Tóm tắt Luận án Structural characterization of animal adenovirus fibre heads

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN HỒNG THANH STRUCTURAL CHARACTERIZATION OF ANIMAL ADENOVIRUS FIBRE HEADS Chuyên ngành : Hóa sinh học Mã số : 62 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2016 Công trình được thực hiện tại Trung tâm công nghệ sinh học Hội đồng nghiên cứu Quốc gia Tây Ban Nha (CNB-CSIC, Madrid, Spain) & Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam (IBT-VAST, Hanoi, Vietnam) Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Trương Nam Hải Viện Công nghệ sinh học, IBT-VAST TS. Mark Johan van Raaij Centro Nacional de Biotecnologia, CNB-CSIC Phản biện 1: PGS. TS. Bùi Phương Thuận Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Hà Nội Phản biện 2: PGS. TS. Trương Quốc Phong Trường ĐH Bách khoa, Hà Nội Phản biện 3: TS. Chu Nhật Huy Viện Công nghệ sinh học Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án phiên chính thức tại Viện Công nghệ sinh học Vào hồi giờ , ngày tháng năm 2016 Có thể tìm luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện Công nghệ sinh học Trang web của Bộ GD&ĐT MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Adenovirus được biết đến như là một vector hữu hiệu trong việc chuyển gen dùng trong liệu pháp gen. Adenovirus xâm nhập vào tế bào vật chủ thông qua vùng gắn đặc hiệu nằm trên đỉnh của các protein sợi (fibre protein). Vùng này nhận biết các thụ thể nằm trên màng tế bào vật chủ, giúp adenovirus nhận dạng và xâm nhiễm vào tế bào vật chủ thông qua cơ chế nhập bào (endocytosis). Cấu trúc của các protein sợi adenovirus đã được công bố, tuy nhiên, hầu hết là của các adenovirus lây nhiễm trên người thuộc chi Mastadenovirus. Các vector có nguồn gốc adenovirus thường được nghiên cứu và phát triển dựa trên hệ gien của adenovirus type 5 lây nhiễm trên người (thuộc chi Mastadenovirus). Một số được nghiên cứu dựa trên hệ gien của ovine adenovirus 7 (Hofmann 1999; Kümin 2002; Both 2004). Tuy nhiên, hiệu quả sử dụng các vector có nguồn gốc từ adenovirus lây nhiễm trên người bộc lộ các hạn chế như: 1) Không vượt qua được hàng rào miễn dịch của cơ thể vật chủ (Daya 2008; Brunetti-Pierri 2013; Wold 2013); 2) Các vector này thường có xu hướng tập trung tại các tế bào gan sau khi được đưa vào cơ thể vật chủ do tính ái lực cao với coxsackie adenovirus receptor (CAR) (Douglas 2007). Do vậy, việc nghiên cứu cấu trúc protein sợi của các adenovirus lây nhiễm trên động vật với các vùng gắn đặc hiệu là yếu tố quan trọng để hiểu rõ sự khác biệt về cơ chế xâm nhập của các adenovirus lây nhiễm trên người và động vật. Các nghiên cứu này là cơ sở cho việc thiết kết các vector chuyển gen mới phù hợp với mục đích điều trị các bệnh hiểm nghèo bằng liệu pháp gen. Do vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Structural characterization of animal adenovirus fibre heads” (tên tiếng Việt: Nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút của các adenovirus lây nhiễm trên động vật). 2. Mục tiêu nghiên cứu Để thực hiện đề tài này, chúng tôi xác định các mục tiêu chính theo từng công đoạn của quá trình nghiên cứu từ tách dòng, biểu hiện và tinh chế protein tới tạo tinh thể, xác định cấu trúc và bước đầu sàng lọc các thụ thể tiềm năng. Các mục tiêu chính của luận án gồm có: Biểu hiện và tinh chế các protein sợi đầu mút của một số loài adenovirus lây nhiễm trên một số động vật khác nhau như chim săn mồi (raptor adenovirus), bò (bovine adenovirus), thằn lằn (lizard adenovirus) và ngỗng (goose adenovirus). Tạo tinh thể của các protein sợi đầu mút của các loài adenovirus khác nhau và xác định cấu trúc bằng các phương pháp phù hợp như thay thế phân tử (molecular replacement) hoặc bằng phương pháp single isomorphous replacement (SIR) và single anomalous dispersion (SAD). Xác định các thụ thể tiềm năng có liên quan đến quá trình nhận dạng và xâm nhập của adenovirus vào các tế bào vật chủ bằng kỹ thuật glycan-array. 3. Nội dung nghiên cứu Để thực hiện được các mục tiêu nêu trên, các công việc cụ thể đã được tiến hành gồm có: Thiết kế các plasmid mang vùng gen mã hóa cho protein sợi đầu mút (fibre head) của một số loài adenovirus khác nhau như raptor adenovirus, bovine adenovirus, lizard adenovirus và goose adenovirus. Biểu hiện protein trong hệ biểu hiện E. coli và tinh chế protein qua hai bước gồm sắc ký ái lực His-tag và sắc ký trao đổi ion. Xác định độ đồng nhất và tính bền nhiệt của các protein sau tinh chế bằng kỹ thuật Thermo-Fluor. Tạo tinh thể protein sử dụng các điều kiện kết tinh khác nhau nhằm tạo ra tinh thể có chất lượng cao dùng cho nhiễu xạ tia X. Giải cấu trúc và tinh chỉnh cấu trúc protein sợi đầu mút của các adenovirus ở dạng đơn lẻ hoặc dạng gắn với các chất gắn (ligand) đặc hiệu. So sánh sự khác biệt về cấu trúc giữa các protein sợi đầu mút của adenovirus lây nhiễm trên người và cho động vật nhằm tìm các vị trí tương tác đặc hiệu nằm trên vùng gắn. Xác định các thụ thể tiềm năng tham gia vào quá trình gắn đặc hiệu với protein sợi đầu mút bằng kỹ thuật glycan-array và các kỹ thuật vật lý – hóa sinh khác. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Tại thời điểm tiến hành nghiên cứu này, chỉ có duy nhất 02 cấu trúc protein sợi đầu mút của các adenovirus lây nhiễm trên động vật được công bố trên tổng số 18 cấu trúc protein sợi đầu mút của adenovirus trong ngân hàng dữ liệu cấu trúc protein (protein data bank). Nghiên cứu này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác định cấu trúc các protein sợi đầu mút của các adenovirus lây nhiễm trên động vật. Việc sử dụng các vector chuyển gen có nguồn gốc từ adenovirus lây nhiễm trên người (chủ yếu là adenovirus típ 5) còn gặp nhiều hạn chế do gặp phải hàng rào miễn dịch của người và tính không đặc hiệu tế bào đích. Do đó, việc nghiên cứu sử dụng các adenovirus lây nhiễm động vật làm vector chuyển gen cho người được xem như là một giải pháp thay thế đầy triển vọng. Các vector này sử dụng protein sợi đầu mút cho việc nhận dạng tế bào và tương tác với thụ thể. Do vậy, nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút của các adenovirus có tác dụng tìm ra cơ chế tương tác của protein sợi với thụ thể, từ đó xác định được các axit amin tham gia tương tác với thụ thể. Những thông tin này cho phép các nhà khoa học, bằng đột biến điểm, có thể thay đổi trình tự axit amin tại vùng protein sợi đầu mút nhằm định hướng vector gắn vào các tế bào đích mong muốn. Luận án đã xác định thành công bốn cấu trúc protein sợi đầu mút của một số loài adenovirus lây nhiễm trên động vật và xác định đươc một số polysaccharides tiềm năng tương tác với protein sợi đầu mút của adenovirus lây nhiễm trên ngỗng. Các kết quả này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, góp phần vào việc bổ sung các thông tin cấu trúc cho quá trình nghiên cứu và phát triển các thế hệ vector chuyển gen mới dùng trong liệu pháp gen. 5. Đóng góp mới của luận án Luận án đã thành công trong việc xác định cấu trúc protein sợi đầu mút của một số adenovirus lây nhiễm trên động vật. Cụ thể, gen mã hóa cho protein sợi đầu mút của một số loài adeovirus đã được tách dòng và biểu hiện thành công dạng tan trong một số chủng E. coli khác nhau. Protein đã được tinh chế thành công qua hai bước tinh chế, nhằm thu được protein có độ sạch và độ đồng nhất cao. Protein sợi đầu mút đã được kết tinh trong các điều kiện khác nhau, tạo nên các tinh thể có chất lượng cao dùng cho phân tích nhiễu xạ tia X. Bốn cấu trúc protein sợi đầu mút được giải và tinh chỉnh với độ phân giải cao (1.2 – 2.0 Å). Hai trong bốn cấu trúc đã được công bố trên tạp chí Virology Journal chuyên về virus và được lưu trữ trên ngân hàng dữ liệu cấu trúc protein (PDB). Các cấu trúc còn lại cũng sẽ được đăng trên các tạp chí chuyên ngành uy tín và được bổ sung trên ngân hàng dữ liệu protein. Quá trình sàng lọc thụ thể tiềm năng bằng kỹ thuật glycan-array cho thấy, protein sợi đầu mút của adenovirus lây nhiễm trên ngỗng (goose adenovirus fibre head) có khả năng gắn với một số loại đường xuất hiện trên bề mặt các tế bào ung thư và khối u. Đây là kết quả mới, chưa từng được công bố và rất có giá trị về mặt thực tiễn đối với việc nghiên cứu phát triển hệ vector chuyển gen dựa trên adenovirus có nguồn gốc động vật. 6. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 150 trang, được chia thành các phần: Mở đầu (02 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (29 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp (25 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (57 trang); Chương 4: Thảo luận (13 trang); Kết luận và kiến nghị (02 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án (01 trang); Tóm tắt (7 trang); Tài liệu tham khảo (14 trang). Luận án có 52 hình và 12 bảng số liệu. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Adenovirus Adenovirus được phân lập lần đầu tiên bởi Wallace Rowe vào năm 1953 từ dịch môi trường nuôi cấy mô hạch hạnh nhân (adenoid) của người. Adenovirus có nguồn gốc từ tên tiếng anh adenoid mang ý nghĩa vùng vòm họng được đề xuất bởi Joseph A. Bell vào năm 1956. Adenovirus thuộc họ Adenoviridae gồm 5 chi: Mastadenovirus, Atadenovirus, Siadenovirus, Aviadenovirus, Ichtadenovirus, có khả năng xâm nhiễm vào tất cả 5 lớp động vật có xương sống gồm cá, lưỡng cư, bò sát, chim và thú. Khi xâm nhiễm vào cơ thể con người, adenovirus thường gây ra các triệu chứng ở đường hô hấp trên bao gồm các triệu chứng như viêm màng kết, viêm amidan, viêm tai, viêm bạch hầu, viêm thanh quản mà chủ yếu là xuất hiện đồng thời cả hai triệu chứng là viêm màng kết và viêm amidan. Hình 1.1: Sơ đồ phân loại các chi của adenovirus thuộc họ Adenoviridae. Adenovirus khi xâm nhập vào tế bào vật chủ không tích hợp vào genome của tế bào vật chủ và sao chép độc lập trong nhân của tế bào vật chủ như một thực thể bổ sung. Do đó không có nguy cơ gây hại về mặt di truyền cho tế bào vật chủ. Chính vì điều này mà adenovirus được quan tâm nghiên cứu sử dụng như một vector chuyển gen trong liệu pháp gen. 1.2. Cấu trúc protein sợi của adenovirus Protein sợi (fibre) là dạng tam phân (trimer), mỗi đơn phân được cấu tạo gồm 3 vùng (domain) riêng biệt: penton base binding domain: là vùng trình tự đầu N của các protein sợi, làm nhiệm vụ gắn với các penton tại các góc của hình khối capsid; protein sợi đầu mút: là vùng trình tự đầu C, cấu trúc có dạng hình cầu với các vị trí gắn đặc hiệu với các thụ thể nằm trên màng tế bào đích; và vùng fibre shaft: là vùng liên kết hai vùng gắn penton base với protein sợi đầu mút. protein sợi đầu mút là phần cấu trúc quan trọng nhất bởi nó tham gia vào quá trình nhận biết bởi các thụ thể trên màng tế bào trước khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ thông qua việc tương tác giữa các protein sợi đầu mút với các thụ thể trên bề mặt tế bào. Do vậy, việc nghiên cứu cấu trúc vùng protein sợi đầu mút là rất quan trọng. Hình 1.2: Mô hình cấu trúc của adenovirus. (A) Vỏ capsid được cấu tạo bởi một hình 20 