Trichoderma reesei - Tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase và một số phương pháp nâng cao khả năng phân hủy cellulose

ới sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma reesei này và các thể đột biến trên chủng đó. Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu và Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma vào cuối thập niên 60. Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma. Việc nuôi cấy dễ dàng và không tốn kém, các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng nghiên cứu cơ bản về Trichoderma hơn là ứng dụng về phân giải cellulose của chúng. Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp. Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới [Theo Christian P. Kubicek và Gary E. Harman]. Đặc điểm sinh học của nấm mốc T.reesei Vị trí phân loại Ban đầu, hệ thống phân loại nấm chia thành 4 ngành (Division, Phylum): Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota . Tiến bộ của Sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã đem lại một diện mạo mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học nấm. Nấm được chia thành 10 dưới ngành (subphylum) trong đó Ascomycota và Basidiomycota được xếp vào dưới ngành Dikarya, Chytridiomycota được xếp vào một dưới ngành riêng biệt, ngoài ra một số Chytridiomycota và Zygomycota được xếp ngoài bảng phân loại . Bảng 1  SEQ Bảng_1 \* ARABIC 1: Bảng hệ thống phân loại giới nấm Theo hệ thống phân loại theo Giáo trình nấm học CBS. ( CBS Course of Mycology) , lần xuất bản thứ 4, Baarn, Delft, 1998, phân loại Trichoderma như sau: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Ascomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma Loài: Trichoderma reesei Đặc điểm hình thái Trichoderma là những sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong chứa chất nguyên sinh có thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm (thông thường là 5-10 µm). Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhóm phát triển thành 1 khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu, liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử cùa Trichoderma, có màu xanh đặc trưng, nhưng cũng có thể là màu trắng, vàng hay xanh xám tùy theo loài, bào tử luôn đơn bào, bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn. Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone). Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh, vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào. Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kết cấu gấp nếp hay xoắn lại, người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome). Nhân tế bào chứa hạch nhân (nucleolus) được bao bọc bởi màng nhân có nhiều lỗ thủng. Nhân tập trung nhiều ở phần ngọn của sợi nấm và ít hơn trong các tế bào phía sau ngọn (1,2 nhân). Nhân nấm thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Nhiễm sắc thể trong nhân thường không dễ nhuộm màu, số lượng tương đối ít ( 6 ở T.reesei).           Tế bào nấm chứa các bào quan giống như trong tế bào các sinh vật có nhân thực (Eukaryote) khác. Ribosome  của T.reesei thuộc loại  80S ( S là đơn vị hệ số lắng Svedberg) có đường kính khoảng 20-25nm, gồm có 2 bán đơn vị ( subunit) : bán đơn vị lớn (large subunit ) 60S (gồm 3 loại ARN- 25S; 5,8S và 5S cùng với 30-40 loại protein). Bán đơn vị nhỏ (small subunit) 40S (gồm loại ARN 18S và 21-24 loại protein)           Phần ngọn có thể tách với phần bên dưới bằng một không bào, lúc đầu nhỏ nhưng về sau kết hợp lại với nhau để lớn dần, tạo áp lực dồn tế bào chất về phía đỉnh ngọn sợi nấm. Tại phần già nhất của sợi nấm thường xảy ra hiện tượng tự tan (autolysis) hoặc bị tan rã dưới tác dụng của các men phân cắt (lytic enzymee) do các vi sinh vật khác sinh ra. Cũng có những phần sợi nấm già phần lipid tích tụ nhiều và kết hợp với thành tế bào tạo nên một màng dày hình thành những bào tử áo (chlamydospore). Loại bào tử này có thể giúp sợi nấm tồn tại được qua những điều kiện môi trường khắc nghiệt. Trường hợp này rất giống với các bào tử nội sinh (endospore).           Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên một môi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm (mycelium, số nhiều- mycelia), sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony). Vào giai đoạn cuối của sự phát triển khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau tạo hệ thống liên thông thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm. Hình 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 1: Sợi nấm T.reesei quan sát dưới kính hiển vi điện tử ( nguồn bởi G.B.Sharples) Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Đặc điểm sinh thái T.reesei là một loại nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử khuẩn ty. T.reesei có tốc độ phát triển nhanh chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 200C. Chúng phát triển nhanh ở nhiệt độ 250C-300C, chậm ở 350C-370C. Ở 350C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường. Trong khi ở 370C, bào tử không xuất hiện sau 7 ngày nuôi cấy. Môi trường sống Trichoderma là nhóm vi nấm phổ biến ưa ẩm. Hầu hết chúng là vi sinh vật hoại sinh, nhưng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác. Trichoderma rất ít tìm thấy thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật. chúng có mặt khắp mọi nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hoặc cận nhiệt đới là khu rừng ôn đới hay rừng phương Bắc. Nhu cầu nhiệt độ tối đa của môi trường sống đặc trưng cho từng loài. Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid và Trichoderma sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ cacbohydrat, amoni acid đến ammonia. Trichoderma có thể được phát hiện trong đất bởi mùi hương của chúng, hương dứa (6-pentyl-pynone đã bay hơi) thường được tạo ra trong quá trình sinh trưởng của Trichoderma Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh : glioviridin, sespuiterpenoids, trichothecenes, cyelic peptides, isocyanid . Trichoderma có khả năng sản xuất đa dạng chất chuyển hóa thứ cấp: anthroquinon , emodin . Môi trường nhân sinh khối Trichoderma phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều cellulose như: bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc, bã bia… Khái niệm kiểm soát sinh học của Trichoderma [nguồn TS. Dương Hoa Xô - TT CNSH Tp. Hồ Chí Minh] Trichoderma có khả năng đối kháng được với nấm bệnh nhờ vào nhiều "hoạt động" khác nhau, chúng có thể sử dụng: Kháng sinh được tạo ra chất có tác dụng kiềm hãm sự tăng trưởng của tác nhân gây bệnh Cạnh tranh: Trichoderma sử dụng cùng một nguồn tài nguyên (dinh dưỡng, không gian sống) với các sinh vật gây bệnh nhưng Trichoderma "xâm chiếm" môi trường trước các vi sinh vật khác. Ký sinh: tức giết chết các loài gây bệnh bằng cách xâm nhập vào bên trong loài nấm gây hại và/hoặc tiết ra những chất (enzymee) để phân hủy chúng. Hình 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 2: Nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh Fusarium [(Nguồn: DienTrang Biolab)] Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng Bảo vệ thực vật: một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma được quan tâm nhiều nhất là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số nấm gây bệnh ở thực vật. Các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều loại Trichoderma khác để kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác. Kết quả các loại Trichoderma kiểm soát hiệu quả các nấm gây bệnh. Nhóm nấm đối kháng Trichoderma hiện nay đang được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghệ sản xuất phân hữu cơ sinh học hiện nay ở Việt Nam. Phân hữu cơ sinh học có phối trộn thêm nấm đối kháng Trichoderma là lọai phân có tác dụng rất tốt trong việc phòng trừ các bệnh vàng lá chết nhanh, còn gọi là bệnh thối rễ do nấm Phytophthora palmirova gây ra. Hay bệnh vàng héo rũ hay còn gọi là bệnh héo chậm do một số nấm bệnh gây ra:  Furasium solari, Pythium sp, Sclerotium rolfosii …. Hình 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 3: Chế phẩm enzyme trichoderma được bổ sung vào phân lân vi sinh sản xuất ở công ty Điền Trang. Cải thiện năng suất cây trồng : (kích thích sự tăng trưởng của cây trồng)  Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm qua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường. Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong thời gian gần đây. Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất) giúp khả năng hút chất ding dưỡng .Ngoài ra, những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán. Hình 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 4 Tăng cường rễ phát triển trong lĩnh vực trồng ngô và đậu tương của dòng T. harzianum T-22 [ HYPERLINK "mailto:geh3@cornell.edu" G. E. Harman, Cornell University, Geneva]. Trong lĩnh vực xử lý môi trường Xử lý các phế phẩm nông nghiệp: Chế phẩm sinh học nấm đối kháng Trichoderma ngòai tác dụng sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, hay sử dụng như một lọai thuốc bảo vệ thực vật thì còn có tác dụng để xử lý ủ phân chuồng, phân gia súc, vỏ cà phê, chất thải hữu cơ như rơm, rạ, rác thải hữu cơ rất hiệu quả. Chế phẩm sinh học BIMA (có chứa Trichoderma ) của Trung Tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh, chế phẩm Vi-ĐK của Công ty thuốc sát trùng Việt Nam … đang được nông dân TP. Hồ Chí Minh và khu vực Đồng bằng Sông Cửu long, Đông nam bộ sử dụng rộng rãi trong việc ủ phân chuồng bón cho cây trồng. Việc sử dụng chế phẩm này đã đẩy nhanh tốc độ ủ hoai phân chuồng từ 2 – 3 lần so với phương pháp thông thường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối của phân chuồng. Người nông dân lại tận dụng được nguồn phân tại chỗ, vừa đáp ứng được nhu cầu ứng dụng tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng do tác dụng của nấm đối kháng Trichoderma có chứa trong phân. Các chế phẩm của Viện Sinh học nhiêt đới như BIO-F, chế phẩm chứa các vi sinh vật do nhóm phân lập và tuyển chọn: xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm mốc Trichoderma sp. và vi khuẩn Bacillus sp. Những vi sinh vật trên có tác dụng phân huỷ nhanh các hợp chất hữu cơ trong phân lợn, gà và bò (protein và cellulose), gây mất mùi hôi. Trước đó, chế phẩm BIO-F đã được sử dụng để sản xuất thành công phân bón hữu cơ vi sinh từ bùn đáy ao, vỏ cà phê và xử lý rác thải sinh hoạt. Trong lĩnh vực khác Trichoderma được bổ sung vào thức ăn gia cầm nhằm tăng khả năng tiêu hóa hemicellulose ở vật nuôi . Nhiều gen có nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh. Chưa có gen nào được thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển . Hình 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 5: Một số gen biocontrol từ T. harzianum have been inserted into plants, where they provide resistance to several diseases. harzianum đã được đưa vào cây thuốc lá để kháng nấm Alternaria alternata gây bệnh héo lá và vào cây khoai tây để kháng nấm Rhizoctonia solani gây bệnh thối rễ [bởi  HYPERLINK "mailto:geh3@cornell.edu" G. E. Harman, Cornell University, Geneva]. Trichoderma là những nhà máy sản xuất nhiều enzymee ngoại bào rất có hiệu quả. Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất các cellulase và các enzymee khác phân hủy các polysaccharide phức tạp. Nhờ vậy chúng thường được sử dụng trong thực phẩm và ngành dệt cho các mục đích tương tự . Khả năng ứng dụng ở Việt Nam Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng Bằng Sông Cửu long và Đông nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani. Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma là khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. Lợi dụng đặc tính này người ta đã trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng. Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa của Công ty Anh Việt (TP. Hồ Chí Minh) phân VK của Công ty Viễn Khang (Đồng Nai) đã được nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau hoan nghênh và ứng dụng hiệu quả . Khả năng phân hủy cellulose ở Trichoderma reesei: Cellulose: Cấu trúc: Cellulose là  HYPERLINK "" \o "Hợp chất cao phân tử (trang chưa được viết)" hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các  HYPERLINK "" \o "Liên kết (trang chưa được viết)" liên kết các mắt xích β-D- HYPERLINK "" \o "Glucose" Glucose, có  HYPERLINK "" \o "Công thức cấu tạo (trang chưa được viết)" công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên  HYPERLINK "" \o "Vách tế bào thực vật (trang chưa được viết)" vách tế bào thực vật. Hinh 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 6: Hình ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose:Màu nâu- HYPERLINK "" \o "Cacbon" cacbon, màu đỏ- HYPERLINK "" \o "Oxy" oxy, màu trắng- HYPERLINK "" \o "Hydro" hydro [ web bách khoa toàn thư ]. Các đơn vị lặp đi lặp lại nhỏ nhất trong cellulose là cellobiose, trong đó bao gồm hai đơn vị glucose. Trong chuỗi cellulose tinh thể dính vào nhau bởi liên kết hydro và lực van der Waals để tạo thành cấu trúc cao phân tử không hòa tan. Hình 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 7: Cấu trúc của phân tử cellulose Nguồn gốc: Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, có khoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra. Đây cũng là loại polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải,....). Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái. Điều không may là cellulose lại "kháng" lại mạnh mẽ với các enzyme phân hủy chúng nhưng may mắn là Trichoderma lại có khả năng phân hủy cellulose mạnh mẽ. Cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật. Cellulose có nhiều trong sợi bông (95%) , sợi lanh (71%), sợi đay ( 71% ). Ngoài ra, cellulose còn có trong gỗ, thưc vật dưới nước (tảo, rong,…),sản phẩm phụ phẩm nông nghiệp ( rơm, rạ, lõi ngô,…). Hình 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 8: Hình ảnh mô tả cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật [bởi  HYPERLINK "JavaScript:location.replace('mailto:davidson@magnet.fsu.edu?SUBJECT='%20+%20document.title)" Michael W. Davidson ] Bảng 1  SEQ Bảng_1 \* ARABIC 2: Thành phần cellulose có trong một số loài thực vật Cellulase: Cấu trúc: Cellulase có 2 vùng chức năng: trung tâm xúc tác và trung tâm tạo liên kết với cellulose. Hai vùng chức năng này nối kết với nhau thông qua vùng không xúc tác [5]. Hinh 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 9: Cấu trúc không gian 3 chiều của enzyme cellulase (Ngân hàng dữ liệu protein, cấu trúc 1JS4) Trung tâm xúc tác là vị trí diễn ra hoạt động phản ứng xúc tác tạo phản ứng. Thông thường cellulose chứa duy nhất 1 trung tâm xúc tác, ngoại trừ một số trường hợp đặc biệt. Trung tâm tạo liên kết với cellulose tạo liên kết bền vững với cellulose. Đơn vị chức năng này giữ vai trò chủ đạo trong quá trình định hướng cơ chất là cellulose đến trung tâm xúc tác của cellulase. Bên cạnh đó, một số cellulose cũng tham gia vào quá trình xúc tác bằng cách cắt những chuỗi cellulose liên kết dạng tinh thể. Một số khác lại có xu hướng liên kết với cellulose vô định hình thay vì cellulose dạng tinh thể [6]. Trung tâm tạo liên kết với cellulose không phải là đơn vị chức năng đặc trưng cho enzyme thủy phân cellulose mà nó còn cấu thành tiểu đơn vị xúc tác cấu trúc cellulosome. Trung tâm tạo liên kết với cellulose liên kết thuận nghịch với cellulose nên nó được ứng dụng trong công nghệ sản xuất protein [7]. Vùng không xúc tác giữ vai trò cầu nối giữa trung tâm tạo liên kết với cellulose và trung tâm xúc tác. Đây chính là vùng đại diện cho sự tương tác giữa protein – protein và giữa protein – đường trong quá trình tổng hợp enzyme [5]. Hinh 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 10: Sơ đồ cấu trúc cellulase A. Cellulase ở nấm và một số vi khuẩn chỉ chứa 1 Trung tâm tạo liên kết với cellulose B. Cellulase ở một số vi khuẩn chứa 2 Trung tâm tạo liên kết với cellulose C. Sơ đồ cấu trúc cellulosome (cấu trúc gồm nhiều enzyme, hoạt động ngoài tế bào) Hinh 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 11: Ứng dụng trung tâm liên kết với cellulose trong sản xuất protein tái tổ hợp [7] Sử dụng phương pháp Bioseparation để phân tách cellulose sản xuất protein tái tổ hợp. (Bioseparation là quá trình tách các thành phần của hỗn hợp đi qua một cột hấp thụ để mỗi thành phần hấp thụ vào bề mặt khác nhau. Quá trình này được sử dụng để tinh chế các protein, các chất sinh học được sử dụng trong sản xuất dược phẩm và thực phẩm ). Sử dụng phương pháp Bioprocessing gắn thêm ligand vào để biến đổi cấu trúc của protein tái tổ hợp. Sử dụng enzyme để cắt protein mong muốn và thu được protein đó.  Phân loại: Ban đầu enzyme cellulase được phân chia thành 2 loại dựa trên khả năng phân hủy cellulose của enzyme: endoglucanase (EC 3.2.1.4) và cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91). Trong đó, cellobiohydrolase có khả năng phân hủy mạnh cellulose kết tinh so với endoglucanase [5]. Tuy nhiên hiện nay tồn tại một hệ thống phân loại cellulase thành 3 nhóm theo cơ chế xúc tác của enzyme [8]. CellulaseCơ chấtCơ chếSản phẩmEndo-cellulaseCellulose kết tinh Cellulose vô định hìnhCắt liên kết giữa các chuỗi celluloseChuỗi đơn celluloseExo-cellulase (cellobiohydrolase)Chuỗi đơn cellulose Cellulose kết tinhCắt liên kết nội chuỗi (1 vị trí cắt sau 2-4 glucose)Tetrasaccharides, disaccharidesCellobiaseTetrasaccharides, disaccharidesCắt liên kết glycoside giữa 2 glucoseMonosaccharideBảng 1  SEQ Bảng_1 \* ARABIC 3: Bảng phân loại cellulase [8, 9] Endo-cellulase (E.C.3.2.1.4) hay 1,4-β-D-glucan 4 glucanohydrolase tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose. Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh. Exo-cellulase (E.C.32.1.91) hay 1,4-β-D glucan cellobiohydrolase cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose (tetrasaccharides, disaccharides). Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endo-cellulase phân giải chúng. Cellobiase (E.C.3.2.1.21) cò được gọi là β-glucosidase, tham gia thủy phân cellobiose, tạo thành glucose. Chúng không có khả năng phân hủy các sợi cellulose. Cơ chế hoạt động: Quá trình phân hủy cellulose được diễn ra qua nhiều bước: Cellulase liên kết với cellulose thông qua trung tâm liên kết với cellulose trên enzyme (giai đoạn 1). Enzyme định hướng vị trí liên kết dễ phân giải trên bề mặt cơ chất (giai đoạn 2). Hình thành phức hệ enzyme – cơ chất ( giai đoạn 3 ). Thủy phân liên kết β-glycosidic nhờ β- glucosidase là một phần nhỏ trong số các protein ngoại bào do T.reesei tiết ra. β- glucosidase nội bào hoặc gắn kết với màng tế bào cũng được nhiều tác giả nghiên cứu. Song mối quan hệ chính xác về gen và sinh hóa giữa các enzyme này chưa được làm sáng tỏ ( giai đoạn 4 ). Desorption of cellulases from the substrate or repetition of step 4 or steps 2/3 if only the catalytic domain detaches from chain (giai đoạn 5 ). Thủy phân cellobiose tạo thành glucose bởi β-glucosidase. Ngoài ra, sản phẩm ức chế và sự biến đổi cơ chất cùng với quá trình thủy phân thì ảnh hưởng tới các bước trên ( giai đoạn 6 ). Hinh 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 12: Sơ đồ cơ chế hoạt động của cellulase [10]. Các bước 1 – 4 để tạo thành sản phẩm cellobiose Bước 1 — vùng xúc tác kết nối với vùng liên kết nhờ tác nhân liên kết linker Bước 2 — xác định vị trí của chuỗi kết thúc Bước 3 — hình thành phức hệ enzyme – cơ chất Bước 4 — thủy phân liên kết β-glycosidic để tạo sản phẩm là cellobiose. Hệ thống cellulase ở Trichoderma reesei : Nhiều loại vi nấm có khả năng sản sinh enzyme phân hủy cellulose. Đó là các loại nấm mùn mềm, nấm mùn nâu, nấm mùn trắng, nấm kỵ khí trong dạ dày loài ăn cỏ... Các loại nấm tạo ra mùn mềm chủ yếu phân hủy polysaccharide. Trong nhóm nấm này, khả năng sinh sản các enzyme phân hủy cellulose cũng khác nhau. Loài nấm có khả năng sinh sản hàng loạt enzyme phân hủy cellulose và được nghiên cứu kỹ là T. viride (reesei). Trichoderma tiết ra một lượng lớn các enzyme khác nhau, có khả năng phối hợp để phân hủy tinh thể cellulose. T. reesei sản sinh 5 enzyme endoglucanase, hai exoglucanase và một cellobiase (β-glucosidase) [8, 11]. EnzymeEC 3.2.1Kí hiệuCD thuộc họEndo-cellulase I II III IV V 4 4 4 4 4 EG I EG II EG III EG IV EG V 7/C 5/A5 12/H 61 45/KExo-cellulase I II 91 91 CBH I CBH II 6/B 7/CCellobiase21BGBảng 1  SEQ Bảng_1 \* ARABIC 4: Tóm tắt các loại enzymee có mặt trong T.reesei [8, 11]. Cellulase từ T.reesei là glycoprotein trong đó saccharide liên kết với gốc asparagin (liên kết qua N) hoặc với gốc serin và threonin (liên kết qua O). Hàm lượng đường của cellulase thay đổi từ 1 đến 10% bao gồm mannose, glucose, galactose, xylose, N-Acetyl glucozamin và galactozamin. Liên kết N-glycozyl tạo ra cấu hình đặc biệt ổn định cấu trúc của cellulase, nhờ đó, bảo vệ cellulase khỏi bị phân hủy protein trong quá trình tiết enzyme. Trong khi đó, liên kết O-glycozyl cấn thiết để tạo hoạt tính cellulase . Endoglucanase có tác dụng thủy phân liên kết β-1,4-glycoside tại các điểm bất kỳ trên mạch phân tử cellulose. Nhờ đó, độ trùng hợp các phân tử giảm nhanh, đồng thời xuất hiện thêm các nhóm khử. Trong 5 loại endoglucanase tiết ra bởi T.reesei, EG I chiếm tỷ lệ cao nhất khoảng 5÷10% tổng số protein tiết ra khi nuôi cấy T. reesei. Mặc dù cơ chế hoạt động khác nhau, EG I và CBH I có mạch tận cùng chứa N giống nhau. EG III có các dạng khác nhau, với khối lượng phân tử 48, 48 và 37 kDa và điểm đẳng điện tương ứng ở 5,4; 5,7 và 4,8 . Exoglucanase phân hủy cellulose theo phương thức tách dần từng đoạn cellobiose khởi đầu mạch không có tính khử của phân tử cellulose. Các enzyme này tác dụng rất hạn chế lên dẫn xuất của cellulose như cacboxycellulose và hydroxyetylcellulose. CBH I và CBH II khác nhau về số lượng đường gắn kết với protein. Thành phần aminoaxit không giống nhau. Tâm hoạt động của hai enzyme này cũng khác nhau, do đó, phương thức hoạt động có những nét riêng. CBH I ưu tiên liên kết với vùng tinh thể của cellulose, trong khi đó, CBH II liên kết cả vùng tinh thể và vùng vô định hình. CBH I chiếm khoảng 60% lượng enzyme do T.reesei tạo ra. Hình 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 13: vùng xúc tác của các enzyme [] Cellobiase chỉ là một phần nhỏ trong số các protein ngoại bào do vi sinh vật tạo ra. Các enzyme làm xúc tác cho quá trình thủy phân Cellodextrin tan trong nước cũng như hợp chất alkyl- và aryl-β-glucoside. Cellobiase nội bào hoặc cellobiase gắn kết với màng tế bào cũng được nhiều tác giả nghiên cứu. Song mối quan hệ chính xác về gen và sinh hóa giữa các enzyme này chưa được làm sáng tỏ. Có ý kiến cho rằng enzyme ngoại bào xuất hiện do sự giải phóng enzyme nội bào cũng như enzyme gắn kết với màng tế bào và thoát ra ngoài theo cơ chế tự phân giải . Cellulase từ T.reesei tồn tại dưới dạng tổ hợp đa enzymee (cellulosome) và ít tồn tại dưới dạng từng enzyme biệt lập. Cellulosome thủy phân hiệu quả cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của cellulose. Trong khi đó, các enzyme đơn lẻ hoặc kể cả hỗn hợp của chúng không thực hiện đồng thời cả hai chức năng trên . Quá trình sản xuất enzyme cellulase được kiểm soát theo cơ chế cảm ứng và ức chế. Trong đa số vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp cellulose được xúc tiến nhờ sản phẩm phân hủy của cellulose. Về phương diện này, các endoglucanase được nghiên cứu nhiều nhất. Một số nhà khoa học nhận thấy P.chrysosporium và G.trabeum tạo ra endoglucanase trong môi trường chỉ chứa cacboxymetylcellulose, cellobiose. Hiện tượng này không xảy ra đối với T.reesei . Cellobiose chỉ gây cảm ứng cho cellulase trong trường hợp T.reesei khi quá trình thủy phân cellobiose giảm đi bằng cách thêm nojirimixin vào môi trường nuôi cấy. Các sản phẩm khác của quá trình phân hủy cellulase như xenlobiono-1.5-lacton hoặc sản phâm oxy hóa cellulose cũng làm tăng khả năng hình thành cellulase từ T.reesei . Glucose là sản phẩm cuối của quá trình thủy phân cellulase. Glulcose gây hiện tượng ức chế endoglucanase ở T.reesei . Tính chất xúc tác của cellulase nhờ vào khả năng hoạt động phối hợp của toàn bộ hệ thống enzyme cellulose. Nó phụ thuộc vào tỉ lệ các enzyme riêng biệt và mức độ bão hòa của cơ chất và loại cơ chất. Hoạt động phối hợp của CBH I và CBH II cùng với EG I và EG III tinh chế từ T.reesei đã được đánh giá với các cơ chất khác nhau cho thấy rằng sự phối hợp giữa các EG và CBH II theo phương thức thông thường đối với endoenzymee và exoenzymee. Trong khi đó, sự phối hợp hoạt động giữa các EG và CBH I lại phụ thuộc vào đặc trưng cấu trúc của cơ chất. Hoạt tính của enzyme riêng biệt từ T.reesei là cao nhất đối với cellulose vô định hình. Trong khi đó, hệ enzymee hai cấu tử CBH I/EG III và CBH I/CBH II có khả năng phối hợp tốt