Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide (POS) từ pectin vỏ chanh leo bằng endopolygalacturonase

- 1 - MỞ ĐẦU Pectic oligosaccharide (POS) là một trong những prebiotic thế hệ mới được nghiên cứu trong thời gian gần đây. POS là một hợp chất cacbonhydrate, bao gồm từ 2 – 10 đơn phân D - galacturonic acid nối với nhau bằng liên kết α (1-4) glucoside và có nhiều đặc tính quý. Là một oligosaccharide của các acid galacturonic nên POS mang tính acid tương tự như một số oligosaccharide trong sữa mẹ, chúng có khả năng gắn với các tác nhân gây bệnh, ngăn chặn sự kết dính của chúng vào bề mặt biểu mô ruột hiệu quả hơn các loại oligosaccharide trung tính. Bên cạnh đó, POS được lên men chọn lọc bởi vi sinh vật có lợi trong đường ruột và sản phẩm của sự lên men này có ảnh hưởng tích cực đối với sức khỏe của vật chủ, tham gia vào quá trình điều hòa trao đổi lipid, glucose, làm giảm cholesterol trong máu, chống ung thư, điều biến miễn dịch, chống béo phì, có tính kháng khuẩn và chống oxi hóa. Với các hoạt tính sinh học có lợi như vậy, POS được ứng dụng bổ sung vào thực phẩm chức năng và thức ăn chăn nuôi. Hiện nay POS có thể được thu nhận bằng việc thủy phân giới hạn pectin nhờ phức hệ pectinase trong đó endopolygalacturonase đóng vai trò quan trọng. Tuy nhiên cho tới nay, chưa có công trình nào trong nước công bố về công nghệ thủy phân pectin tạo POS nhờ các kỹ thuật thủy phân giới hạn bằng enzyme. Từ những mối quan tâm trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide (POS) từ pectin vỏ chanh leo bằng endopolygalacturonase”.  Mục tiêu nghiên cứu - Thu nhận được nguồn endopolygalacturonase (EPG) - Xây dựng được quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo bằng phương pháp thủy phân giới hạn nhờ endopolygalacturonase. - Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng chế phẩm POS thu được trong sản xuất thực phẩm chức năng.  Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu đề ra, luận án gồm các nội dung chính sau đây: 1 - Nghiên cứu thu nhận nguồn endopolygalacturonase - 2 - + Phân lập và tuyển chọn chủng A. niger sinh tổng hợp EPG cao + Cải tạo chủng và tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp EPG + Thu nhận, tinh sạch và xác định đặc tính của enzyme chủng cải tạo. 2 - Xây dựng được quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo. + Nghiên cứu thu nhận pectin từ vỏ chanh leo + Nghiên cứu điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS + Tách, tinh sạch và bảo quản chế phẩm POS 3 - Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng chế phẩm POS thu được trong sản xuất thực phẩm chức năng + Đánh giá hoạt tính sinh học + Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, an toàn vệ sinh thực phẩm + Ứng dụng POS trong sản xuất bánh chức năng  Những đóng góp mới của luận án 1 – Tạo được chủng Aspergillus niger UV06-12-23 có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao góp phần làm phong phú thêm nguồn chủng giống và pectinase. 2 - Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống quá trình thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo bằng enzyme thu nhận pectic oligosaccharide (POS) và chứng minh được khả năng tăng sinh vi khuẩn có lợi, giảm vi khuẩn có hại, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của chế phẩm POS thu được, góp phần làm phong phú thêm một nguồn prebiotic mới cho Việt Nam. Bố cục của luận án Luận án được trình bày trong 127 trang: mở đầu (3 trang), tổng quan tài liệu (28 trang), vật liệu và phương pháp nghiên cứu (16 trang), kết quả và thảo luận (63 trang với 32 bảng và 37 hình), kết luận và kiến nghị (2 trang), danh mục các công trình đã công bố (1 trang) và tài liệu tham khảo (13 trang với 7 tài liệu tiếng Việt và 135 tài liệu tiếng Anh). 1. TỔNG QUAN Tổng quan các vấn đề nghiên cứu của luận án được trình bày chi tiết về các phần: hoạt tính sinh học của POS, cơ chất pectin, enzyme endopolygalacturonase, các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân pectin tạo POS, các phương pháp thu hồi và tinh sạch POS, các phương pháp định tính, định lượng và đánh giá hoạt tính sinh học của POS. - 3 - 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vậ  ủng n ậ A. niger CĐN4, BK01, PDG, LN; 26 chủng A. niger CNTP 5002 – 5055; Lactobacillus rhamnosus GG (L1), L. amylovorus DSM16698 (L2), L. acidophilus NCFM (L3), L. reuteri DSM 17938 (L4), L. casei Shirota (L5), L. bulgaricus CH-3 (L6), L. fermentum PCC (L7), L. plantarum 299V (L8), L. johnsonii La1 (L9), Bifidobacterium lactis Bb12 (Bif), Escherichia coli 0157:H7, Salmonella enterica subsp. enterica serotype Typhi ATCC 19430 (S. typhi) và Staphylococcus aureus ATCC 25923 từ bộ sưu tập giống của Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học Phân tử, Đại học Bách Khoa Hà Nội.  Vỏ chanh leo từ các cơ sở chế biến chanh leo trên địa bàn Hà Nội.  