mặt (icosahedra). Các protein sợi (fibre protein) gắn từ các đỉnh của capsid. (B) Protein sợi được cấu tạo bởi 3 domain riêng biệt: vùng gắn với penton tại đầu N, vùng tương tác với thụ thể tại đầu C và vùng fibre shaft làm nhiệm vụ liên kết vùng đầu N và đầu C. 1.3. Ứng dụng của adenovirus trong liệu pháp gen Adenovirus được sử dụng phổ biến như là một vector hữu hiệu trong việc chuyển gen với các đặc điểm nổi trội như không tích hợp vào genome của tế bào vật chủ, tự sao chép một cách độc lập trong nhân của tế bào vật chủ, do đó không gây nguy hại về mặt di truyền. Adenovirus thuộc loại virus không có màng bọc với genome có bản chất là một sợi ADN kép với kích thước khoảng 35 kb, trong đó 30 kb có thể được thay thế bởi các đoạn ADN ngoại lai phục vụ cho mục đích chuyển gen trong liệu pháp gen. 1.4. Tinh thể hóa protein và xác định cấu trúc Kỹ thuật nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction) đã mở ra một hướng nghiên cứu đầy tiềm năng trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như sinh học cấu trúc, hóa sinh, khoa học vật liệu, y học phân tử, nghiên cứu và phát triển thuốc. Tinh thể hóa protein là bước tiên quyết trong việc xác định cấu trúc bằng kỹ thuật nhiễu xạ tia X. Nguyên lý của quá trình tinh thể hóa protein được hiểu đơn giản là việc kết tủa thuận nghịch của các phân tử protein khi tồn tại ở trạng thái có nồng độ và độ đồng nhất cao. Các phân tử protein trong dung dịch sẽ kết tinh bằng kỹ thuật khuyếch tán không khí (vapour diffusion technique) nhằm đưa nồng độ protein trong các giếng đạt tới trạng thái bão hòa. Tại trạng thái này, một số điểm nucleation được hình thành do protein tập trung với nồng độ cao. Các phân tử protein xung quanh được sắp xếp và lắp ráp vào tinh thể theo một trật tự nhất định (space group), tạo nên các tinh thể hình khối 3 chiều với đường kính khoảng vài chục tới vài trăm micromet. Hình 1.3: Qui trình xác định cấu trúc của một phân tử protein. Bắt đầu từ biểu hiện và tinh chế protein, kết tinh protein, phân tích tinh thể bằng nhiễu xạ tia X, thu thập số liệu, xử lý số liệu, xác định và tinh chỉnh cấu trúc. Cấu trúc không gian của một phân tử protein được xác định dựa vào việc các kỹ thuật như thay thế phân tử (molecular replacement) đối với các phân tử protein có độ tương đồng cao với cấu trúc đã biết, hoặc kỹ thuật single isomorphous replacement (SIR) hay single anomalous dispersion (SAD) sử dụng tín hiệu khác biệt từ sự nhiễu xạ của các nguyên tử kim loại nặng. Qui trình đi từ tinh chế protein tới kết tinh, nhiễu xạ tia X, xác định và tinh chỉnh cấu trúc, phân tích cấu trúc được thể hiện trong hình 1.3. 1.5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút của các adenovirus lây nhiễm trên động vật Cấu trúc của các protein sợi đầu mút được nghiên cứu rộng rãi, hầu hết thuộc về các adenovirus thuộc chi Mastadenovirus lây nhiễm trên người và một số động vật. Tại thời điểm bắt đầu thực hiện nghiên cứu, có 16 cấu trúc protein sợi đầu mút của mastadenovirus và chỉ duy nhất 02 cấu trúc protein sợi đầu mút của các adenovirus lây nhiễm trên động vật được công bố trên ngân hàng dữ liệu protein. Do vậy việc nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút của các adenovirus lây nhiễm trên động vật sẽ cung cấp các thông tin chi tiết về cấu trúc của một số loài adenovirus lây nhiễm trên động vật. Tạo điều kiện cho việc so sánh với các cấu trúc đã biết nhằm chỉ ra các vùng quyết định lên việc tương tác với thụ thể trên màng tế bào. Việc nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút với các vùng gắn đặc hiệu là yếu tố quan trọng để hiểu rõ sự khác biệt về cơ chế xâm nhập của các adenovirus lây nhiễm trên động vật. Nguồn dữ liệu cấu trúc các protein sợi đầu mút này sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu thiết kế các vector chuyển gen định hướng tế bào đích. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Các hóa chất và vật liệu dùng trong sinh học phân tử được sử dụng của các hãng uy tín trên thế giới như Sigma-Aldrich (Missouri, USA), Merck (New Jersey, USA) hay VWR (Pennsylvania, USA). Protein được tinh chế bằng sắc ký ái lực kim loại sử dụng chất giá Ni-NTA của hãng Jena Biosciences (Jena, Germany). Tinh chế lần hai được tiến hành bằng sắc ký trao đổi ion sử dụng cột trao đổi ion dương Resource S6 và cột trao đổi ion âm Resource Q6 của hãng GE-Healthcare (Madrid, Spain). Quá trình kết tinh protein sử dụng các bộ kit của hãng Jena Biosciences, Sigma-Aldrich, and Molecular Dimensions (Newmarket, Suffolk, UK). 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Biểu hiện, tinh chế và tạo tinh thể protein sợi đầu mút của một số loại adenovirus Các đoạn DNA mã hóa cho các protein sợi đầu mút được tách dòng trong plasmid pET28a(+). Protein được biểu hiện các vùng protein sợi ở dạng tan trong hệ biểu hiện E. coli, và được làm sạch bằng qui trình tinh chế gồm hai bước: tinh chế bằng cột sắc ký ái lực kim loại và tinh chế qua cột sắc ký trao đổi ion. Protein sạch được cô đặc tới nồng độ thích hợp từ 10-20 mg/ml bằng cột Unicorn, Millipore. Protein đã cô đặc được sử dụng cho quá trình kết tinh trên đĩa MRC Swissci 96 giếng ở nhiệt độ 4 hoặc 21ºC sử dụng các bộ kit thương mại của các hãng cung cấp uy tín (Sigma-Aldrich, Jena-Biosciences, Emerald BioSystems). Các tinh thể protein được thu nhận và phân tích bằng phương pháp nhiễu xạ X-ray (X-ray diffraction) tại các hệ thống phát tia X (beamline) tại ALBA, Barcelona, Tây Ban Nha hoặc tại