Tóm tắt Luận án Tổng hợp và nghiên cứu tính tương thích sinh học khả năng tạo mô xương của vật liệu composit poly (d, l) lactic axit/hydroxyapatit

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Trần Thanh Hoài TỔNG HỢP VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH TƯƠNG THÍCH SINH HỌC KHẢ NĂNG TẠO MÔ XƯƠNG CỦA VẬT LIỆU COMPOSIT POLY (D, L) LACTIC AXIT/HYDROXYAPATIT Chuyên ngành: Hóa lí thuyết và Hóa lí Mã số : 62440119 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2017 Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Kim Ngà 2. PGS.TS. Hồ Phú Hà Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi.giờ, ngàythángnăm. Có thể tìm hiều luận án tại thư viện: 1. Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường ĐHBK Hà Nội 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 1. Trần Thanh Hoài, Nguyễn Kim Ngà (2015) Nghiên cứu ảnh hưởng kích thước hạt nano của hydroxyapatit đến khả năng tạo apatit của màng hydroxyapatit/poly (D,L) lactic axit. Tạp chí Khoa học và Công nghệ- Các trường Đại học Kỹ thuật, 104, pp. 99-102 . 2. Trần Thanh Hoài, Nguyễn Kim Ngà (2015) Effect of casting solvent on microstructure and biocompatibility of poly (D, L)lactic acid/hydroxyapatite nanorod for bone regeneration. Vietnam Journal of Chemistry 53(6e3), pp. 100-108. 3. Lưu Trường Giang, Trần Thanh Hoài, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Nguyễn Kim Ngà (2015) Synthesis and characterizations of hydroxyapatite nanorods: effect of surfactant concentration and hydrothermal time on their morphology. Tạp chí Khoa học và Công nghệ- Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, 53 (4D), pp. 295-303. 4. Nguyen Kim Nga, Tran Thanh Hoai, Pham Hung Viet (2015) Biomimetic scaffolds based on hydroxyapatite nanorod/poly(D,L) lactic acid with their corresponding apatite-forming capability and biocompatibility for bone tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 128, pp. 506-514. 5. Trần Thanh Hoài, Nguyễn Kim Ngà, Hồ Phú Hà. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ hydroxyapatit đến hình thái cấu trúc vi mô và khả năng tương thích sinh học của khuôn định dạng compozit hydroxyapatit/ poly(D,L) lactic axit . Tạp chí Hóa học và Ứng dụng. Đã nhận đăng (số 2, năm 2017) 6. Tran Thanh Hoai, Nguyen Kim Nga, Luu Truong Giang, Tran Quang Huy, Phan Nguyen Minh Tuan, Bui Thi Thanh Binh. Hydrothermal synthesis of hydroxyapatite nanorods for rapid formation of bone-like mineralization. Journal of Electronic Materials (Under revision 1/2017). 1 MỞ ĐẦU Các tổn thương về xương đang gia tăng bởi sự già hóa dân số, tai nạn giao thông và sự xuất hiện nhiều môn thể thao mạo hiểm dễ gây ra các chấn thương. Trong các bệnh về xương thì tỷ lệ bệnh cần ghép xương đang gia tăng đáng kể. Thay thế xương là một giải pháp tối ưu trong điều trị sửa chữa các vùng bị phá hủy hay các mô nhiễm bệnh do hoại tử, dị tật, thoái hóa, ung thư hay vì mục đích thẩm mỹ. Các phương pháp ghép xương hiện nay đang được sử dụng là phương pháp ghép xương tự thân, ghép xương đồng loại, ghép xương dị loại và kỹ thuật mô xương. Mỗi phương pháp có những ưu nhược điểm riêng, trong đó kỹ thuật mô xương là một phương pháp mới đang được nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Trong kỹ thuật mô xương, vật liệu có hoạt tính sinh học được chế tạo dưới dạng khuôn định dạng 3D. Khuôn định dạng (scaffold) là khuôn tạm thời để tế bào bám dính, sinh trưởng, phát triển và hình thành khung ngoại bào trong quá trình hình thành cấu trúc mô mới. Khuôn định dạng có thể được chế tạo từ các vật liệu polyme phân hủy sinh học, vật liệu vô cơ có hoạt tính sinh học hoặc composit. Vật liệu composit với sự liên kết của vật liệu gốm sinh học và polyme, được xem là phương pháp hiệu quả để tăng cường hoạt tính sinh học và tính chất cơ học của khuôn định dạng. Vật liệu vô cơ có thành phần tương tự thành phần khoáng trong xương là hydroxyapatit (HAp). HAp có tính tương thích sinh học, hoạt tính sinh học cao. Chính vì vậy, vật liệu composit HAp/polyme đang thu hút các nhà khoa học nghiên cứu và phát triển để tạo ra khuôn định dạng có những tính chất gần giống với xương người. Hiện nay, trên thế giới, vật liệu composit HAp/polyme ứng dụng trong kỹ thuật mô xương đã được nghiên cứu rất nhiều và thử nghiệm trên động vật. Ở trong nước, đến nay chưa có công trình nào nghiên cứu về vật liệu composit ứng dụng trong kỹ thuật mô xương. Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn đề tài:’’Tổng hợp và nghiên cứu tính tương thích sinh học khả năng tạo mô xương của vật liệu composit Poly (D, L) lactic axit/hydroxyapatit’’. Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu tổng hợp vật liệu composit sinh học gồm hydroxyapatit và polyme sinh học (PDLLA) nhằm mục đích tạo ra vật liệu có khả năng tương hợp sinh học, kích thích sự phát triển xương để có thể ứng dụng trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xương. 