Pectinex Utra-SPL (Novozymes – Đan Mạch) 2.2. P cứ 2.2.1. P ậ c ủ sinh endopolygalacturonase cao Phân lập chủng A. niger trên môi trường Czapeck và sàng lọc trên môi trường Czapeck-pectin theo Hannan A. và cs (2009). Chọn những chủng cho giá trị hoạt độ endopolygalacturonase cao. 2.2.2. Cải tạo chủng A. niger sinh tổng hợp EPG cao Bào tử chủng A. niger CNTP5037 được chiếu UV và trang trên môi trường Czapeck + 1% pectin + 0,1% triton X-100, nuôi trong tủ ấm 30 o C, 3 ngày (theo Vu V.H. và cs (2009)). Tiếp đó tuyển chọn chủng thu được dựa trên khả năng sinh tổng hợp EPG cao và ổn định. 2.2.3. Khảo sát, tố óa đ c sinh ổ ợ EPG cao Nghiên cứu được thực hiện trên môi trường lên men rắn (cám gạo 70%, trấu 20%, dịch khoáng Czapeck 2 ml) trong bình tam giác 250 ml với hàm lượng pectin (8, 10, 12, 14, 16 % (w/w)), độ dày môi trường (9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 mm), độ ẩm môi trường (50, 60, 70, 80%), nhiệt độ (25, 30, 35, 40 o C) trong thời gian lên men (1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày) theo Akhter N. và cs (2011). Tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp EPG theo phương pháp bề mặt đáp ứng và quy hoạch Box-Benken, sử dụng phần mềm Design-Expert 7.15. Ma trận thực nghiệm bao gồm 17 thí nghiệm với khoảng chạy của 3 - 4 - yếu tố khảo sát là nhiệt độ (25 – 35 o C), độ ẩm (50 – 70%), hàm lượng pectin (10 – 14%). 2.2.4. c đ ạ đ e d a ac a e Phản ứng enzyme được thực hiện với 1ml dung dịch pectin 3% là 250µl dung dịch enzyme ở 50⁰C. Độ giảm độ nhớt của dung dịch thủy phân pectin được xác định với nhớt kế Elcometer, tốc độ quay 200 vòng/phút, trục L2 trong 30 phút. Một đơn vị endopolygalacturonase là lượng enzyme cần thiết làm giảm 50% độ nhớt của dung dịch trong 30 phút ở 50 o C và pH 4,5 theo Hendges D.H. và cs (2011). 2.2.5. Tinh sạch endopolygalacturonase Dịch enzyme được chiết từ môi trường rắn nuôi cấy A. niger UV06- 12-23 bằng đệm pH 4,5 (tỷ lệ 7:1) và kết tủa bằng (NH4)2SO4 (40 - 80%), ethanol lạnh (0 o C) (50 - 80%) hoặc lọc dòng ngang với màng 10 kDa. Tiếp theo đó EPG được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion trên hệ thống FPLC với cột QFF và đệm đẩy là gradient NaCl 1M nồng độ 0 – 500 mM, tốc độ dòng 1 ml/phút theo Buga M.L. và cs (2010). 2.2.6. ả đ c của e d a ac a e EPG tinh sạch được xác định nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ (30 - 70 o C); pH tối ưu và độ bền pH (3,0 - 7,0) trong thời gian 1 – 7 giờ; ảnh hưởng của ion kim loại (nồng độ 10 mM), thông số Km và Vmax. 2.2.7. P ec ừ vỏ chanh leo Thu pectin từ vỏ chanh leo bằng acid citric ở pH 2 – 6, nhiệt độ 20 - 120 o C trong 5 - 15 phút và thu dịch lọc, bỏ bã. Cô đặc dịch lọc 10 lần ở 50C, kết tủa pectin bằng ethanol lạnh (0 o C) theo tỷ lệ ethanol: dịch lọc 1: 1, 2: 1, 3:1. Lọc thu tủa, sấy ở 50C và bảo quản pectin. Pectin được xác định hàm lượng theo phương pháp canxi pectat và chỉ số este hóa theo Pinheiro E.R. và cs (2008). 2.2.8. c đ nh đ u ki n và tố óa quá trình ủ ới hạn pectin tạo POS Pectin được hòa tan trong đệm với các nồng độ pectin thay đổi theo từng thí nghiệm (1 – 5% (w v)). Sau đó bổ sung enzyme với tỷ lệ enzyme cơ chất 30 - 50U/g, ở pH 3 - 5, nhiệt độ 40 - 60 o C, tốc độ khuấy 200 - 350 vòng phút trong thời gian từ 1 - 7 giờ theo Gomez B. và cs - 5 - (2014). Xác định hàm lượng POS và phổ các oligosaccharide tạo thành bằng sắc ký lớp mỏng. Tối ưu hóa quá trình thủy phân được thực hiện với ma trận thực nghiệm bao gồm 17 thí nghiệm với khoảng chạy của 3 yếu tố khảo sát là nhiệt độ (45 – 55 o C), tỷ lệ enzyme cơ chất (30 –50 U/g), tốc độ khuấy (200 – 300 vòng/phút). 2.2.9. P ạch POS Dịch POS sau khi thủy phân được ly tâm 6.000 vòng/phút trong 10 phút sau đó lọc cut-off với màng 10kDa, 1 kDa. Tiếp theo tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel Toyopearl GigaCap Q-650M trên cột có kích thước 50x1 cm. Chạy 1 ml dung dịch POS lên cột, rửa chiết và thu các phân đoạn 1,5 ml. Xác định hàm lượng, thành phần POS ở các phân đoạn và hiệu suất thu hồi POS (%). 2.2.10. c đ ạ c của P Cấy 1% (v/v - 3x10 5 cfu/ml) chủng thử nghiệm trong môi trường MR bổ sung 1% glucose (w/v) hoặc 1% POS (w/v), nuôi ở 37 o C. Cấy trang các mẫu canh trường trên ở thời điểm ban đầu và sau 24 giờ vào môi trường thạch đĩa để đếm số lượng khuẩn lạc (môi trường đặc hiệu VRBL, BSA, TSA, MRS tương ứng cho E. coli, S. typhi, S. aureus và L. acidophilus). Xác định điểm hoạt tính prebiotic (PAS) của POS dựa trên số lượng khuẩn lạc ban đầu và sau 24 giờ theo Huebner J. và cs (2007). 2.2.11. c đ àm ợng pectic oligosaccharide Hàm lượng POS được xác định dựa trên sự thủy phân hoàn toàn POS bằng acid H2SO4 và đường khử giải phóng ra (galacturonic acid) được xác định theo Kit D-Galacturonic (Megazym, Ireland). 2.2.12. c đ àm ợng pectic oligosaccharide bằng HPAEC Dịch POS được bơm 20µl vào cột carbopac PA1 trên hệ thống Dionex với dung dịch chuẩn là mono, di và trigalacturonic của Sigma với nồng độ 1 mg/ml theo Combo A.M.M. và cs (2012). 