Tóm tắt Luận án Nghiên cứu xác định một số dạng selen trong hải sản bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC LÊ THỊ DUYÊN NGHI£N CøU X¸C §ÞNH MéT Sè D¹NG SELEN TRONG H¶I S¶N B»NG PH¦¥NG PH¸P VON-AMPE HßA TAN Chuyên ngành : Hóa Phân tích Mã số : 62.44.29.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2012 Công trình được hoàn thành tại: Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lê Lan Anh 2. TS. Lê Đức Liêm Phản biện 1: GS.TS. Hồ Viết Quý Phản biện 2: PGS.TS. Huỳnh Văn Trung Phản biện 3: PGS.TS. Tạ Thị Thảo Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Vào hồi 9 giờ ngày 21 tháng 12 năm 2012 Có thể tìm hiểu luận án tại: CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Lê Thị Duyên, Lê Đức Liêm, Nguyễn Thị Thu Hiền (2010), “Tối ưu hóa điều kiện xác định Se(IV) bằng phương pháp von-ampe hòa tan catot xung vi phân trên điện cực giọt thủy ngân treo”, Tuyển tập Hội nghị khoa học lần thứ 19 trường Đại học Mỏ-Địa Chất, Hà Nội 2. Nguyễn Viết Hùng, Lê Thị Duyên, Vũ Thị Thanh Hồng, Vũ Đức Lợi và Lê Lan Anh (2010), “Nghiên cứu quy trình phân tích hàm lượng Asen và Selen trong hải sản”, Tạp chí Phân tích Hóa, Lý và Sinh học, Tập 15, số 3, 228-234. 3. Trần Thị Hồng Vân, Nguyễn Viết Hùng, Lê Đức Liêm và Lê Thị Duyên (2010), “Xác định hàm lượng vết Selen trong một số hải sản bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan catot”, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội, Vol. 55, số 3, 54-63. 4. Lê Lan Anh, Lê Thị Duyên, Lê Đức Liêm và Nguyễn Viết Hùng (2011), “Nghiên cứu xác định một số dạng Selen: Se6+, Se4+, và Selencystin bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan”, Tạp chí Phân tích Hóa, Lý và Sinh học, Tập 16, số 4, 13-17. 5. Lê Thị Duyên, Lê Lan Anh và Lê Đức Liêm (2012), “Định lượng một số dạng selen trong hải sản bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam, Tập 50(3), 317-325. 6. Lê Thị Duyên, Lê Lan Anh và Lê Đức Liêm (2012), “Nghiên cứu phương pháp Von-Ampe hòa tan phân tích dạng selen hữu cơ dimetyl diselenua”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam, Tập 50 (Giấy nhận đăng). 1 I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Mở đầu Vai trò quan trọng của vết các nguyên tố trong khoa học, công nghệ và đời sống đã được biết đến từ lâu. Chính vì vậy, nhiều phương pháp phân tích hàm lượng vết các nguyên tố trong các đối tượng khác nhau đã được nghiên cứu, trong đó nhiều phương pháp tiêu chuẩn hóa đã được xây dựng. Nhưng để nghiên cứu giải thích một cách khoa học và chính xác độ độc độc tính; quá trình sinh hóa, sinh địa hóa; quá trình chuyển hóa và tích lũy sinh học vết các nguyên tố, việc xác định hàm lượng tổng vết các nguyên tố là chưa đủ, mà còn phải dạng tồn tại của chúng trong các đối tượng nghiên cứu. Với độ nhạy, độ chính xác và tính chọn lọc cao và nhất là có thể phân tích trực tiếp được dạng tồn tại vết các nguyên tố, phương pháp Von-Ampe hòa tan đã trở thành phương pháp phân tích hiện đại được lựa chọn để nghiên cứu phân tích trực tiếp dạng các nguyên tố trong các mẫu sinh-y-dược học, lương thực thực phẩm, môi trường. Mặt khác, selen (Se) là nguyên tố hai mặt trong đời sống, vừa có thể đóng vai trò là nguyên tố vi lượng vừa có thể là độc tố môi trường có độ độc cao. Khoảng nồng độ Se được phép có mặt trong cơ thể người mà không gây độc hại là rất hẹp và tùy thuộc vào dạng tồn tại của Se. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã chọn đề tài luận án “Nghiên cứu xác định một số dạng selen trong hải sản bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan”. 2. Mục tiêu của luận án Nghiên cứu một cách hệ thống, xác lập các điều kiện từ lấy, bảo quản, xử lý, chiết tách, làm giàu đến ghi đo xác định chính xác và tin cậy một số dạng selen trong mẫu hải sản. 3. Nhiệm vụ của luận án 1. Nghiên cứu tính chất điện hóa, xác lập các điều kiện và thông số máy tối ưu xác định các dạng selenit (Se(IV)), selencystin (Se-Cyst), dimetyl diselenua (DMDSe) bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan trên điện cực giọt treo thủy ngân (HMDE). 2. Nghiên cứu điều kiện và quy trình lấy, bảo quản và xử lý mẫu đảm bảo nguyên trạng và toàn vẹn dạng selen trong mẫu hải sản. 3. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu, chiết tách làm giàu, ghi đo xây dựng quy trình xác định chính xác và tin cậy Se tổng, dạng Se vô cơ và Se hữu cơ trong mẫu hải sản bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan sử dụng điện cực HMDE làm điện cực làm việc. 4. Đánh giá phương pháp, quy trình và áp dụng phân tích Se tổng và dạng Se trong mẫu thật. 4. Điểm mới của luận án 1. Đã nghiên cứu thiết lập các điều kiện tối ưu, lần đầu tiên ở Việt Nam, xây dựng thành công phương pháp xác định riêng rẽ các dạng Se(IV), Se-Cyst, 2 DMDSe cũng như đồng thời chính xác và tin cậy hai dạng Se(IV) và Se-Cyst bằng cùng một phép ghi đo DPCSV. 2. Đã nghiên cứu thành công kỹ thuật chiết tách tối ưu, toàn vẹn và định lượng các dạng selen từ mẫu hải sản. 3. Đã nghiên cứu thiết lập được quy trình hoàn chỉnh từ lấy, bảo quản, xử lý mẫu, chiết tách và xác định ba dạng selen (Se(IV), Se-Cyst, DMDSe) trong mẫu cá Khoai, tôm Sú và Mực bằng phương pháp DPCSV. 5. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 132 trang: Mở đầu (2 trang), nội dung chính 116 trang, được phân bố thành 3 chương: Chương I - Tổng quan (22 trang), chương II - Thực nghiệm (7 trang), chương III - Kết quả và thảo luận (87 trang), kết luận (2 trang), 106 tài liệu tham khảo (12 trang); danh mục các công trình liên quan đến luận án (1 trang). II. NỘI DUNG LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, mục tiêu, nhiệm vụ nghiên cứu của luận án, những đóng góp mới của luận án và phương pháp nghiên cứu. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Phần tổng quan bao gồm các vấn đề: 1.1. Dạng selen trong tự nhiên và tác động của chúng đối với sức khỏe con người 1.1.1. Dạng selen trong tự nhiên 1.1.2. Tác động của selen đối với sức khỏe con người 1.2. Tính chất điện hóa của selen 1.3. Các phương pháp phân tích selen 1.3.1. Các phương pháp phân tích tổng selen 1.3.2. Các phương pháp phân tích dạng selen 1.4. Phương pháp Von-Ampe hòa tan trong phân tích dạng selen 1.4.1. Giới thiệu chung về phương pháp Von-Ampe hòa tan 1.4.2. Ứng dụng phương pháp Von-Ampe hòa tan trong phân tích dạng selen 1.5. Tình hình nghiên cứu về dạng selen trong thủy, hải sản trên thế giới 1.6. Những nghiên cứu về dạng vết các nguyên tố ở Việt Nam CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.1.1. Thiết bị, dụng cụ 2.1.2. Hóa chất 2.2. Nội dung thực nghiệm 2.2.1. Pha các dung dịch chuẩn 2.2.2. Chuẩn bị mẫu phân tích 2.2.3. Các bước nghiên cứu để xây dựng quy trình phân tích bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan 2.2.4. Xử lý số liệu thực nghiệm 3 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong chương này chúng tôi trình bày 6 nội dung chính: 3.1. NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐIỆN HÓA CỦA SELEN TRÊN HMDE Trong phần này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đặc tính Von-Ampe vòng của các dạng selen: Se(IV), Se-Cyst và DMDSe Hình 3.1. Đường CV của 200ppb Se(IV) trên nền HCl 0,1M Khoảng thế quét (+0,1 ÷ -1,0)V, tốc độ quét 50mV/s. Hình 3.2. Đường CV của 700ppb Se-Cyst trên nền HCl 0,1M Khoảng thế quét (+0,1 ÷ -0,8)V, tốc độ quét 50mV/s. Hình 3.3. Đường CV của 50ppb DMDSe trên nền HCl 0,06M + LiClO4 0,2M + CH2Cl2/C2H5OH (1/1) Khoảng thế quét (+0,1 ÷ –1,0)V, tốc độ quét 50mV/s Từ những kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, các dạng Se(IV), Se-Cyst, DMDSe đều có hoạt tính điện hóa. Trong chiều quét thứ nhất, trên đường CV của Se(IV) xuất hiện một pic khử ở thế -0,481V, của Se-Cyst xuất hiện ở -0,374V và của DMDSe ở -0,288V. Nhưng trong chiều ngược lại đều không xuất hiện một pic ôxy hóa nào, chứng tỏ tất cả các quá trình đều là quá trình ôxy hóa khử bất thuận nghịch. 3.2. NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN GHI ĐO TỐI ƯU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ DẠNG SELEN Trong phần này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện ghi đo tối ưu như: nền điện li, nồng độ nền điện li, các thông số máy (thế điện phân làm giàu, thời gian điện phân làm giàu, tốc độ quét thế, biên độ xung, thời gian đặt xung, tốc độ khuấy trộn dung dịch, kích thước giọt thủy ngân, thời gian sục khí N2, thời gian cân bằng). 3.2.1. Se(IV) và Se-Cyst trong pha nước * Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện ghi đo tối ưu xác định riêng hai dạng Se(IV) và Se-Cyst Các kết quả nghiên cứu thu được được trình bày trong bảng 3.1. 4 Bảng 3.1: Điều kiện tối ưu phân tích Se(IV) và Se-Cyst Các thông số ghi đo Se(IV) 2ppb Se-Cyst 25ppb Điện cực làm việc HMDE HMDE Chế độ ghi đo DP DP Kích thước giọt thủy ngân 6 6 Tốc độ khuấy (vòng/phút) 2000 2000 Thời gian sục khí N2 300s 300s Nền HCl 0,05M÷1M Sử dụng:0,1M 0,1M÷1M Sử dụng: 0,1M Thế điện phân làm giàu -0,2÷-0,3V Sử dụng: -0,3V -0,1÷-0,2V Sử dụng: -0,2V Thời gian điện phân làm giàu 90s÷150s Sử dụng: 90s 90s÷150s Sử dụng: 90s Thời gian cân bằng 15s 15s Biên độ xung 0,05V 0,05V Thời gian đặt xung 0,02s 0,02s Tốc độ quét thế 0,02V/s 0,02V/s Khoảng thế quét (-0,2 ÷ -0,7)V (-0,2 ÷ -0,7)V * Nghiên cứu khả năng xác định đồng thời Se(IV) và Se-Cyst trong mẫu a. Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời hai dạng Se(IV) và Se-Cyst Trên cơ sở điều kiện tối ưu xác định riêng Se(IV) và Se-Cyst (bảng 3.1), từ đó cho thấy: có thể xác định đồng thời cả hai dạng Se(IV) và Se-Cyst trong cùng một phép ghi đo ở điều kiện đưa ra trong bảng 3.2. Bảng 3.2: Các điều kiện tối ưu xác định đồng thời hai dạng Se(IV) và Se-Cyst Điện cực làm việc HMDE Thời gian điện phân làm giàu 90s÷150s Chế độ ghi đo DP Thời gian cân bằng 15s Kích thước giọt thủy ngân 6 Biên độ xung 0,05V Tốc độ khuấy (vòng/phút) 2000 Thời gian đặt xung 0,02s Thời gian sục khí N2 300s Tốc độ quét thế 0,02V/s Nền HCl 0,1M÷1M Khoảng thế quét (-0,2÷-0,7)V Thế điện phân làm giàu -0,2V b. Ghi đo đồng thời hai dạng Se(IV) và Se-Cyst * Chuẩn bị 10ml mẫu tự tạo gồm: Se(IV) 2ppb, Se-Cyst 10ppb, HCl 0,1M * Ghi đo mẫu: Tiến hành ghi đo mẫu với các điều kiện đưa ra trong bảng 3.2, sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định hàm lượng các dạng (thêm 2 lần, mỗi lần thêm 2ppb Se(IV) và 10ppb Se-Cyst). Kết quả được thể hiện trên hình 3.4 và bảng 3.3. 5 Hình 3.4: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn của mẫu tự tạo Bảng 3.3: Kết quả xác định hàm lượng hai dạng Se(IV) và Se-Cyst trong mẫu tự tạo Các dạng Se(IV) Se-Cyst Hàm lượng đưa vào (ppb) 2 10 Hàm lượng trung bình xác định được (ppb) (n=3) 2,067 10,700 Độ lệch tương đối 3,35% 7,00% Từ kết quả nghiên cứu cho thấy: các đường thêm chuẩn của Se(IV) và Se-Cyst đều có pic đẹp, cân đối, Ip thể hiện được mối quan hệ tuyến tính với nồng độ, hai pic tách xa nhau. Do đó, có thể xác định đồng thời hai dạng Se(IV) và Se-Cyst trong cùng một phép ghi đo. 3.2.2. DMDSe trong pha hữu cơ DMDSe là chất dễ bay hơi, nên trước khi ghi đo, các dung dịch nghiên cứu được làm lạnh về nhiệt độ 60C. Sau quá trình nghiên cứu, chúng tôi rút ra điều kiện tối ưu cho phép phân tích DMDSe được trình bày trong bảng 3.4. Bảng 3.4: Điều kiện tối ưu phân tích DMDSe Điện cực làm việc HMDE Thế điện phân làm giàu -0,08V Chế độ ghi đo DP Thời gian điện phân làm giàu 60s÷120s Kích thước giọt thủy ngân 4 Thời gian cân bằng 15s Tốc độ khuấy (vòng/phút) 2000 Biên độ xung 0,05V Thời gian sục khí N2 200s Thời gian đặt xung 0,02s Nền HCl 0,06M Tốc độ quét thế 0,01V/s LiClO4 0,2M Khoảng thế quét (-0,17÷-0,40)V CH2Cl2+C2H5OH 1/1 (v/v) 3.3. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT CẢN TRỞ ĐẾN PHÉP GHI ĐO CÁC DẠNG SELEN 3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất cản trở đến phép ghi đo Se(IV) 3.3.1.1. Ảnh hưởng của một số ion đến phép ghi đo Se(IV) Tiến hành ghi đo các đường DPCSV của Se(IV) 2ppb khi không thêm và khi thêm các ion Cu(II), Pb(II), Zn(II), Cd(II), As(V) và Fe(III) với các nồng độ khác nhau theo các điều kiện tối ưu đưa ra trong bảng 3.2, thời gian điện phân 90s. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong các hình 3.5, 3.6. 6 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 20 40 60 80 100 120 ppb I ( nA ) Ah của Cu(II) Ah của Pb(II) Ah của Cd(II) Ah của Fe(III) Hình 3.5: Sự phụ thuộc của Ip vào nồng độ các ion Cu(II), Pb(II), Cd(II) và Fe(III) 0 5 10 15 20 25 30 0 100 200 300 ppb I ( nA ) Ah của Zn(II) Ah của As(V) Hình 3.6: Sự phụ thuộc của Ip vào nồng độ các ion Zn(II), As(V) Khi tỉ lệ nồng độ Cu(II)/Se(IV) tăng dần thì Ip tăng dần, tới 3,75 lần thì Ip tăng 18,1%; khi tỉ lệ nồng độ Pb(II)/Se(IV) tăng dần thì Ip giảm dần, tới 5 lần thì Ip giảm xuống 11,97%; khi tỉ lệ nồng độ Cd(II)/Se(IV) tăng dần thì Ip giảm dần, tới 5 lần thì Ip giảm 19,6%; khi tỉ lệ nồng độ Fe(III)/Se(IV) tăng dần thì Ip giảm dần, tới 2,5 lần thì Ip giảm 13,38% và tới 50 lần thì Ip giảm 25,98%; khi tỉ lệ nồng độ As(V)/Se(IV) tăng dần thì Ip giảm dần, tới 15 lần thì Ip giảm xuống 14,4%; khi tỉ lệ nồng độ Zn(II)/Se(IV) tăng dần thì Ip giảm dần nhưng không đáng kể. Tóm lại: Các ion ảnh hưởng nhiều đến cường độ dòng pic hòa tan của Se(IV) như: Pb(II), Cd(II) và Fe(III), những ion này có thể loại bỏ bằng cách dùng nhựa chelex 100 dạng amoni. 3.3.1.2. Ảnh hưởng của chất béo tới phép ghi đo Se(IV) Chất béo là một họ chất gồm rất nhiều chất, ở đây chúng tôi chỉ sử dụng một axít béo (axít stearic C17H35COOH) đại diện cho loại chất này để nghiên cứu. Tiến hành ghi đo các đường DPCSV của Se(IV) 2ppb khi không thêm và khi thêm dung dịch axít stearic/etanol với các nồng độ khác nhau theo các điều kiện tối ưu đưa ra trong bảng 3.2, thời gian điện phân 90s. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong hình 3.7. Ah của axít stearic đến Ip của Se(IV) 0 5 10 15 20 25 30 0 200 400 600 800 1000 1200 ppb I ( nA ) Hình 3.7: Đường DPCSV và đồ thị nghiên cứu ảnh hưởng của axít stearic đến Ip của Se(IV) Từ kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, sự có mặt của axít stearic đã làm biến dạng pic hòa tan của Se(IV) (pic không nhẵn, không cân đối) ngay ở nồng độ thấp 40ppb (gấp 20 lần nồng độ Se(IV)), đồng thời làm giảm cường độ dòng 0ppb 40ppb ax béo 7 pic xuống 10,55%. Khi nồng độ axít stearic gấp 250 lần thì cường độ dòng pic giảm 18,36% và khi gấp 500 lần thì giảm đi 32,42%. Như vậy, sự có mặt của chất béo trong hải sản sẽ ảnh hưởng đến phép ghi đo xác định dạng Se(IV), cần phải loại bỏ. Để loại chất béo ra khỏi dịch chiết trước khi ghi đo DPCSV, có thể dùng dung môi n-hexan. 3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất cản trở đến phép ghi đo Se-Cyst 3.3.2.1. Ảnh hưởng của một số ion tới phép ghi đo Se-Cyst Tiến hành ghi đo các đường DPCSV của Se-Cyst 25ppb khi không thêm và khi thêm các ion Cu(II), Pb(II), Zn(II), Cd(II), As(V) và Fe(III) với các nồng độ khác nhau theo các điều kiện tối ưu đưa ra trong bảng 3.2, thời gian điện phân 90s. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong các hình 3.8, 3.9. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 200 400 600 ppb I ( nA ) Ah của Cd(II) Ah của Fe(III) Ah của Zn(II) Ah của As(V) Hình 3.8: Sự phụ thuộc của Ip vào nồng độ các ion Cd(II), Fe(III), Zn(II), As(V) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 200 400 600 800 1000 ppb I ( nA ) Ah của Cu(II) Ah của Pb(II) Hình 3.9. Sự phụ thuộc của Ip vào nồng độ các ion Cu(II), Pb(II) Khi tỉ lệ nồng độ Cd(II)/Se-Cyst tăng tới 12 lần thì Ip giảm 10,2%, tới 20 lần thì Ip cũng chỉ giảm 12,3%; khi tỉ lệ nồng độ Fe(III)/Se-Cyst tăng tới 8 lần thì Ip giảm 16,3%, đến 16 lần thì Ip giảm 28,3%; khi tỉ lệ nồng độ Zn(II)/Se-Cyst tăng dần thì Ip thay đổi không đáng kể; khi tỉ lệ nồng độ As(V)/Se-Cyst tăng tới 16 lần thì Ip giảm 10,53%; khi tỉ lệ nồng độ Cu(II)/Se-Cyst tăng tới 12 lần thì Ip tăng 15,1%, tới 16 lần thì Ip tăng 19,65%; khi tỉ lệ nồng độ Pb(II)/Se-Cyst tăng tới 28 lần thì Ip tăng lên 10,95%, nhưng tới 36 lần thì Ip cũng chỉ tăng lên 16,95%. Tóm lại: Qua kết quả nghiên cứu cho thấy, nhìn chung các ion không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng ít đến phép ghi đo Se-Cyst. 3.3.2.2. Ảnh hưởng của chất béo tới phép ghi đo Se-Cyst Tiến hành ghi đo các đường DPCSV của Se-Cyst 25ppb khi không thêm và khi thêm dung dịch axít stearic/etanol với các nồng độ khác nhau theo các điều kiện tối ưu đưa ra trong bảng 3.2, thời gian điện phân 90s. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong hình 3.10. Ah của axít stearic đến Ip của Se-Cyst 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 ppb I ( nA ) Hình 3.10: Sự phụ thuộc của Ip vào nồng độ axít stearic Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, khi tăng nồng độ axít stearic thì Ip của Se- Cyst giảm dần nhưng không đáng kể. Khi nồng độ axít stearic gấp 400 lần nồng 8 độ Se-Cyst thì chiều cao pic cũng chỉ giảm đi 8,52%. Tuy nhiên, axít stearic làm biến dạng pic hòa tan của Se-Cyst (pic không cân đối) khi ở nồng độ cao 2000ppb (gấp 80 lần nồng độ Se-Cyst) và làm giảm độ lặp lại giữa các phép ghi đo. Như vậy, sự có mặt của chất béo trong hải sản ảnh hưởng đến phép ghi đo xác định dạng Se-Cyst, cần phải loại bỏ. 3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất cản trở tới phép ghi đo DMDSe Tiến hành ghi đo các đường DPCSV của DMDSe 5ppb khi không thêm và khi thêm những lượng axít stearic/etanol khác nhau theo những điều kiện tối ưu đưa ra trong bảng 3.4 với thời gian điện phân 60s. Kết quả được thể hiện trong hình 3.11. -200m -250m -300m -350m U (V) 0 -25.0n -50.0n -75.0n -100n -125n -150n I ( A) Ah của axít stearic đến Ip của DMDSe 0 20 40 60 80 100 120 140 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 ppb I ( nA ) Hình 3.11: Đường DPCSV và đồ thị nghiên cứu ảnh hưởng của axít stearic đến Ip của DMDSe Từ kết quả thu được cho thấy, khi tăng nồng độ của axít stearic thì cường độ dòng Ip của DMDSe giảm dần nhưng không đáng kể. Khi nồng độ axít stearic gấp 2000 lần nồng độ DMDSe thì Ip cũng chỉ giảm 8,46%. Mặt khác, sự có mặt của axít stearic cũng không làm biến dạng pic của DMDSe ngay cả khi ở nồng độ lớn. Có thể nói, chất béo ảnh hưởng không đáng kể đến phép ghi đo DMDSe. 