2 Nội dung nghiên cứu luận án: 1. Nghiên cứu tổng hợp bột HAp kích thước nano bằng phương pháp thủy nhiệt có bổ sung hai chất hoạt động bề mặt khác nhau là CTAB và P123. Trong đó, luận án nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước, hình dạng của tinh thể HAp như: - Ảnh hưởng của nồng độ chất hoạt động bề mặt. - Ảnh hưởng của thời gian thủy nhiệt. Từ các mẫu bột HAp tổng hợp được ở các điều kiện khác nhau, luận án thực hiện đánh giá hoạt tính sinh học của bột HAp bằng thí nghiệm in-vitro ngâm trong dung dịch SBF. 2. Nghiên cứu chế tạo khuôn định dạng composit HAp/PDLLA bằng phương pháp đổ dung môi rửa hạt. Trong đó, luận án nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc vi mô của khuôn định dạng như: - Ảnh hưởng của tỷ lệ HAp/PDLLA. - Ảnh hưởng của dung môi sử dụng là chloroform và 1,4-dioxan. Từ các mẫu khuôn định dạng chế tạo được, luận án thực hiện đánh giá hoạt tính sinh học của các khuôn định dạng bằng thí nghiệm in-vitro ngâm trong dung dịch SBF và tính tương thích sinh học của khuôn định dạng bằng thí nghiệm in-vitro với tế bào MG63. Ý nghĩa khoa học và đóng góp mới của luận án: Luận án đã tập trung nghiên cứu tổng hợp bột HAp có kích thước nano và chế tạo vật liệu composit HAp/PDLLA cấu trúc 3D có lỗ xốp ứng dụng trong kỹ thuật mô xương. Các kết quả đạt được đã có những đóng góp mới sau: - Luận án đã tổng hợp thành công bột nano HAp bằng phương pháp thủy nhiệt có sử dụng hai chất hoạt động bề mặt khác nhau là P123 và CTAB. Bột HAp tổng hợp được (đường kính trung bình 28 nm chiều dài trung bình 120 nm, tỷ lệ Ca/P là 1,66) có kích thước tương tự kích thước khoáng xương tự nhiên và thể hiện hoạt tính sinh học cao khi ngâm trong dung dịch SBF. Lớp apatit được hình thành trong thời gian ngắn sau 7 ngày ngâm trong dung dịch SBF, hình thái lớp apatit tạo thành đặc trưng cho lớp apatit giống xương. - Luận án đã chế tạo thành công khuôn định dạng composit HAp/PDLLA có cấu trúc 3D xốp, bằng phương pháp đổ dung môi rửa hạt với chất tạo lỗ là NaCl và sử dụng hai dung môi khác nhau là 1,4-dioxan và chloroform. Khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp được có độ dày 2 mm, độ xốp cao > 70% với kích thước lỗ 3 xốp dao động trong khoảng 117-254 µm. Các mẫu khuôn định dạng đều có khả năng tương thích sinh học với tế bào MG63. Bố cục của luận án Luận án có 118 trang với 23 bảng,55 hình. Ngoài phần mở đầu (3 trang), kết luận (1 trang), danh mục các công trình công bố (1 trang) và tài liệu tham khảo (11 trang), luận án được chia thành 3 chương như sau: Chương 1. Tổng quan (34 trang) Chương 2. Thực nghiệm (12 trang) Chương 3. Kết quả và thảo luận (50 trang) CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Xƣơng và các phƣơng pháp cấy ghép xƣơng Xương là mô cứng có khả năng tự tái tạo và sửa chữa trong một số trường hợp bị gãy hay tổn thương mà không để lại sẹo[5, 6]. Tuy nhiên, trong trường hợp tổn thương do bệnh lý hay các tổn thương quá lớn, xương không thể tự liền và tự sửa chữa nên cần cấy ghép để giúp phần tổn thương tái tạo và phục hồi. Phương pháp cấy ghép xương có thể được chia làm các loại chính sau: phương pháp ghép xương đồng loại (allograft), phương pháp ghép xương tự thân (autograft), phương pháp ghép dị loại (xenograft. Phương pháp ghép xương không gây ra các phản ứng miễn dịch nhưng bệnh nhân phải phẫu thuật nhiều lần và số lượng mô ghép có hạn. Phương pháp ghép dị loại là phương pháp ghép xương được lấy từ cơ quan người hiến tặng. Phương pháp này có nhược điểm là độ bền cơ của vật liệu giảm 50% sau khi xử lý và giá thành cao. Phương pháp ghép xương có nguồn gốc từ động vật, thực vật có ưu thế về chi phí và số lượng nhưng thường xuất hiện các phản ứng đào thải mô ghép. Để khắc phục các nhược điểm trên, kỹ thuật mô xương đã được phát triển. Trong kỹ thuật mô, thiết kế khuôn định dạng và mô ghép sẽ làm giảm nhược điểm của các phương pháp ghép truyền thống và cải thiện sự liên kết, tạo xương, kích thích tạo xương và tính dẫn xương của mô ghép. 1.2. Các vật liệu chế tạo khuôn định dạng Vật liệu sinh học đã được nghiên cứu để chế tạo khuôn định dạng ứng dụng trong kỹ thuật tạo mô gồm 3 dạng chính: vật liệu polyme phân hủy sinh học; vật liệu vô cơ có hoạt tính sinh học; vật 4 liệu composit được tổng hợp từ 2 dạng vật liệu trên (polyme/vật liệu vô cơ hoạt tính sinh học). Trong các hợp chất vô cơ có hoạt tính sinh học HAp nổi bật với hoạt tính sinh học cao, đã được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong y sinh và đặc biệt HAp có thành phần giống với thành phần vô cơ trong xương người. Vì vậy, nếu dùng HAp để tạo khuôn định dạng, nó sẽ giúp khuôn định dạng tương thích với tế bào tạo xương và kích thích quá trình tái tạo xương sớm. Polyme PDLLA có những ưu điểm thích hợp để tổng hợp composit chế tạo khuôn định dạng như tính cơ học ổn định, thời gian phân hủy thích hợp, khi kết hợp với hợp chất vô cơ có hoạt tính sinh học có thể điều khiển thời gian phân hủy tủy thuộc vào ứng dụng, sản phẩm phân hủy không gây độc với cơ thể. Đặc biệt PDLLA có thể được tổng hợp từ axit lactic, là axit được tạo bởi quá trình lên men sinh học, vì vậy PDLLA có thể coi là một sản phẩm thân thiện với môi trường. Trong luận án này, chúng tôi đã lựa chọn hai vật liệu HAp và PDLLA để chế tạo khuôn định dạng composit ứng dụng trong lĩnh vực mô xương. 