Eurepean Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble, Pháp). Để thu nhận tín hiệu khác biệt (anomalous signal) từ các nguyên tử kim loại nặng (heavy atom). Các tinh thể được gắn với ion kim loại nặng bằng cách nhúng (soak) trong dung dịch có chứa kim loại nặng từ 1 đến 5 phút. Các tinh thể sau đó được rửa lại trong dung dịch ban đầu và được làm đông (freezing) trong nitơ lỏng, chuẩn bị cho việc phân tích nhiễu xạ tia X. 2.2.2. Phương pháp xác định và tinh chỉnh cấu trúc Cấu trúc của các phân tử protein được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau bao gồm phương pháp thay thế phân tử (molecular replacement) đối với các protein có trình tự tương đồng cao với cấu trúc đã biết hoặc bằng phương pháp single isomorphous replacement (SIR) và single anomalous dispersion (SAD) với các proein có trình tự tương đồng thấp với các cấu trúc đã biết. Protein sợi đầu mút của raptor adenovirus 1 được xác định bằng phương pháp thay thế phân tử sử dụng protein sợi đầu mút của turkey adenovirus 3 như là cấu trúc khuôn. Cấu trúc protein sợi đầu mút của bovine adenovirus 4 được xác định bằng phương pháp single isomorphous replacement (SIR) do đồng thời thu nhận được dữ liệu nhiễu xạ tia X từ tinh thể dạng native (không có ion kim loại nặng) và dạng derivatised với ion kim loại nặng mercury (Hg). Cấu trúc protein sợi đầu mút của goose adenovirus 4 và lizard adenovirus 2 được xác định bằng phương pháp single anomalous dispersion (SAD) sử dụng tín hiệu khác biệt (anomalous signal) từ ion kim loại nặng mercury (Hg) và selenium (Se). Các phần mềm được sử dụng cho phương pháp molecular replacement gồm có PHASER, AMORE, MOLREP trong CCP4 suite. Các phần mềm sử dụng cho việc xác định cấu trúc và tinh chỉnh (refinement) cấu trúc gồm có SHARP, PHENIX, ARP/WARP, REFMAC5, COOT. 2.2.3. Phương pháp xác định độ bền nhiệt của protein bằng Thermo-Fluor Phương pháp xác định độ bền nhiệt của protein sợi đầu mút bằng Thermo-Fluor được tiến hành trên máy PCR định lượng iCycler iQ PCR Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules CA, USA) sử dụng chấy nhuộm phát huỳnh quang SYPRO Orange (Life Technologies SA, Madrid, Spain) do đặt tính gắn không đặc hiệu với các bề mặt kỵ nước (Dupeux 2011). Khi protein bị biến tính ở nhiệt độ cao sẽ để lộ các vùng kỵ nước ra ngoài tạo điều kiện để SYPRO Orange gắn vào và giải phóng tín hiệu huỳnh quang ở bước sóng 590 nm. 30 ml mẫu phản ứng được chuẩn bị trong đĩa 96 giếng bao gồm 30 mg protein sợi đầu mút và 3 ml dung dịch SYPRO Orange 50X được chuẩn bị mới trước khi tiến hành thí nghiệm. Chu trình nhiệt được thiết lập từ 4 - 95 ºC với tốc độ đốt nóng là 1 ºC/phút. Tín hiệu phát huỳnh quang được thu tại mỗi 30 giây tương đương với mỗi lần tăng 0.5 ºC trong chu trình nhiệt. Nhiệt độ nóng chảy của protein được định nghĩa là thời điểm mà 50% phân tử protein trong dunh dịch bị biến tính hoàn toàn. 2.2.4. Kỹ thuật xác định các thụ thể tiềm năng bằng glycan-array Kỹ thuật glycan-array sử dụng các phân tử đường gắn với các glycoprotein được phủ sẵn trên một micro-array chip. Protein tái tổ hợp được bơm vào bề mặt của micro-array chip trong môi trường đệm PBS pH 7.2. Bề mặt chip sau đó được rửa lại bằng dung dịch PBS nhằm loại bỏ các protein không bám. Protein tái tổ hợp được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể kháng His-tag. Tín hiệu huỳnh quang được thu lại tại các vị trí có tương tác giữa protein nghiên cứu và phân tử đường. Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần nhằm hạn chế tối đa các sai số kỹ thuật. Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Trong khuôn khổ thực hiện đề tài luận án của mình, nghiên cứu sinh đã tiến hành biểu hiện, tinh chế, tạo tinh thể và xác định cấu trúc của các vùng protein sợi đầu mút của các adenovirus lây nhiễm trên động vật. Bốn cấu trúc đã được xác định ở độ phân giải cao (1.2 – 2 Å) gồm có protein sợi đầu mút của raptor adenovirus 1, bovine adenovirus 4, lizard adenovirus 2 và goose adenovirus 4. Về tổng thể, các cấu trúc đều ở dạng tam phân (trimer) gồm 3 đơn phân giống nhau được tạo thành bởi hai phiến beta ABCJ và GHID liên kết với nhau thông qua một vùng xoắn alpha. Về cơ bản, các cấu trúc protein sợi đầu mút đã được xác định đều giữ nguyên mô hình beta-sandwich. Tuy nhiên, có nhiều điểm khác biệt trong cấu trúc và cấu hình của các beta-strand và vùng loop, đặc biệt ở vùng loop DG do vùng này thường mang các axit amin tham gia vào quá trình gắn với thụ thể. 3.1. Xác định cấu trúc của raptor adenovirus 1 protein sợi đầu mút và nghiên cứu sự ảnh hưởng của vùng beta-hairpin lên việc hình thành tam phân 3.1.1. Biểu hiện và tinh chế protein protein sợi đầu mút của adenovirus lây nhiễm trên một số loài chim săn mồi (raptor adenovirus 1) Protein sợi đầu mút của raptor adenovirus 1 (vùng 324-464) đã được biểu hiện trong E. coli BL21(DE3)plysS và E. coli Rosetta2(DE3)_plysS với hiệu suất khoảng 16 mg/lít môi trường nuôi cấy. Protein được tinh chế bằng sắc ký ái lực kim loại được thôi ở phân đoạn từ 50-250 mM imidazole. Các phân đoạn tiếp tục được xử lý bằng sắc ký trao đổi ion. Hai đỉnh tinh sạch được thu hồi ở phân đoạn chứa khoảng 300 mM sodium chloride. Protein tinh sạch được kiểm tra trên gel điện di với hai băng tương ứng với dạng tam phân (trimer) và đơn phân (monomer) (Hình 3.1). Hình 3.1: Protein sợi đầu mút (324-464) của raptor adenovirus 1 được làm sạch bằng sắc ký trao đổi ion (A) và được điện di kiểm tra trên gel biến tính SDS-PAGE 12% (B). Protein được xử lý