Tổng quan về enzyme amylase

iệt độ của khối tăng lên, do đó cần phải chú ý tới đảo trộn khối hạt. Hoạt động của Enzyme : trong khối hạt, Enzyme ở dạng liên kết và chúng được chuyển sang trạng thái hoạt động khi hạt nảy mầm. Ngoài ra còn có một số Enzyme được tổng hợp mới. Các Enzyme hoạt động trong quá trình nảy mầm của hạt lúa . - α-Amylase : Enzyme này không hoàn toàn hoạt động ở hạt chín. Hoạt tính của Enzyme α-Amylase tăng dần trong quá trình nảy mầm của hạt. Ở nhiệt độ 15 - 170C, hoạt tính của α-Amylase đạt đến cực đại vào ngày thứ 10 – 12 của quá trình nảy mầm; Ở nhiệt độ 28 – 300C, hoạt tính của α-Amylase đạt cực đại vào ngày 5 – 8 . - β-Amylase : Enzyme β-Amylase tồn tại ở dạng liên kết và một số ít hoạt động rất yếu trong hạt chín hoàn toàn. Hoạt động này tăng nên trong quá trình hạt nảy mầm. Thời gian để hoạt động của Enzyme này đạt đến cực đại cũng tuỳ thuộc vào nhiệt độ . - Enzyme Oxy Hoá Khử : Trong quá trình nảy mầm , hoạt động của các ezyme này tăng nên mạnh do đó hoạt động hô hấp của hạt cũng gia tăng. Hoạt động hô hấp của hạt mạnh nhất vào ngày thứ 4–6 ở nhiệt độ 27 - 280C và cường độ hô hấp phụ thuộc vào độ ẩm của hạt, nhiệt độ vào lượng O2 cung cấp. * Phương pháp tinh sạch Amylase: Có hai phương pháp - Tinh sạch Enzyme Amylase bằng phương pháp sắc ký - Thu nhận Enzyme Amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (polyacrylamide Gel Electrophoresis – PAGE) 3. Thu nhận Enzyme từ vi sinh vật: Nguồn thu nhận chủ yếu là : nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn… Khi nuôi VSV tạo Amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ Enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Ở một số VSV, quá trình tổng hợp Amylase tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ Enzyme phụ thuộc vào tuyến tính của sự tăng khối. * Yêu cầu chung Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập, và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hoá các điều kiện nuôi. Như vậy sự tổng hợp Enzyme Amylase không những phụ thuộc vào tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu. Ngoài các yếu tố hoá học (thành phần môi trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của quá trình nuôi cấy cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp Enzyme Amylase. Trong các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các Enzyme Amylase trong quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi trường , tính chất cơ lý của môi trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… Là những yếu tố cơ bản tối quan trọng * Nuôi VSV tạo Amylase bằng phương pháp bề mặt: Yêu cầu đối với môi trường thành phần dinh dưỡng. Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi VSV tạo Amylase cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi VSV tạo Enzyme khác là tính hoàn thiện. Hầu hết các VSV tạo Amylase đều hấp thụ carbon chủ yếu ở các dạng hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin…), hyđro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử. Cấu tử chính của môi trường VSV tạo Amylase bằng phương pháp lên men bề mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi VSV không cần bổ sung thêm các chất khác nữa. Cám mì có 16–22% tinh bột, 10 – 12% protein, trong đó các amino acid quan trọng như methionine (0,19%), cystine (0,3%), arginine (1%), lysine (6%), tryptophan (0,3%), 3 – 4% chất béo, 10,3% celulose, các nguyên tố trơ (Na – 0.09% , K – 1% , Ca – 0.16% , P - 0.94% ) và các nguyên tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng 20% tinh bột 10 –15% chất béo, 10 – 14% protein, 8–16% celulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37 –5 9 %) Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của enzyme. Cám không được chứa tinh bột dưới 20 – 30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay vị đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%... Tuy là phế liệu của công nghiệp xay xát, nhưng cám cũng tương đối đắt tiền, hơn nữa trong quá trình nuôi VSV, các chất dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn. Cấu tử này thường là mầm mạch (15 – 20 %), trấu (2 – 5%), mùn cưa (5 - 10%)… Có thể dùng cặn bã canh trường rắn (sau khi cách ly Enzyme) là cấu tử chính của môi trường (Silova, Fenikxov) 1967, đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải tiệt trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai. Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 - 5atm trong vòng 4 -6 giờ, có thể thanh trùng bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin (40%) và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường. Độ ẩm tối thích cuả môi trường : Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích (đối với Asp.niger , Asp.awamort, Asp.flavus , Asp.arysee) của môi trường là 58 – 60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm mà tăng quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 – 55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như sự tạo Enzyme Amylase. Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường trong bình tam giác, trong tủ ấm phòng thí nghiệm hoạt lực Amylase cao nhất thu ở độ ẩm 65 –68%). Cần nhớ rằng khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối (trên các khay), thì độ ẩm môi trường không được vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ ẩm cao (việc phòng ngừa và hạn chế sự hư hỏng của canh trường) trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm sợi lại còn có ý nghĩa to lớn hơn đối với sự tạo thành Enzyme. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến sinh tổng hợp Enzyme Amylase như sau : Ảnh hưởng của việc giữ độ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-Amylase của Asp.ozysee nuôi bằng phương pháp bề mặt . Phương án thí nghiệm 20 giờ 34 giờ 42 giờ Độ ẩm % Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô Độ ẩm % Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô Độ ẩm % Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô Khay để hở 27,8 15.0 23.8 18.0 22.0 20.5 Khay đậy nắp 46,4 20.4 42.4 32.9 42.4 36.7 Qua bảng số liệu trên thấy rõ là hoạt lực α-Amylase của canh trường nuôi nấm sợi , khi bị hong khô giảm gần hai lần. Điều đó khẳng định sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích. Cần thông khí liên tục trong suốt thời kì sinh trưởng của VSV. Trong quá trình sinh trưởng của mình VSV tiêu thụ 25 – 35% chất dinh dưỡng của môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2 . Vì vậy cần phải thải nhiệt này bằng thông gió với không khí vô trùng có độ ẩm tương đối khoảng 100%. Chế độ thông khí có thể liên tục , gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên) tuỳ thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi , vào khoảng cách giữa các tầng khay và đĩa khay. Thường là giai đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4 - 5 lần thể tích không khí trên một thể tích phòng trong 1 giờ , còn ở giai đoạn thứ 2 là 30 – 60 thể tích không khí trên thể tích phòng nuôi/1 giờ, còn ở giai đoạn thứ 3 giảm đi chỉ còn 10 – 12 thể tích không khí . Nhiệt độ nuôi : Toàn bộ chu kì sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm 3 thời kỳ : + Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10 – 11 giờ đầu tiên, đối với vi khuẩn 3 – 4 giờ). Trong thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23 – 300C đối với nấm mốc và duy trì nhiệt độ 32–380C cho vi khuẩn. Độ ẩm tương đối của không khí là 96 - 100% . + Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vòng 4- 18giờ). Ở giai đoạn này nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý rất lớn. Kết quả là trong lớp sợi nấm đang mọc nhiệt độ tăng lên đến 37 - 400C , đôi khi cao hơn tới 470C. Vì vậy cần phải hạ nhiệt độ phòng nuôi giúp cho sợi nấm mọc đều và đẹp. Ở nhà máy người ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28 – 290C và độ ẩm cao vào phòng nuôi. + Thời kỳ tạo Enzyme Amylase mạnh mẽ (kéo dài từ 10 - 20 giờ). Trong thời kỳ này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự toả nhiệt giảm mạnh. Các Enzyme Amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Theo Rodxevits (Pozerur, 1967) trong một ngày đầu ở giai đoạn sinh trưởng thứ nhất, thứ hai, nấm mốc Asp.ozysee chỉ được tạo được 7,5 – 8% Enzyme , trong vòng 12h sau, hoạt lực của oligo–1,6– glucosidase tăng lên gấp 10 lần. Đối với đa số VSV ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống 3 – 40C so với giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 28 - 300C , cho Bac.subtilis là 35–370C. Thời gian nuôi để có lượng Amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Tuỳ thuộc vào tính chất của chủng VSV và sự ngừng tổng hợp Enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của Enzyme. Đối với đa số nấm mốc Aspergillus, sự tạo Enzyme Amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử. Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thì thời gian nuôi để có thể tích luỹ Amylase cực đại đối với từng loại nấm sợi và vi khuẩn như sau : Chủng Thời gian nuôi ( giờ ) - Asp.orysee – 476 24 -25 - Asp.oryae – KC 30 – 36 - Asp.oryae 8F1 24 – 30 - Asp.awamori 22 36 - Bac.subtilis 68 – 72 ( ở 300C ) * Nuôi VSV tạo Amylase bằng phương pháp bề sâu: Môi trường dinh dưỡng : Đặc điểm chung cho mọi môi trường nuôi VSV tạo Enzyme Amylase là có chất cảm ứng: tinh bột, dextrin hay maltose. Nguồn nitơ dinh dưỡng thường dùng là nitơ vô cơ (NaNO3). Sinh tổng hợp α-Amylase hoạt động của chủng Aspergillus thường chỉ thấy trong các môi trường có các muối của acid sulfuric. Đối với sinh trưởng của một số nấm sợi tạo maltase và oligo–1,6–glucoamylase hoạt động lại rất cần có sự có mặt của Mg trong môi trường. Để tạo điều kiện cho VSV phát triển tốt và sinh nhiều Amylase người ta cho thêm vào môi trường các loại nước chiết như nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước chiết đậu nành,… đó là nguồn bổ sung amino acid, vitamin và các tạp chất sinh trưởng. Dưới đây là một số môi trường lỏng dùng để VSV tạo các Enzyme Amylase. Đối với Aspergillus, người ta thường nuôi bằng môi trường Sapeck cải tiến gồm : 6% tinh bột ; 0,9% NaNO3 ; 0,001% FeSO4 ; 0,1% KH2PO4 ; 0,05%MgSO4; 0,05% KCl và nước máy. Để tăng cường khả năng sinh trưởng của VSV và khả năng tạo Enzyme có thể thêm nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước cám nấu, nước chiết bột đậu nành . Nhiệt độ nuôi : Nhiệt độ nuôi là một trong những yếu tố quan trọng với sinh trưởng của VSV và sự tạo thành các Enzyme Amylase. Không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ dẫn tới giảm hoạt lực các Amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm sợi thuộc giống Aspergillus là 30 – 320C (trong đó có Asp.orysee 3–9–15 và Asp.awamori 22), Bacillus. Môi trường thích hợp nhất và tạo nhiều Amylase ở nhiệt độ 370C. Một số vi khuẩn khác thì lại có nhiệt độ tối thích cao hơn. Bac.circulans phát triển mạnh ở nhiệt độ 65 – 700C song lại tạo nhiều Amylase ở nhiệt độ 500C vì vậy người ta thường cấy giống ở 700C sau đó tiến hành cho tích luỹ ở nhiệt độ 500C nuôi chủng này bằng môi trường nước lỏng gồm nước nấu khoai tây, pepton và phấn. Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn tới độ bền của Enzyme tạo thành Amylase của Bac.coagulans và Bac.searothermophilus được nuôi ở 350C và 550C có độ bền nhiệt khác xa nhau. Khi giữ nhiệt ở 900C trong 1 giờ thì Amylase của chủng sinh trưởng ở nhiệt độ 350C bị mất 90 – 94% hoạt độ ban đầu ; trong lúc đó Amylase của chủng được nuôi ở nhiệt độ 550C chỉ bị vô hoạt có 10 - 12%. Các VSV ưa nhiệt thì sinh tổng hợp nên các Amylase bền nhiệt. Enzyme với độ bền nhiệt cao có ưu thế lớn trong nhiều lĩnh vực sản xuất. Ngoài ra nuôi vi khuẩn ưa nhiệt lại rất tiện lợi cho việc sản xuất công nghiệp, vì nuôi ở nhiệt độ cao tạo ra điều kiện chọn lọc và cho phép giảm bớt yêu cầu khắt khe về độ tuyệt trùng, đồng thời khi nuôi đỡ bị nhiễm tạp khuẩn. Sục khí và khuấy trộn Phần lớn vi sinh vật tạo Amylase là những VSV hiếu khí. Vì vậy sinh trưởng cuả chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hoà tan trong dịch nuôi cấy. Trong quá trình sinh trưởng của mình, VSV sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hoà tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung. Chính vì lẽ đó, việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới quá trình sinh