1.3. Phƣơng pháp tổng hợp bột HAp Hoạt tính sinh học, cơ học của HAp phụ thuộc vào độ tinh khiết, kích thước, hình dạng của HAp tổng hợp được. Các đặc tính này sẽ quyết định phạm vi ứng dụng của vật liệu. Do đó có rất nhiều phương pháp đã được nghiên cứu có thể điều khiển hình thái, kích thước của HAp. Một số phương pháp đã và đang được nghiên cứu trong tổng hợp HAp như: phương pháp đồng kết tủa, phương pháp thủy nhiệt, phương pháp sol-gel, Phương pháp thủy nhiệt có ưu điểm là thời gian phản ứng nhanh (< 24h), chỉ cần một giai đoạn để hình thành tinh thể nên dễ điều khiển các thông số của phản ứng, các tinh thể thu được có độ đồng nhất cao về hình dạng và kích thước, kích thước hạt thu được từ 50 nm. Với những ưu điểm nêu trên, chúng tôi đã sử dụng phương pháp thủy nhiệt trong tổng hợp HAp. 1.4. Phƣơng pháp chế tạo khuôn định dạng composit Có rất nhiều phương pháp chế tạo khuôn định dạng composit polyme/gốm như phương pháp đổ dung môi rửa hạt, phương pháp nhiệt phân tách pha (TIPS), phương pháp bọt khí rửa hạt và công nghệ in 3D. Mỗi kỹ thuật sẽ tạo ra khuôn định dạng với cấu trúc lỗ khác nhau với những ưu nhược điểm riêng. 5 Phương pháp đổ dung môi rửa hạt có ưu điểm đơn giản nhưng hiệu quả cao, dễ dàng tạo hình cho khuôn định dạng và dễ kiểm soát độ xốp, kích thước lỗ của khuôn định dạng bằng kích thước và số lượng hạt tạo lỗ. Với những ưu điểm đã nêu trên, chúng tôi nhận thấy phương pháp đổ dung môi rửa hạt phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm và thích hợp để tạo khuôn định dạng composit HAp/PDLLA. 1.5. Phƣơng pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học của vật liệu Một số phương pháp thường dùng để dự đoán hoạt tính sinh học của vật liệu trước khi thử nghiệm trên cơ thể động vật là thí nghiệm in-vitro với dung dịch mô phỏng dịch cơ thể người (SBF) và thí nghiệm với tế bào. Thí nghiệm ngâm vật liệu trong dung dịch SBF được dùng để đánh giá hoạt tính sinh học của vật liệu thông qua khả năng hình thành lớp apatit giống xương. Thí nghiệm nuôi cấy tế bào lên vật liệu để đánh giá khả năng tương thích của vật liệu với tế bào. Đánh giá này dựa trên sự phát triển của tế bào và khả năng bám dính, di trú của tế bào trên vật liệu. Phương pháp AlamarBlue là phương pháp đánh giá khả năng tương thích và phát triển của tế bào với vật liệu. Thuốc thử AlamarBlue là chất oxi hóa có màu xanh và không phát huỳnh quang. Khi thuốc thử alamarBlue được ủ cùng với tế bào sống, thuốc thử sẽ bị khử và chuyển thành màu đỏ, phát huỳnh quang. Tín hiệu được đo ở bước sóng kích thích 560 nm và bước sóng phát xạ là 590 nm [175]. Kính hiển vi laze đồng tiêu cự với khả năng ghi lại các lớp ảnh ở sâu trong mẫu để tạo nên hình ảnh 3D cho phép quan sát sự bám dính và di trú của tế bào trên vật liệu. CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và nguyên liệu đầu Các hóa chất tổng hợp bột HAp, tổng hợp khuôn định dạng composit HAp/PDLLA và thử hoạt tính sinh học của vật liệu có độ tinh khiết cao. 2.2. Tổng hợp bột HAp Bột HAp được tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt với cơ chất ban đầu là CaCl2 và Na2HPO4 và có bổ sung hai chất hoạt động bề mặt khác nhau là P123 và CTAB. Quy trình thí nghiệm được thực hiện ở phòng thí nghiệm của bộ môn Vô cơ Đại cương, trường ĐH Bách Khoa Hà Nội. 6 - Với chất hoạt động bề mặt P123, luận án khảo sát hàm lượng tối ưu để tổng hợp được bột HAp có kích thước bé và độ đồng nhất cao - Với chất hoạt động bề mặt CTAB, luận án khảo sát hàm lượng tối ưu và thời gian thủy nhệt để tổng hợp được bột HAp có kích thước bé và độ đồng nhất cao. 2.3. Tổng hợp composit HAp/PDLLA Khuôn định dạng composit HAp/PDLLA đã được tổng hợp tại phòng thí nghiệm BM Vô cơ Đại cương, ĐH Bách Khoa Hà Nội. Composit HAp/PDLLA được chế tạo theo phương pháp đổ dung môi rửa hạt với NaCl là hạt dùng để tạo lỗ. - Với hai dung môi khác nhau: chloroform và 1,4 dioxane - Với tỉ lệ HAp/PDLLA khác nhau 0%, 10%, 20%, 30% 2.4. Các phƣơng pháp xác định đặc trƣng Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) đo trên máy Siemens D5005 sử dụng bức xạ CuKα (λ= 0,15406 nm), góc quay từ 10-70 o . Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR) được ghi trên máy Nicolet 6700 spectrometer sử dụng kỹ thuật ép viên KBr trong khoảng 4000-400 cm-1 với độ phân giải 4 cm-1 Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) được đo trên thiết bị S- 4800 Hitachi Nhật Bản và Supra 40, Zeiss, Đức Phương pháp phân tích bằng phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS) được xác định thông qua thiết bị đo EDS Nova NanoSEM 450, FEI và JEOL JED-2300 với chương trình phân tích định lượng ZAF Phương pháp đo độ xốp của khuôn định dạng được đo theo phương pháp bão hòa chất lỏng 2.5. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính của vật liệu Thí nghiệm in-vitro ngâm trong dung dịch SBF được thực hiện tại phòng thí nghiệm BM Vô cơ Đại cương và BM Vi sinh-hóa sinh- sinh học phân tử, ĐH Bách Khoa Hà Nội Thí nghiệm nuôi với tế bào MG63: - Đánh giá khả năng phát triển của tế bào bằng phương pháp AlamarBlue - Đánh giá khả năng bám dính di trú của tế bào qua kính hiển vi laze đồng tiêu cự Phân tích thống kê 7 Các kết quả được đo nhiều lần và lấy giá trị trung bình. Phần mềm Anova được sử dụng để phân tích thông kê ,với giá trị P < 0,05 là giá trị có sự khác biệt giữa các mẫu. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Các kết quả nghiên cứu đặc trƣng, thành phần bột HAp tổng hợp 3.1.1. Các kết quả đặc trƣng bột HAp tổng hợp phƣơng pháp thủy nhiệt sử dụng chất hoạt động bề mặt P123 3.1.1.1. Kết quả khảo sát hình thái của các mẫu bột HAp phương pháp SEM Hình thái của mẫu HAp tổng hợp với các nồng độ khác nhau P123 được xác định thông qua hình ảnh SEM. Hình ảnh cho thấy các hạt HAp ở các mẫu đều có dạng hình que với bề mặt trơn, nhẵn. Điều này cho thấy nồng độ chất hoạt động bề mặt P123 không ảnh hưởng đến hình dạng của hạt HAp tổng hợp được (hình 3.1). Ảnh SEM của mẫu 2P123 cho thấy (hình 3.1 c), hạt HAp của mẫu này có kích thước bé nhất và đồng đều. Hình 3.1. Các ảnh SEM của các mẫu bột HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt với hàm lượng chất hoạt động bề mặt P123 khác nhau: (a) 0g P123, (b) 1g P123, (c) 2g P123, (d) 3g P123 Kích thước hạt HAp của các mẫu đo bằng phần mềm ImageJ được trình bày trong Bảng 3.1. Kết quả cho thấy khi nồng độ P123 tăng lên thì kích thước hạt tổng hợp được giảm. Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nồng độ P123 thì sản phẩm thu được có kích thước to hơn và hình dạng hạt không đồng đều. Hình ảnh của mẫu 3P123 đã cho thấy điều này (hình 3.1 d), bán kính trung bình của hạt HAp là 82 nm, chiều dài là 365 nm. Sự có mặt của P123 với khối lượng 2g là tối ưu cho quá trình tổng hợp bột nano HAp có hình dạng que, độ đồng đều cao và kích thước hạt tương tự với HAp trong tự nhiên. Bảng 3.1. Một số đặc điểm của các mẫu bột HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt sử dụng chất hoạt động bề mặt P123 2P123 100 nm 3P123 d 8 Mẫu Đường kính trung bình của hạt (nm) Độ dài trung bình của hạt (nm) Hình dạng hạt 0P123 103±26 585±315 Hình que 1P123 74±25 383±152 Hình que 2P123 28±5 120±32 Hình que 3P123 82 365 Hình que 3.1.1.2. Kết quả phân tích XRD của mẫu bột HAp Giản đồ nhiễu xạ tia X (hình 3.3) cho thấy các pic đặc trưng của HAp tương ứng với các mặt (002), (102), (210), (211), (112), (300), (202) và (301), không quan sát thấy các pic đặc trưng của các pha khác (như tricalcium photphat, tetracalcium photphat). Điều này khẳng định sản phẩm tổng hợp được chỉ có HAp. Hình 3.2. Giản đồ XRD của mẫu bột nano HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt sử dụng chất hoạt động bề mặt P123: (a) 0P123, (b)1P123 và (c)2P123 3.1.1.3. Kết quả phân tích FTIR của mẫu bột HAp Phổ FTIR (Hình 3.4) cho thấy, phổ của các mẫu không có sự khác biệt rõ ràng và xuất hiện các phổ đặc trưng cho các nhóm trong cấu trúc HAp. Kết quả phân tích khẳng định mẫu có chứa HAp. C ư ờ n g đ ộ 2θ Đ ộ t ru y ền q u a, % Tần số dao động, cm -1 9 Hình 3.3. Phổ FTIR của bột nano HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt với hàm lượng chất hoạt động bề mặt P123 khác nhau: (a) 0P123, (b) 1P123, (c) 2P123 3.1.1.4. Kết quả phân tích EDS của mẫu bột HAp Phổ EDS và thành phần trong mẫu 2P123 được chỉ ra trong hình 3.5 và bảng 3.2 cho thấy ba nguyên tố chính cấu tạo nên hạt HAp là O, P và Ca với tỉ lệ khối lượng tương ứng là 44.17±4.52, 16,14±1,23 và 34,64±3,05%. Tỷ lệ Ca/P trong tất cả các mẫu HAp nằm trong khoảng 1,55 đến 1,66 gần đúng với giá trị tính theo công thức hóa học là 1,67, điều này cho thấy các mẫu HAp được đã được tổng hợp thành công. Hình 3.4. Phổ EDS của bột nano HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt với hàm lượng chất hoạt động bề mặt P123là 2g 3.1.1.5. Các kết quả xác định tính chất bề mặt của các mẫu bột HAp Một số tính chất bề mặt của các mẫu HAp được phân tích theo phương pháp hấp phụ và nhả hấp phụ nitơ. Đường đẳng nhiệt hấp phụ và nhả hấp phụ N2 của các mẫu cho thấy, diện tích bề mặt riêng BET của các mẫu HAp không có sự khác biệt đáng kể khi thay đổi nồng độ P123 (Hình 3.7). Các mẫu đều có diện tích bề mặt riêng trong khoảng 14-27m2.g-1, nhưng cấu trúc lỗ có sự khác biệt. C ư ờ n g đ ộ P/P o T h ể tí ch l ỗ , m 3 /g S T P 10 Hình 0.5. Đường đẳng nhiệt hấp phụ và nhả hấp phụ nitơ của các mẫu bột nano HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt với hàm lượng chất hoạt động bề mặt P123 khác nhau: (a) 0P123, (b) 1P123, (c) 2P123 3.1.1.6. Cơ chế hình thành hạt HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt sử dụng chất hoạt động bề mặt P123 Cơ chế hình thành HAp có thể được giả định dựa trên các kết quả đạt được. Khi có mặt của P123, ở pH cao, phản ứng giữa dung dịch CaCl2 và Na2HPO4 tạo HAp. Trong dung dịch, P123 tạo thành mixen hình trụ có kích thước nano và hoạt động như những “nanoreactor”. Ở nồng độ P123 thấp, có nhiều nhân HAp không được liên kết với mixen, do đó không được định hướng phát triển nên sẽ tạo ra các tinh thể HAp lớn và không đồng đều. Ở nồng độ P123 cao, kích thước của các hạt mixen sẽ tăng do đó sẽ tạo ra các hạt HAp có kích thước lớn. 3.1.1.7. Các kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của bột HAp Các hạt HAp dưới