biến tính nhiệt 95ºC trong khoảng 5 phút (đường chạy 1) và không biến tính nhiệt (đường chạy 2) trước khi tra mẫu. 3.1.2. Tinh thể hóa protein sợi đầu mút của raptor adenovirus 1 Protein sợi đầu mút của raptor adenovirus 1 (dạng native) được kết tinh trong điều kiện có chứa sodium chloride và ethanol như mô tả trong hình 1.5A. Tuy nhiên, protein đột biến mất đoạn beta-hairpin được kết tinh trong điều kiện chứa đệm HEPES pH 7.5 và Jeffamine M-600 (Hình 3.2B). Hình 3.2: Tinh thể của protein sợi đầu mút của raptor adenovirus 1, dạng native (A) và dạng đột biến mất đoạn beta-hairpin (B) 3.1.3. Cấu trúc protein sợi đầu mút của raptor adenovirus 1 Cấu trúc vùng protein sợi đầu mút của raptor adenovirus, thuộc chi Siadenovirus, đã được xác định bằng phương pháp thay thế phân tử (molecular replacement) sử dụng cấu trúc protein sợi đầu mút của turkey adenovirus làm cấu trúc khuôn. Với tỉ lệ giống hệt về trình tự giữa protein sợi đầu mút của raptor adenovirus và turkey adenovirus là 19%, việc xác định cấu trúc dựa trên phương pháp thay thế phân tử là rất khó khăn. Tuy nhiên, do cấu hình không gian và cấu trúc tổng thể protein sợi đầu mút của raptor và turkey adenovirus là khá giống nhau, do vậy phương pháp thay thế phân tử đã được sử dụng thành công để xác định cấu trúc vùng protein sợi đầu mút của raptor adenovirus. Cấu trúc này được xác định ở dạng tam phân (trimer) với sự tham gia liên kết của các phiến beta-hairpin ở các đơn phân (monomer) này với vùng HI-loop của đơn phân liền kề như đã mô tả trong hình 3.3B. Đây là một đặc điểm mới chưa từng được công bố đối với cấu trúc của các protein sợi của adenovirus. Hình 3.3: Cấu trúc của protein sợi đầu mút của raptor adenovirus 1. (A) Cấu trúc dạng “propeller” với 2 phiến beta-sheet kép ABCJ và GHID. Đầu N và đầu C được đánh dấu bởi Nt và Ct. Vùng beta-hairpin (axit amin 359-373) được đánh dấu bằng dấu (*). (B) Tương tác giữa các đơn phân hình thành nên tam phân. (C) Bề mặt tích điện của protein sợi đầu mút được dự đoán bao gồm các vùng tích điện âm (đỏ) và các vùng tích điện dương (xanh nước biển). (D) Tương tác bề mặt giữa các đơn phân. Để nghiên cứu ảnh hưởng của vùng beta-hairpin này trong việc hình thành cấu trúc không gian ở dạng tam phân, đột biến mất đoạn được tiến hành nhằm loại bỏ vùng beta-hairpin khỏi cấu trúc của protein sợi đầu mút. Tuy nhiên, kết quả phân tích cấu trúc cho thấy, không có khác biệt nào giữa cấu trúc của protein ban đầu và protein đã đột biến mất đoạn beta-hairpin (Hình 3.4). Hình 3.4: So sánh cấu trúc protein sợi đầu mút của raptor adenovirus 1 dạng native (màu xanh lá cây) và dạng đột biến mất đoạn beta-hairpin (màu tím). Cấu trúc được so sánh ở dạng đơn phân (A) và tam phân (B). Đầu N và đầu C của protein sợi được đánh dấu bởi Nt và Ct trong hình A. 3.1.4. Kết quả xác định độ bền nhiệt protein sợi đầu mút của RAdV-1 Để nghiên cứu ảnh hưởng của vùng beta-hairpin này trong việc hình thành cấu trúc không gian ở dạng tam phân, đột biến mất đoạn được tiến hành nhằm loại bỏ vùng beta-hairpin khỏi cấu trúc của protein sợi đầu mút. Kết quả xác định độ bền của protein bằng phương pháp biến tính nhiệt (Thermo-Fluor) cho thấy protein đột biến mất đoạn beta-hairpin (đường vạch đứt) có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn so với protein dạng native (đường vạch liền) (Hình 3.5A). Trong thí nghiệm này, cả hai protein dạng đột biến mất đoạn beta-hairpin và dạng native được kiểm tra độ bền nhiệt trong dải nhiệt độ từ 4-95ºC với sự tham gia của chất phát huỳnh quang SYPRO-Orange. Tại 95ºC, protein sợi đầu mút dạng đột biến mất đoạn beta-hairpin có xuất hiện đỉnh phát huỳnh quang tương ứng với thời điểm protein bị biến tính ở nhiệt độ 95ºC. Tuy nhiên, không xuất hiện đỉnh phát huỳnh quang ở 95ºC trong trường hợp của protein dạng tự nhiên. Hình 3.5: Nghiên cứu tính bền nhiệt của protein sợi của raptor adenovirus 1. (A) Đồ thị tín hiệu huỳnh quang thể hiện tính bền nhiệt của protein sợi đầu mút của raptor adenovirus 1 dạng tự nhiên (nét vạch liền) và dạng đột biến mất đoạn beta-hairpin (nét vạch đứt). (B) Kết quả điện di kiểm tra trên gel biến tính polyacrylamide 12 % protein sợi đầu mút dạng tự nhiên (đường chạy 1) và protein đột biến mất đoạn beta-hairpin (đường chạy 2). Protein biến tính và dạng tự nhiên được điện di kiểm tra trên gel biến tính polyacrylamide. Kết quả điện di cho thấy, protein dạng đột biến (đường chạy 2, Hình 3.5B) xuất hiện nhiều dạng oligomer hơn so với protein ở dạng native (đường chạy 1, Hình 3.5B). 3.2. Xác định cấu trúc protein sợi đầu mút của adenovirus lây nhiễm trên bò (bovine adenovirus 4) 3.2.1. Biểu hiện và tinh chế protein sợi đầu mút của bovine adenovirus 4 Các đoạn gen mã hóa cho vùng trình protein sợi đầu mút của bovine adenovirus (gồm có 248-535, 414-535 và protein đầy đủ 1-535) được tách dòng trong vector pET28a(+). Tuy nhiên, chỉ duy nhất phân đoạn 414-535 (protein sợi đầu mút) được biểu hiện dạng tan trong hệ biểu hiện E. coli JM109(DE3). Protein được tinh chế qua hai bước gồm sắc ký ái lực kim loại và sắc ký trao đổi ion dương. Protein được thôi ra ở 5 đỉnh khác nhau được ký hiệu là a, b, c, d, e như trong hình 3.6A. Kết quả điện di kiểm tra cho thấy, xuất hiện một băng duy nhất ở kích thước khoảng 15 kDa, tương ứng với kích thước đơn phân (Hình 3.6B). Hình 3.6: Kết quả tinh chế protein sợi đầu mút 414-535 của bovine adenovirus 4 bằng sắc ký trao đổi ion. Protein thôi ra ở các đỉnh a, b, c, d, e được điện di kiểm tra ở các đường chạy từ 3-12. Đường chạy 1 và 2 là protein tinh chế ái lực kim loại được thôi ra bằng imidazole và pH thấp. Đường chạy 3-12 là protein tương ứng thu được ở các đỉnh a, b, c, d và e theo từng cặp có xử lý biến tính nhiệt (4, 6, 8, 10, 12) và không sử lý biến tính nhiệt (3, 5, 7, 9, 11). 