trưởng và tích luỹ sinh khối cũng như sinh tổng hợp các Enzyme của VSV : Việc khuấy đảo bằng các cách như sau : + Sục không khí vô trùng vào thiết bị nuôi + Bằng máy móc chuyên dùng + Bằng tác dụng hiệp đồng của cả sục khí lẫn máy khuấy + Bằng tác dụng của các khí sinh ra khi lên men * Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10 – 12m3 không khí vô trùng ( có nhiệt độ không quá 400C ) trên 1m3 môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi trong khoảng 68 – 72giờ. Với thời gian nuôi ngắn hơn ở các thùng lên men nhân giống ( 48giờ ) và trong các thùng lên men sản xuất (48 – 52giờ) thì lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi Asp.orysee (3-9-15) phải là 30m3/m3 môi trường /giờ đối với thùng nhân giống và 40m3/m3 môi trường/giờ cho thùng sản xuất. Mức độ sục khí tối ưu để nuôi Asp.orysee (3-9-15) tương ứng với 180 micromol O2/lít môi trường (nồng độ oxy hoà tan đo bằng máy cực phổ với điện cực kiểu clark). Chủng này có vận tốc tiêu thụ oxy hoà tan cực lớn vào cuối pha sinh trưởng logarithm. Vận tốc tiêu thụ O2 giảm dần từ lúc bắt đầu pha ổn định. Nuôi VSV ưa nhiệt đòi hỏi nhiều không khí hơn là nuôi VSV ưa ẩm. Nhiệt độ và pH của một số Enzyme Amylase do VSV tổng hợp Vi sinh vật Enzyme pHoppt Toopt Aspa.wamori α-Amylase 4,5 – 6,2 40 β-Amlylase 3,5 – 7,0 50 Glucoamylase 4,5 – 4,7 55-75 Asp.niger α-Amylase 4,7 – 6,0 65 Glucoamylase 3,8 50 Asp.asami α-Amylase 3,8 50 Glucoamylase 5,0 55 Asp.orysee α-Amylase 5,5 – 5,9 50 – 57 β-Amlylase 4,8 30 Glucoamylase 4,8 50 Bac.amyloliquefaciens α-Amylase 5,7 – 6,0 55 – 60 Bac.diastaticus α-Amylase 5,8 70 Bac.subtilis α-Amylase 4,6 – 5,1 37 Endomyces sp Glucoamylase 4,8 55 Phizopase doleamar Glucoamylase 5,5 45 V. Phương pháp xác định hoạt độ: 1. Đơn vị đo hoạt độ: Mức độ hoạt động trong chế phẩm là thông tin quan trọng về lượng Enzyme trong đối tượng nghiên cứu, vì trong những điều kiện xác định, tốc độ phản ứng Enzyme tỉ lệ với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng. Lượng Enzyme theo quy ước quốc tế được biểu diễn bằng đơn vị Enzyme. Đơn vị Enzyme quốc tế ( UI ) là lượng Enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được 1 micromol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Trong những điều kiện xác định ( bão hòa cơ chất ), tốc độ phản ứng do Enzyme xúc tác tỷ lệ với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng Hoạt độ riêng của 1 chế phẩm Enzyme đặc trưng cho độ thuần khiết của chế phẩm Enzyme. Hoạt độ phân tử của Enzyme là số phân tử cơ chất ( hoặc số đương lượng các liên kết bị phân giải ) được chuyển hóa bởi 1 phân tử Enzyme sau 1 phút. Hoạt độ của trung tâm xúc tác Enzyme là số cơ chất ( hoặc số đương lượng các liên kết bị phân giải ) được chuyển hóa trên 1 trung tâm hoạt động sau 1 phút. Hoạt độ xúc tác của Enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm phản ứng tạo thành trên 1 đơn vị thời gian càng lớn. Bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa của cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng ta có thể đánh giá hoạt độ xúc tác của Enzyme. Có 3 nhóm phương pháp: Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong 1 thời gian nhất định ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định. Đo thời gian cần thiết để thu được 1 lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định. Chọn nồng độ Enzyme như thế nào để trong 1 thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm. * Phương pháp xác định hoạt độ Enzyme có rất nhiều. Ở mỗi nước và mỗi phòng thí nghiệm có thể dùng phương pháp này hay phương pháp khác là tùy thuộc điều kiện và thói quen. Nhưng khi so sánh chất lượng giữa các chế phẩm với nhau thì phải theo phương pháp thống nhất. 2. Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme có trong dịch chế phẩm nghiên cứu với các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iodine bằng máy so màu quang điện sẽ tính được hoạt độ Enzyme Đơn vị hoạt độ Amylase là lượng Enzyme chuyển hóa được 1 g tinh bột tan thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong thời gian 1 giờ ( pH cho Amylase của malt là 4,8 – 4,9; của nấm là 4,7; của vi khuẩn là 6,0 …) 3. Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( γ-Amylase) a/ Phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trong chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt độ Enzyme. Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan pH= 4,7 ở nhiệt độ 300C trong 1 giờ giải phóng được 1 mg glucose. b/ Phương pháp sử dụng Enzyme glucosidase: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trong dịch chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành qua phản ứng xúc tác đặc hiệu của Enzyme glucosidase sẽ xác định được hoạt độ Enzyme. Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan pH = 4,7 ở nhiệt độ 300C trong thời gian 1 phút giải phóng được 1 μmol glucose. 4. Điều kiện cần và đủ để thu nhận chế phẩm Amylase có hoạt lực cao a) Chủng giống vi sinh vật: Muốn nhận chế phẩm Amylase có hoạt độ cao, trước hết phải tuyển chọn, nghiên cứu xem chủng, giống nào có khả năng tích tụ nhiều Amylase. Khi đã tuyển chọn được giống tốt tức là đã có được điều kiện cần thiết để tạo ra chế phẩm Amylase có hoạt độ cao. Nhưng giống tốt chỉ có tính chất tương đối với thời gian và điều kiện nhất định nào đó. Loài người luôn tìm cách phân lập và tạo ra các giống mới có hoạt lực ngày càng cao hơn bằng nhiều biện pháp khác nhau như lai tạo, gây đột biến, tách và cấy gen. Bằng con đường kết hợp giữa etylenimin và tia tử ngoại Ghendina đã tạo được chủng Asp.awamori 78 - 2 và Asp.awamori 22 có hoạt lực Amylase cao hơn 2 - 3 lần so với ban đầu. b) Môi trường dinh dưỡng: Trong sản xuất chế phẩm Amylase theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trên canh trường rắn người ta hay dùng nhất là cám lúa mì. Đây là môi trường tự nhiên tốt nhất để sinh tổng hợp Amylase. Cám lúa mì thường chứa khoảng 20 - 30% tinh bột, 10 - 12% protit. Ngoài ra còn chứa muối khoáng, các nguyên tố vi lượng, vitamin... Để tiết kiệm cám người ta còn trộn thêm các nguyên liệu khác vào môi trường như trấu, mùn cưa, bã khoai tây, bã bia... Ở nước