hơn đối với cellulose tinh thể . Hình 1  SEQ Hinh_1 \* ARABIC 14: Cơ chế enzym thủy phân cellulose . Hai cellobiohydrolases (CBH) tấn công vào vùng cellulose tinh thể ở chuỗi kết thúc và endoglucanases (EG) ở giữa khu của cellulose. Các vòng tròn đầy, ký hiệu là R, đại diện cho vùng kết thúc giảm và các vòng tròn mở, ký hiệu NR, đại diện cho vùng kết thúc không giảm. C là vùng cellulose kết tinh[ Teeri, 1997 ]. Quá trình sản sinh cellulase ở T.reesei còn chịu sự chi phối của các hiện tượng khác, ngoài hiệu ứng cảm ứng vá ức chế của các sản phẩm phân hủy. Nhiều loại hợp chất phenol đã được chứng minh là có tác dụng kìm hãm sự phát sinh cellulase ở T.reesei. Ngoài ra, các hợp chất phenol gây ức chế endoglucanase ở thể đột biến T.reesei không tạo ra phenol oxidase, nhưng không ức chế đối với thể hồi biến không tạo phenol oxidase và loại thông thường . Hơn nữa, hoạt tính của cellulase trong chất lọc nuôi cấy nấm không những phụ thuộc và sự điều tiết sinh tổng hợp cellulase mà còn phụ thuộc vào sự có mặt của các chất ức chế trong môi trường nuôi cấy. Gluconolacton là chất ức chế mạnh đối với cellobiase ở T.reesei. Sự kìm hãm hoạt động của cellobiase khi có mặt gluconolacton hoặc nojirimixin có thể ngăn ngừa hiệu ứng cảm ứng của cellulase. Song, ngoài hiện tượng ức chế, khi nuôi cấy nấm cũng xảy ra hiện tượng hoạt hóa cellulase. Chẳng hạn, theo báo cáo gần đây thì T. reesei sinh ra hai loại β-glucosidase là Bgl1 và Bgl2 được tạo ra trong điều kiện phân hủy cellulose có khả năng làm tăng tới 10 lần hoạt tính endoglucanase của T.reesei (Alinda A. Hasper et al., 2001). Hệ gene qui định cellulase ở T.reesei EnzymeGenCellobiohydrolase I II Cel7A Cel6AEndoglucanase I II III IV V Cel7B Cel5A Cel12A Cel61A Cel45ABảng 1  SEQ Bảng_1 \* ARABIC 5: Tóm tắt các gen qui định cellulase ở nấm T.reesei Phần 2: Phương pháp tác động để nâng cao khả năng phân hủy cellulose cao Phương pháp hiện đại: Nâng cao khả năng sản xuất cellobiohydrolases ( CBH ) ở chủng T.reesei Khuếch đại biểu hiện cbh1 bằng cách tăng số bản sao gen cbh1: Plasmid pALK496 (Hình 21) đã được xây dựng và chuyển vào nấm T. reesei ALKO2221 để tăng số lượng bản sao của gen cbh1. Hinh 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 1: Plasmid pALK496 sử dụng cho biến đổi của chủng ALK02221 nhằm sản xuất lượng lớn CBHI [ Kelly và Hynes, 1985 ]. a. Khảo sát sự tồn tại của đoạn ADN cần chèn vào các chủng biến đổi: Kết quả Southern Blotting cho thấy vạch có kích thước 4,5 kb, 3 kb và 2.3 kb tương ứng casset biểu hiện cbh1, amdS và đoạn egl1 tìm thấy ở những chủng ALKO3760, ALKO3761 và ALKO3862 . Vạch 4.5 kb của chủng ALKO3762 và chủng ALKO3760 đậm hơn so với vạch 4.5 kb của chủng ALKO3761, chứng tỏ số lượng bản sao casset biểu hiện cbh1 của chủng ALKO3762 và chủng ALKO3760 nhiều hơn. Vạch 2.0 kb (pALK496 phân đoạn bởi enzyme cắt giới hạn Xba1) của chủng ALKO3862 và chủng ALKO3760 chứng tỏ chúng chứa 2 bản sao liên tiếp của đoạn ADN tách ra từ pALK496. Vạch 6 kb, 3.3 kb, 2.1 kb, 1.9 kb của chủng ALKO3760 chứng tỏ chủng chứa một phần casset biểu hiện cbh1. Như vậy, ALKO3862 chứa ít nhất 2 bản sao cbh1 và 2 đoạn sao chép này nằm liên tiếp nhau. ALKO3760 chứa ít nhất 2 bản sao cbh1, trong đó, đoạn sao chép thứ 2 chưa hoàn chỉnh là đoạn ADN chứa trong plasmid pALK496). Hình 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 2: Kết quả Southern Blot ở các chủng biến đổi. Giếng 1 và 2: marker Giếng 3: ALKO2221, giếng 4: ALKO3760, giếng 5: ALKO3761, giếng 6: ALKO3862. b. Khảo sát khả năng tổng hợp cellulase ở các chủng: Các chủng biến đổi được khảo sát khả năng tổng hợp cellulase bằng phương pháp filter paper-hydrolyzing activity (FPU). So với chủng chủ ALKO2221, lượng CBHI tăng 1.5 lần ở chủng ALKO3760, 1.4 lần ở chủng ALKO3862 và 1.3 lần ở chủng ALKO3761 (bảng 2 1). Ngoài ra, những thay đổi trong số lượng của CBHII và EGI đã được tìm hiểu. Số lượng CBHII giảm 25% ở chủng ALKO3760 và chủng ALKO3862, nhưng ở chủng ALKO3761 lượng CBHII đã tăng 15% so với chủng chủ ALKO2221. Đáng ngạc nhiên, số lượng EGI giảm 30% và 40% trong ALKO3760 và chủng ALKO3862 so với chủng chủ ALKO2221, mặc dù các gen egl1 được giữ nguyên vẹn trong bộ gen. Mức độ tiết ra các protein tăng lên so với chủng chủ. ChủngSố bản sao casset biểu hiện cbh1CBHI (mg/ml)CBHII (mg/ml)EGI (mg/ml)ALK0222102.2±0.10.18±0.010.32±0.01ALK0376023.4±0.20.13±00.22±0ALK0386223.1±0.10.13±0.010.17±0.01ALK0376113.0±0.20.22±0.040.00Bảng 2  SEQ Bảng_2 \* ARABIC 1: Sản xuất cellulase bởi chủng chủ ALK02221 và bởi chủng đã biến đổi ALK03760, ALK03862, ALK03761. Khuếch đại biểu hiện cbh2 bằng cách sử dụng promoter mạnh cbh1: Casset của pALK546 (hình 23) chứa promoter mạnh cbh1 biến nạp vào chủng ALKO2221 nhằm điều khiển biểu hiện cbh2 bằng promoter cbh1. Chủng biến đổi được phân tích bằng phương pháp Southern Blot nhằm khẳng định sự tồn tại của đoạn promoter. Hinh 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 3: Plasmid pALK546 sử dụng cho biến đổi của chủng ALK02221 nhằm sản xuất lượng lớn CBHII . Hình 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 4: Kết quả Southern Blot của các chủng biến đổi. ADN toàn phần được phân cắt bởi enzyme cắt giới hạn XhoI. Sản phẩm của quá trình này được lai với đoạn ADN của pALK 546 được phân cắt bởi EcoRI và BamHI. Giếng 1 và 6: khối lượng phân tử marker , Giếng 2: ALKO2221, giếng 3:ALKO3798, giếng 4: ALKO3799, giếng 5: ALKO3873 Locus của cbh1 và cbh2 có kích thước 9.1 kb và 9.8 kb nằm trên cùng một vị trí kích thước được tìm thấy ở mọi chủng. Vạch có kích thước 4.9 kb tương ứng đoạn gen ble liên kết với promoter cbh1( ble-cbh1 promoter), vạch có kích thước 3.4 kb tương ứng đoạn cbh2 và đầu 3’ của gen egl2, vạch có kích thước 2.3 kb là đoạn 5’ của gen egl2 liên kết với ble. Kết quả cho thấy chủng ALKO3898 và ALKO3899 chứa 1 bản sao có nguồn gốc từ plasmide pALK546 tuy nhiên vị trí chèn của bản sao này chưa được xác định. Một số nghiên cứu tiếp theo cho thấy chủng ALKO3873 chứa 1 bản sao chèn vào vị trí egl2. Hình 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 5: Kết quả Southern Blot ở các chủng biến đổi. Làn 1: marker, kDa, làn 2: ALK02221, làn 3: ALK03873, làn 4: ALK03798, làn 