2.2.13. Chế đ s y phun tạo chế phẩm POS b t Dịch POS được phối trộn với maltodextrin đến hàm lượng chất khô 10, 12, 14, 16% và sấy ở chế độ 1: nhiệt độ đầu vào 200 o C, tốc độ tiếp liệu 3 lít/giờ; chế độ 2: nhiệt độ đầu vào 170 o C, tốc độ tiếp liệu 2,5 lít/giờ; chế - 6 - độ 3: nhiệt độ đầu vào 150 o C, tốc độ tiếp liệu 2 lít/giờ. Sản phẩm bột được đánh giá cảm quan và hiệu suất thu hồi (%). 2.2.14. Thử nghi m đ c tính c p của pectic oligosaccharide Thử nghiệm được tiến hành tại Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, trên 50 con chuột nhắt trắng giống Swiss cân nặng 18 – 22 g với liều 20 – 60g POS/kg chuột. 2.2.15. Thử nghi m sản xu t bánh quy xốp bổ sung POS Tiến hành sản xuất bánh quy xốp bổ sung POS 1 – 3% (w/w) và đánh giá cảm quan theo TCVN 3215-79. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu thu nhận endopolygalacturonase 3.1.1. Phân lập, tuyển ch n A. niger sinh tổng hợp EPG cao Từ một số nguồn vỏ quả giàu pectin đã phân lập được 40 chủng nấm sợi trên môi trường Czapeck. Trong đó chỉ có 16 chủng có khả năng phát triển trên môi trường chứa pectin và 7 chủng có đường kính khuẩn lạc >3 cm. Các chủng này đều mang những đặc điểm hình thái tương tự như của A. niger. Tiếp đó sàng lọc 7 chủng nấm mốc phân lập được và 30 chủng A. niger thu nhận từ các bộ sưu tập giống theo phương pháp đo bán kính vòng thủy phân cho thấy có 19/37 chủng cho giá trị (D - d) ≥ 4mm và 7 chủng có hoạt độ polygalacturonase >13 U/g. Xác định khả năng sinh tổng hợp EPG của 7 chủng này (bảng 3.4) cho thấy chỉ có A. niger CNTP 5037 sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao nhất đạt 22,94 U/g sau 3 ngày nuôi cấy. Do vậy, lựa chọn A. niger CNTP 5037 cho nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.4 Hoạt độ EPG của 7 chủng nấm mốc thử nghiệm TT Chủng Hoạt độ EPG (U/g) TT Chủng Hoạt độ EPG (U/g) 1 CNTP 5037 22,94 5 C2 20,79 2 CNTP 5004 18,61 6 CNTP 5002 16,88 3 CNTP 5007 17,30 7 CNTP 5020 16,45 4 CF 21,09 - 7 - 3.1.2. Cải tạo chủng A. niger CNTP5037 sinh tổng hợp EPG cao 3.1.2.1. Lựa chọn thời gian chiếu UV Bào tử A. niger CNTP 5037 được chiếu UV với thời gian 0 – 80 phút. Kết quả cho thấy với thời gian chiếu UV 80 phút thì toàn bộ bào tử bị tiêu diệt và thời gian chiếu 70 phút cho tỷ lệ sống 0,2%. Theo Zambare V. và cs (2010) tỷ lệ sống 0,01% là thích hợp nhất cho chọn lựa thời gian gây đột biến vì các vi sinh vật này có thể bị đột biến nhiều lần hoặc nhiều điểm dẫn tới tăng cường khả năng sinh tổng hợp hoạt chất mong muốn khi nuôi cấy. Do đó, thời gian chiếu xạ 75 phút với tỉ lệ sống 0,02% được lựa chọn cho quá trình cải tạo chủng A. niger CNTP 5037 bằng UV. 3.1.2.2. Sàng lọc dòng xử lý UV sinh endopolygalacturonase cao Qua 10 lần chiếu UV thu được 458 dòng có khả năng sống sót trên môi trường Czapeck-pectin. Trong số đó chỉ có 20 dòng có D d cao hơn (1,76 – 3,6 lần) so với chủng gốc (bảng 3.6). Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp EPG của 20 dòng này cho thấy có 4 dòng sinh tổng hợp EPG cao hơn (164,60 – 193,19%) so với dòng gốc (bao gồm: A. niger UV06, UV07, UV11, UV19). Đặc biệt chỉ có A. niger UV06 ổn định qua 5 lần cấy truyền, do đó lựa chọn A. niger UV06 cho nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.6 Khả năng tổng hợp EPG của dòng đột biến Ký hiệu dòng Hoạt độ EPG (U/g) Hiệu suất so với chủng gốc (%) Ký hiệu dòng Hoạt độ EPG (U/g) Hiệu suất so với chủng gốc (%) CNTP 5037 22,94 100,00 UV11 44,32 193,19 UV01 29,41 128,00 UV12 27,89 121,51 UV02 34,11 148,69 UV13 34,12 148,73 UV03 29,64 129,20 UV14 33,24 144,89 UV04 31,76 138,44 UV15 29,78 129,31 UV05 29,47 128,46 UV16 26,78 116,73 UV06 39,59 172,58 UV17 31,34 136,60 UV07 38,68 168,61 UV18 23,78 103,66 UV08 23,47 102,03 UV19 37,78 164,60 UV09 32,45 141,51 UV20 36,24 157,94 UV10 30,46 132,70 - 8 - 3.1.2.3. Cải tạo chủng bằng chiếu UV nhiều lần Tiến hành đột biến dòng A. niger UV06 nhiều lần bằng tia UV. Kết quả thu được biểu diễn ở bảng 3.8 cho thấy A. niger UV06-12-23 có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao gấp 2,8 lần so với dòng gốc (60,82 U g môi trường) và ổn định qua 15 lần cấy truyền vẫn giữ được 95% hoạt độ so với thế hệ đầu tiên. Bảng 3.8 Khả năng sinh tổng hợp EPG của các dòng xử lý UV nhiều lần qua các lần cấy truyền Số lần chiếu UV Tên dòng Hoạt độ endopolygalacturonase (U/g) Số lần cấy truyền (lần) 1 2 3 4 5 2 A. niger UV06-12 45,19 45,41 44,01 44,76 44,84 A. niger UV06-13 48,68 42,47 40,15 36,51 31,14 A. niger UV06-14 54,32 40,01 32,94 18,16 6,09 A. niger UV06-15 47,78 32,13 26,62 15,18 5,58 3 A. niger UV06-12-21 64,06 60,21 54,38 52,22 50,37 A. niger UV06-12-22 57,43 47,12 35,92 25,18 14,25 A. niger UV06-12-23 60,82 59,22 59,85 58,02 58,15 3.1.3. Thu nhận và đ c tính của EPG từ A. niger UV06-12-23 3.1.