ta do không có cám lúa mì nên trong sản xuất người ta hay dùng nhất là bột ngô vàng, cám gạo và trấu đem trộn lẫn với nhau. Thành phần tối ưu để thu được chế phẩm Amylase có hoạt độ cao từ Asp.awamori là cám 75% ( hàm lượng tinh bột 29% ) bột ngô 6% ( hàm lượng tinh bột 55% ) và 19% trấu. Hàm lượng tinh bột chung là 25%. Điều kiện tối ưu khi nuôi cấy là: to 32OC, độ ẩm 57% và nuôi trong 42 giờ. Ngoài tinh bột, môi trường cần chứa maltose và dextrin. Sự có mặt của glucose, fructose và saccarose có tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc nhưng lại hạn chế sự tích tụ Amylase. Ngược lại khi thêm lactose và MgO vào môi trường lỏng thì nấm mốc phát triển kém nhưng lại tạo nhiều Amylase. Ngoài gluxit, để tổng hợp Enzyme, vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng đều cần đến chất chứa nitơ. Nguồn nitơ có thể có sẵn trong cám, bột ngô, khi cần thiết có thể bổ sung thêm từ khô lạc, khô đậu tương hoặc từ các muối amin hoặc ure. Theo kết quả nghiên cứu của giáo sư Phenicxôva, nấm mốc Asp.awamori có thể phát triển tốt trong môi trường chứa 0,05% đạm vô cơ nhưng để tạo α-Amylose thì cần tăng nồng độ tới 0,15%; để tạo glucoamylase cần tăng tới 0,4%. Nhiều nguồn đạm hữu cơ cũng có tác dụng tốt đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc nhưng ít có hiệu quả về phương diện tích tụ Enzyme. Ví dụ khi bổ sung gelatin casein và ngay cả cao ngô vào canh trường thì việc tích tụ Enzyme vẫn thua kém so với nguồn đạm vô cơ. Ngược lại, nếu ta thêm mầm, rễ của hạt ươm mầm vào canh trường lại có tác dụng tốt đến tích tụ Enzyme. Sự tạo thành và tích tụ Amylase còn gắn với sự có mặt của các ion Mg2+, Ca2+ và photpho, đặc biệt là magie. Trong môi trường thiếu MgSO4, Amylase hầu như không đc tạo thành, hàm lượng chỉ vào khoảng 0,05% - Sau magie là photpho, ion P đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành acid nucleic. Hàm lượng của muối KH2PO4 vào khoảng 0,1 - 0,2%. Canxi có trong thành phần của α-Amylase. Một phân tử α-Amylase có tới 2 hoặc 3 ion canxi. Người ta cho rằng tính chịu nhiệt của Enzyme này phụ thuộc số ion canxi có trong phân tử; nhưng cũng có ý kiến cho rằng tính bền nhiệt của Enzyme này còn phụ thuộc vào thành phần acid amin, nhất là hàm lượng của acid glutamic. Lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng không kém. Hoạt độ Amylase gắn liền với sự có mặt của nhóm –SH; mặt khác còn tham gia vào thành phần của acid amin cấu tạo thành Enzyme. Hàm lượng lưu huỳnh trong canh trường chứa 0,04g/100ml đảm bảo cho hoạt độ Amylase đạt cực đại và bằng 360 đv/100ml. Nếu giảm tới 0,004% hoạt độ Amylase của Asp.orysee chỉ còn 50% và bằng 180 đv/100ml. Hoạt độ của một số chủng nuôi trên môi trường cám lúa mì theo phương pháp bề mặt Chủng Vi sinh vật Hoạt độ dv/g chất khô Hoạt độ Amylase Hoạt độ D Hoạt độ Glu Hoạt độ Pr Asp.oryae KC 70.0 450.0 30.0 50.0 Asp.oryae U476 85.0 665.0 80.0 40.0 Asp.niger S4-10-111 0.65 437.0 70.0 0.5 Asp.awamori 14.5 850.0 30.0 0 c) Điều kiện nuôi cấy Chủng giống và môi trường nuôi cấy là tiền đề quan trọng, bên cạnh đó ta còn phải chú ý đến những điều kiện tối ưu cho nấm mốc phát triển và tích tụ Enzyme. Bao gồm: Nhiệt độ Cần phải có trang bị phù hợp để duy trì và ổn định nhiệt độ canh trường. Bằng cách quạt không khí lạnh và ẩm vào canh trường. Nếu nuôi cấy trong môi trường lỏng thì cần làm lạnh đồng thời kết hợp với sục khí. Nhiệt độ không khí trước khi đưa vào phòng nuôi phải vào khoảng 22 – 250C, còn độ ẩm tương đối của không khí là 98 - 100%. Độ ẩm canh trường Trong điều kiện vô trùng ở phòng thí nghiệm, độ ẩm tối ưu để nấm mốc phát triển nằm trong giới hạn 65 - 70%. Trong thực tế sản xuất, mức độ vô trùng không thể đạt được như trong phòng thí nghiệm nên người ta thường nuôi cấy trong canh trường có độ ẩm thấp hơn, nhằm hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn.Tùy theo điều kiện trang thiết bị ở mỗi nơi mà độ ẩm có thể khống chế ở 50 - 60%. Độ ẩm canh trường thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn, nhưng nấm mốc cũng phát triển chậm dẫn đến tích tụ Enzyme ít và phải kéo dài thời gian. Do đó vấn đề cần đặt ra là phải bằng mọi biện pháp thực hiện tốt công việc vệ sinh. Muốn vậy trước hết phải tiệt trùng môi trường ở áp suất và thời gian thích hợp nhằm tiêu diệt các tế bào và bào tử vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu dùng làm môi trường. Do trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm mốc thải ra một lượng nhiệt khá lớn nên canh trường bị nóng và làm giảm độ ẩm. Đổ nước lạnh xuống nền và phun nước quanh tường sẽ góp phần giảm nhiệt và giúp cho canh trường đỡ bị khô. pH môi trường Khi nuôi cấy theo phương pháp bề mặt trên canh trường rắn, pH ít ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm mốc, thường áp dụng pH tự nhiên của môi trường vào khoảng 5,5 - 6,0. pH thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng sẽ ảnh hưởng tới tích tụ Enzyme. Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng: pH ban đầu thường vào khoảng 6 - 7. Đối với Asp.orysee sau 3 ngày nuôi cấy pH giảm còn 5,5 - 6,0. Ngược lại khi nuôi Asp.awamori để nhận glucoamylase, sau 52 giờ pH tăng tới 7,6 - 7,8. Thực tế pH có ảnh hưởng nhiều tới tích tụ Enzyme, vì thế trong sản xuất người ta sử dụng acid hoặc amoniac để điều chỉnh, giữ cho pH luôn trong giới hạn tối ưu. Cung cấp oxy Trong quá trình phát triển và tích tụ Enzyme, nấm mốc rất cần oxy. Trong sản xuất sinh học, sự phát triển của tế bào và tích tụ Enzyme có liên quan mật thiết tới sự có mặt của oxy. Khi nuôi cấy theo phương pháp bề mặt, nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với oxy của không khí qua sợi nấm và mixen. Vì thế canh trường phải xốp, giúp cho nấm mốc tạo nhiều sợi và tích tụ Enzyme. Nếu môi trường dính bết, không khí ít tiếp xúc thì sẽ xảy ra hô hấp yếm khí, ảnh hưởng xấu đến tích tụ Enzyme. Vì vậy ở mỗi giai đoạn của sự phát triển, tùy vào lượng oxy cần cho quá trình trao đổi chất và lượng nhiệt nấm mốc tỏa ra mà điều chỉnh lượng không khí vào phòng nuôi cho thích hợp. Yêu cầu về lượng không khí và cung cấp oxy trong môi trường lỏng có những khác biệt. Yêu cầu đặt ra