5: ALK03799. Làn 1: ALK02221, làn 2: ALK03873, làn 3: ALK03798, làn 4: ALK03799. Kết quả SDS-PAGE cho thấy ở 3 chủng biến đổi, lượng CBHI/II được tổng hợp nhiều hơn so với chủng đối chứng dựa vào độ đậm của các vạch. Khảo sát lượng CBHII tổng hợp bằng Western Blot, độ đậm của các vạch phản ánh lượng CBHII cao được tìm thấy ở cả 3 chủng biến đổi. Lượng CBHII tăng từ 3- 4 lần khi ta tăng thêm số lượng bản sao gen cbh2 dưới sự điều khiển của promoter mạnh cbh1. Chủng ALK03798 (chứa EGII ) sản xuất lượng lớn CBHII (gấp 4 lần so với chủng chủ ALKO2221). ALK03873 (không chứa EGII) và ALK03799 (chứa EGII) sản xuất lượng CBHII lớn gấp 3 lần so với chủng chủ. Chủng ALKO3798 và ALKO3799 sản xuất lượng CBHI khoảng 20% và ALKO3873 khoảng 10% so với chủng chủ. Lượng endoglucanase giảm 20% ở chủng ALKO3798 và ALKO3799. Như vậy thiếu gen egl2 trong chủng ALKO3873 là nguyên nhân làm giảm lượng endoglucanase. ChủngCBHI (mg/ml)CBHII(mg/ml)EGI(mg/ml)ALK022210.18±0.010.18±0.010.32±0.01ALK037980.70±0.070.70±0.070.31±0.05ALK037990.50±0.050.50±0.050.28±0.01ALK038730.53±0.170.53±0.170.39±0.10Bảng 2  SEQ Bảng_2 \* ARABIC 2: Sản xuất cellulase bởi chủng ALKO2221 và chủng ALKO3797, ALKO3798, ALKO3873. Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG ) ở chủng T.reesei bằng cách sử dụng promoter mạnh : T.reesei VTT-D-79125 là chủng đột biến sản xuất lượng lớn cellulase gồm EGI/II, CBHI/II. ALKO2698 là chủng sản xuất lượng lớn EGI không chứa gen cbh1- được thay thế bởi casset biểu hiện egl1. Vì vậy, hai chủng này được sử dụng như thể nhận plasmid nhằm tạo chủng biến đổi có khả năng sản xuất lượng lớn EGII. Endoglucanase sản xuất bởi chủng biến đổi EGII liên quan đến số lượng bản sao của casset biểu hiện egl2. Chủng T.reesei sản xuất lượng lớn EGI/II và không tổng hợp CBHI/II được xây dựng bằng cách thay cbh2 bằng gen egl2. Các chủng được biến đổi nhờ vào pALK537 và pALK540. pALK537 gồm promoter cbh1 kich thước 2.2 kb và đoạn AvaII của vùng kết thúc cbh1 có kích thước 0.7 kb. pALK540 chứa promoter cbh1, nhân tố kết thúc và egl2 như trong pALK537. Hình 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 6: Sơ đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid pALK537. egl2 được nối với promoter cbh1. Đoạn NotI 9.2 kb thì được tách ra từ plasmid để thực hiện biến đổi. Hình 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 7: Giới hạn của plasmid pALK540. Đoạn ClaI-PvuI 11.6 kb thì được tách ra từ plasmid để thực hiện biến đổi. Biến đổi chủng T.reesei : để gen egl2 biểu hiện cho lượng lớn EG, promoter mạnh của gen cbh1 được dùng nhằm điều khiển biểu hiện gen egl2. Tương tự như nghiên cứu trình bày phần trên, các chủng biến đổi được phân tích bằng Southern Blot nhằm xác định số lượng bản sao của egl2. . Hình 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 8: Southern blotting của chủng ALKO3530 và ALKO3574 . Chủng ALKO3574 chứa 1 bản sao egl1 trong pALK537 tại locus cbh1 trong khi chủng ALKO3530 chứa 2 bản sao egl1 tại cùng vị trí. Hơn nữa, lượng EGI, CBHI/II cũng được phân tích cụ thể. Bảng 2  SEQ Bảng_2 \* ARABIC 3: Sản xuất cellulase bởi chủng chủ VTT-79125 và các chủng đột biến sản xuất lượng lớn EGI. NA- chưa xác định Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG ) ở chủng T.reesei bằng cách nhân bản và biểu hiện gen khác loài : Nhân bản gen cellulase từ Melanocarpus albomyces và biểu hiện chúng ở T.reesei do nhiều nghiên cứu tìm thấy ở Melanocarpus albomyces có 3 gen hiệu quả sản xuất cellulase đó là :Cel7A, Cel45A, Cel7B. Nếu những gen này hoạt động dưới sự điều khiển của promoter mạnh cbh1 ở T.reesei biến đổi gen có thể sẽ cho sản lượng endoglucanase cao ở chủng biến đổi M.albomyces (ALKO237, CBS685.95) sử dụng như là chủng cho gen cellulase. Chủng E.coli XL1-Blue MRA sử dụng như chủng chủ tạo thư viện gen cho M.albomyces. T.reesei ALKO3620 (gen egl2 xóa bỏ) là chủng để biến đổi. T.reesei ALKO4072 là chủng không chứa gen cbh1, egl2 dùng như chủng đối chứng. ADN nhiễm sắc thể của M.albomyces thì được phân đoạn bởi enzyme cắt giới hạn Sau3A. Đoạn ADN 5- 15 kb liên kết Lambda DASHRII và được biến nạp vào trong tế bào E.coli XL-Blue MRA. Các gen cel45A, cel7A, cel7B được khuếch đại bằng PCR. Các primer sử dụng để khuếch đại gen. CellulasePeptidePrimercel45A #429 #28-rev  Cel7A #507 #509-rev Cel7B#636 #534-rev  Bảng 2  SEQ Bảng_2 \* ARABIC 4: Các primer để khuếch đại gen egl 20-50 kDa và cbh 50kDa của M.albomyces bằng phương pháp PCR. Plasmids Plasmid pALK1231 và pALK1235 được xây dựng cho biểu hiện của gen cel45A của M.albolyces. pALK1231 và pALK1235 chứa vùng casset biểu hiện : đoạn cel45A 0.9 kb khởi đầu với 1 ATG dưới sự kiểm soát của promoter mạnh cbh1 của T.reesei 2.2 kb và đoạn AvaII 0.7 kb là phần kết thúc của cbh1. pALK1231 chứa thêm 1 đoạn BamHI-EcoRI 1.7 kb của cbh1 và đoạn SpeI-XbaI 3.1 kb của gen amdS. pALK1235 gồm 1 đoạn ScaI-StuI egl1 đầu 5’ dài 1.8 kb và ScaI-XhoI egl1đầu 3’ kích thước 1.6 kb và 1 đoạn NotI-PvuII 2.2 kb. pALK1238 và pALK1240 được xây dựng cho biểu hiện của gen cel45A của M.albomyces. pALK1231 và pALK1235 biểu hiện của gen cel7A bắt đầu bằng ATG. pALK1242 xây dựng cho biểu hiện của gen cel7B. Hình 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 9: Các plasmid được sử dụng cho biến đổi T.reesei ALK3620 biểu hiện gen cel45A, cel7A, cel7B ở M.albomyces. Các chủng sau biến đổi được kiểm tra sự có mặt của gen biến đổi và khảo sát lượng CBHI, EGI được tổng hợp bởi các chủng. Kết quả Bản sao thay thế vào chủng biến đổi ALKO3620/1231/14, ALKO3629/1231/16, ALKO3620/1235/49 và ALKO3620/1235/40 sản xuất đạt 2100–2500 NCU/ml ở 70 ◦C (bảng ). Phân tích cassette biểu hiện thì thấy rằng hoặc là locus cbh1 hoặc egl1 không có ảnh hưởng đáng kể tới mức độ hoạt động tạo enzyme. Hoạt động của enzyme endoglucanase của chủng ALKO3620/1235/40 và ALKO3620/1235/49 biến đổi tạo EGI thì thấp hơn so với chủng ALKO3620/1231/14 và ALKO3620/1231/16 biến đổi tạo CBHI.endoglucanase hoạt động tối ưu ở 700C sau 20 phút. Chủng biến đổi sản xuất lượng endoglucanase cao hơn so với chủng chủ M. albomyces ALKO4237 (bảng 2.5) Khoảng 38% chủng biến đổi ALKO3620/pALK1238 thì không tạo CBHI và khoảng 23% chủng biến