3.2.2. Kết quả tạo tinh thể protein sợi đầu mút của bovine adenovirus 4 Protein sau tinh chế được kết tinh trong các điều kiện khác nhau. Các bộ kit dùng để kết tinh protein đã được liệt kê trong phần vật liệu và phương pháp. Từ hơn 400 điều kiện kết tinh khác nhau, tinh thể có chất lượng cao được tìm thấy ở một số các điều kiện chứa PEG 3350 và thiocyanate hoặc isothicocyanate (Hình 3.7). Hình 3.7: Tinh thể protein sợi đầu mút của bovine adenovirus 4 được kết tinh ở điều kiện chứa PEG 3350 và thiocyanate hoặc isothiocyanate (A). Các tinh thể cũng thu được ở điều kiện chứa PEG 400 và glycerol (B). 3.2.3. Cấu trúc của protein sợi vùng đầu C của adenovirus lây nhiễm trên bò Cấu trúc vùng protein sợi đầu mút của bovine adenovirus 4 thuộc chi Atadenovirus được xác định bằng phương pháp single isomorphous replacement (SIR). Trong số các cấu trúc protein sợi đầu mút của adenovirus, hai cấu trúc này có nhiều đặc điểm tương đồng với protein sợi đầu mút của adenovirus lây nhiễm trên rắn (snake adenovirus 1) do chúng đều thuộc chi Atadenovirus. Những cấu trúc này được xem là những cấu trúc nhỏ nhất trong số các cấu trúc protein sợi đầu mút của adenovirus với khoảng 120 axit amin cho mỗi đơn phân (monomer) (Hình 3.8). Hình 3.8: Cấu trúc protein sợi đầu mút của của bovine adenovirus 1 ở dạng đơn phân (A) và dạng tam phân (C). Topology của cấu protein sợi đầu mút được thể hiện dạng phiến beta màu vàng (B). Tính tích điện bề mặt được dự đoán với các vùng tích điện âm (màu đỏ) và tích điện dương (màu xanh) (D). Đầu N và đầu C của protein sợi được đánh dấu bằng Nt và Ct trong hình A và B. 3.3. Xác định cấu trúc protein sợi đầu mút của adenovirus lây nhiễm trên thằn lằn. 3.3.1. Biểu hiện và tinh chế protein sợi đầu mút của lizard adenovirus 2 Vùng trình tự mã hóa cho protein sợi đầu mút của lizard adenovirus 2 được xác định dựa trên việc phân tích trình tự của cấu trúc trục trung tâm gồm các đoạn lặp beta (beta spiral motif) (Hình 3.9). Các phân đoạn được dự đoán chứa vùng protein sợi đầu mút gồm có 245-433, 305-433 và vùng trình tự đầy đủ của toàn bộ protein sợi 1-433. Protein được biểu hiện trong hệ biểu hiện E. coli JM109(DE3). Hình 3.9: Phân tích trình tự mã hóa cho protein sợi của lizard adenovirus 2. Vùng trình tự đánh dấu màu đỏ là vùng trình tự 305-433. Vùng trình tự màu xanh là đoạn bổ sung từ 245-305. Các plasmid mang gen mã hóa cho đoạn 245-433, 305-433 và trình tự đầy đủ 1-433 được biểu hiện trong E. coli JM109(DE3). Protein được tinh chế qua hai bước tinh chế tương tự như quá trình tinh chế của protein protein sợi đầu mút của bovine adenovirus 4. Protein được thu lại từ các phân đoạn chứa nồng độ muối sodium chloride khoảng 50%. Kết quả điện di cho thấy, protein tồn tại ở dạng đơn phân (monomer) khi mẫu được biến tính nhiệt 95ºC trong 5 phút trước khi được tra vào bản gel điện di biến tính SDS-PAGE (Hình 3.10B, đường chạy 4, 6, 8, 10). Dạng tam phân được tìm thấy ở các đường chạy mà mẫu không được xử lý biến tính nhiệt trước khi chạy (Hình 3.10B, đường chạy 5, 7, 9, 11). Hình 3.10: Kết quả tinh chế protein sợi đầu mút của lizard adenovirus 2 bằng sắc ký trao đổi ion. (A) Sắc ký đồ thể hiện quá trình tinh chế protein bằng sắc ký trao đổi cation. (B). Điện di biến tính protein trên gel SDS-PAGE. Đ/c 1 và 2: protein thu được từ sắc ký ái lực ở phân đoạn 250 và 500 mM imidazole. Đ/c 3-10: protein thu được từ các phân đoạn 19-22 của sắc kí trao đổi ion. Mẫu được xử lý biến tính nhiệt 95ºC (đ/c 3, 5, 7, 9) và không xử lý nhiệt (đ/c 4, 6, 8, 10) trước khi tra trên bản gel. Protein dạng đơn phân (monomer) và tam phân (trimer) được đánh dấu bằng mũi tên đen. 3.3.2. Kết quả tạo tinh thể của protein sợi đầu mút 2 của lizard adenovirus 2 Protein sợi đầu mút của lizard adenovirus 2 được kết tinh trong điều kiện có chứa PEG 3350 và potassium thiocyanate. Tuy nhiên, tinh thể protein bị phân hủy khi được đặt vào trong dung dịch có chứa Hg nhằm mục đích gắn Hg vào tinh thể protein, phục vụ cho việc thu số liệu với tín hiệu khác biệt. Do vậy, protein được biểu hiện trong môi trường nghèo M9 với sự có mặt của Seleno-methionine nhằm tạo ra các phân tử protein có chứa Seleno. Protein được tinh chế và kết tinh trong điều kiện giống với protein dạng tự nhiên (native) ban đầu. 3.3.3. Mô tả cấu trúc vùng protein sợi đầu mút 2 của lizard adenovirus 2 Cấu trúc vùng protein sợi đầu mút 2 của lizard adenovirus 2 được xác định có nhiều đặc điểm tương đồng với protein sợi đầu mút của adenovirus lây nhiễm trên rắn (snake adenovirus 1) do chúng đều thuộc chi Atadenovirus. Lizard adenovirus là một adenovirus đặc biệt với việc có hai gen mã hóa cho protein sợi trong hệ gen. Tuy nhiên điểm đặc biệt hơn cả là virus này hoặc có protein sợi ngắn (fibre 1) gắn vào mỗi đỉnh hoặc 3 protein sợi dài (fibre 2) gắn vào mỗi đỉnh thông qua vùng gắn với penton base. Tuy nhiên, chỉ duy nhất protein sợi dài được biểu hiện và tinh chế thành công ở dạng tan. Do vậy, cấu trúc được xác định cho protein sợi dài với nhiều điểm tương đồng so với cấu trúc protein sợi đầu mút của snake và bovine adenovirus. Hình 3.11: Cấu trúc của protein sợi đầu mút của lizard adenovirus 2 ở dạng đơn phân (A) và dạng tam phân (B). Đầu N và đầu C của protein sợi đầu mút được đánh dấu bằng Nt và Ct trong hình A. Cấu trúc được so sánh với cấu trúc đã biết gồm protein sợi đầu mút của bovine adenovirus 4 (màu hồng sẫm), của snake adenovirus 1 (màu da cam, orange) và lizard adenovirus 2 (protein sợi đầu mút sợi 1) (màu xanh lá cây, green) (Hình 3.12). Hình 3.12: So sánh cấu trúc của protein sợi đầu mút 2 của lizard adenovirus (màu lục lam) với các protein sợi đầu mút của bovine adenovirus 4 (màu hồng sẫm), của snake adenovirus 1 (màu da cam) và lizard adenovirus 2 (protein sợi đầu mút 1) (màu xanh lá cây). 