là phải làm sao để oxy của không khí hòa tan vào canh trường càng nhiều càng tốt. Trong canh trường lỏng tế bào nấm mốc phân tán trong dịch thể, sự tiếp xúc của chúng với oxy phải thông qua canh trường – khuấy và sục khí là biện pháp tốt để oxy có thể hòa tan vào dung dịch. Lượng oxy hòa tan trong canh trường phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: nhiệt độ, áp suất, công nghệ sục khí cũng như hàm lượng và tính chất của các chất hòa tan trong dung dịch. C. Ứng dụng Enzyme Amylase Amylase là nhóm Enzyme được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: công nghệ sản xuất rượu bia, công nghệ thực phẩm…đặc biệt là trong lĩnh vực sản xuất bia. Trong lĩnh vực sản xuất bia Amylase được sử dụng để đường hóa tinh bột thành maltose, glucose dùng làm cơ chất cho quá trình lên men bia. + Trong công nghiệp sản xuất rượu bia (giai đoạn đường hoá tinh bột ) + Trong công nghiệp sản xuất tương , mạch nha , mật, đường glucose …. + Từ tinh bột có thể làm cơm rượu làm thức ăn cho gia súc rất giàu chất dinh dưỡng + Amylase còn được ứng dụng trong sản xuất làm bánh mì , làm cho bánh nở xốp thơm ngon hơn . + Trong công nghiệp dệt chế phẩm Enzyme Amylase còn dùng để rũ hồ vải là tẩy lớp hồ bột trên mặt vải. Làm cho vải mềm mịn , dễ tẩy trắng dễ bắt màu khi nhuộm . + Trong công nghiệp chế biến dược phẩm + Trong công nghiệp sản xuất bột ngọt I. Ứng dụng trong sản xuất Bia Bia là loại đồ uống có độ cồn thấp, giàu dinh dưỡng. Ngoài việc cung cấp một lượng calori khá lớn, trong bia còn chứa một hệ Enzyme khá phong phú, đặc biệt là nhóm Enzyme kích thích tiêu hóa Nguyên liệu sử dụng : Ngũ cốc , hoa Houblon, nước , Nấm men, chất phụ gia Các chủng vi sinh vật sử dụng: + Saccharomyces cerevisisae ( Lên men nổi) + Saccharomyces cerevisidae (Lên men chìm) Tinh bột là thành phần chiếm vị trí số một của hạt đại mạch cả về số lượng lẫn vai trò của nó trong sản xuất bia. Trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng Enzyme Amylase có trong mầm đại mạch. Ngoài ra, còn sử dụng các Enzyme khác có trong mầm đại mạch để thủy phân và chuyển hoá các chất không tan sang trạng thái tan như chuyển protein, cellulose… sang amino acid và glucose . Các quá trình công nghệ này đã được thực hiện ở nhiều nước trên thế giới. So với các loại Enzyme Amylase từ các nguồn khác, Amylase từ thóc đại mạch đã được nảy mầm được sử dụng với số lượng nhiều nhất hiện nay. Quá trình hạt đại mạch nảy mầm là quá trình sinh tổng hợp Enzyme Amylase và nhiều Enzyme khác Nhờ sự tổng hợp ra những Enzyme này, hạt tiến hành quá trình tự phân hủy tinh bột, protein và các hợp chất khác để cung cấp nguyên liệu và năng lượng cho hạt nảy mầm Enzyme Amylase tác động vào giai đoạn đường hóa: Biến đổi tinh bột đã qua giai đoạn dịch hóa thành Dextrin và Maltose tác động tạo Dextrin hóa, b- Amylase tác động tạo mantose. a-Amylase Tinh bột Dextrin + maltose + glucose Thủy phân a-1,4 của amylose b-Amylase Tinh bột Maltose + b - Dextrin (Glucogen) Trong gian đoạn lên men tiếp theo, các chất đường, dextrin có phân tử thấp sẽ được chuyển hóa thành rượu etylic, CO2 và một số sản phẩm phụ khác tạo thành bia theo yêu cầu kỹ thuật và chất lượng sản phẩm. 1. Đường hóa nguyên liệu: a. Chuẩn bị nguyên liệu: Malt là nguyên liệu chính cung cấp tinh bột và Amylase cho đường hóa. Malt: là tên gọi ngũ cốc nảy mầm ( Đại mạch, tiểu mạch, thóc gạo, lúa mì đen, thóc nếp…). Trong sản xuất bia, người ta dùng chủ yếu là đại mạch nảy mầm. Hạt đại mạch là nguồn cung cấp nguyên liệu cho đường hóa , tạo đường cho sự lên men về sau . Trong quá trình nảy mầm của hạt sẽ tích tụ được nhiều men mới, tăng hoạt tính hàng loạt men và Amylase tăng hoạt tính đáng kể, cần thiết cho quá trình đường hóa. Hoạt lực của α-Amylase có thể ghi nhận được vào những thời điểm đầu tiên của quá trình ươm mầm, còn đến ngày thứ ba hoặc ngày thứ tư thì hoạt lực của chúng sẽ tăng một cách đáng kể. Thời gian để α-Amylase đạt được hoạt lực cực đại phụ thuộc vào nhiệt độ ươm mầm. Ví dụ ở nhiệt độ 12 – 140C hoạt lực đạt cực đại sau 11 – 12 ngày đêm, nếu ở nhiệt độ 18 – 200C hoạt lực đạt cực đại sau 6 – 7 ngày đêm. Còn nếu nhiệt độ 25 – 280C thì chỉ cần sau 4 ngày là Enzyme này đạt được hoạt độ tối đa. Ngoài Amylase hoạt độ của protease, sitase, maltase, phosphatase cũng tăng lên. Quá trình oxy hóa – khử lượng men tạo thành tập trung phần lớn ở gần phôi và nội nhũ. Phần trên nội nhũ chứa 25% lượng men có trong malt. Trong quá trình nảy mầm có một số quá trình sinh hóa xảy ra như sau: Thủy phân một phần tinh bột ( 20 – 25% ) ra đường đơn giản hơn. Đường oligo - polysaccharide có bị phân giải một phần thành monosaccharide và trisaccharide. Lipase thủy phân một phần lipid thành acid béo và glycerine Do việc tạo thành acid hữu cơ và vô cơ nên độ chua của hạt này mầm tăng cao , pH 5,6 – 5,9. b. Đường hóa: Đường hóa là công đoạn sản xuất bia rất quan trọng, trong đó lượng đường được tạo thành sẽ quyết định khả năng lên men và chất lượng bia sau này. Chính vì thế, nhiều nhà máy bia trên thế giới đã cho thêm Enzyme với số lượng lớn trong giai đoạn này. Các Enzyme vào trong giai đoạn này là những Enzyme vi khuẩn chịu nhiệt. Biến đổi sinh hóa của quá trình đường hóa là thủy phân tinh bột thành dextrin và đường đơn giản (maltose, glucose…) dễ tan và lên men dưới tác dụng của Amylase trong malt, ở nhiệt độ và pH tối ưu . Có quá trình thủy phân protid – peptid , peptone, acid amin hòa tan được trong dung dịch nhờ Enzyme protease, peptidase có trong malt. Cellulose, peptin cũng bị thủy phân, tạo thành sản phẩm hòa tan được trong dung dịch, tamin bị oxy hóa tạo ra Flobafel tạo thêm màu cho bia Malt xay nhỏ trộn với nước thành dịch hồ, nâng nhiệt độ lên 60 – 700C giữ trong 30 đến 40 phút, sau đó nâng lên nhiệt độ 750C và giữ ở nhiệt độ này cho đến khi đường hóa xong (PH 4,6 - 5,8 ) Hiện nay có nhiều phương pháp đường hóa, nâng nhiệt độ nhiều đợt 2 - 3 lần hoặc nâng nhiều đợt từng phần riêng rồi pha trộn lẫn nhau Với nguyên liệu fi-malt giàu bột (ngũ cốc) trước khi đường hóa và trộn malt cần xay nhỏ trộn nước nấu sơ bột thành hồ hoặc cháo loãng, dung dịch đường hóa gọi là dịch đường maltose, lọc