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp EPG Từ kết quả khảo sát (hình 3.3 – 3.7) cho thấy các khoảng hoạt động tương ứng của các thông số khảo sát để thu được hoạt độ endopolygalacturonase cao khi nuôi cấy trên môi trường rắn bao gồm: 10 – 14% pectin, độ ẩm 50 – 70% và nhiệt độ 25 – 35 o C. Hoạt độ EPG thu được cao ở độ dày môi trường 17 mm sau 72 giờ lên men. 3.1.3.2. Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp EPG từ A. niger UV06-12-23 Dựa trên cơ sở đã khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp EPG, tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời của độ ẩm (X1), hàm lượng pectin (X2) và nhiệt độ (X3). Kết quả được thể hiện ở bảng 3.10. Phương trình hồi quy biểu hiện hoạt độ EPG mô tả ảnh hưởng của các yếu tố độc lập và các mối tương tác giữa chúng được biểu diễn như sau: Hoạt độ EPG = +72,02 + 4,53X1 + 1,55X2 + 2,61X3 + 3,40X1X2 – 2,00X1X3 + 3,13X2X3 – 6,91X1 2 – 7,04 X2 2 – 2,53X3 2 . - 9 - Từ kết quả trên dựa vào phương pháp tối ưu hóa tìm được điều kiện lên men tối ưu nhất là: độ ẩm 64%, hàm lượng pectin 12,5% và nhiệt độ 31 o C. Khi đó, hoạt độ EPG đạt được 73,4 U/g. Hình 3.3 – 3.7 Ảnh hưởng của hàm lượng pectin (3.3), độ dày môi trường (3.4), độ ẩm (3.5), nhiệt độ (3.6) và thời gian (3.7) đến sinh tổng hợp EPG của A. niger UV06-12-23 Bảng 3.10 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hoạt độ EPG thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau TN Độ ẩm (%) Hàm lượng pectin (%) Nhiệt độ ( o C) Hoạt độ EPG (U/g) TN Độ ẩm (%) Hàm lượng pectin (%) Nhiệt độ ( o C) Hoạt độ EPG (U/g) 1 50 10 30 54,42 10 60 14 25 58,64 2 70 10 30 58,28 11 60 10 35 60,02 3 50 14 30 51,05 12 60 14 35 69,03 4 70 14 30 68,53 13 60 12 30 70,05 5 50 12 30 53,71 14 60 12 30 72,21 6 70 12 25 65,17 15 60 12 30 73,17 7 50 12 35 64,00 16 60 12 30 71,38 8 70 12 35 67,45 17 60 12 30 73,29 9 60 10 25 62,13 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 - 10 - 3.1.3.3. Tách và tinh sạch EPG từ chủng xử lý UV Tinh sạch EPG từ A. niger UV06-12-23 bằng (NH4)2SO4 85% độ bão hòa, ethanol 70% (0 o C) và lọc dòng ngang màng 10 kDa cho thấy hiệu suất thu hồi enzyme bằng kĩ thuật lọc cao hơn hẳn so với kết tủa bằng amonium sulfate bão hòa và ethanol (hiệu suất lần lượt là 83,9%; 67,7% và 73,2%). EPG sau khi lọc được tinh sạch tiếp bằng sắc ký trao đổi ion kết quả thu được chế phẩm EPG qua cột QFF có 1 đỉnh duy nhất và 1 băng đậm (hình 3.10-11) với hoạt độ riêng 794,4 U/mgPr với độ tinh sạch 6,38 lần so với EPG trong dịch thô và hiệu suất thu hồi đạt 38,8% (bảng 3.13). Bảng 3.13 Các bước tinh sạch EPG từ A. niger UV06-23 TT Các bước tinh sạch Thể tích (ml) Lượng protein tổng số (mg) Hoạt độ tổng (U) Hoạt độ riêng (U/mgPr) Mức độ tinh sạch (lần) Hiệu suất thu hồi (%) 1 Enzyme thô 1000 87,9 10950 124,6 1,00 100 2 Sau lọc cut-off 100 37,75 9187 243,4 1,95 83,9 3 Qua cột QFF 5 5,35 4250 794,4 6,38 38,8 Hình 3.10 – 3.11 Sắc ký đồ tinh sạch EPG bằng cột QFF trên hệ thống FPLC (3.10) và bản điện di SDS-PAGE protein EPG (3.11) M: marker protein (Fermentas), 1: dịch enzyme thô, 2: dịch enzyme sau lọc cut-off 10 kDa, 3: dịch enzyme sau cột QFF 3.1.3.4. Đặc tính của endopolygalacturonase từ chủng xử lý UV Nghiên cứu đặc tính cho thấy EPG bền trong vùng pH 3 – 5, nhiệt độ 30 - 50ºC và pHopt 4,5, topt 50 o C. Ở nồng độ 10mM, enzyme hoạt động mạnh hơn 114,2% bởi Ca 2+ , không bị ảnh hưởng bởi Na + , K + , bị ức chế 1 2 3 M 3.10 3.11 - 11 - bởi Cu 2+ , Fe 2+ , Mn 2+ , Mg 2+ . Xác định các thông số động học cho kết quả Km = 4,94 (mg/ml), Vmax = 1,46 (µmol/phút). 3.2. Sản xu t pectic oligosaccharide (POS) từ pectin vỏ chanh leo 3.2.1. Thu nhận và chuyển hóa pectin Qua quá trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến thu hồi pectin bằng acid citric và thử nghiệm trên quy mô 100kg vỏ chanh leo, luận án đã xây dựng quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo cho sản xuất POS như hình 3.18. Hình 3.18 Sơ đồ quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo Pectin thu nhận theo quy trình trên được đánh giá thành phần và chất lượng. Kết quả được biểu diễn trong bảng 3.15. Bảng 3.15 Thành phần của pectin tách chiết từ chanh leo Thành phần hóa h c Hàm ợng Pectin (%) 95 DE pectin (%) 70 (Chanh tím) - HMP 38 (Chanh vàng) - LMP Độ ẩm (%) 5,47 Hàm lượng tinh bột (%) 0,5 Hàm lượng protein (%) 0 Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) 6×10 Coliform (MPN/g) 10 S. aureus (CFU/g) 0 Hiệu suất thu nhận pectin (%) 2,8 Xử lí nguyên li u (cắt, chần acid citric 3%, nghiền) Chiết pectin (pH 2, 100 o C, 10 phút) Thu d c , C đ c (50 o C, cô chân không tới 20oBx) Kết tủa (ethanol lạnh 0oC, tỷ lệ 3:1) S y (nhiệt độ 50oC) Đó ó , bảo quản PECTIN Vỏ chanh leo - 12 - Pectin từ vỏ chanh leo tím thuộc dạng HM pectin (pectin có mức độ methyl hóa cao). Trong khi endopolygalacturonase hoạt động phân cắt hiệu quả hơn trên LM pectin để tạo POS. Cùng với đó nguồn vỏ chanh leo từ các cơ sở sản xuất ở Việt Nam chủ yếu là chanh leo tím. Do vậy, để ứng dụng pectin từ vỏ chanh leo tím vào sản xuất POS cần nghiên cứu chuyển hóa HM pectin thành LM pectin. Kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình chuyển hóa được thực hiện ở nồng độ pectin 2% (w/v) bằng HCl 1% (v/v) với tốc độ khuấy 50 vòng/phút, 70 o C trong 4 - 6 giờ. Pectin thu được có hàm lượng 86 - 89% với DE 34 – 47. 