dạng bột sẽ không thích hợp khi thí nghiệm ngâm mẫu trong dung dịch SBF, bởi vậy, hoạt tính sinh học của mẫu HAp đã được đánh giá thông thí nghiệm in-vitro ngâm mẫu dạng màng composit HAp/PDLLA trong dung dịch SBF. Hình 3.6. Ảnh SEM của màng HAp/PDLLA sau khi ngâm trong SBF Kết quả từ ảnh SEM sau 1, 3, 7 ngày ngâm trong dung dịch SBF cho thấy, lớp khoáng hình thành trên bề mặt màng F-2P rất nhanh chỉ sau 1 ngày ngâm trong SBF. Kết quả này chứng tỏ F-2P có hoạt tính sinh học cao hơn các mẫu còn lại. Dựa trên phân tích EDS và tỉ lệ Ca/P (Bảng 3.5), các khoáng OCP và TCP có thể đã được tạo thành trên bề mặt của F-2P sau 1 và 3 ngày ngâm trong SBF. Bảng 3.2. Tỉ lệ Ca/P của các mẫu sau khi ngâm trong SBF Mẫu 1 ngày 3 ngày 7 ngày F-0P 1,55 F-2P 1,36 1,47 1,57 (a3) 0P123 0,2µm Ngày 7 0,2µm Ngày 7 (c3) 2P123 11 Các mẫu đã công bố trong [187] chỉ xuất hiện lớp apatit sau 45 ngày. Hơn nữa, sau 7 ngày ngâm, hình thái của lớp apatit giống xương hình thành rất đặc biệt giống như san hô đã được quan sát thấy. Dựa trên sự so sánh và các kết quả đạt được, có thể thấy kích thước và hình dạng của hạt nano HAp đóng vai trò then chốt quyết định hoạt tính sinh học và khả năng tương thích sinh học trong gia đoạn phát triển tạo apatit giống xương. 3.1.2. Các kết quả đặc trƣng bột HAp tổng hợp bằng phƣơng pháp thủy nhiệt sử dụng chất hoạt động bề mặt CTAB 3.1.2.1. Các kết quả khảo sát hình thái của các mẫu HAp bằng phương pháp SEM Quan sát trên ảnh SEM, ta thấy tất cả các mẫu HAp tổng hợp được đều có dạng hình que với kích thước nano. Kích thước hạt HAp của các mẫu đo bằng phần mềm ImageJ được trình bày trong Bảng 3.7. Hình 3.7. Ảnh SEM của các mẫu bột HAp được tổng hợp với các nồng độ khác nhau của chất hoạt động bề mặt CTAB Bảng 3.3. Một số đặc trưng và hình thái hạt nano HAp được tổng hợp với các hàm lượng khác nhau của chất hoạt động bề mặt CTAB Các kết quả phân tích khẳng định rằng, khi thay đổi nồng độ chất hoạt động bề mặt CTAB hình thái của hạt nano HAp không thay đổi, nhưng có ảnh hưởng đến chiều dài của hạt. Với lượng CTAB bổ sung vào là 0,64 g, hạt nano HAp tổng hợp được có kích thước bé và đồng đều nhất. Chúng tôi đã sử dụng lượng CTAB thêm vào là 0,64g để tổng hợp các mẫu HAp với các thời gian thủy nhiệt khác Mẫu Đường kính trung bình (nm) Chiều dài trung bình (nm) Tỷ lệ bề mặt Hình thái CT 41 ± 7 133 ± 32 3.24 Hình que 1CT 42 ± 6 145 ± 32 3.45 Hình que 2CT 44 ± 7 150 ± 40 3.41 Hình que 4CT 43 ± 9 158 ± 43 3.67 Hình que 2CT 4CT 12 nhau, để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian thủy nhiệt đến hình thái hạt Hap. Hình 3.14 là ảnh SEM của các mẫu bột HAp tổng hợp với các khoảng thời gian thủy nhiệt là 6, 12 và 18 giờ. Từ ảnh SEM, sử dụng phần mềm ImageJ, kết quả đo cho thấy chiều dài hạt tăng từ 76 đến 133 nm khi thời gian thủy nhiệt tăng từ 6 đến 18 giờ. Quan sát trên ảnh SEM ta thấy mẫu bột tổng hợp với thời gian thủy nhiệt là 12 giờ có kích thước hạt HAp bé và đồng đều nhất. Hình 3.8. Ảnh SEM của các mẫu bột HAp được tổng hợp với hàm lượng CTAB 0,64 gam và các khoảng thời gian thủy nhiệt khác nhau 6 giờ (a), 12 giờ (b), 18 giờ (c) 3.1.2.2. Kết quả phân tích EDS của các mẫu HAp Kết quả phân tích phổ EDS (hình 3.16) cho thấy tỷ lệ thành phần của các nguyên tố chính có trong mẫu HAp là O (41,89 %), Ca (34,45% ) và P (17,13%). Tỷ lệ Ca/P của các mẫu HAp nằm trong khoảng 1,55- 1,59 gần với giá trị trên lý thuyết 1,67 tính theo công thức hóa học. Điều này khẳng định, các mẫu HAp đã được tổng hợp thành công. Hình 3.9. Phổ EDS của mẫu nano HAp tổng hợp với 0,64 g CTAB và thủy nhiệt trong 12 giờ CT(6) CT(12) keV C ư ờ n g đ ộ 13 3.1.2.3. Kết quả phân tích FTIR của các mẫu HAp Hình 3.10. Phổ FTIR của các mẫu HAp tổng hợp với các nồng độ CTAB khác nhau: 4,64 g (a), 1,64g (b), 0,64g (c) Phổ FTIR của mẫu CT, 1CT và 4CT được thể hiện trên hình 3.17. Kết quả trên hình cho thấy, phổ của các mẫu không có sự khác biệt nhiều và đều có các phổ đặc trưng cho các nhóm trong cấu trúc HAp. 3.1.2.4. Kết quả phân tích XRD của các mẫu HAp Hình 3.11. Phổ XRD của các mẫu HAp tổng hợp với các nồng độ CTAB khác nhau: 0,64g (a), 1,64g (b), 4,64 g (a) Kết quả phân tích XRD các mẫu CT, 1CT và 4CT (hình 3.18) cho thấy các pic đặc trưng của HAp ở các vị trí 2θ = 25,90o, 28,15 o , 28,70 o , 31,55 o , 32,15 o , 32,65 o và 34,0 o . Trong phổ nhiễu xạ không xuất hiện các pic đặc trưng cho β-tricanxi photphat, tetra- canxi photphat. Vì vậy, kết quả XRD kết hợp với kết quả FTIR phân tích ở trên có thể khẳng định các mẫu HAp tổng hợp được là đơn pha. 3.1.2.5. Cơ chế hình thành hạt HAp theo phương pháp thủy nhiệt có bổ sung chất hoạt động bề mặt CTAB Kích thước hạt mixen tăng lên khi nồng độ CTAB tăng, dẫn đến kích thước hạt HAp tăng. Vì vậy, với lượng CTAB là 0,64 g Đ ộ t ru y ền q u a, % Tần số dao động, cm -1 C ư ờ n g đ ộ 2θ 14 tương đương với nồng độ 10,61mM là nồng độ chất hoạt động bề mặt thích hợp để tạo ra các hạt HAp có kích thước và hình dạng giống với khoáng xương. Với thời gian thủy nhiệt kéo dài, các hạt mixen hình cầu kết hợp với nhau để tạo thành các mixen hình que. Chính vì vậy, thời gian thủy nhiệt rất