xong ta có nước “mout”. Nước “mout” được đun sôi với hoa houblon ( 18 -26g/10 lít bia ở Việt Nam) . Trong nước “mout”, sau khi đường hóa có chứa 90% là các chất Carbohydrate, trong số này có đến 75% đường có khả năng lên men. Phần còn lại 25% là các loại dextrin mạch thẳng và mạch nhánh. Trong nhiều trường hợp, lượng đường tạo thành không đạt được mức độ trên do nhiều nguyên nhân. Trong đó nguyên nhân chính là chất lượng malt kém. Có ba cách để làm tăng lượng đường trong nước “mout”: + Kéo dài thời gian đường hóa + Sử dụng thêm đường + Sử dụng Enzyme để đường hóa hết lượng tinh bột Trước đây người ta thường áp dụng hai cách trên. Sau này, việc sử dụng Enzyme thường được sử dụng hơn. Người ta thường sử dụng các loại chế phẩm Enzyme sau: Các loại Enzyme thủy phân tinh bột sử dụng trong sản xuất bia Loại Enzyme và vi sinh sản xuất Điều kiện sử dụng Kiểu tác động và sản phẩm tạo ra pH 0C Amylase vi khuẩn a) B.subtillis b) B.licheniformis 6,5 6,5 85 105/95 Endo, nối α-1,4 Dextrin α-Amylase nấm mốc Asp.orysee 5,0 55 Endo, nối α-1,4 Maltoz Amylglucosidase Asp.niger 4,3 6,0 Exo, nối α-1,4; α-1,6 Glucoz Pullulnase Loài Bacillus 4,3 60 Endo, nối α-1,6 Dextrin Glucose isomerase B.coaglucanz 8,0 60 Endo, nối α-1,4 Glucoz + Fructoz Các loại Enzyme khi cho thêm vào trong sản xuất bia thường nhằm vào những mục đích sau: + Nâng cao chất lượng dịch đường hóa + Nâng cao khả năng lên men bia + Nâng cao chất lượng và ổn định chất lượng bia. + Giảm giá thành sản phẩm khi tiến hành thay malt bằng những nguyên liệu phi malt. Những ưu điểm của Enzyme từ nguồn VSV được sử dụng trong sản xuất bia như sau: + Các chế phẩm Enzyme từ VSV thường có hoạt tính xúc tác rất mạnh và chứa khá đầy đủ các loại Enzyme cần thiết cho sự chuyển hóa tinh bột thành các loại đường, đặc biệt là tạo ra được loại đường có khả năng lên men với số lượng lớn. + Các chế phẩm Enzyme từ VSV thường có khả năng hoạt động ở nhiệt độ rất cao. Điều này rất thuận lợi cho việc vận hành quá trình dịch hóa và đường hóa. 2. Lên men bia Là giai đoạn quan trọng quyết định cho chất lượng bia và hiệu suất sản xuất. Cơ sở sinh hóa ( Saccharomyces cerevisiae ) C 6H 12O 6 àC 2H 5OH + CO2 Quá trình tạo acid hữu cơ và tạo rượu cao tác dụng với nhau tạo ra ester ảnh hưởng đến mùi vị bia.Trong quá trình lên men PH giảm dần , lúc đầu dịch lên men 5,3 -5,6 sau lên men chính còn 4,2 – 4,4. Quá trình sinh lý đặc trưng trong giai đoạn đầu thời kỳ lên men là sinh trưởng , tăng sinh khối. II. Ứng dụng trong sản xuất bánh mì: Các chế phẩm Enzyme tinh khiết được dùng để tăng cường và điều chỉnh công nghệ của nhiều loại sản phẩm trong đó có sản xuất bánh mì. Nguồn Enzyme thường sử dụng là malt. Tuy nhiên trong những năm gần đây, nguồn nguyên liệu malt dần dần được thay thế bằng nguồn nguyên liệu từ nấm sợi, trong đó có Amylase làm tăng chất lượng bánh mì. Chế phẩm Enzyme từ nấm sợi chủ yếu thu nhận từ Asp.orysee có pH tối ưu là 4,5 – 5,5. Trong công nghiệp sản xuất bánh mì Enzyme Amylase có tác dụng làm giảm độ dính, tăng độ đàn hồi của bột nhào, tăng mùi thơm, tăng nhanh thể tích bánh và rút ngắn thời gian nhào α-Amylase của nấm sơi, chịu acid hơn và nhạy cảm với nhiệt độ hơn là α-Amylase của hạt và của vi khuẩn. Sự tác động tương hỗ khả năng chuyển hóa của Enzyme cho vào trong quá trình chế biến và sự hoạt động của nấm men sẽ làm tăng nhanh chất lượng bánh và đảm bảo được những mục đích trên. Nhiệt độ thích hợp đối với tác dụng của α-Amylase nấm sợi là 500C và bị ức chế ở nhiệt độ 65 - 680C. Do hoàn toàn bị ức chế ở các giai đoạn khác nhau của quá trình nướng nên α-Amylase nấm mốc không kịp phát huy tác dụng dextrin hóa tinh bột và vì vậy không làm giảm chất lượng ruột bánh. Đồng thời α-Amylase nấm sợi lại có tác dụng đường hóa và tạo khí mạnh nên rút ngắn được quá trình chuẩn bị bột nhào và làm chất lượng bánh được tốt hơn. Khi ta sử dụng chế phẩm Enzyme từ nấm sợi Asp.orysee hay Asp.awamori, lượng đường khử và các amino acid tự do tăng lên. Đây chính là nguyên nhân chính dẫn tới sự tạo thành màu và mùi trong sản xuất bánh mì. Ý nghĩa quan trọng của việc sử dụng chế phẩm Enzyme trong sản xuất bánh mì là khi ta sử dụng Enzyme, nhờ hoạt động của nó mà lượng đường được tạo thành từ từ, không tập trung quá nhiều ở giai đoạn đầu hoặc ở giai đoạn cuối của quá trình nhào bột. Chính vì thế, Enzyme như một chất điều hòa rất có hiệu quả cho quá trình lên men, tạo CO2 trong suốt quá trình kỹ thuật. Như vậy, ở một góc độ nào đó ta sử dụng Enzyme trong sản xuất bánh mì như một yếu tố điều khiển kỹ thuật cho quá trình sản xuất này. Dextrinase và maltose của nấm sợi có tác dụng hỗ trợ cho α-Amylase. Dextrinase thủy phân các dextrin cuối cùng cho đến maltose. So với β-Amylase thì dextrinase tạo thành đường nhiều hơn. Maltose thủy phân dextrin và maltose đến glucose. Hoạt độ của Enzyme được đặc trưng bằng lượng đối chất bị thủy phân ứng với 1 gram chế phẩm Enzyme trong 1 đơn vị thời gian. III. Ứng dụng trong sản xuất Siro: Enzyme Amylase được ứng dụng trong giai đoạn thủy phân tinh bột của quy trình sản xuất siro. Trong phương pháp thủy phân bằng acid và Enzyme. Enzyme Amylase là Enzyme quan trọng để chuyển hóa tinh bột è đường. Enzyme α-Amylase tạo maltose từ Asp.orysee. Enzyme β-Amylase tạo maltose từ malt đại mạch. Quá trình đường hóa xảy ra ở pH 4,8 - 5,2, nhiệt độ 55 - 600C, thời gian phản ứng đến 2 ngày. 1. Siro maltose: Siro maltose được sản xuất chủ yếu bằng phương pháp Enzyme sử dụng duy nhất Enzyme Amylase tạo maltose. Trong quy trình đặc trưng, dung dịch cơ chất 35 - 45% chất khô DE 10-20 được đường hóa bằng Enzyme tạo maltose. Trong trường hợp này pH = 5, nhiệt độ 50 - 550C, trong 24 - 48h. Nồng độ maltose trong sản phẩm thu được khoảng 40 - 60%. Lượng cao hơn 80% maltose có thể thu được nhờ sử dụng Enzyme thủy phân liên kết nhánh trong quá trình đường hóa để thủy phân các liên kết α-1,6 tạo thêm đoạn mạch thẳng làm cơ chất cho Amylase tạo maltose. 