3.2.2. Đi u ki n thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo POS Để chủ động nguồn enzyme trong nghiên cứu này endopolygalacturonase thương mại (Pectinex Ultra SP-L) được sử dụng để nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo và sau đó ứng dụng quy trình này trên enzyme nghiên cứu (endopolygalacturonase từ A. niger UV06-12-23) để sản xuất POS. 3.2.2.1. Lựa chọn nồng độ pectin Thủy phân pectin nồng độ 1 - 5% (w/v) trong 4 giờ. Kết quả thu được biểu diễn ở hình 3.20 cho thấy nồng độ pectin 3% (w/v) tốc độ phản ứng được duy trì và ổn định trong khoảng 3 giờ, hàm lượng POS ngày càng tăng lên. Do vậy, nồng độ cơ chất 3% được lựa chọn. Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo M: oligosaccharide chuẩn; B: giếng 1-5 với nồng độ cơ chất 1, 2, 3, 4, 5% 3.2.2.2. Tỷ lệ enzyme/cơ chất thích hợp Thủy phân pectin vỏ chanh leo 3% ở các tỷ lệ enzyme cơ chất là 20 - 60 U/g pectin. Kết quả cho thấy ở tỷ lệ 40 U/g phổ sản phẩm chứa chủ yếu G2 G3 G1 B A M 1 2 3 4 5 A - 13 - là đường đôi, đường ba và hàm lượng POS lớn nhất (hình 3.21). Do đó lựa chọn nồng độ này cho các nghiên cứu tiếp theo. Hình 3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin vỏ chanh leo M: oligosaccharide chuẩn; giếng 1-5 với tỷ lệ 20, 30, 40, 50, 60 U/g 3.2.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ Với nồng độ pectin 3% (w/v) khoảng nhiệt độ thủy phân được nghiên cứu 40 - 60C. Xác định hàm lượng, thành phần của POS và biểu diễn kết quả trên hình 3.22 cho thấy, phản ứng ở 50C, dịch thủy phân xuất hiện lượng G2 và G3 mong muốn và tổng lượng POS tạo ra cao nhất. Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin vỏ chanh leo M: oligosaccharide chuẩn; giếng 1-3 tương ứng với nhiệt độ 40, 50, 60 o C 3.2.2.4. Ảnh hưởng của pH Tiến hành thủy phân pectin 3% (w/v) ở pH 3 – 5, kết quả hình 3.23 cho thấy ở mức pH 4 pectin đã được thủy phân hoàn, đã xuất hiện các vệt G2 và G3 rất rõ. Đồng thời, lượng G1 tạo ra cũng ít hơn. G1 G2 G3 B M 1 2 3 A A B G1 G2 G3 M 1 2 3 4 5 - 14 - Hình 3.23 Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo M: oligosaccharide chuẩn; giếng 1-3 với pH 3, pH 4, pH 5 3.2.2.5. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy Tiến hành thủy phân pectin 3% (w/v) trong 4 giờ ở các tốc độ khuấy 200 – 350 vòng/phút. Kết quả hình 3.24 cho thấy do dịch pectin có độ nhớt khá cao nên tốc độ phản ứng thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tốc độ khuấy. Trong các thử nghiệm, tốc độ khuấy 250 vòng phút được lựa chọn do phổ sản phẩm thu được chủ yếu là G2 và G3. Hình 3.24 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo M: oligosaccharide chuẩn; 1-4: dịch POS ở tốc độ khuấy 200, 250, 300, 350 vòng/phút 3.2.2.6. Ảnh hưởng của thời gian Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân giới hạn pectin chanh leo trong 7 giờ cho thấy hàm lượng POS tăng nhanh và đạt cao nhất là 18,16 mg/ml khi thủy phân 4 tiếng (hình 3.25). G2 G3 G1 M 1 2 3 4 A B A B G2 G3 G1 M 1 2 3 - 15 - Hình 3.25 Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin chanh leo M: oligosaccharide chuẩn; 1-6: thời gian thủy phân 1, 2, 3, 4, 5 và 6 giờ 3.2.2.7. Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân pectin tạo POS Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu hóa hàm lượng POS thu được sau quá trình thủy phân thu được 43 phương án thí nghiệm. Với phương án tốt nhất là 44 U/g pectin, nhiệt độ 53C và tốc độ khuấy là 270 vòng/phút, hàm lượng POS tính toán đạt 24,35 mg/ml (hiệu suất thủy phân 81,83%). Tiến hành thủy phân pectin vỏ chanh leo với điều kiện tối ưu bằng endopolygalacturonase thu nhận từ chủng đột biến A. niger UV06-12-23, sau 5 tiếng thủy phân thu được hàm lượng POS đạt 23,55 mg/ml. Kết quả sắc ký đồ hình 3.28 cho thấy sau 4 tiếng thủy phân (giếng 5) dịch thủy phân từ nguồn enzyme này gồm nhiều thành phần hơn dịch thủy phân bằng enzyme thương mại (gồm mono, di, tri và tetra galacturonic acid) và hiệu suất thủy phân thấp hơn không đáng kể so với enzyme thương mại (78,50% và 81,16% tương ứng). Do phổ sản phẩm khi thủy phân 4 tiếng vẫn là các oligosaccharide nên có thể áp dụng các điều kiện đã tối ưu khi sử dụng EPG nghiên cứu để sản xuất POS. Hình 3.28 Bản sắc ký lớp mỏng dịch thủy phân pectin vỏ chanh leo bằng EPG từ A. niger UV06-12-23 A G2 G3 G1 B M 1 2 3 4 5 6 1: mono, di, tri galacturonic acid 2 – 7: dịch thủy phân sau 30, 60, 120, 180, 240 và 300 phút 8: pectin chưa thủy phân - 16 - 3.2.3. Thu nhận và tinh sạch POS Trong sản phẩm dịch thủy phân ngoài POS (digalacturonic acid và trigalacturonic acid) vẫn còn chứa một phần nhỏ các sản phẩm phụ như pectin thủy phân chưa sâu (pectin khối lượng phân tử thấp), monogalacturonic acid và enzyme. Do vậy, trong phần này các công đoạn của quá trình tinh sạch được nghiên cứu nhằm tạo ra nhiều dòng sản phẩm để đa dạng hóa các mục đích sử dụng (ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, y dược và phân tích). 