3.4. Xác định cấu trúc protein sợi đầu mút của adenovirus lây nhiễm trên ngỗng 3.4.1. Kết quả phân tích trình tự gen, xác định vùng trình tự mã hóa cho protein sợi đầu mút Tương tự như đối với các protein sợi đầu mút khác, vùng trình tự mã hóa cho trục trung tâm (fibre shaft domain) của protein sợi được xác định dựa vào cấu trúc lặp lại của beta-spiral motif. Các phân đoạn chứa vùng protein sợi đầu mút được đưa vào vector pET28a(+) phục vụ cho mục đích biểu hiện ở hệ vi khuẩn E. coli. Các phân đoạn gồm có 209-460, 238-460, 267-460 và vùng trình tự đầy đủ của cả protein sợi 1-460 được kiểm tra biểu hiện. Tuy nhiên, chỉ duy nhất vùng trình tự 238-460 được biểu hiện dưới dạng tan một phần. Protein được làm sạch và điện di kiểm tra như được mô tả trong hình 3.13. Hình 3.13: Kết quả tinh sạch protein sợi đầu mút của goose adenovirus 4. (A) Protein được thôi ở hai đỉnh liền kề trên sắc ký trao đổi ion. Protein được thu ở các phân đoạn từ 22-26. (B) Kết quả điện di biến tính SDS với protein thu được từ các phân đoạn 22-25 (đường chạy 1-4, tất cả được xử lý nhiệt 95ºC trong 5 phút trước khi tra mẫu). Đường chạy 5 và 6, protein thu được từ phân đoạn 26 (xử lý biến tính nhiệt và không xử lý biến tính nhiệt). Đường chạy M: thang protein chuẩn. 3.4.2. Kết quả tạo tinh thể của protein sợi đầu mút của goose adenovirus 4 Hơn 400 điều kiện khác nhau đã được thử nhằm tạo ra tinh thể protein sợi đầu mút của goose adenovirus 4. Protein kết tinh ở một số điều kiện khác nhau ở dạng thanh dài có kích thước khoảng vài trăm micromet. Tinh thể đạt chất lượng cho thí nghiệm nhiễu xạ tia X được tìm thấy trong điều kiện có chứa PEG 600 trong môi trường đệm HEPES pH 7.0 (Hình 3.14C). Hình 3.14: Kết quả tạo tinh thể protein sợi đầu mút của goose adenovirus 4 trong các điều kiện khác nhau. Tinh thể được thu nhận trong điều kiện có chứa PEG 600 và HEPES pH 7.0 (C), đủ điều kiện cho thí nghiệm nhiễu xạ tia X. 3.4.3. Kết quả xác định cấu trúc protein sợi đầu mút của goose adenovirus 4 Cấu trúc protein sợi đầu mút của goose adenovirus 4 cũng được xác định bằng phương pháp single anomalous dispersion (SAD). Cấu trúc này được xác định là một trong những cấu trúc lớn nhất trong số các cấu trúc protein sợi đầu mút của adenovirus với 220 axit amin cho mỗi đơn phân. Cấu trúc này có nhiều điểm tương đồng với cấu trúc protein sợi đầu mút của fowl adenovirus (fibre 1 và 2). Tuy nhiên, với sự xuất hiện của một đoạn beta ngắn ở vị trí song song với sợi beta A cho thấy cấu trúc này có nhiều điểm tương đồng với cấu trúc protein sợi đầu mút của các adenovirus lây nhiễm trên người. Hình 3.15: Cấu trúc của protein sợi đầu mút của goose adenovirus 4. Dạng đơn phân (A), dạng tam phân (C). Topology của protein sợi đầu mút được thể hiện dạng phiến beta (màu vàng) (B). Bề mặt tích điện của protein sợi đầu mút được dự đoán với các vùng có tích điện âm (màu đỏ) và các vùng tích điện dương (màu xanh) (D). 3.5. Kết quả sàng lọc các thụ thể tiềm năng bằng kỹ thuật glycan array Kết quả phân tích phổ phát huỳnh quang sử dụng micro-array chip đã được gắn trên bề mặt các neoglycoconjugates và glycoproteins với các protein sợi đầu mút của raptor adenovirus, bovine adenovirus và lizard adenovirus không thu nhận được tín hiệu huỳnh quang từ các chip. Đối với protein sợi đầu mút của goose adenovirus, tín hiệu huỳnh quang được thu nhận tại các vị trí tương ứng với polysaccharide Lacto-N-fucopentaose type III và một số đường dạng Lewis-X (Hình 3.16). Hình 3.16: Tín hiệu huỳnh quang thu được tại các vị trí có tương tác ái lực giữa protein sợi đầu mút của goose adenovirus với một số polysaccharides khác nhau bằng kỹ thuật glycan-array. Protein sợi đầu mút của goose adenovirus có ái lực cao với đường Lacto-N-fucopentaose III và một số đường dạng Lewis-X. Chương 4 THẢO LUẬN Bốn cấu trúc của protein sợi đầu mút (fibre head) của các loài adenovirus thuộc chi Atadenovirus, Aviadenovirus và Siadenovirus đã được xác định. Cấu trúc protein sợi đầu mút của raptor adenovirus, thuộc chi Siadenovirus, đã được xác định bằng phương pháp thay thế phân tử (molecular replacement) sử dụng cấu trúc protein sợi đầu mút của turkey adenovirus làm cấu trúc khuôn. Với tỉ lệ giống hệt về trình tự giữa protein sợi đầu mút của raptor adenovirus và turkey adenovirus là 19%, việc xác định cấu trúc dựa trên phương pháp thay thế phân tử là rất khó khăn. Tuy nhiên, do cấu hình không gian và cấu trúc tổng thể protein sợi đầu mút của raptor và turkey adenovirus là khá giống nhau, do vậy phương pháp thay thế phân tử đã được sử dụng thành công để xác định cấu trúc vùng protein sợi đầu mút của raptor adenovirus. Trong trường hợp fibre head của bovine adenovirus 4, phương pháp thay thế phân tử cũng đã được sử dụng nhưng không thành công trong việc xác định được cấu trúc. Do vậy, nghiên cứu sinh đã phải sử dụng phương pháp single isomorphous replacement để xác định cấu trúc fibre head của bovine