3.4. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN 3.4.1. Xây dựng đường chuẩn của Se(IV) Tiến hành xây dựng đường chuẩn của Se(IV) tại hai vùng nồng độ (0,08 ÷ 1) ppb và (0,8 ÷ 10) ppb ở các điều kiện tối ưu đưa ra trong bảng 3.2 với thời gian điện phân cho hai vùng lần lượt là 150s và 90s. Kết quả ghi đo được trình bày trong các bảng 3.5, 3.6 và các hình 3.12, 3.13. Bảng 3.5: Kết quả ghi đo xây dựng đường chuẩn của Se(IV) vùng nồng độ (0,08 ÷ 1) ppb Stt 1 2 3 4 5 6 Se(IV) (ppb) 0,08 0,15 0,30 0,60 0,80 1,00 Ip (nA) 1,64 2,44 4,47 9,64 12,20 14,90 y = 14.774x + 0.3338 R2 = 0.9976 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 [Se(IV)] (ppb) I ( nA ) Hình 3.12 : Đường DPCSV và đường chuẩn của Se(IV) vùng nồng độ (0,08 ÷ 1) ppb 0 ppb Ax béo 9 Bảng 3.6: Kết quả ghi đo xây dựng đường chuẩn của Se(IV) vùng nồng độ (0,8 ÷ 10) ppb Stt 1 2 3 4 5 Se(IV) (ppb) 0,8 1,5 3,0 6,0 10,0 Ip (nA) 8,3 19,3 44,7 97,7 182,0 y = 18.833x - 9.8305 R2 = 0.9972 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 2 4 6 8 10 12 [Se(IV)] (ppb) I ( nA ) Hình 3.13: Đường DPCSV và đường chuẩn của Se(IV) vùng nồng độ (0,8 ÷ 10) ppb Nhận xét: ở vùng nồng độ thấp của Se(IV) cho pic cân đối và đẹp hơn, nhưng chân pic dốc hơn so với vùng nồng độ cao. Kết quả cũng cho thấy, ở vùng nồng độ cao pic nhọn hơn và thế đỉnh pic của Se(IV) có sự dịch chuyển một ít về phía âm hơn. 3.4.2. Xây dựng đường chuẩn của Se-Cyst Tiến hành xây dựng đường chuẩn của Se-Cyst tại hai vùng nồng độ (0,5 ÷ 8) ppb và (5 ÷ 45) ppb ở các điều kiện tối ưu đưa ra trong bảng 3.2 với thời gian điện phân cho hai vùng lần lượt là 150s và 90s. Kết quả được trình bày ở các bảng 3.7, 3.8 và các hình 3.14, 3.15. Bảng 3.7: Kết quả ghi đo xây dựng đường chuẩn của Se-Cyst vùng nồng độ (0,5 ÷ 8) ppb Stt 1 2 3 4 5 Se-Cyst (ppb) 0,5 1,0 2,0 5,0 8,0 Ip (nA) 1,60 2,51 4,45 13,80 25,10 y = 3.1506x - 0.9048 R2 = 0.991 0 5 10 15 20 25 30 0 2 4 6 8 10 [Se-Cyst] (ppb) I ( nA ) Hình 3.14: Đường DPCSV và đường chuẩn của Se-Cyst vùng nồng độ (0,5 ÷ 8) ppb Bảng 3.8: Kết quả ghi đo xây dựng đường chuẩn của Se-Cyst vùng nồng độ (5 ÷ 45) ppb Stt 1 2 3 4 5 Se-Cyst (ppb) 5 10 16 25 45 Ip (nA) 11,2 34,7 50,5 76,9 144,0 10 y = 3.2338x - 1.8626 R2 = 0.9969 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 10 20 30 40 50 [Se-Cyst] (ppb) I ( nA ) Hình 3.15: Đường DPCSV và đường chuẩn của Se-Cyst vùng nồng độ (5 ÷ 45) ppb 3.4.3. Xây dựng đường chuẩn của DMDSe Tiến hành xây dựng đường chuẩn của DMDSe ở vùng nồng độ (2 ÷ 22) ppb trong điều kiện tối ưu đưa ra ở bảng 3.4, thời gian điện phân là 60s. Kết quả được trình bày ở bảng 3.9 và hình 3.16. Bảng 3.9: Kết quả ghi đo xây dựng đường chuẩn của DMDSe vùng nồng độ (2 ÷ 22) ppb Stt 1 2 3 4 5 DMDSe (ppb) 2 7 12 17 22 Ip (nA) 68,7 155 237 306 368 y = 14.992x + 47.036 R2 = 0.9951 0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 5 10 15 20 25 [DMDSe] (ppb) I ( nA ) Hình 3.16: Đường DPCSV và đường chuẩn của DMDSe vùng nồng độ: (2 ÷ 22) ppb Từ những kết quả thu được cho thấy, ở hai vùng nồng độ (0,08 ÷ 1) ppb và (0,8 ÷ 10) ppb của Se(IV); (0,5 ÷ 8) ppb và (5 ÷ 45) ppb của Se-Cyst cũng như vùng nồng độ (2 ÷ 22) ppb của DMDSe đều có sự phụ thuộc tuyến tính giữa Ip và nồng độ dạng chất nghiên cứu với hệ số tương quan R2 > 0,99. 3.5. ĐÁNH GIÁ ĐỘ LẶP LẠI, GIỚI HẠN PHÁT HIỆN VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG CỦA PHƯƠNG PHÁP 3.5.1. Độ lặp lại Để đánh giá độ lặp lại của phép ghi đo, chúng tôi tiến hành ghi đo lặp lại 10 đường Von - Ampe hòa tan của Se(IV) 2ppb, Se-Cyst 25ppb và DMDSe 5ppb trong khoảng thời gian ngắn. Điều kiện ghi đo được tiến hành như điều kiện tối ưu đưa ra trong bảng 3.2 (đối với Se(IV), Se-Cyst) và bảng 3.4 (đối với DMDSe), thời gian điện phân cho cả ba dạng selen là 90s. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong các hình 3.17, 3.18 và bảng 3.9. 11 Se(IV) -200m -300m -400m -500m -600m -700m U (V) 0 -5.00n -10.0n -15.0n -20.0n -25.0n I ( A) Se-Cyst Hình 3.17: Đường DPCSVcủa Se(IV), Se-Cyst nghiên cứu độ lặp lại của phép ghi đo - 2 0 0 m - 2 5 0 m - 3 0 0 m - 3 5 0 m U ( V ) 0 - 2 5 . 0 n - 5 0 . 0 n - 7 5 . 0 n - 1 0 0 n - 1 2 5 n - 1 5 0 n I ( A ) Hình 3.18: Đường DPCSV của DMDSe nghiên cứu độ lặp lại của phép ghi đo Bảng 3.9: Kết quả nghiên cứu đánh giá độ lặp lại của phép ghi đo STT Ipic (nA) Se(IV) Se-Cyst DMDSe 1 25,9 76,6 141 2 25,8 76,4 145 3 26,0 76,8 141 4 25,9 76,5 143 5 25,7 76,6 144 6 25,8 76,9 140 7 25,8 76,3 142 8 26,0 76,5 140 9 25,8 76,8 140 10 25,6 76,1 140 Số liệu tính toán X 25,83 76,55 141,6 S 0,125 0,246 1,838 S X 0,0396 0,0777 0,5811 V 0,484% 0,321% 1,298% Từ kết quả nghiên cứu thu được cho thấy: cả ba phép ghi đo Se(IV), Se-Cyst và DMDSe đều có độ lệch chuẩn (S), độ lệch chuẩn trung bình (S X ), hệ số biến động (V) nhỏ. Hai phép ghi đo Se(IV), Se-Cyst có hệ số biến động V nhỏ hơn 1%, còn với DMDSe lớn nhất cũng chỉ ở mức 1,298%, chứng tỏ các phép ghi đo có độ lặp lại tốt. 12 3.5.