3.2.3.1. Tinh sạch bằng kỹ thuật lọc màng Từ 10 lít dịch POS sau khi thủy phân được ly tâm 6.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C, sau đó lọc lần lượt qua màng 10kDa và màng 1 kDa. Kết quả biểu diễn trên bảng 3.20. Bảng 3.20 Hiệu suất thu hồi POS sau lọc dòng ngang Thể tích (lít) Tổng lượng Pectin khối lượng phân tử thấp (g) Tổng lượng POS (g) Hiệu suất thu hồi (%) Dịch đầu 10 27,1 ± 0,5 242,7 ± 5,7 100 Dịch qua màng 10 kDa 9,5 3,5 ± 0,1 214,2 ± 4,5 88,2 ± 1,80 Dịch qua màng 1 kDa 9,0 0 200,4 ± 4,1 82,5 ± 1,75 Kết quả cho thấy sau khi lọc qua màng 10 kDa lượng pectin khối lượng phân tử thấp giảm đi đáng kể so với dịch ban đầu (3,5g và 27,1g), trong khi lượng POS trong dịch cao (hiệu suất thu hồi POS 88,2%). Tiếp tục qua màng 1 kDa, dịch qua màng không chứa pectin khối lượng phân tử thấp với hiệu suất thu hồi 82,5%. Sắc ký đồ hình 3.10B (giếng 3) cũng cho thấy dịch POS sau khi lọc chỉ gồm mono, di và tri galacturonic acid. 3.2.3.2. Tinh sạch POS qua cột sắc ký Dịch POS sau khi lọc qua màng 1 kDa được tinh sạch tiếp bằng phương pháp sắc ký lọc gel. Kết quả trên bảng 3.21 và hình 3.29 - 17 - Hình 3.29 Các phân đoạn POS khi lọc gel (A) và TLC sản phẩm khi tinh sạch (B) 1: mono, di, tri galacturonic acid; 2: dịch POS qua màng 10 kDa ; 3: dịch POS qua màng 1 kDa; 4 - 5: dịch chiết phân đoạn 15 và 40 Dịch POS sau khi lọc thu được 2 đỉnh tương ứng với phân đoạn 13 – 24 và phân đoạn 34 – 41 (hình 3.29A). Phân tích thành phần của 2 đỉnh này trên bản sắc ký hình 3.29B cho thấy ở phân đoạn 15 (đỉnh 1) chỉ chứa di và tri galacturonic acid (giếng 4), còn ở phân đoạn 40 (đỉnh 2) chỉ chứa monogalacturonic acid (giếng 5). Với phân đoạn POS từ 13 – 24, tổng hàm lượng POS thu được là 379,7 mg như vậy hiệu suất thu hồi POS sau khi lọc gel là 78,6% (bảng 3.21). Bảng 3.21 Hiệu suất thu hồi POS sau khi lọc gel Tổng lượng POS (mg) Tổng lượng mono galacturonic acid (mg) Hiệu suất thu hồi (%) Dịch qua màng 1 kDa 398,4 ± 1,7 30,2 ± 0,5 82,5 ± 1,75 Dịch sau lọc gel 379,7 ± 1,5 0 78,6 ± 1,78 Như vậy, dịch POS sau khi lọc gel không chứa monogalacturonic acid và chỉ bao gồm di, tri galacturonic acid. 3.2.4. Nghiên cứu hoàn thi n chế phẩm POS 3.2.4.1. Tạo chế phẩm POS dạng bột Dịch thủy phân pectin từ vỏ chanh leo chứa POS và một ít sản phẩm phụ. Trong đó pectin là chất xơ thực phẩm và an toàn với con người. Do vậy, toàn bộ dịch thủy phân có thể sử dụng làm sản phẩm POS thô ứng dụng bổ sung vào các lĩnh vực sản xuất thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và đồ uống. A B G2 G1 G3 G1 G2 + G3 - 18 - Kết quả nghiên cứu điều kiện sấy thích hợp nhất đối với sản phẩm POS là: nhiệt độ đầu vào 170 o C, tốc độ tiếp liệu 2,5 lít/giờ, tốc độ đầu bơm ly tâm 23000 vòng/phút. Từ 60 lít dịch POS, sau khi phối trộn với maltodextrin tới 12 o Bx và sấy phun với điều kiện như trên thu được 2,56 kg chế phẩm POS 55%. 3.2.4.2. Nghiên cứu bảo quản chế phẩm POS Khi bổ sung natri benzoat 0,01% vào chế phẩm POS dạng lỏng cho thấy hàm lượng POS trong chế phẩm ổn định, chất lượng gần như không thay đổi so với ban đầu sau 12 tháng. Với chế phẩm POS dạng bột bảo quản trong túi thiếc sau 12 tháng không thấy sự phát triển của vi khuẩn tổng số hiếu khí, E. coli, Samonella, bào tử nấm men, nấm mốc và hàm lượng POS ổn định, chất lượng sản phẩm không thay đổi. 3.2.5. Xây dựng quy trình sản xu t POS từ pectin vỏ chanh leo Với các điều kiện thủy phân pectin tạo POS, chúng tôi xây dựng quy trình sản xuất POS thô từ pectin vỏ chanh leo như hình 3.31. Hình 3.31 Sơ đồ quy trình thu nhận chế phẩm POS từ pectin vỏ chanh leo - 19 - 3.3. Đánh giá hoạ và ăm dò ứng dụng của POS 3.3.1. Hoạt tính sinh h c Để minh chứng tác dụng có lợi của pectic oligosaccharide, trong nghiên cứu này chế phẩm POS được đánh giá hoạt tính sinh học trong điều kiện in vitro thông qua khả năng làm tăng số lượng vi khuẩn có lợi và giảm số lượng vi khuẩn gây hại trên các chủng kiểm định. Bên cạnh đó, điểm hoạt tính prebiotic (PAS) của POS cũng được đánh giá và so sánh với một số loại prebiotic khác đang được sử dụng phổ biến. 3.3.1.1. Ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn có lợi và có hại Kết quả bảng 3.27 cho thấy cả 9 chủng probiotic Lactobacillus thử nghiệm đều tăng sinh mạnh trên môi trường chứa POS so với môi trường có glucose, trong đó L. acidophilus (L3) có khả năng tăng sinh mạnh nhất. Khi nuôi cấy E. coli, S. typhi và S. aureus trong môi trường chứa POS, số lượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy đều giảm hơn khi nuôi chúng trong môi trường không chứa POS. Bảng 3.27 Ảnh hưởng của POS tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi và hại Chủng thử nghiệm Số lượng khuẩn lạc tăng sau 24 giờ (Tính theo Lgcfu/ml) Môi trường Glucose Môi trường chứa POS L1 9,523 ± 0,089 9,768 ± 0,091 L2 9,520 ± 0,090 9,708 ± 0,090 L3 9,488 ± 0,091 9,788 ± 0,089 L4 9,530 ± 0,091 9,714 ± 0,089 L5 9,529 ± 0,089 9,676 ± 0,090 L6 9,514 ± 0,090 9,775 ± 0,091 L7 9,572 ± 0,092 9,695 ± 0,091 L8 9,529 ± 0,090 9,745 ± 0,090 L9 9,595 ± 0,089 9,733 ± 0,091 E. coli 0157:H7 9,563 ± 0,090 8,340 ± 0,076 S. enterica Typhi 9,533 ± 0,092 8,403 ± 0,075 S. aureus ATCC 25923 9,556 ± 0,090 8,628 ± 0,078 Kết quả thử nghiệm về ảnh hưởng của POS tới sự phát triển của hai loại vi khuẩn có lợi và có hại khi chúng được nuôi kết hợp trong cùng một môi trường ở bảng 3.28 cho thấy mật độ hỗn hợp vi khuẩn được cải thiện - 20 - trong môi trường nuôi khi có mặt của POS, tuy nhiên lượng tăng chủ yếu là của L. acidophilus còn vi khuẩn có hại sinh trưởng chậm. Bảng 3.28 Ảnh hưởng của POS tới sự phát triển đồng thời của vi khuẩn có lợi và có hại Chủng thử nghiệm (tỉ lệ 1:1) Số lượng khuẩn lạc tăng sau 24 giờ nuôi (Lgcfu/ml) L1+ Vi khuẩn có hại L1 Vi khuẩn có hại L1 + S. enterica Typhi 9,828 ± 0,079 9,818 ± 0,079 8,161 ± 0,050 L1 + E. coli 0157:H7 9,790 ± 0,078 9,782 ± 0,080 8,041 ± 0,053 L1 + S. aureus ATCC 25923 9,792 ± 0,078 9,772 ± 0,078 8,455 ± 0,053 Để minh chứng hoạt tính sinh học của POS tại cơ quan có thẩm quyền một cách độc lập, chế phẩm POS thô dạng bột được gửi đi đánh giá hoạt tính sinh học tại Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.29 cho thấy chế phẩm POS thô vẫn có khả năng tăng sinh số lượng vi khuẩn có lợi như: L. acidophilus ATCC 4356, L. rhamnosus ATCC 7469, B. bifidum ATCC 15700 và ức chế sự phát triển của E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923. Bảng 3.29 Kết quả phân tích hoạt tính sinh học của POS thô dạng bột Chủng thử nghiệm Số lượng khuẩn lạc tăng sau 24 giờ (Lgcfu/ml) trên môi trường Glucose POS Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 7,96 8,26 Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 6,64 6,77 Bifidobacteria bifidum ATCC 15700 8,18 8,25 Escherichia coli ATCC 25922 8,77 8,56 Staphylococcus aureus ATCC 25923 7,39 4,79 Như vậy, qua nghiên cứu ảnh hưởng của POS đến sự phát triển của vi khuẩn có lợi và gây hại trong điều kiện in vitro có thể thấy POS làm tăng cường sự phát triển của vi sinh vật có lợi thuộc Lactobacillus, Bifidobacteria và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây hại E. coli, S. typhi, S. aureus. Kết quả này là cơ sở khoa học để bổ sung POS vào quá trình chế biến tạo sản phẩm chức năng. - 21 - 3.3.1.2. So sánh khả năng tăng sinh một số chủng vi khuẩn có lợi bởi POS và các prebiotic khác Để so sánh khả năng sử dụng POS của một số vi khuẩn có lợi với các loại chế phẩm prebiotic khác đang lưu hành trên thị trường Việt Nam, tiến hành xác định tỷ lệ tăng sinh sau 24 giờ so với môi trường MRS thu được kết quả biểu diễn ở biểu đồ hình 3.33. Hình 3.33 Khả năng tăng sinh của các chủng Lactobacillus thử nghiệm trong môi trường chứa các loại prebiotic khác nhau Kết quả hình 3.11 cho thấy, tất cả các chủng thử nghiệm đều sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường chứa POS và các prebiotic khác. Tuy nhiên, L. rhamnosus, L. acidophilus, L. bulgaricus, L. fermentum và L. plantarum phát triển tốt nhất trên môi trường chứa POS, trong khi đó L. amylovorus sử dụng MOS, L. casei và B. lactis dùng FOS còn L. reuteri và L. johnsonii sử dụng Inulin tốt hơn các loại khác. Vì vậy, POS có thể được sử dụng làm nguồn cacbon khá tốt cho sự phát triển của vi khuẩn có lợi. 3.3.1.3. Xác định điểm hoạt tính prebiotics của POS Điểm hoạt tính của POS trên 10 chủng vi khuẩn probiotic được thể hiện ở đồ thị hình 3.34 cho thấy, chế phẩm POS khi kết hợp với L. acidophilus cho điểm prebiotic cao nhất (0,597) và thấp nhất là L. fermentum (0,525). Khi tạo chế phẩm sinh học kết hợp giữa vi khuẩn có lợi và POS có thể kết hợp giữa POS với vi khuẩn L. acidophilus để tạo ra chế phẩm có hoạt tính sinh học cao hơn các cách kết hợp khác để ứng dụng trong thực phẩm chức năng hoặc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy hải sản. - 22 - Hình 3.34 Điểm hoạt tính prebiotic đối với các chủng vi khuẩn có lợi 3.3.2. Đ ch ợng sản phẩm và an toàn v sinh thực phẩm cho chế phẩm POS dạng b t 3.3.2.1. Kiểm tra chất lượng sản phẩm Do Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đến năm 2015 không có quy định cụ thể về các chỉ tiêu vi sinh, hóa lý cho sản phẩm thực phẩm chức năng, tuy nhiên chế phẩm POS thường được bổ sung vào các sản phẩm bánh, sữa, đồ uống nên ở đây chọn Quy chuẩn Việt Nam 2011 cho sản phẩm sữa bột trẻ đến 12 tháng tuổi để làm đối chứng. Kết