adenovirtus 4. Với fibre head của lizard adenovirus 2, phương pháp thay thế phân tử cũng không thành công, việc nhúng tinh thể với kim loại nặng (heavy atom soaking) cũng không thành công do các nguyên tử kim loại nặng làm ảnh hưởng tới cấu trúc của tinh thể. Do vậy, phương pháp thay thế methionine bằng seleno-methionine đã được sử dụng nhằm tạo ra các protein có gắn Seleno. Quá trình này được thực hiện nhờ việc biểu hiện protein trong chủng E. coli B834(DE3) trong môi trường nghèo M9 có bổ sung seleno-methionine. Nhờ đó, cấu trúc đã được xác định thành công bằng phương pháp single anomalous dispersion (SAD). Các protein được gửi đi phân tích nhằm sàng lọc và xác định các thụ thể tiềm năng liên quan đến quá trình nhận biết và xâm nhập tế bào của adenovirus bằng kỹ thuật glycan-array. Tuy nhiên, chỉ duy nhất protein sợi đầu mút của goose adenovirus được xác định có ái lực với các polysaccharide Lacto-N-fucopentaose và Lewis-X. Điều này chứng tỏ các polysaccharide này có thể liên quan đến quá trình tương tác thụ thể và có thể tham gia vào hình thành cấu trúc của các thụ thể trong tự nhiên của goose adenovirus. Do vậy, việc xác định cấu trúc protein sợi đầu mút của goose adenovirus dạng đơn lẻ và dạng tương tác với các loại polysaccharides này sẽ cung cấp các thông tin hữu ích dùng cho việc thiết kế và phát triển các vector chuyển gen trong tương lai. Đối với các protein sợi đầu mút của raptor adenovirus 1, bovine adenovirus 4 và lizad adenovirus 2, không thu được tín hiệu huỳnh quang có ý nghĩa thống kê tại các vị trí tương ứng của các polysaccharides. Chứng tỏ không có sự tương tác ái lực của các protein sợi đầu mút này với các polysaccharides gắn trên micro-array chip. Điều này có thể được giải thích là do cấu trúc phức tạp của các thụ thể tự nhiên trên bề mặt tế bào so với cấu trúc của các polysaccharides được gắn trên bề mặt micro-array chip. Ngoài ra, quá trình biến đổi sau dịch mã (rất hạn chế ở E. coli) cũng có thể ảnh hưởng tới việc tương tác của các thụ thể với protein sợi đầu mút. Do vậy, cần phải tiến hành các thí nghiệm khác nhau ở mức độ in vivo nhằm tìm ra các thụ thể thực sự tham gia vào quá trình nhận biết của protein sợi đầu mút, kích hoạt quá trình xâm nhiễm. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã biểu hiện và tinh chế thành công protein sợi đầu mút (fibre head) tái tổ hợp dạng dung hợp với đuôi His-tag của các adenovirus lây nhiễm trên một số động vật như chim săn mồi (raptor adenovirus 1), bò (bovine adenivurs 4), thằn lằn (lizard adenovirus 2) và ngỗng (goose adenovirus 4). Đã tạo tinh thể và xác định thành công 4 cấu trúc protein sợi đầu mút của các adenovirus này với độ phân giải cao từ 1.2 – 2.0 Å. Các cấu trúc protein sợi đầu mút đã được xác định đều giữ nguyên mô hình beta-sandwich gồm ABCJ và GHID liên kết bởi vùng xoắn alpha. Nhiều điểm khác biệt được chỉ ra so với các cấu trúc đã biết. Đã tiến hành sàng lọc các thụ thể tiềm năng tham gia tương tác với protein sợi đầu mút bằng kỹ thuật glycan-array. Protein sợi đầu mút của raptor adenovirus, bovine adenovirus và lizard adenovirus không có ái lực gắn với các poly-saccharides trên micro-array chip. Protein sợi đầu mút của goose adenovirus 4 được xác định có ái lực với Lacto-N-fucopentaose và đường Lewis-X, là các loại đường được tìm thấy trên bề mặt của các tế bào khối u và tế bào ung thư. KIẾN NGHỊ Đối với các protein sợi đầu mút của raptor adenovirus 1, bovine adenovirus 4 và lizard adenovirus 2, cần tiếp tục tiến hành các thí nghiệm sàng lọc các thụ thể tiềm năng bằng các kỹ thuật in vivo khác nhau nhằm tìm ra các thụ thể tham gia vào việc tương tác với protein sợi. Đối với protein sợi đầu mút của goose adenovirus 4, cần tiến hành kiểm tra lại ái lực gắn với Lacto-N-fucopentaose và một số dạng đường Lewis-X bằng co-crystallization hoặc bằng các kỹ thuật vật lý khác như: NMR, ITC, SPR nhằm khẳng định ái lực gắn đối với các phân tử polysaccharides tiềm năng. Nghiên cứu tạo đột biến điểm đối với các cấu trúc đã biết nhằm làm tăng ái lực gắn với các thụ thể tiềm năng, hoặc định hướng thay đổi tế bào gắn đích. Các adenoviruses mang cấu trúc đột biến có thể được xây dựng phục vụ cho nghiên cứu chức năng sau này. DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Pénzes JJ, Menéndez-Conejero R, Condezo GN, Ball I, Papp T, Doszpoly A, Paradela A, Pérez-Berna AJ, López-Sanz M, Nguyen TH, van Raaij MJ, Marschang RE, Harrach B, Benkő M, San Martín C (2014). Molecular characterization of a lizard adenovirus reveals the first atadenovirus with two fiber genes, and the first adenovirus with either one short or three long fibers per penton. Journal of Virology 88, 11304-11314. Nguyen TH, Vidovszky MZ, Ballmann MZ, Sanz-Gaitero M, Singh AK, Harrach B, Benkő M, van Raaij MJ (2015). Crystal structure of the fibre head domain of bovine adenovirus 4, a ruminant atadenovirus. Virology Journal 2015. 12, 81. Singh AK, Berbís MÁ, Ballmann MZ, Kilcoyne M, Menéndez M, Nguyen TH, Joshi L, Cañada FJ, Jiménez-Barbero J, Benkő M, Harrach B, van Raaij MJ (2015). Structure and sialyllactose binding of the carboxy-terminal head domain of the fibre from a siadenovirus, turkey adenovirus 3. PLoS ONE 10, e0139339. Thanh H. Nguyen, Mónika Z. Ballmann, Huyen T. Do, Hai N. Truong, Mária Benkő, Balázs Harrach and Mark J. van Raaij (2016). Crystal structure of raptor adenovirus 1 fibre head and role of the beta-hairpin in siadenovirus fibre head domains. Virology Journal 2016; 13: 106. MỤC LỤC