đổi ALKO3620/ pALK1240 thì không tạo EGI. Gen cbh1 của T.reesei thì được thay thế bởi 1 bản sao của đoạn plasmid pALK1238 biểu hiện trong ALKO3620/1238/42 và gen egl1 được thay thế bởi 1 bản sao của pALK1238 biểu hiện trong ALKO3620/1240/32. Trong môi trường nuôi cấy bề mặt, chủng ALK3620/1238/42 tạo ra 4700 NCU/ml ở 50 ◦C, và 6000 NCU/ml ở 70 ◦C. ALKO3620/1240/32 tạo ra 1700 NCU/ml ở 50 ◦C và 3500 NCU/ml ở 70 ◦C. Bảng 2  SEQ Bảng_2 \* ARABIC 5: Sản xuất cellulase bởi chủng M. albomyces ALKO4237, chủng chủ Trichoderma ALKO3620 (egl2) và chủng T.reesei biến đổi sao chép cel45A, cel7A và cel7B thay thế gen cbh1 hay egl1. n.a-không xác định Phương pháp cổ điển: Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên hình thái T.reesei và việc sản xuất enzyme cellulase. Tóm tắt Mục đích của nghiên cứu này là xác định hình thái của nấm ảnh hưởng như thế nào đến khả năng sản xuất cellulase ở Trichoderma reesei nuôi cấy trong môi trường lactose và lactobionic acid kiểu fed-batch trong bồn bioreactor 7 lít. Khi cho cellulose vào dịch chiết nấm men từ môi trường nuôi cấy đã cho hiệu suất sản xuất enzyme cao nhất với thể tích enzyme có hoạt tính 69.8U/L.h, và sinh khối nấm men cực đại là 14.7g/l . Những phát hiện này kèm theo đặc điểm hình thái của nấm: tổng sợi nấm là 98% tổng diện tích ước lượng, với chiều dài sợi nấm 10mm, thể tích 45.1 mm3, đường kính 7.9μm, số lượng nhánh 9, và số lượng đỉnh mỗi sợi nấm là 29. Một sự tương quan rõ ràng đã được tìm thấy giữa các sợi nấm, số lượng đỉnh và khả năng sản xuất enzyme cellulase. Chủng và bào tử T.reesei C30 Môi trường nuôi cấy trung gian Môi trường sản xuất Đĩa petri Bioreactor Xác định nồng độ cellulose Xác định lượng sinh khối khô Quan sát hình thái Chủng T.reesei RUT-C30 được cấy truyền vào môi trường thạch potato dextrose (potato dextrose agar-PDA) vô trùng trong đĩa petri. Đĩa PDA sau đó được ủ ở 300C trong 7 ngày ( đến khi sự hình thành bào tử xảy ra tốt) và sao đó bảo quản ở nhiệt độ 40C và giữ ở -800C để sử dụng lâu hơn. Kích thước bào tử nấm có thể tính bằng phương trình dưới, giả sử các bào tử có hình cầu và cả hai kích thước của chúng giống như hình tròn. Trong đó: Vs là thể tích bào tử và Ds là đường kính bào tử. Kích thước sợi nấm được ước lượng khi sợi nấm được xem như là một hình trụ rắn. Kích thước của sợi nấm có thể tính bằng công thức sau: Trong đó Vh là thể tích sợi nấm, Dh là đường kính sợi nấm và Lh là chiều dài sợi nấm. T.reesei được nuôi cấy trong 4 loại môi trường khác nhau nhằm kiểm tra hình thái và kích thước bào tử cũng như sợi nấm đồng thời khảo sát khả năng sản xuất cellulase. Môi trường A: 10 g/l cellulose, 10 g/l nấm men, 10 g/l glucose, 1.4 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 0.4 g/l CaCl2.2H2O, 0.3 g/l MgSO4.7H2O, 0.005 g/l FeSO4.7H2O, 0.0037 g/l CoCl2.6H2O, 0.0016 g/l MnSO4.H2O, 0.0014 g/l ZnSO4.7H2O. Môi trường B: 10 g/l glucose, 5.1 g/l bã ngô( đã được acid hóa và làm ẩm), 1.4 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 0.5 g/l CaCl2.2H2O, 0.3 g/l MgSO4.7H2O, 0.005 g/l FeSO4.7H2O, 0.0016 g/l MnSO4.H2O, 0.0014 g/l ZnSO4.7H2O. Môi trường C: 7.5 g/l cellulose, 0.3 g/l nấm men, 0.8 g/l peptone, 3 g/l urea , 1.4 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 0.3 g/l CaCl2.2H2O, 0.3 g/l MgSO4.7H2O, 0.005 g/l FeSO4.7H2O, 0.02 g/l CoCl2.6H2O, 0.0016 g/l MnSO4.H2O, 0.0014 g/l ZnSO4.7H2O. Môi trường D: 10 g/l glucose, 6.7 g/l đạm nấm men, 4 g/l KH2PO4, 20 g/l carboxymethylcellulose (CMC). Kết quả cho thấy sinh khối khô trong môi trường A đạt đến nồng độ 14.7 g/l vào cuối giai đoạn và giảm dần sau khi thêm hỗn hợp lactose và acid lactobionic như là 1 tác nhân gây ức chế. Sinh khối khô đạt được trong môi trường B, C, D tương ứng gấp 1.6, 3.3, 2.0 lần so với môi trường A (bảng 2.5). Các sinh khối tích lũy qua thời gian, giả thiết rằng có mối quan hệ mạnh mẽ giữa tổng hợp cellulase và nồng độ của sinh khối tổng. Thành phần môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến hình thái của T.reesei Trichoderma reesei nuôi ở các môi trường khác nhau sẽ biểu hiện các hình dạng sợi nấm khác nhau và được quan sát bằng kính hiển vi điện tử như hình 2 10.Hình 2 10 minh họa thành phần môi trường ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của nấm. Các sợi nấm nảy chồi cực đại tại 120h sau đó giảm dần. Nếu nuôi cấy trong môi trường B thì các sợi nấm nảy chồi giảm 6 lần, trong môi trường C giảm 4 lần và môi trường D giảm 7 lần so với môi trường A (hình 2 10 ). Hình 2 10 cũng cho thấy hoạt động của enzyme cellulase cao điểm tại 120h. Lượng bào tử được quan sát nhiều hơn 50% trong các môi trường B, C, D (hình 2 10B). Trong môi trường A, các sợi nấm phân nhánh chủ yếu trong 10h đầu tiên của sự lên men, trong khi đó các nhánh được hình thành khoảng 24h sau khi bắt đầu của giai đoạn lên men ( hình 2 10C). Hình 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 10: sự phát triển hình thái của các sợi nấm trên các môi trường : môi trường (A), môi trường B ( B), môi trường C (C), môi trường D (D) Sự phát triển của hệ sợi nấm Hình thái của sợi nấm có thể ảnh hưởng đến năng suất tạo enzyme trong môi trường A (hình 2 11). Hình ảnh từ kính điện tử quét (hình 2 11A và 2 11B) cho thấy các sợi nấm phân nhánh nhiều, dài và linh động. các sợi nấm dài và phân nhánh làm tăng bề mặt tiếp xúc của nấm, có thể làm tăng sự tương tác với cơ chất , và do đó năng suất sản xuất enzyme cao (De Nicolas- Santiago et al.,2006). Túi bào tử và đầu bào tử đính được hình thành bởi cuống bào tử đính (hình 2 11E). Số lượng đỉnh phát triển từ sợi nấm chính là 1 dấu hiệu của sự tích lũy sinh khối trong môi trường nuôi cấy (hình 2 11C và 2 11 D). Protein được tiết ra từ sợi nấm và chủ yếu ở đỉnh của sợi nấm đang phát triển. Điều đó được giải thích là do các đỉnh có nhiều lỗ hổng làm cho nó dễ dàng cho các enzyme ngoại bào đi qua khỏi vách tế bào (Peberdy, 1994 ; Punt et al.,1994). Vì vậy, tăng số lượng các đỉnh của sợi nấm hoạt động làm tăng năng suất protein (Juge et al.,1998; Pluschkell et al., 1996). Hình 2 11 cho thấy sự phát triển của đặc điểm sợi nấm phụ thuộc thời gian. Hình 2 11D ta thấy chiều dài tối đa của sợi nấm trong môi trường A là dài nhất ( môi trường A: chiều dài tối đa là 10 mm, môi trường B là 8 mm, môi trường C là 8 mm và môi trường D là 4 mm). Hình 2 11E – H mô tả sự thay đổi đặc điểm hình thái sợi nấm phụ thuộc thời gian trong 4 môi trường thử. Trong môi trường A, đường kính sợi nấm thay đổi ngay sau đạt giá trị lớn nhất là 7.9 µm trong khi đường kính sợi nấm trong môi trường B là 6.1 µm, C là 6.2 µm, D là 4.3 µm (hình 2 11E). Hình 2 11F cho thấy sự tăng thể tích sợi nấm trong môi trường A là lớn nhất. Hình 2 11G , trong môi trường A số lượng các nhánh tăng theo thời gian trong khi số lượng nhánh mỗi sợi nấm nhỏ hơn so với môi trường khác tại điểm mà enzyme hoạt động . Trong môi trường A, số lượng đỉnh của mỗi sợi nấm đạt cực đại 29 đỉnh/ sợi nấm tại thời điểm enzyme hoạt động (120h). trong khi đó , môi trường B chỉ đạt 4 đỉnh/ sợi nấm, môi trường C là 6 đỉnh/ sợi nấm, môi trường D là 3 đỉnh/ sợi nấm (hình 2 11H). Hình 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 11: đặc điểm hình thái của sợi nấm theo thời gian trên các môi trường khác nhau. Môi trường A (), môi trường B (), môi trường C (), môi trường D (). Ảnh hưởng qua lại giữa pH và cơ chất trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sản xuất cellulase. Mỗi cơ chất và mỗi vi sinh vật nhất định thích hợp ở 1 pH khác nhau và ảnh hưởng tới sản lượng của sản phẩm. Theo báo cáo của Andreotti et al thì T.reesei sinh trưởng tốt nhất trong môi trường nuôi cấy ở pH =5 và hơi chậm ở pH 4.5 và 4. Tuy nhiên, Chahal et al. cho thấy rằng T.reesei sản xuất cellulase tối ưu ở pH=6.0. Hình 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 12: ảnh hưởng của pH đến sản lượng filter paper activity (FPA) của T.reesei QMY-1 trên cơ chất alpha cellulose. Kí hiệu: Với cơ chất là alpha cellulose (chứa 99,9% cellulose) thì hoạt tính của T.reesei tối ưu tại pH 5.0. Tại pH 5.0 và 6.0 thì lượng FPA đạt tối ưu là 3.2 và 3.0 IU/ml sau 99h (Hình 2 12). Sản lượng cellulase thấp ở pH 3.0 và 7.0. Tuy nhiên, trong các tài liệu công bố trước thì pH 3.0 (2,4,7), pH 4,0 (10), và pH 5,0 (4) cho sản lượng cellulase cao của nấm T. reesei. Trong một thử nghiệm khác , khi pH 5,0 ± 0.05, lượng cellulase đạt 4,0 IU / ml trong vòng 91 h. Hình 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 13: ảnh hưởng của pH khác nhau đến sản lượng filter paper activity (FPA) của T.reesei QMY-1 trên cơ chất CTMP. Kí hiệu : Với cơ chất là CTMP (chứa 60% cellulose, và phần còn lại là hemicelluloses và lignin) thì hoạt tính của T.reesei tối ưu ở pH 6.0. Lượng FPA thu được 2.02IU/ml tại pH 6.0 và 1.87IU/ml tại pH 5.0 sau 139h và 117 h (Hình 2 13). Ta nhận thấy rằng nếu cơ chất cảm ứng chứa nhiều cellulose thì sản lượng FPA cao và đạt sản lượng tối ưu ở thời gian ngắn hơn. Với cơ chất là alpha cellulose (chứa 99,9% cellulose) thì FPA đạt được gấp 1.5 lần so với cơ chất là CTMP (chứa 60% cellulose ). Và pH tối ưu cũng phụ thuộc cơ chất . Nếu cơ chất alpha cellulose (chứa 99,9% cellulose) thì pH tối ưu ở 5. Nếu cơ chất là CTMP (chứa 60% cellulose ) thì pH tối ưu ở 6. Ảnh hưởng của áp suất đến khả năng tạo cellulase Hình 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 14: Ảnh hưởng của áp suất đến khả năng tạo cellulase Giai đoạn đầu của quá trình lên men , các enzyme tạo thành đạt tỷ lệ cao hơn đáng kể trong ở áp suất cao ,quá trình lên men đã được gần như hoàn thành sau 48 h, năng suất tăng 12,2-16,7 FPU/1/h (Hình 2 14). Tuy nhiên, sản lượng cuối cùng của cellulases thì giống như cho quá trình lên men ở áp suất thường. Ảnh hưởng của sục khí và không sục khí đến khả năng sản xuất cellulase ở T.reesei RUT C30. Hình 2  SEQ Hinh_2 \* ARABIC 15: Ảnh hưởng của quá trình sục khí () và không sục khí () trong quá trình lên men Trong quá trình lên men đối với chủng Rut C30 thì tốt nhất lên men trong điều kiện không sục khí. Điều kiện nuôi cấy của các chủng T.reesei Bảng 2  SEQ Bảng_2 \* ARABIC 6: So sánh sản lượng tế bào thu được trong nuôi cấy liên tục của nấm T.reesei Nhận xét: chủng Trichoderma sp. đạt tối ưu trong môi trường cơ chất là glucose. Chủng Rut C30 là chủng thích hợp được với nhiều cơ chất khác nhau (glucose, lactose, mùn cưa...)và cho năng suất tương đối cao. Do đó, chủng Rut C30 đã được sử dụng khá phổ biến. PHẦN 3: KIẾN NGHỊ Hai phương pháp cổ điển và hiện đại là ở 2 bài báo cáo khác nhau. Theo tôi nghĩ, nếu có điều kiện nên khảo sát chung để tạo được chủng có khả năng sản xuất cellulase cao nhất. Bằng cách đột biến tạo chủng tốt nhất sau đó nuôi trong điều kiện tối ưu nhất. TÀI LIỆU THAM KHẢO: Tài liệu trong nước Hồ Huỳnh Thùy Dương. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Nguyễ Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương. Công nghệ lên men. Nhà xuất bản đại học quốc gia TP.HCM, 2004. Nguyễn Đức Lượng,Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Cao Cường. Công nghệ gen. Nhà xuất bản đại học quốc gia TP.HCM, 2007 Tài liệu nước ngoài G. C. Ainsworth and al. The Fungi. New York and London: Academic Press, 1, pp.1963-1973. Ainsworth and Bisby, 1995. Dictionary of the Fungi. David S. HIBBETT and al, 2007. A higher-level phylogenetic classification of the Fungi. Mycological Research, III, pp. 509 – 547. Markus Linder and Tuula T. Teeri , 1997. The roles and function of cellulose-binding domains, Journal of Biotechnology, 57, pp 15-28. Martin Schülein, 2000. Protein engineering of cellulases, Biochimica Et Biophysica Acta, 1543, pp 239 – 252. Edward A Bayer and al, 1998. Cellulose, cellulases and cellulosomes. Current Opinion in Structural Biology, 8, pp. 548 – 557. Ilan Levy and Oded Shoseyov, 2002. Cellulose-binding domains Biotechnological applications. Biotechnology Advances, 20, pp 191–213. M. L. Rabinovich and al, 2002. Microbial Cellulases. Applied Biochemistry and Microbiology, 38, pp. 305–321. Prabuddha Bansal and al, 2009. Modeling cellulase kinetics on lignocellulosic substrates. Biotechnology Advances, 27, pp. 833–848. Yong-Hong Wang et al, 2009. Production and distribution of β-glucosidase in a mutant strain Trichoderma viride T 100-14. New Biotechnology, 26, pp. 150-156.ra Tài liệu trên mạng internet K ho HYPERLINK "" www.en.wikipedia.org  HYPERLINK ""   HYPERLINK ""