quả đánh giá từ Viện Dinh dưỡng cho thấy sản phẩm POS thô dạng bột đạt chỉ tiêu vi sinh, hóa lý đối với thực phẩm theo như Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm độc tố vi nấm, giới hạn ô nhiễm kim loại nặng và vi sinh vật trong thực phẩm. Kết quả hình 3.36 cho thấy phổ sản phẩm của POS chỉ gồm di, tri galacturonic (24 mg/ml) và một lượng ít monogalacturonic acid (3 mg/ml). Hình 3.36 Sắc ký đồ HPAEC dịch thủy phân pectin chanh leo A: Mono, di, tri galacturonic acid chuẩn, B: dịch thủy phân pectin 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0 -5 13 25 38 50 63 75 88 100 2 [modified by igor] nC min 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0 -5 13 25 38 50 63 75 88 100 1 [modified by igor] nC min B A G1 G2 + G3 G1 G2 + G3 - 23 - 3.3.2.2. Thử nghiệm độc tính cấp của sản phẩm trên chuột Sản phẩm POS thô dạng bột khi cho chuột uống với mức liều từ 20,0 g – 60,0 g mẫu thử kg chuột không nhận thấy biểu hiện khác thường so với nhóm đối chứng, không nhận thấy có biểu hiện ngộ độc trên chuột thí nghiệm trong thời gian theo dõi. Tất cả chuột đều ăn uống, hoạt động bình thường. Không xác định được liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) vì mẫu thử không gây chết chuột thử nghiệm ở mức liều tối đa nhất có thể cho uống. 3.3.3. Thử nghi m sản xu t bánh quy xốp bổ sung POS Dựa trên một số công trình đã công bố, trong nghiên cứu này chọn lượng POS để khuyến cáo sử dụng với hàm lượng từ 3 – 10 g người/ngày để làm cơ sở tính toán bổ sung vào bánh bích quy. Tiến hành phối trộn các nguyên liệu và bổ sung POS bột 1 – 3% (w w), đánh nhuyễn sau đó tạo hình và nướng ở nhiệt độ 160 o C trong 10 phút. Bánh đối chứng (không chứa POS) và các lô bánh bổ sung POS được xác định cảm quan. Kết quả cho thấy mẫu bánh bổ sung 2% POS có vị ngon, vẫn giữ được màu sắc và cấu trúc của sản phẩm. Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy quá trình nướng ở nhiệt độ cao (160 o C) thời gian dài (10 phút) không làm thay đổi thành phần của POS (digalacturonic acid và trigalacturonic acid). Bên cạnh đó, POS vẫn có trong sản phẩm bánh sau khi nướng, do đó bánh bổ sung POS 2% vẫn có khả năng tăng sinh vi khuẩn có lợi và ức chế vi khuẩn gây hại. Như vậy, bánh quy xốp bổ sung POS 2% (w/v) có thể sử dụng làm bánh chức năng nhằm tăng cường sức khỏe cho con người. 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sau một thời gian nghiên cứu, luận án đã đưa ra một số kết luận sau: 1. Đã phân lập được 7 chủng A. niger và từ 37 chủng tuyển chọn được A. niger CNTP 5037, tạo được chủng đột biến A. niger UV06-12-23 bằng UV có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao (60,82 U/g). 2. Tìm được điều kiện lên men rắn thích hợp để A. niger UV06-12-23 sinh tổng hợp endopolygalacturonase (73,15 U/g tại 31 o C, pectin 12,5%, độ ẩm 64,5%, 72 giờ) và đã tách tinh sạch, xác định được đặc tính xúc tác - 24 - của endopolygalacturonase: bền ở pH 3 - 5, 30 - 50ºC và pH tối ưu 4,5, nhiệt độ tối ưu 50 o C; Km = 4,94 (mg/ml), Vmax = 1,46 (µmol/phút). 3. Xây dựng được quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo: Vỏ chanh leo được xử lý (cắt, chần acid citric 3%, nghiền) rồi chiết pectin (pH 2, 100 o C, 10 phút) và thu dịch bằng vải lọc, cô đặc chân không (ở 50 o C, đến 25 o Bx) sau đó kết tủa pectin bằng (ethanol 0 o C, tỷ lệ 3:1) và sấy ở 50 o C, đóng gói tạo pectin thành phẩm. 4. Đã xác định được điều kiện tối ưu để chuyển hóa pectin từ vỏ chanh leo tạo POS (pectin 3%, tỷ lệ enzyme cơ chất 44 U/g, pH 4, 53 o C, khuấy 270 vòng/phút, 4 giờ), hiệu suất thủy phân 80%, phổ sản phẩm POS chứa chủ yếu digalacturonic acid và trigalacturonic acid. 5. Xây dựng được quy trình thu hồi POS từ dịch thủy phân giới hạn pectin và hoàn thiện tạo chế phẩm POS thô và tinh sạch: + Chế phẩm POS thô (POS 55%): Thủy phân Pectin vỏ chanh leo (3%, endopolygalacturonase 44 U/g, pH 4, 53 o C, 270 v/p, 4 giờ) rồi sấy phun (trộn maltodextrin 12 o Bx, tvào170 o C, tra80 o C). + Chế phẩm POS tinh sạch: Thủy phân Pectin vỏ chanh leo (3%, endopolygalacturonase 44 U/g, pH 4, 53 o C, 270 v/p, 4 giờ), lọc dòng ngang (10 kDa và 1 kDa) sau đó lọc gel (ToyopearGigaCapQ650M). 6. Chế phẩm POS bột được đánh giá có khả năng tăng sinh các vi khuẩn có lợi (Lactobacillus 137,41 - 193,37%) và giảm các vi khuẩn có hại trong cơ thể chủ (E. coli 68,59%, S. typhi 87,26%, S. aureus 88,08%), đảm bảo các chỉ tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm. 7. Bước đầu ứng dụng chế phẩm POS bột sản xuất bánh quy xốp chức năng, bánh vẫn giữ được các tính chất cảm quan đặc trưng về mùi vị và cấu trúc. 4.2. Kiến ngh - Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất POS từ pectin vỏ chanh leo trên quy mô công nghiệp - Cần nghiên cứu thử nghiệm hiệu quả của sản phẩm POS vào sản xuất sản phẩm thực phẩm chức năng khác có sử dụng POS làm cơ sở phát triển các dự án sản xuất POS ở quy mô lớn.