2. Sản xuất siro giàu fructose HFS: Hiện nay, các nước châu Âu và châu Mỹ sản xuất siro đường fructose từ bột bắp bằng phương pháp Enzyme phát triển rất mạnh. Theo phương pháp này, phôi bắp được xử lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm ra khỏi khối bột bằng ly tâm. Enzyme chỉ được sử dụng sau khi bột đã hòa vào nước. Đặc tính Enzyme từ các nguồn VSV khác nhau Stt Enzyme Nguồn Enzyme Khoảng pH Khoảng nhiệt độ pH, nhiệt độ phổ biến Chất hoạt hóa Chức năng 1 α-Amylase nấm sợi Asp.niger Asp.orysee Asp.awamori 4-6 50-70 4,5-6,5 Thủy phân hạn chế tinh bột 2 α-Amylase vi khuẩn ưa ẩm Bac.subtilis Bac.amylo liquefaciens 6-7 40-80 6-7,5 Ca2+ Thủy phân hạn chế tinh bột 3 α-Amylase vi khuẩn ưa nhiệt Bac.licheniformis Bac.stearothermo-philus 5,5-6,5 4,5-6,5 90-120 5,8 ; 100 6 ; 115 Ca2+ Thủy phân tinh bột ở t0 cao 4 β-Amylase Bac.polymyxa 4,7 55-75 5 ; 60 Tao siro co DE thấp 5 Pullulase Bacillus sp 3,5-4,5 55-65 4 ; 60 Ca2+ Phân cắt mạch nhánh 6 Amylogluco-sidase Asp.niger 3-4,5 55-65 4 ; 60 Đường hóa, phân cắt lk 1,4 glucoside HFS được sản xuất quy mô lớn từ những năm 1970 sử dụng α-Amylase bền nhiệt của hãng Novo trong quá trình dịch hóa và glucose-isomerase cố định để chuyển hóa glucose thành fructose. Glucose-isomerase được cố định và được tạo thành các hạt có kích thước trong khoảng 0,3 - 1,0 mm. Enzyme cố định được nhồi vào các cột có chiều cao khoảng 6m, đường kính 1,5m và tiếp xúc với dung dịch glucose DE 93 - 96 có nồng độ chất khô 40 - 60%. Trong quá trình phản ứng E cố định mất dần hoạt tính, cột phản ứng thông thường phải thay bằng Enzyme mới khi glucose-isomerase bị mất đi khoảng 12,5% hoạt tính. Cột thủy phân bền vững nhất trong thực tế có thể sử dụng trong 200 ngày. 3. Siro chứa đường oligo khác: Sản phẩm siro chứa 50 - 72% maltotetrose được sản xuất bằng quá trình thủy phân liên tục sử dụng hệ Enzyme Amylase tạo DP4 cố định từ Pseudomonas stutzeri 4. Sản xuất siro và đường tinh thể: Quá trình đường hóa: Trong quá trình thủy phân bằng Enzyme, dịch sau khi dịch hóa có nồng độ chất khô 30 - 35%, pH 4 - 4,5 nhiệt độ 600C được cho phản ứng với Glucoamylase. Quá trình đường hóa được tiến hành gián đoạn hoặc liên tục trong các thùng phản ứng lớn dung tích từ 200 ngàn tới vài triệu lit ở quy mô công nghiệp. Tùy thuộc vào nồng độ Enzyme sử dụng mà thời gian phản ứng có thể kéo dài từ 1 - 4 ngày. Cho tới khi đạt được nồng độ glucose cao nhất. Nồng độ glucoamylase ảnh hưởng trực tiếp tới thời gian phản ứng, tăng gấp đôi nồng độ Enzyme sẽ giảm một nửa thời gian đạt đến lượng glucose cao nhất. Nồng độ cơ chất thấp lượng maltose và isomaltose sinh ra sẽ giảm dẫn đến hiệu suất thu glucose sẽ tăng, theo nhiều nghiên cứu của Hebecta (1993) : hiệu suất thu glucose đạt 98,8 ; 98,2 ; 97,5 ; 96,9% khi nồng độ chất khô của cơ chất ban đầu tương ứng là 10, 15, 20, 25%, tuy nhiên nồng độ cơ chất thấp lại dễ gây nhiễm khuẩn và tăng chi phí cô đặc sản phẩm. Maltulose: 1-0-α-D-gluconopyranosyl-D-fructose được tạo ra trong dung dịch thủy phân ở giá trị pH cao trong quá trình dịch hóa gốc glucose cuối cùng, một đoạn Oligo bị chuyển thành fructose do phản ứng isomer hóa, sự có mặt của fructose ngăn chặn sự thủy phân liên kết α-1,4 của glucoamylase trong giai đoạn đường hóa và tạo ra maltulose trong sản phẩm sau thủy phân. Để tránh hiện tượng này, pH của quá trình dịch hóa cần được giữ ở giá trị 6,0 hoặc thấp hơn. Ở pH cao maltulose có thể tạo ra gây giảm hiệu suất thu glucose, các đường oligo DP3 và cao hơn còn lại trong dung dịch sau thủy phân thường phân nhánh và vì thế khó bị thủy phân tiếp tục bởi glucoamylase. Hiệu suất glucose có thể được nâng cao nhờ sử dụng pullulanase từ β-megaterium trong giai đoạn đường hóa. Sử dụng Enzyme có 2 ưu điểm sau: các oligo mạch nhánh có thể bị thủy phân nhanh hơn, lượng glucose Amylase cần ít hơn dẫn tới giảm các phản ứng ngược tạo ra isomaltose nhờ vậy lượng glucose tăng lên khoảng 0,5 - 1,5%. Amylase từ Bacillus.megaterium (tên thương mại là megatex) cũng thủy phân các đường oligo mạch nhánh thành Panosyl sau đó chuyển thành glucose để tạo ra DP4 mạch thẳng, đường oligo này dễ dàng bị thủy phân bởi glucoamylase thành glucose. Kết quả thời gian phản ứng và nồng độ glucoamylase sử dụng giảm, lượng isomaltose và các oligo mạch dài tạo ra ít hơn, lượng glucose tăng 1,0%, pH phản ứng khi sử dụng glucoamylase kết hợp với pullulanase và Amylase từ B.megaterium tương ứng là 4,5 - 4,8 và 5,0 - 5,2. Quá trình thủy phân liên tục: Enzyme sử dụng là amyloglucosidase, từ Asp.niger, ở 550C và pH 4,5 với nồng độ 0,5% thể tích cao hơn 15 lần so với nồng độ Enzyme sử dụng trong thiết bị gián đoạn với thời gian thủy phân khoảng 40 - 70h. Với thời gian phản ứng trên màng là 1h, hằng số KM là 562g/l, cao hơn 2 - 7 lần so với KM gián đoạn. IV. Ứng dụng trong sản xuất Cồn: Nguyên liệu chủ yếu mà các nhà máy rượu nước ta thường dùng là sắn, sau đó là ngô và một phần gạo hoặc tấm. Đối với sản xuất rượu thì thành phần quan trọng nhất là gluxit lên men được, gồm tinh bột và một số đường. Trong đa số gluxit nói chung thì tỷ lệ giữa H và O đều tương tự như trong nước. Ví dụ ramnose – C6H12O5. * Vai trò của α-Amylase và b-Amylase trong sản xuất cồn từ hydro carbon: - Trước đây người ta dùng Enzyme Amylase của malt, nhưng ngày nay đã thay thế bằng Enzyme Amylase của nấm sợi. - Trong sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột, Enzyme Amylase được sử dụng ở các giai đoạn đường hóa: + Chuyển hóa tinh bột bằng α-Amylase để tạo thành dextrin. Đường hóa Làm nguội Nấu chín ở nhiệt độ cao Nguyên liệu chứa tinh bột Amyloglucosidase hoạt động ở 550C Amylase hoạt động ở 550C + Chuyển hóa dextrin bằng b-Amylase hay amyloglucosidase để tạo ra đường có khả năng lên men. Sơ đồ Quá trình chuyển hóa tinh bột + Quá trình đường hóa đóng vai trò quyết định đến khả năng lên men và hiệu suất cồn thu được. Các chế phẩm Enzyme được sử dụng trong sản xuất cồn bao gồm những chế phẩm thô được thu nhận từ phương pháp nuôi cấy bề mặt, nuôi chìm hoặc các chế phẩm đậm đặc, tinh khiết. Chủ yếu là sử dụng chế phẩm dạng thô vì tính chất kinh tế. + Vì sử dụng chế phẩm dạng thô, do đó để tránh các phản ứng không mong muốn trong quá trình đường hóa, trước khi đường hóa phải xác định họat tính Enzyme của từng lọai Enzyme từ đó điều chỉnh họat động cuả chúng. + Trong giai đoạn dịch hóa Enzyme