quan trọng nó quyết định độ dài và sự đồng đều của các hạt nano HAp tổng hợp được.Với lượng CTAB là 0,64g và thời gian thủy nhiệt là 12 h là điều kiện thích hợp để tạo ra các hạt nano HAp có kích thước bé và độ đồng đều nhất. 3.1.2.6. Các kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của bột HAp Với độ đồng đều cao, kích thước bé (đường kính 41 nm, chiều dài 125 nm) mẫu CT(12) được chọn để thử hoạt tính sinh học. Lớp apatit hình thành trên màng chứa các hạt nano HAp của mẫu CT(12) có hình thái giống với lớp màng có chứa các hạt nano HAp của mẫu 2P123 (hình 3.11). Hình thái lớp khoáng này là hình thái đặc trưng cho lớp apatit giống với xương [179]. Sau 7 ngày lớp apatit đã hình thành hoàn toàn trên màng chứa các hạt nano HAp của mẫu CT(12). Điều này khẳng định mẫu CT(12) cũng có hoạt tính sinh học cao giống với mẫu 2P123. Tuy nhiên, mẫu 2P123 có kích thước bé gần giống với HAp có trong xương tự nhiên hơn mẫu CT(12) nên chúng tôi sẽ sử dụng mẫu 2P123 để nghiên cứu tổng hợp khuôn định dạng composit HAp/PDLLA. Hình 3.12. Ảnh SEM của màng HAp/PDLLA (được phủ bột HAp có thời gian thủy nhiệt 12h) trước và sau khi ngâm trong SBF 3 và 7 ngày 3.2. Các kết quả nghiên cứu các đặc trƣng, hoạt tính và tính tƣơng thích sinh học của khuôn định dạng composit HAp/PDLLA 3.2.1. Các kết quả nghiên cứu đối với khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp với dung môi 1, 4-dioxan 500 nm 7 ngày g 100 nm 7 ngày h 15 Hình 3.13. Ảnh khuôn định dạng composit HAp/PDLLA được tổng hợp bằng phương pháp đổ dung môi rửa hạt sử dụng dung môi 1,4-dioxan: (a) mẫu S3 có tỷ lệ HAp là 20%, (b) mẫu S4 có tỷ lệ HAp là 30% Bốn mẫu khuôn định dạng được tổng hợp với tỷ lệ HAp/PDLLA lần lượt là 0, 10, 20, 30% sử dụng dung môi 1,4 dioxan để hòa tan polyme PDLLA và được ký hiệu tương ứng là S1, S2, S3, S4. Các mẫu có hình dạng cố định với độ dày 2 mm (hình 3.21) và cấu trúc lỗ xốp 3.2.1.1. Các kết quả khảo sát hình thái bề mặt của các mẫu khuôn định dạng composit bằng phương pháp SEM Kết quả trên ảnh SEM (hình 3.23) cho thấy hình thái bề mặt của khuôn định dạng trở nên thô ráp hơn, độ dày thành lỗ xốp tăng khi thành phần HAp tăng. Hình 3.14. Ảnh SEM của khuôn định dạng được tổng hợp với các tỷ lệ HAp khác nhau Phần mềm ImageJ được sử dụng để đo kích thước lỗ của các mẫu khuôn định dạng. Kết quả đo kích thước lỗ được thể hiện trên Bảng 3.11. Bảng 3.4. Thành phần và kích thước lỗ xốp của các mẫu khuôn định dạng Mẫu Khối lượng HAp (g) Khối lượng PDLLA (g) Tỷ lệ HAp/PDLLA Kích thước lỗ (µm) S1 0 0.455 0 274 ± 76 S2 0.0455 0.455 10 183 ± 60 S3 0.091 0.455 20 122 ± 58 S4 0.136 0.455 30 117 ± 60 (a) (b) 2 mm (a1) S1 (b1) S2 (d) S4 16 Kết quả cho thấy, tỷ lệ HAp càng cao thì kích thước lỗ trên khuôn định dạng HAp/PDLLA càng nhỏ và độ dày thành lỗ càng tăng. 3.2.1.2. Các kết quả phân tích FTIR Kết quả phân tích phổ FTIR(hình 3.25) của composit HAp/PDLLAcho thấy sự dịch chuyển pic của nhóm (C=O) của PDLLA từ vùng 1749 cm-1trong phổ S1sang vùng 1754 và 1752 cm-1 trong phổ tương ứng của S3 và S4. Pic của liên kết C-H xuất hiện trong vùng 2999 và 2951 cm -1 trong phổ S1 cũng bị dịch chuyển sang vùng 2996 và 2946 cm -1 , 2998 và 2948 cm -1 tương ứng trong phổ của mẫu S3 và S4. Kết quả này cho thấy, liên kết hydro đã được hình thành giữa nhóm OH của HAp và nhóm C=O của PDLLA, các hạt nano HAp đã được cố định trên nền polyme PDLLA. Hình 3.15. Phổ FTIR của các mẫu: (a) mẫu bột HAp, (b) mẫu S3, (c) mẫu S4, (d) mẫu S1 3.2.1.3. Các kết quả phân tích EDS Kết quả phân tích phổ EDS cho thấy ba nguyên tố O, P, Ca là thành phần chủ yếu trong khuôn định dạng tổng hợp được với tỉ lệ tương ứng như sau: 45,03±1,63 %, 5,64±0,47 % và 9,58±0,52 %. Tỷ lệ Ca/P là 1,69 gần bằng với tỷ lệ trên lý thuyết 1,67. Kết quả này chứng tỏ các hạt nano HAp đã được liên kết thành công lên chất nền polyme trong khuôn định dạng composit. Đ ộ t ru y ền q u a, % Tần số dao động, cm -1 17 Hình 3.16. Phổ EDS của mẫu S4 3.2.1.4. Kết quả đo độ xốp Độ xốp của khuôn định dạng được đo theo phương pháp bão hóa chất lỏng. Kết quả cho thấy, các mẫu khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp được có độ xốp khá cao từ 80-89%. Với độ xốp này, các mẫu tổng hợp được sẽ tạo thuận lợi cho các tế bào bám dính, phát triển trong thí nghiệm in-vitro. Hình 3.17. Ảnh SEM của mẫu khuôn định dạng S3, S4 sau khi ngâm trong SBF 5 và 7 ngày Kết quả trên ảnh SEM (Hình 3.28) cho thấy sự phát triển hoàn toàn của lớp khoáng trên bề mặt S3 và S4 sau 7 ngày ngâm trong SBF. Hình 3.18. Ảnh SEM của mẫu S1, S2 sau khi ngâm trong SBF 5 và 7 ngày Ảnh SEM của mẫu S1 và S2 (Hình 3.29) cho thấy một vài đám hoa san hô xuất hiện trên mẫu S2 và S1 sau 7 ngày ngâm. Các C ƣ ờ n g đ ộ keV 1µm (a3) S3 7 ngày 1µm (b1) S4 7 ngày 500 nm A Day 5 (a1) S1 5 ngày C 300 nm 7 day 7 ngày (b) S2 18 kết quả này cho thấy với tỷ lệ HAp từ 20-30% khuôn định dạng HAp/PDLLA có khả năng tạo apatit cao trong thí nghiệm in-vitro. Kết quả phân tích phổ EDS cho thấy thành phần chính có mặt trong lớp khoáng là các nguyên tố Ca, P và O. Tỷ lệ Ca/P trong lớp khoáng lần lượt là 1,24 và 1,55 tương ứng sau 5 và 7 ngày ngâm trong SBF. Kết quả phân tích ở trên cho thấy sự hình thành lớp apatit giống xương được quan sát thấy sau 7 ngày ngâm trong SBF với vật liệu composit HAp/PDLLA (đã tổng hợp được trong luận án). Trong khi đó, sự hình thành lớp apatit tương tự như thế được quan sát thấy sau thời gian dài hơn từ 14 đến 21 ngày ngâm với màng nano HAp/PDLLA [192] và Akermanite/PDLLA [193]. Phần khoáng trong các mẫu đã công bố trước đây có hình thái và thành phần khác xa mẫu HAp trong luận án và trong xương tự nhiên. Dựa trên kết quả so sánh và các kết quả đạt được, có thể thấy kích thước và hình dạng của hạt nano HAp đóng vai trò then chốt quyết định hoạt tính sinh học và khả năng tương thích sinh học trong gia đoạn phát triển tạo apatit giống xương. 