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được tính theo quy tắc 3σ. Chúng tôi sử dụng luôn kết quả thí nghiệm nghiên cứu độ lặp lại ở mục 3.5.1 để tính toán LOD và LOQ cho các dạng selen. LODSe(IV) = 0,029 (ppb) LODSe-Cyst = 0,241 (ppb) LODDMDSe = 0,195 (ppb) LOQSe(IV) = 0,097 (ppb) LOQSe-Cyst = 0,803 (ppb) LOQ DMDSe = 0,649 (ppb) Kết luận: Phương pháp Von-Ampe hòa tan catôt xung vi phân với điện cực giọt treo thủy ngân làm điện cực làm việc mặc dù có độ nhạy không cao bằng phương pháp HPLC-ICP-MS nhưng cũng tương đương so với các phương pháp như HPLC-ICP-AES, HPLC-HG-AAS , có độ lặp lại tốt, có thể áp dụng tốt cho phân tích định lượng các dạng selen có hoạt tính điện hóa. 3.6. ĐỊNH LƯỢNG SELEN TỔNG VÀ MỘT SỐ DẠNG SELEN TRONG HẢI SẢN 3.6.1. Định lượng selen tổng trong mẫu hải sản 3.6.1.1. Xây dựng quy trình phân tích mẫu Để xây dựng quy trình phân tích mẫu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện phân tích mẫu tối ưu. Nghiên cứu điều kiện vô cơ hóa mẫu Qua tham khảo tài liệu đồng thời dựa trên nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi tiến hành vô cơ hóa mẫu theo quy trình sau: Cân chính xác khoảng 0,01g mẫu hải sản khô đông (đã được xử lý theo mục 2.2.2) cho vào bình Kendan, thêm vào 2ml hỗn hợp axít (HNO3 + HClO4) đậm đặc tỉ lệ (1:1), thêm tiếp 5ml axít H2SO4 đặc, lắc đều và đặt vào miệng bình phễu thủy tinh nhỏ. Đun nóng hỗn hợp ở nhiệt độ 2500C trên bếp điều nhiệt cho tới khi mẫu trong và không màu (khoảng 3÷4h), sau đó đổ hỗn hợp ra cốc thủy tinh chịu nhiệt và cô cạn hết axít dư đến khi thu được muối trắng ẩm. Sản phẩm thu được tiếp tục xử lý để khử Se(VI) về Se(IV). Nghiên cứu điều kiện khử Se(VI) về Se(IV) Chúng tôi chọn phương pháp khử Se(VI) về Se(IV) bằng cách đun cách thủy trong axít HCl. Để tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình khử, chúng tôi tiến hành nghiên cứu chọn nồng độ HCl và thời gian khử tối ưu. Kết quả thu được chỉ ra trong bảng 3.10 và bảng 3.11. Bảng 3.10. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất khử Se(VI) về Se(IV) CHCl 1M 2M 3M 4M 5M 6M 7M 8M Hiệu suất khử (%) 46,2 55,1 67,5 77,0 89,5 96,0 92,0 90,5 Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ HCl tốt nhất cho quá trình khử là 6M. 13 Bảng 3.11. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử đến hiệu suất khử Se(VI) về Se(IV) Thời gian khử (phút) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Hiệu suất khử (%) 72,0 75,5 83,2 88,7 94,5 102,5 98,0 96,4 93,3 89,0 Kết quả nghiên cứu cho thấy, thời gian tối ưu để khử Se(VI) về Se(IV) là 50÷90 phút. Tuy nhiên, để hiệu suất khử cao nhất, chúng tôi chọn thời gian khử là 60 phút. Sau khi nghiên cứu, khảo sát, chúng tôi đưa ra quy trình phân tích hàm lượng Se tổng trong mẫu hải sản được tóm tắt theo sơ đồ hình 3.19. 0,01 gam mẫu 2ml (HNO3 + HClO4) (1:1) 5ml H2SO4 2500C Mẫu được vô cơ hóa Cô cạn Muối trắng ẩm HCl 6M 90-1000C Se(IV) Ghi đo DPCSV 3-4h 60ph Hình 3.19: Quy trình xác định Se tổng trong mẫu hải sản 3.6.1.2. Đánh giá phương pháp Để đánh giá độ chính xác của phương pháp, chúng tôi sử dụng mẫu chuẩn Quốc Tế DORM-2 (Dogfish muscle certified reference material for trace metals) để tiến hành định lượng Se tổng theo quy trình trên. Tuy nhiên, do hàm lượng Se trong mẫu chuẩn nhỏ nên chúng tôi lấy lượng mẫu ban đầu nhiều hơn so với quy trình (0,05g). Kết quả phân tích được chỉ ra trong hình 3.20 và bảng 3.12. -2.00e-6 -1.00e-6 0 1.00e-6 2.00e-6 c (g/L) 0 -5.00n -10.0n -15.0n -20.0n -25.0n -30.0n I ( A) -6.8e-007 Se c = 0.682 µg/L +/- 0.051 µg/L (7.48 %) I ( A) Hình 3.20: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn xác định Se tổng trong mẫu chuẩn DORM-2 14 Bảng 3.12: Kết quả phân tích hàm lượng Se tổng trong mẫu chuẩn DORM-2 Mẫu chuẩn Hàm lượng selen tổng Độ thu hồi Rev (%) Giá trị chứng chỉ (mg/kg) Kết quả phân tích (mg/kg) Sai số so với giá trị chứng chỉ Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB DORM-2 1,400 ± 0,090 1,364 ±0,102 1,342 ±0,096 1,312 ±0,126 1,339 ±0,108 4,36% 91,64 Từ kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, sai số giữa kết quả xác định theo phương pháp nghiên cứu và giá trị chứng chỉ là không đáng kể. Do đó có thể kết luận: Phương pháp DPCSV mà chúng tôi nghiên cứu có độ chính xác cao. 3.6.1.3. Áp dụng phân tích hàm lượng selen tổng trong mẫu hải sản Áp dụng quy trình đã nghiên cứu xây dựng được (hình 3.19) vào phân tích hàm lượng Se tổng trong các mẫu hải sản. Kết quả thu được chỉ ra trên các hình 3.21 đến 3.25 và bảng 3.13. * Mẫu Ngao Hình 3.21: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn mẫu Ngao * Mẫu cá Khoai Hình 3.22: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn mẫu cá Khoai Mẫu tôm Sú Hình 3.23: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn mẫu tôm Sú 15 * Mẫu Mực Hình 3.24: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn mẫu Mực * Mẫu cá Thu Hình 3.25: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn mẫu cá Thu Tổng hợp các kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.13. Bảng 3.13: Kết quả xác định hàm lượng Se tổng trong các mẫu hải sản Mẫu (µg/g) Số lần ghi đo Ngao Cá Khoai Tôm Sú Mực Cá Thu Lần 1 105,39 52,78 15,46 41,80 86,86 Lần 2 106,30 51,68 14,90 42,17 86,57 Lần 3 105,65 50,98 15,12 43,13 85,98 Giá trị trung bình 105,78 51,81 15,16 42,37 86,47 Rev (%) 109,24 97,22 96,26 91,96 93,08 3.6.1.4. Kết quả ghi đo quang phổ hấp thụ nguyên tử lò graphit (GFAAS) của một số mẫu hải sản Bên cạnh việc xác định hàm lượng selen tổng trong hải sản bằng phương pháp DPCSV, chúng tôi còn xác định hàm lượng selen tổng trong một số mẫu đại diện bằng phương pháp GFAAS. Kết quả ghi đo được tổng kết và so sánh như trong bảng 3.15. Bảng 3.15: So sánh kết quả nghiên cứu thu được theo hai phương pháp: DPCSV và GFAAS Mẫu (µg/g) Phương pháp Ngao Tôm Sú Cá Thu DPCSV 105,78 15,16 86,47 GFAAS 117,93 15,67 89,16 Sai số tương đối giữa hai phương pháp 11,49% 3,36% 3,11% 16 Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng giữa hai phương pháp DPCSV và GFAAS sai lệch không đáng kể. Cùng với kết quả phân tích mẫu chuẩn, chứng tỏ phương pháp DPCSV xây dựng được có độ tin cậy và độ chính xác cao, cho phép xác định nhạy lượng vết selen trong các mẫu sinh học. Qua kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng selen trong mẫu Ngao lớn nhất, tiếp đến là cá Thu, cá Khoai, Mực và nhỏ nhất là trong tôm Sú. Các kết quả chứng tỏ rằng những động vật sống dưới đáy tích lũy selen lớn hơn so với những động vật sống ở tầng cao hơn. 3.6.2. Định lượng một số dạng selen trong mẫu hải sản 3.6.2.1. Xây dựng sơ đồ chiết tách và xác định một số dạng selen trong mẫu hải sản a. Chọn dung môi chiết các dạng selen trong mẫu hải sản Để chiết các dạng selen trong hải sản, qua tham khảo tài liệu và để phù hợp với nền điện li khi xác định bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan cũng như thuận lợi cho việc chiết tách loại bỏ protein và chất béo, chúng tôi chọn dung dịch axít HCl 0,5M để ngâm chiết mẫu. b. Chiết tách và xác định dạng DMDSe trong pha hữu cơ Để tiến hành nghiên cứu các điều kiện chiết tách tối ưu, chúng tôi chuẩn bị 50ml dung dịch mẫu pha chuẩn gồm: Se(IV) 1µg/l, Se-Cyst 20µg/l, DMDSe 2µg/l, axit béo 20000µg/l và HCl 0,5M. Sử dụng dung môi diclometan (CH2Cl2) để chiết tách làm giàu dạng DMDSe từ dung dịch mẫu pha chuẩn. Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần chiết và thể tích dung môi chiết diclometan Lấy những thể tích khác nhau của CH2Cl2 để chiết tách dạng DMDSe trong mẫu pha chuẩn và tiến hành chiết nhiều lần. Các kết quả thu được chỉ ra trong bảng 3.16. Bảng 3.16 : Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của số lần chiết và thể tích dung môi chiết CH2Cl2 đến hiệu suất chiết DMDSe Thể tích diclometan (ml) % DMDSe tìm thấy (TB) Chiết lần 1 (n=3) Chiết lần 2 (n=3) 3,5 83,50 16,41 5,5 98,76 Không tìm thấy 10 99,14 Không tìm thấy Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, với 5,5ml CH2Cl2 thì hiệu suất chiết đã đạt được trên 98% ngay ở lần chiết đầu tiên. Ở lần chiết thứ hai không tìm thấy DMDSe, do nồng độ DMDSe còn lại trong dịch chiết mẫu rất ít và mặc dù đã được làm giàu vào pha hữu cơ nhưng vẫn nhỏ hơn giới hạn phát hiện. Do đó, chúng tôi chọn thể tích CH2Cl2 để chiết lấy dạng DMDSe là 5,5ml và tiến hành chiết 1 lần. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lắc chiết Để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lắc chiết đến hiệu suất chiết, chúng tôi sử dụng 5,5ml diclometan để chiết tách dạng DMDSe trong 50ml mẫu pha chuẩn và thay đổi thời gian lắc chiết (5, 10, 15, 20 phút). Các kết quả nghiên cứu thu được được trình bày ở bảng 3.17. Bảng 3.17: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lắc chiết đến hiệu suất chiết DMDSe Thời gian lắc chiết 5 phút (n=3) 10 phút (n=3) 15 phút (n=3) 20 phút (n=3) % DMDSe tìm thấy (TB) 36,89 64,13 98,45 99,22 17 Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, từ 15 phút trở đi hiệu suất chiết đạt được trên 98%. Tuy nhiên, khi phân tích mẫu cần rút ngắn thời gian phân tích, do đó chúng tôi chọn thời gian lắc chiết là 15 phút. c. Chiết loại chất béo để xác định dạng Se-Cyst và Se(IV) trong pha nước Chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện tối ưu để chiết loại chất béo bằng n-hexan dựa trên mẫu pha chuẩn được chuẩn bị như ở phần b. Nghiên cứu số lần chiết và thể tích dung môi chiết n-hexan tối ưu Trước khi sử dụng n-hexan để loại bỏ chất béo, chúng tôi tiến hành chiết tách dạng DMDSe vào pha hữu cơ bằng 5,5ml diclometan. Sau đó, thêm những thể tích n-hexan khác nhau vào dịch chiết pha nước của mẫu pha chuẩn và tiến hành chiết nhiều lần. Các kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.18. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, nếu dùng 5ml n-hexan thì phải chiết 7 lần, còn nếu dùng 10ml n-hexan thì phải chiết 3-4 lần thì hiệu suất thu hồi Se-Cyst và Se(IV) mới đạt > 90%. Để rút ngắn số lần chiết, chúng tôi chọn thể tích n- hexan để chiết loại bỏ chất béo là 10ml và số lần chiết là 3 lần. Bảng 3.18: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của số lần chiết và thể tích dung môi chiết n-hexan đến độ thu hồi hai dạng Se-Cyst và Se(IV) Số lần chiết Dạng selen Chiết bằng 5ml n-hexan Chiết bằng 10ml n-hexan Hàm lượng tìm thấy (µg/l) Độ thu hồi (%) Hàm lượng tìm thấy (µg/l) Độ thu hồi (%) 1 lần Se-Cyst 19,421 97,11 20,238 101,19Se(IV) 0,000 0,00 0,000 0,00 2 lần Se-Cyst 20,513 102,57 20,319 101,60Se(IV) 0,000 0,00 0,335 33,50 3 lần Se-Cyst 20,486 102,43 20,941 104,71Se(IV) 0,000 0,00 1,155 115,50 4 lần Se-Cyst 20,212 101,06 19,606 98,03Se(IV) 0,126 12,60 1,103 110,30 5 lần Se-Cyst 19,904 99,52 17,316 86,58Se(IV) 0,640 64,00 1,014 101,40 6 lần Se-Cyst 21,671 108,36 14,738 73,69Se(IV) 0,850 85,00 0,873 87,30 7 lần Se-Cyst 20,800 104,00Se(IV) 0,901 90,10 8 lần Se-Cyst 16,283 81,42Se(IV) 1,097 109,70 9 lần Se-Cyst 15,270 76,35Se(IV) 1,012 101,20 d. Chiết loại protein để xác định dạng Se-Cyst và Se(IV) trong pha nước Trong mẫu pha chuẩn không có protein nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu điều kiện chiết loại protein tối ưu trên mẫu thật (chọn mẫu tôm Sú để nghiên cứu). Để loại bỏ protein, chúng tôi dùng dung môi diclometan. 18 Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần chiết và thể tích dung môi chiết diclometan Sau khi chiết loại bỏ chất béo bằng n-hexan, tiếp tục thêm vào dịch chiết pha nước (≈50ml) những thể tích khác nhau của diclometan và tiến hành chiết nhiều lần. Sau mỗi lần chiết, đo DPCSV xác định dạng Se-Cyst (có hàm lượng lớn trong các mẫu hải sản). Các kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.19. Bảng 3.19: Kết quả xác định hàm lượng Se-Cyst trong mẫu tôm Sú sau khi chiết loại protein Số lần chiết Hàm lượng dạng Se-Cyst xác định được sau khi chiết loại protein (µg/l) Chiết bằng 5ml CH2Cl2 Chiết bằng 10ml CH2Cl2 1 lần 11,357 12,019 2 lần 13,394 7,572 3 lần 8,559 Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy, khi dùng 5ml CH2Cl2 để chiết loại protein và tiến hành chiết 2 lần thì thu được hàm lượng Se-Cyst trong mẫu tôm Sú cao nhất. Tuy nhiên, để khẳng định sau 2 lần chiết bằng CH2Cl2 thì hàm lượng hai dạng Se(IV) và Se-Cyst mất đi không đáng kể, chúng tôi đã nghiên cứu trên 50ml mẫu pha chuẩn được chuẩn bị như phần b. Sau khi chiết 3 lần bằng n-hexan (mỗi lần 10ml) để loại bỏ axít béo, tiếp tục chiết 2 lần bằng CH2Cl2 (mỗi lần 5ml). Sau mỗi lần chiết bằng CH2Cl2 và loại bỏ pha hữu cơ, lấy 10ml dịch chiết pha nước tiến hành ghi đo DPCSV theo các điều kiện tối ưu đưa ra ở bảng 3.2 để xác định hai dạng selen trong pha nước. Kết quả nghiên cứu thu được chỉ ra trong bảng 3.20. Bảng 3.20: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của số lần chiết bằng 5ml diclometan đến độ thu hồi các dạng selen trong pha nước Số lần chiết Dạng Se-Cyst Dạng Se(IV) Hàm lượng tìm thấy (µg/l) Độ thu hồi (%) Hàm lượng tìm thấy (µg/l) Độ thu hồi (%) 1 lần 19,742 98,71 0,958 95,80 2 lần 19,105 95,53 0,898 89,80 Qua kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 2 lần chiết bằng CH2Cl2 (mỗi lần 5ml) thì độ thu hồi Se-Cyst và Se(IV) đạt được lần lượt là 95,53% và 89,80%, chứng tỏ hàm lượng các dạng này mất đi không đáng kể. Do đó, chúng tôi chọn điều kiện chiết loại protein trong pha nước áp dụng cho các mẫu hải sản là 5ml CH2Cl2 và tiến hành chiết 2 lần. e. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết mẫu Để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết mẫu, chúng tôi chọn mẫu cá Khoai để nghiên cứu và dựa trên hàm lượng Se-Cyst xác định được-là dạng có hàm lượng lớn trong các mẫu hải sản để đạt được độ chính xác cao. 19 Bảng 3.21: Kết quả xác định hàm lượng Se-Cyst trong mẫu cá Khoai theo thời gian ngâm chiết mẫu Thời gian ngâm chiết mẫu 12h 24h 30h Hàm lượng Se-Cyst tìm thấy (µg/l) 17,134 21,045 21,465 Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, với thời gian ngâm chiết mẫu 24h đến 30h thì hàm lượng Se-Cyst thu được ổn định. Nếu ngâm chiết mẫu lâu hơn nữa thì lượng axit béo và protein sẽ bị chiết ra nhiều hơn và gây khó khăn cho việc ghi đo mẫu. Do đó, thời gian phù hợp để ngâm chiết mẫu được chọn là 24h. Từ các kết quả nghiên cứu, kết hợp với tham khảo từ các tài liệu, chúng tôi đề xuất sơ đồ chiết tách và xác định một số dạng selen trong hải sản bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan (hình 3.26): 1g Mẫu khô 50ml HCl 0,5M60C 24h Máy li tâm 2000 (vòng/phút) Gạn lấy phần dung dịch ở trên Dịch chiết Pha hữu cơPha nước Se(IV) Xác định DMDSe 5,5 ml CH2Cl2 lắc 15 phút DPCSV Lọc (0,45 µm) Dịch chiết LiClO4/EtOH HCl làm lạnh 60C Se-cyst Dịch chiết pha nước 5ml CH2Cl2 (2 lần) Dịch chiết Pha nước DPCSV 10ml n-hexan (3 lần) lắc 5 phút lắc 5 phút Hình 3.26: Sơ đồ chiết tách và xác định một số dạng Se trong mẫu hải sản 3.6.2.2. Áp dụng phân tích mẫu thật Cân chính xác 1g mẫu khô đông, thêm vào 50ml HCl 0,5M và ngâm chiết ở nhiệt độ khoảng 60C. Sau 24h lấy mẫu ra và đổ vào ống ly tâm 50ml, ly tâm 20 phút với tốc độ 2000 vòng/phút. Gạn lấy phần dung dịch và lọc qua màng lọc cỡ 0,45µm, thu được dịch chiết. Thêm vào dịch chiết 5,5ml diclometan, lắc 15 phút rồi để yên trong ngăn mát của tủ lạnh, chờ phân lớp. Tách riêng pha hữu cơ (pha CH2Cl2) và pha nước. Tiếp tục xử lý các pha như sau: - Pha hữu cơ Lấy 5ml dịch chiết pha hữu cơ, thêm vào 0,3ml HCl 2M, 1ml LiClO4 2M/EtOH và định mức bằng etanol đến 10ml. Làm lạnh hỗn hợp đến nhiệt độ khoảng 60C. Sử dụng các điều kiện ghi đo tối ưu đưa ra ở bảng 3.4, tiến hành định lượng bằng phương pháp thêm chuẩn. Để nghiên cứu độ thu hồi dạng DMDSe, chuẩn bị mẫu tương tự nhưng thêm vào mỗi mẫu ban đầu 50µl DMDSe 1000µg/l, khi đó trong 50ml dung dịch HCl ngâm chiết mẫu, nồng độ DMDSe thêm vào là 1,0µg/l. Tiến hành chiết tách và định lượng tương tự như mẫu thật. Kết quả nghiên cứu thu được sử dụng để tính toán độ thu hồi. 20 - Pha nước Lấy toàn bộ dịch chiết pha nước, thêm vào 10ml n-hexan và lắc 5 phút (làm 3 lần) để loại bỏ chất béo. Tách bỏ pha n-hexan, thu lấy dịch chiết pha nước, tiếp tục thêm vào 5ml CH2Cl2 và lắc 5 phút (2 lần) để loại bỏ protein. Tách bỏ pha CH2Cl2, thu dịch chiết pha nước. Hút 1ml dịch chiết pha nước cho vào bình định mức 10ml, thêm vào 1ml HCl 1M và định mức bằng nước cất siêu sạch tới vạch. Sử dụng các điều kiện ghi đo tối ưu đưa ra ở bảng 3.2, tiến hành định lượng bằng phương pháp thêm chuẩn. Để nghiên cứu độ thu hồi dạng Se-Cyst, chuẩn bị mẫu tương tự nhưng thêm vào mỗi mẫu ban đầu 100µl Se-Cyst 100.000µg/l, khi đó trong 50ml dung dịch HCl ngâm chiết mẫu, nồng độ Se-Cyst thêm vào là 200µg/l. Tiến hành chiết tách và định lượng tương tự như mẫu thật. Kết quả nghiên cứu thu được sử dụng để tính toán độ thu hồi. Các kết quả phân tích mẫu thể hiện trên các hình 3.27 đến 3.35. * Mẫu cá Khoai - Pha hữu cơ - 4 . 0 0 e - 6- 2 . 0 0 e - 6 0 2 . 0 0 e - 64 . 0 0 e - 66 . 0 0 e - 6 c ( g / L ) 0 - 1 0 . 0 n - 2 0 . 0 n - 3 0 . 0 n - 4 0 . 0 n - 5 0 . 0 n - 6 0 . 0 n I ( A ) 3 . 7 e - 0 0 6 D M D S e c = 3 . 7 3 3 µ g / L + / - 0 . 0 0 6 µ g / L ( 0 . 1 6 % ) Hình 3.27: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn xác định dạng DMDSe trong mẫu cá Khoai Tiến hành chiết lặp lại với 5,5ml diclometan một lần nữa và ghi đo DPCSV xác định dạng DMDSe (hình 3.28). Kết quả nghiên cứu cho thấy, mặc dù tăng thời gian điện phân làm giàu nhưng vẫn không xuất hiện pic của DMDSe. Hình 3.28: Đường DPCSV xác định dạng DMDSe trong mẫu cá Khoai (chiết lần 2) 21 - Pha nước -2.00e-5-1.00e-5 0 1.00e-52.00e-53.00e-5c (g/L) 0 -10.0n -20.0n -30.0n -40.0n -50.0n I ( A ) -2.1e-005 Se-cyst c = 21.045 µg/L +/- 1.034 µg/L (4.91%) Hình 3.29: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn xác định dạng Se-Cyst trong mẫu cá Khoai Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, đối với mẫu cá Khoai, béo hơn so với các mẫu hải sản khác nên chúng tôi phải chiết 4 lần bằng n-hexan để loại bỏ chất béo. Kết quả thể hiện trên hình 3.29. Trên đường DPCSV, pic của Se-Cyst cho rất rõ còn pic của Se(IV) có cường độ nhỏ bên cạnh pic của Se-Cyst. Do đó, chúng tôi tiến hành ghi đo riêng Se(IV) với thế điện phân đặt âm hơn (-0,3V) so với khi ghi đo chung (-0,2V) để quan sát phổ rõ và đẹp hơn. Kết quả thu được chỉ ra trên hình 3.30. Hình 3.30: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn xác định dạng Se(IV) trong mẫu cá Khoai * Mẫu tôm Sú - Pha hữu cơ Hình 3.31: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn xác định dạng DMDSe trong mẫu tôm Sú Tiến hành chiết lặp lại với 5,5ml diclometan và ghi đo DPCSV xác định dạng DMDSe. Kết quả thu được tương tự trường hợp mẫu cá Khoai, mặc dù tăng thời gian điện phân làm giàu nhưng vẫn không xuất hiện pic của DMDSe. 