α-Amylase tham gia thực hiện các phản ứng sinh hóa cần thiết và quyết định đến hiệu suất sản xuất cồn. Trong khi đó cũng trong giai đọan này Enzyme b-Amylase lại tạo ra các sản phẩm không mong muốn, làm cản trở quá trình lên men. + Trong giai đoạn đường hóa dịch đường, Enzyme α-Amylase tham gia thực hiện các phản ứng sinh hóa cần thiết và quyết định đến hiệu suất sản xuất cồn. Còn Enzyme b-Amylase tham gia những biến đổi cơ bản cơ chất để tăng cường quá trình chuyển hóa cơ bản. + Khi thủy phân tinh bột, Enzyme α-Amylase tác động vào liên kết α-1,4 glucoside và sản phẩm tạo ra là mantose và dextrin mà mạch của chúng gần bằng C6. Các dextrin sau đó sẽ phân hủy chủ yếu theo C6 C5 + C1. C7 C6 + C1 hay C5 + C2. C8 C6 + C2 hay C5 + C3. + Enzyme α-Amylase của vi khuẩn thủy phân tinh bột tạo ra lượng glucose và maltose theo tỷ lệ 1 : 5,45. Enzyme α-Amylase của nấm sợi thủy phân tinh bột tạo ra lượng glucose và maltose theo tỷ lệ 1 : 3,79. Enzyme α-Amylase của vi khuẩn và nấm sợi đều không có khả năng phân giải α-1,6 glucoside của cơ chất. Như vậy, vai trò cơ bản của α-Amylase trong sản xuất rượu, cồn là làm dịch hóa nhanh ở giai đoạn nấu và cả ở giai đoạn đầu của sự đường hóa, dextrin hóa và tích tụ đường. * Vai trò của glucoamylase: Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucoside trong các polysaccharide, chúng liên tiếp phân cắt các gốc glucose không khử trong mạch polysaccharide. Ngoài ra glucoamylase còn có khả năng phân cắt liên kết α-1,6 glucoside. Sản phẩm cuối cùng tạo thành là glucose. V. Ứng dụng trong sản xuất Bánh kẹo Mục đích của việc sử dụng Enzyme vào sản xuất các loại bánh quy là làm tăng mùi và vị bánh, khi chế biến bột thành các loại bánh quy các Enzyme protease và Amylase của bột hoạt động làm tăng hàm lượng các amino acid tự do và làm tăng lượng đường khử. Đường khử và các amino acid tự do có trong khối bột sẽ cùng tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử và kết quả tạo cho bánh quy có mùi, vị màu hấp dẫn. Tuy nhiên nếu chỉ tận dụng lượng Enzyme có sẵn trong tinh bột thì phản ứng trên xảy ra không mạnh, nhất là khi sử dụng lọai bột xấu để sản xuất bánh. Do đó người ta thường bổ sung thêm Enzyme protease và Amylase vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh quy. Khi đó lượng đường khử và lượng amino acid tự do sẽ tăng lên, phản ứng oxi hóa khử cũng được tăng cường. VI. Ứng dụng trong sản xuất glucose và Mật: Chúng ta đã biết từ tinh bột có thể thu được các phẩm vật đường khác nhau khi thủy phân tinh bột bằng acid cũng như bằng Enzyme Amylase sẽ thu được mật. Mật glucose hay mật maltose thường được dùng trong sản xuất bánh kẹo và trong sản xuất các sản phẩm cho trẻ em và người bệnh. Hiện nay nhiều nước như: Nhật, Mỹ.… đã sản xuất glucose đi từ tinh bột bằng Enzyme glucoamylase, nhưng trong các chế phẩm Enzyme glucoamylase luôn luôn chứa cả glucozyltransferase do đó sẽ làm giảm tính chất của glucose, làm cho glucose khó kết tinh và ảnh hưởng xấu đến chất lượng thực phẩm. Vì vậy tốt hơn hết là nên chọn những chủng nấm mốc không tạo ra glucozyltransferase (ta có thể hấp phụ nó bằng đất sét chua hoặc bằng cách khử họat tính của nó bằng acid hoặc kiềm) Glucoamylase bền trong một khoảng pH rộng, những nấm mốc chứa nhiều glucoamilase như Asp.warner, Rhizopus, đặc biệt là Rhizopus ở Nhật đã sản xuất chế phẩm glucoamylase từ canh trường bề mặt của nấm mốc này. VII. Ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc: Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn. Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Ðể tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường cho thêm Enzyme Amylase vào. Enzyme Amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột tạo thành đường, giúp cho quá trình chuyển hóa tinh bột tốt hơn. VIII. Ứng dụng trong công nghiệp dệt: Trong công nghiệp dệt, người ta thường sử dụng Enzyme Amylase của vi khuẩn để tẩy tinh bột và làm cho vải mềm. Trong vải thô thường chứa khỏang 5% tinh bột và các tạp chất khác. Do đó, khi sử dụng chế phẩm Enzyme Amylase của vi khuẩn vải sẽ tốt hơn. Người ta thường sử dụng lượng chế phẩm Amylase khỏang 0,3 - 0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý 5 - 15 phút ở nhiệt độ 900C. Tuy nhiên ngoài chế phẩm Enzyme Amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn, hiện nay người ta đã quan tâm đến việc sử dụng Amylase từ nấm sợi. Cho đến nay có rất nhiều nước đã sử dụng Enzyme trong công nghiệp dệt để tăng khả năng cạnh tranh các hàng vải, sợi. Các nước sử dụng lượng Enzyme Amylase nhiều nhất trong lĩnh vực này là Mỹ, Nhật, Pháp, Ðan Mạch. Một số loại Enzyme Amylase được sử dụng trong công nghiệp dệt Stt Loại Enzyme Khoảng pH hoạt động Nhiệt độ tối ưu Chất hoạt hóa, chất làm ổn định 1 α-Amylase của malt 4,5 – 5,5 55- 65 Ca2+ 2 Amylase pancreatin 6,7 – 7,5 45 – 50 NaCl, Ca2+ 3 α-Amylase nấm sợi 4,5 – 5,5 55 – 65 Ca2+ 4 α-Amylase vi khuẩn 5,5 – 7,5 75 – 85 NaCl, Ca2+ 5 α-Amylase vi khuẩn chịu nhiệt 5,0 – 7,0 90 - 105 NaCl, Ca2+ Tài Liệu Tham Khảo 1. Công nghệ Enzyme – Nguyễn Đức Lượng . Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Tp.HCM – 2008 2. Công nghệ vi sinh-Tập 2: Vi sinh vật Công Nghiệp – Nguyễn Đức Lượng. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Tp.HCM – 2008 3. Công nghệ lên men ứng dụng trong Công Nghệ Thực Phẩm – Bùi Ái. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Tp.HCM – 2008 4. Động lực các quá trình xúc tác sinh học – Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Văn Hân. Nhà xuất bản Khoa Học – Kỹ Thuật – 2005 5. Tinh bột sắn và các sản phẩm từ tinh bột sắn – Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Xích Liên. Nhà xuất bản Khoa Học – Kỹ Thuật – 2005 6. Công nghệ sản xuất Malt và Bia – Hoàng Đình Hoài. Nhà xuất bản Khoa Học – Kỹ Thuật – 2005 7. Công nghệ sản xuất kiểm tra cồn etylen – Nguyễn Đìng Thương. Nhà xuất bản Khoa Học – Kỹ Thuật – 2005 8. Hóa học Thực Phẩm – Hoàng Kim Anh. Nhà xuất bản Khoa Học – Kỹ Thuật – 2007 9. Hóa sinh học - Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam. 10. Enzyme và xúc tác sinh học – Nguyễn Hữu Chấn. Nhà xuất bản Y học – 1983 11. 12. 13. 14. 15.