3.2.1.6. Các kết quả nghiên cứu khả năng tương thích sinh học của khuôn định dạng HAp/PDLLA với tế bào MG63 Kết quả thí nghiệm AlamarBlue được thể hiện trên Hình 3.32. Sự khử màu alamarBlue cho biết sự tồn tại và phát triển của tế bào. Hình 3.19. Khả năng phát triển của tế bào MG63 trong môi trường chứa các mẫu khuôn định dạng được tổng hợp với dung môi 1,4-dioxan (S1, S2, S3 và S4) sau 3, 5 và 7 ngày Kết quả thí nghệm cho thấy cường độ huỳnh quang của các mẫu thí nghiệm cao hơn mẫu đối chứng và tăng khi thời gian nuôi C ƣ ờ n g đ ộ h u ỳ n h q u a n g (A .U ) Thời gian nuôi cấy (ngày) Mẫu đối chứng 19 cấy tăng từ 5 đến 7 ngày nuôi. Các mẫu có bổ sung 10 % HAp, cường độ huỳnh quang cao hơn các mẫu còn lại. Điều này chứng tỏ tất cả các mẫu đều có sự tương thích tốt với tế bào đặc biệt những mẫu có bổ sung HAp. Sự có mặt của HAp đã thúc đẩy sự phát triển của các tế bào trên khuôn định dạng. Tuy nhiên, tỷ lệ HAp cao trong mẫu khuôn định dạng có thể ức chế sự phát triển của tế bào. Kết quả nghiên cứu sự bám dính và phát triển của tế bào lên khuôn định dạng qua kính hiển vi laser đồng tiêu cự được thể hiện ở Hình 3.33. Quan sát hình ảnh các mẫu sau 5 ngày và 7 ngày nuôi cấy ta thấy số lượng tế bào trên các mẫu tăng lên đáng kể, các mẫu đều xuất hiện các tế bào bám dính, phát triển và phân bố. Đặc biệt, trên mẫu S4 quan sát thấy một lượng lớn tế bào cùng với mạng lưới cytoskeleton phát triển dày đặc sau 7 ngày. Khi thời gian nuôi cấy tăng lên, S4 thể hiện tính tương thích sinh học cao hơn các mẫu mà có tỷ lệ HAp thấp (thể hiện ở sự bám dính tốt của tế bào và sự phân bố tốt của mạng lưới cytoskeleton). Hình 3.20. Sự bám dính và phát triển của tế bào MG63 trên khuôn định dạng (S1, S2, S3 và S4) sau 5 và 7 ngày 3.2.2. Các kết quả nghiên cứu đối với khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp với dung môi chloroform 3.2.2.1. Các kết quả khảo sát hình thái bề mặt của các mẫu khuôn định dạng composit bằng phương pháp SEM Hình 3.34 cho thấy hình thái và cấu trúc lỗ của các mẫu khuôn định dạng F1, F2, F3 cũng giống với các mẫu khuôn định 5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày 20 dạng S1, S2, S3 và S4 được tổng hợp sử dụng dung môi 1, 4 dioxan. Khi tăng tỷ lệ HAp lên 10 và 30%, hình thái bề mặt mẫu F2, F3 càng thô rắp và thành lỗ xốp càng dày lên. Kích thước lỗ của các mẫu được đo trên ảnh SEM bằng phần mềm ImageJ được tổng hợp trong Bảng 3.15 Hình 3.21. Ảnh SEM của các mẫu khuôn định dạng composit HAp/PDLLA được tổng hợp với dung môi chloroform (F1, F2 và F3) Bảng 3.5. Thành phần và kích thước lỗ xốp của các mẫu khuôn định dạng tổng hợp với dung môi chloroform Mẫu Tỷ lệ HAp/PDLLA Kích thước lỗ (µm) F1 0% 244.97 ± 91 F2 10% 176.611 ± 67 F3 30% 129.309 ± 41 Các kết quả phân tích chỉ ra rằng tỷ lệ HAp cũng ảnh hưởng đến kích thước lỗ trên các mẫu khuôn định dạng F1, F2 và F3 sử dụng dung môi chloroform. So sánh kích thước lỗ mẫu F1, F2 và F3 với các mẫu tương ứng cùng tỷ lệ HAp là S1, S2 và S4, kết quả phân tích thống kê cho thấy mẫu F1, F2, F3 không có sự khác biệt đáng kể so với mẫu S1, S2, S4 (P>0,05). Như vậy, khi thay dung môi 1,4 dioxan bằng dung môi chloroform trong tổng hợp khuôn định dạng HAp/PDLLA không làm thay đổi hình thái và kích thước lỗ của các khuôn định dạng. 3.2.2.2. Các kết quả phân tích XRD Kết quả phân tích phổ XRD cho thấy phổ của mẫu khuôn định dạng composit HAp/PDLLA có xuất hiện vạch nhiễu xạ đặc trưng cho HAp ở vùng 2θ = 32o, trong khi trên mẫu polymer PDLLA không có. Điều này chứng tỏ, các hạt nano HAp đã được gắn lên pha polymer. (a1) F1 (b1) F2 (c1) F3 21 Hình 3.22. Giản đồ của mẫu khuôn định dạng PDLLA và HAp/PDLLA sử dụng dung môi chloroform 3.2.2.3. Kết quả đo độ xốp Độ xốp của các mẫu khuôn định dạng F1, F2 và F3 cũng được đo theo phương pháp bão hóa chất lỏng đã được trình bày trong mục 2.4.5. Kết quả đo độ xốp của các mẫu được thể hiện trong bảng 3.16 và hình 3.36. Bảng 3.6. Độ xốp của các khuôn định dạng tổng hợp sử dụng hai dung môi khác nhau chloroform và 1, 4-dioxan Tỷ lệ HAp/PDLLA 1,4-dioxan Chloroform 0% 89.39±2.86 % 83 ± 3% 10% 84.46±2.17 % 76 ± 2% 30% 80.18±0.78 % 73 ± 2% Kết quả đo cho thấy, độ xốp của các khuôn định dạng sử dụng dung môi chloroform cũng giảm khi tỷ lệ HAp tăng. Lần lượt so sánh các mẫu F1, F2 và F3 với các mẫu tương ứng cùng tỷ lệ HAp là S1, S2 và S4. Kết quả phân tích cho thấy độ xốp của mẫu F1 (độ xốp trung bình 83%) và S1 (độ xốp trung bình 89,39%) không có sự khác biệt (P>0,05), độ xốp của mẫu F2 và F3 có sự khác biệt rõ rệt so với độ xốp của mẫu S2 (độ xốp trung bình 84,46 %) và S4 (độ xốp trung bình 80,18%) (P<0,05). Độ xốp của các mẫu tổng hợp với dung môi chloroform giảm so với các mẫu tổng hợp với 1, 4 dioxan. Nguyên nhân có thể được giải thích là do sự khác biệt về tốc độ bay hơi của hai dung môi 1, 4-dioxan và chloroform. 