hai chiều và so sánh với tài liệu. 1. Từ loài Hếp đã phân lập được 9 hợp chất trong đó có 7 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài cây này gồm glycerol 1,3-dihexadecanoate-2 (9Z,12Z- octadecadienoate) (ST1), stigmasterol (ST3), n-tritriacontane (ST5), n-tetracosane (ST6), β-sitosterol (ST7), acid ursolic (ST8), daucosterol (ST9) và 2 hợp chất triterpenoid đã được phân lập trước đây là α- amyrin (ST2) và myricadiol (ST4). 23 2. Từ loài Cóc đỏ đã phân lập được 12 hợp chất trong đó có 1 hỗn hợp là β- sitosterol:stigmasterol (1:1) (CĐ1), 2 dẫn xuất acetyl hóa là 1,3-di-O-acetyl-2- methyl-5-tridecylbenzene (CĐ2a), hexa-O-acetyl-D-mannitol (CĐ8a) và 9 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài Cóc đỏ là 1,3-dihydroxy-2-methyl-5- tridecylbenzene (CĐ2), 1,3-dihydroxy-5-nonadecylbenzene (CĐ3), quercetin (CĐ4), β-sitosterol glycoside (CĐ5), astragalin (CĐ6), 1-O-acetyl-D-mannitol (CĐ7), D-mannitol (CĐ8), 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl-2’,3’,4’,6’- tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside (CĐ9); 1,3,4,5-tetra-O-acetylfructopyranose (CĐ10). Hợp chất 1-O-acetyl-D-mannitol (CĐ7) chỉ được tìm thấy trong xạ khuẩn, chất này lần đầu tiên được phân lập từ thực vật. Thành phần chính của dịch chiết methanol cành Cóc đỏ là đường D-mannitol (CĐ8) với hàm lượng rất cao (15.92 %), đây là nguồn nguyên liệu tự nhiên để sản xuất đường thay thế cho bệnh nhân tiểu đường và thuốc trị bệnh tăng nhãn áp. 3. Từ loài Cỏ chông đã phân lập được 11 chất trong đó có 2 chất lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên là neomotienone (SL1) và (S)-(1,4- dioxaspiro [4.5]decan-2-yl)methanol (SL7) cùng với 8 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài Cỏ chông là glycerol 1,2-di-(9Z,12Z-octadecadienoate)-3-dodecanoate (SL2), hexacosanyl-1-acetate (SL3), β-sitosterol (SL4), stigmasterol (SL5), daucosterol (SL6), n-butyl-D-frucrofuranoside (SL8); thymidine (SL9), 2,4-dimethoxyphenyl-1- β-D-glucoside (SL10) và 1 sản phẩm acetyl hóa là 2,4-dimethoxyphenyl-1-(2,3,4,6- tetra-O-acetyl-β-D-glucopyran-oside) (SL10a). 4. Luận án đã thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư (HepG2, MCF7, KB, Lu) của 7 loại cao chiết và 3 hợp chất từ loài Cỏ chông và Hếp. Kết quả cho thấy các cao chiết và các hợp chất này đều có hoạt tính yếu hoặc không có hoạt tính. 5. Luận án đã thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa và kháng vi sinh vật kiểm định của 12 loại cao chiết từ loài Cỏ chông và Cóc đỏ cùng với 4 hợp chất từ loài Cỏ chông. Kết quả cho thấy các cao chiết và các hợp chất này đều có hoạt tính yếu hoặc không có hoạt tính. 24 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Duong Van Anh, Pham Thi Huyen, Tran Van Sung, Do xuan Cam, Tran Thi Phuong Thao, The first phytochemical investigation of Scaevola taccada, a mangove plant collected in Ly Son island, Quang Ngai, Viet Nam, Tạp chí Hóa học, 2014, 52 (5), 659- 660. 2. Pham Thi Huyen, Duong Van Anh, Do xuan Cam, Nguyen The Anh, Tran Van Loc, Tran Van Sung, Tran Thi Phuong Thao, Triterpens and phytosterols from Scaevola taccada collected in Ly Son island, Quang Ngai province, Viet Nam, Tạp chí Hóa học, 2015, 53 (2), 235 - 239. 3. Phạm Thị Huyền, Đào Đức Thiện, Trần Văn Lộc, Trần Văn Sung, Trần Thị Phương Thảo, Thành phần hóa học cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) thu hái tại tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam, Tạp chí Hóa học, 2017, 55 (3), 281. 4. Pham Thi Huyen, Tran Van Loc, Tran Van Sung, Tran Thi Phuong Thao, Chemical constituents of Spinifex littoreus collected in the coast of Quang Nam province, Viet Nam, Chemistry of Natural Compounds (đã được chấp nhận đăng).