22 - Pha nước -1.00e-5 0 1.00e-5 2.00e-5c (g/L) 0 -10.0n -20.0n -30.0n I ( A ) -1.3e-005 Se-cyst c = 13.394 µg/L +/- 1.383 µg/L (10.33%) Hình 3.32: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn xác định dạng Se-Cyst trong mẫu tôm Sú Đối với dạng Se(IV), cũng giống như trường hợp của cá Khoai, phải ghi đo riêng rẽ với thế điện phân đặt âm hơn (-0,3V) so với khi ghi đo chung (-0,2V). Kết quả thu được thể hiện trên hình 3.33. Hình 3.33: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn xác định dạng Se(IV) trong mẫu tôm Sú * Mẫu Mực - Pha hữu cơ Hình 3.34: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn xác định dạng DMDSe trong mẫu Mực Tiến hành chiết lặp lại với 5,5ml diclometan và ghi đo DPCSV xác định dạng DMDSe. Kết quả cho tương tự trường hợp mẫu cá Khoai và tôm Sú, mặc dù tăng thời gian điện phân làm giàu nhưng vẫn không xuất hiện pic của DMDSe, đó là do hàm lượng DMDSe trong dịch chiết mẫu còn ít, nên mặc dù được làm giàu vào pha hữu cơ nhưng hàm lượng vẫn nhỏ hơn giới hạn phát hiện. 23 - Pha nước -3 . 0 0 e -5 -2 . 0 0 e -5 -1 . 0 0 e -5 0 1 . 0 0 e -5 c ( g /L ) 0 -2 . 0 0 n -4 . 0 0 n -6 . 0 0 n -8 . 0 0 n -1 0 . 0 n I ( A ) - 3 .2 e - 0 0 5 S e - c y s t c = 3 1 . 5 6 7 µ g / L + / - 2 . 3 0 8 µ g / L ( 7 . 3 1 % ) Hình 3.35: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn xác định dạng Se-Cyst trong mẫu Mực Từ kết quả nghiên cứu thu được cho thấy: Trên đường DPCSV chỉ xuất hiện pic của Se-Cyst, không có tín hiệu pic của Se(IV). Tổng hợp các kết quả định lượng một số dạng selen trong mẫu hải sản được trình bày trong bảng 3.22. Bảng 3.22: Kết quả xác định hàm lượng một số dạng selen trong mẫu hải sản bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan Dạng Selen Mẫu Se(IV) Se-Cyst DMDSe Hàm lượng selen tổng (pp DPCSV) (µg/g) Hàm lượng TB (µg/g) Hàm lượng TB (µg/g) Rev (%) Hàm lượng TB (µg/g) Rev (%) Cá Khoai 0,143 10,596 92,33 0,042 88,26 51.81 Tôm Sú 0,166 6,269 85,44 0,028 82,79 15,16 Mực 0,000 15,494 91,37 0,051 81,42 42,37 Từ kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, trong các mẫu đã phân tích, hàm lượng dạng Se-Cyst lớn nhất sau đó đến Se(IV) và dạng DMDSe ít nhất. Hàm lượng dạng Se-Cyst và DMDSe trong mẫu mực lớn nhất, tiếp đến là cá Khoai và nhỏ nhất là trong tôm Sú. Trong khi đó, hàm lượng selen tổng của cá Khoai lại lớn nhất rồi đến Mực và nhỏ nhất là tôm Sú. Tuy nhiên, đối với mẫu Mực, mặc dù hàm lượng selen tổng lớn nhưng lại không tìm thấy dạng Se(IV) trong mẫu. Tóm lại : Phương pháp Von-Ampe hòa tan có thể xác định một số dạng selen có hoạt tính điện hóa như: Se(IV), Se-Cyst, DMDSe trong hải sản. So với một số phương pháp khác như HPLC-ICP-MS, HPLC-HG-AFS thì phương pháp DPCSV không lợi thế bằng khi không xác định được đồng thời nhiều dạng selen hơn nữa bao gồm cả dạng hoạt động điện hóa (Se(IV), Se-Cyst) cũng như không hoạt động điện hóa (Se(VI), SeMet, SeEt, TMSe, selencystein v.v..) với giới hạn phát hiện rất thấp cỡ ng/l. Tuy nhiên, bằng phương pháp DPCSV với giai ghi đoạn tiền xử lý bằng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng làm giàu dạng DMDSe vào pha hữu cơ dùng dung môi CH2Cl2, có thể xác định được dạng DMDSe mà các phương pháp trên không xác định được. Để xác định dạng DMDSe cũng như một số dạng selen dễ bay hơi khác cần phải kết hợp sử dụng phương pháp GC-MS. 24 KẾT LUẬN 1. Đã nghiên cứu một cách hệ thống, thiết lập được các điều kiện tối ưu (nền, nồng độ nền điện li, các thông số máy) để xác định riêng rẽ các dạng : selenit (Se(IV)), selencystin (Se-Cyst), dimetyl diselenua (DMDSe) cũng như đồng thời chính xác và tin cậy hai dạng Se(IV) và Se-Cyst bằng cùng một phép ghi đo Von-Ampe hòa tan catot xung vi phân (DPCSV), đặc biệt là các dạng selen hữu cơ chưa từng được nghiên cứu ở Việt Nam. 2. Đã nghiên cứu, thiết lập các điều kiện tối ưu xây dựng được quy trình xác định chính xác hàm lượng selen tổng trong hải sản bằng phương pháp DPCSV. Độ tin cậy, độ chính xác của quy trình được đánh giá thông qua việc phân tích mẫu chuẩn Quốc Tế DORM-2. Kết quả phân tích thu được cho thấy giữa giá trị tìm thấy và giá trị chứng chỉ khác nhau không đáng kể (4,36%) với độ thu hồi 91,64%. 3. Đã tiến hành đánh giá tính khoa học và độ tin cậy của phương pháp phân tích nghiên cứu được thông qua việc đánh giá độ lặp lại theo độ lệch chuẩn S và hệ số biến động V của 10 phép ghi đo lặp lại. Tiến hành đánh giá độ chính xác và giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ theo qui tắc 3σ. Những kết quả tính toán thu được cho thấy: - Cả độ lệch chuẩn (S) và hệ số biến động (V) của phương pháp đều nhỏ: SSe(IV) = 0,125; SSe-Cyst = 0,246; SDMDSe = 1,838 và VSe(IV) = 0,484%; VSe-Cyst = 0,321%; VDMDSe = 1,298%. - Cả giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ của các dạng nghiên cứu đều thấp: LODSe(IV) = 0,029 (ppb); LODSe-Cyst = 0,241 (ppb); LODDMDSe= 0,195 (ppb). LOQSe(IV) = 0,097 (ppb); LOQSe-Cyst = 0,803 (ppb); LOQDMDSe = 0,649 (ppb). - Khoảng tuyến tính ở hai vùng nồng độ 10-9M, 10-8M của các dạng Se(IV), Se-Cyst và vùng 10-8M đối với dạng DMDSe. 4. Đã nghiên cứu, thiết lập được các quy trình hoàn chỉnh từ lấy mẫu, bảo quản mẫu, xử lý mẫu đến chiết, tách tối ưu các dạng selen từ các mẫu hải sản để bảo đảm toàn vẹn và định lượng các dạng selen trong mẫu. 5. Đã nghiên cứu thành công, đề xuất sơ đồ chiết tách và xác định một số dạng selen vô cơ, selen hữu cơ trong các mẫu hải sản có hoạt tính điện hóa bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan. 6. Đã áp dụng quy trình nghiên cứu thiết lập được vào việc xác định hàm lượng selen tổng trong các mẫu hải sản (Ngao, cá Khoai, tôm Sú, Mực, cá Thu) và so sánh kết quả thu được với phương pháp AAS không ngọn lửa. Kết quả phân tích thu được từ hai phương pháp khá phù hợp nhau. 7. Đã áp dụng sơ đồ nghiên cứu xây dựng được vào việc phân tích 3 dạng selen (Se(IV), Se-Cyst, DMDSe) từ các mẫu cá Khoai, tôm Sú và Mực. Những kết quả phân tích thu được cho thấy trong khi hàm lượng dạng Se-Cyst lớn nhất, tiếp đến là dạng Se(IV) và nhỏ nhất là dạng DMDSe trong các mẫu cá Khoai và tôm Sú, thì không tìm thấy dạng Se(IV) trong mẫu Mực.