3.2.2.4. Các kết quả nghiên cứu khả năng tương thích sinh học của khuôn định dạng HAp/PDLLA được tổng hợp với dung môi chloroform. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 20 40 60 80 100 120 140 Li n( C ps ) 2-Theta scale PDLLA HAp/PDLLA C ư ờ n g đ ộ 2θ 22 Hình 3.23. Khả năng tồn tại phát triển của tế bào MG63 trong môi trường có các khuôn định dạng được tổng hợp với dung môi chloroform (F1, F2 và F3) sau 3, 5 và 7 ngày Kết quả nghiên cứu sự phát triển của tế bào trên khuôn định dạng bằng thí nghiệm alamaBlue được thể hiện trên hình 3.37. Phân tích tín hiệu huỳnh quang cho thấy các giá trị huỳnh quang đều tăng ở các mẫu F1, F2 và F3 trong thời gian nuôi tế bào từ 3 đến 7 ngày. Sau 7 ngày, mẫu F1 có số tế bào phát triển tốt hơn ở mẫu F2 và F3. Điều này có thể là do độ xốp và kích thước lỗ của F1 (83% và 245 µm) lớn hơn của F2 (76% và 177 µm) và F3 (72% và 129%). So sánh giữa các mẫu được tổng hợp với 1, 4 dioxan, mẫu S2 (với 10% HAp) với độ xốp và kích thước lỗ trung bình 84% và 183 µm có sự phát triển tế bào tốt nhất. Như vây, độ xốp và kích thước lỗ trung bình trong khoảng 183-245 µm và 83-84% là tốt cho sự phát triển của tế bào. Độ xốp và kích thước lỗ quá lớn hoặc quá bé đều ảnh hưởng đến phát triển của tế bào. Để nghiên cứu sự phát triển của tế bào trên khuôn định dạng, các mẫu khuôn định dạng sau khi nuôi cấy với tế bào được quan sát qua kính hiển vi laser đồng tiêu cự. Kỹ thuật được thực hiện tương tự với mẫu S1, S2, S3 và S4 đã trình bày ở trên. Kết quả trên Hình 3.38 cho thấy sự bám dính và phân bố của tế bào MG63 trên các khuôn định dạng sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. Thời gian nuôi cấy (ngày) C ư ờ n g đ ộ h u ỳ n h q u an g (A .U ) Mẫu đối chứng 23 Hình 3.24. Sự bám dính và phát triển của tế bào MG63 trên khuôn định dạng (F1, F2 và F3) sau 5 và 7 ngày Ở ngày thứ 5, trên mẫu F1, tế bào đã phát triển và phân bố khắp bề mặt, mạng lưới cytoskeleton phát triển mãnh liệt; trong khi đó trên mẫu F2, tế bào và sợi cytoskeleton phát triển thành cụm; trên mẫu F3, tế bào và sợi cytoskeleton phát triển rải rác. Ở ngày thứ 7, các sợi cytoskeleton trên mẫu F2 và F3 phát triển có hướng và có xu thế kết chặt lại với nhau, trong khi đó trên mẫu F1, các sợi này thường tách và lan rộng ra xung quanh tế bào. Điều này cũng đã được giải thích là do sự có mặt của HAp. So sánh khả năng bám dính của tế bào trên các mẫu F1, F2 và F3 với các mẫu tương ứng cùng tỷ lệ HAp là S1, S2 và S4 cho thấy sự bám dính, phát triển và phân bố của tế bào trên các mẫu được tổng hợp với chloroform chậm hơn so với các mẫu được tổng hợp với 1,4-dioxan. KẾT LUẬN Từ những kết quả nghiên cứu trong luận án chúng tôi rút ra những kết luận chính sau: 1. Đã tổng hợp thành công bột nano HAp bằng phương pháp thủy nhiệt có sử dụng hai chất hoạt động bề mặt khác nhau là P123 và CTAB. Các kết quả nghiên cứu cấu trúc, hình thái học, thành phần và hoạt tính sinh học cho thấy: Day 5 Day 7 100 µm (a) 100 µm (b) F1 5 ngày 7 ngày Day 5 Day 7 100 µm (e) 100 µm (f) F3 7 ngày 5 ngày 24 - Với hàm lượng P123 sử dụng là 2g sản phẩm HAp thu được có kích thước tương tự HAp trong xương tự nhiên đường kính trung bình 28 nm chiều dài trung bình 120 nm, tỷ lệ Ca/P là 1,66 - Với hàm lượng CTAB là 0,64 g và thời gian thủy nhiệt là 12 giờ, sản phẩm thu được có kích thước hạt bé nhất, có hình dạng thanh tương đối đồng đều, đường kính trung bình 41 nm chiều dài trung bình 125 nm, tỷ lệ Ca/P là 1,55. - Hai mẫu bột nano HAp này đều thể hiện hoạt tính sinh học cao khi ngâm trong dung dịch SBF, lớp apatit được hình thành trong thời gian ngắn sau 7 ngày ngâm trong dung dịch SBF, hình thái lớp apatit tạo thành đặc trưng cho lớp apatit giống xương. 2. Đã chế tạo thành công khuôn định dạng composit HAp/PDLLA có cấu trúc 3D xốp, bằng phương pháp đổ dung môi rửa hạt với chất tạo lỗ là NaCl, sử dụng hai dung môi khác nhau là 1,4- dioxan và chloroform, tỷ lệ HAp/PDLLA khác nhau là 0, 10, 20, 30%. Các nghiên cứu khảo sát hình thái, cấu trúc, độ xốp, hoạt tính sinh học và khả năng tương thích với tế bào MG63 của các khuôn định dạng cho thấy: - Khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp được có cấu trúc 3D xốp, độ dày 2 mm, độ xốp cao > 70% với kích thước lỗ xốp dao động trong khoảng 117-254 µm. - Các mẫu khuôn định dạng với tỷ lệ HAp từ 20-30% thể hiện hoạt tính sinh học cao khi ngâm trong dung dịch SBF, thời gian hình thành lớp apatit giống xương sau 7 ngày ngâm trong dung dịch SBF. - Các mẫu khuôn định dạng đều có khả năng tương thích sinh học với tế bào MG63. Độ xốp và kích thước lỗ trung bình trong khoảng 83-84% và 183-245 µm là tốt cho sự phát triển của tế bào MG63.