Trình bày phương pháp xác định trinh tự axitnucleic bằng phương pháp hoá học của Maxam - Gilbert

PAGE  PAGE 2 Họ và Tên : Phạm Thị Phụng Lớp : K33C Khoa : Sinh – KTNN Trường : ĐHSP Hà Nội 2 Bài kiểm tra học phần: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề bài: Trình bày phương pháp xác định trinh tự axitnucleic bằng phương pháp hoá học của Maxam- Gilbert. Trả lời: Hiện nay có một số phương pháp giải trình tự AND khác nhau.Trong đó có phương pháp giải trình tự các nucleotit của A.Maxam và W.Gilbert ( còn được gọi là phương pháp hoá học). 1. Nguyên lí của phương pháp: - Đây là phương pháp phân giải hoá học của A.Maxam và W.Gilbert. - Sử dụng hoá chất để phân huỷ AND ở các vị trí bazơ đặc hiệu, tạo ra các đoạn có chiều dài khác nhau 1 nucleotit. Hoá chất tác dụngBazơ bị đứt gãyDimethylsunphatGGlicôsidicA + GHyđrazinC + THyđrazin + NaClC - Điện di các đoạn AND này và nhận biết vị trí của chúng nhờ đánh dấu phóng xạ. Dựa vào đó để đọc được trình tự của AND. 2. Các bước tiến hành - Chuỗi AND kép được đánh dấu phóng xạ với 32P tại đầu cuối 5’ nhờ enzim Poli nucleotit kinaz và 32P-dATP - Dùng Dimethylsunphoxit đun nóng đến 900 và điện di để biến tính và tách dời 2 sợi đơn - Chia các sợi đơn thành 4 mẫu riêng rẽ và được xử lí với các hoá chất đặc hiệu để phá hỏng một hoặc hai trong bốn bazơ nitơ. - Sử lí tiếp các mẫu này với Piperidin để bẻ gãy AND tại vị trí bazơ đã phá hỏng. - Điện di riêng rẽ 4 mẫu trên cùng 1 gel điện di, làm phim phóng xạ tự ghi và đọc vị trí của các nu lần lượt trên 4 mẫu từ cực dương lên cực âm của gel theo nguyên tắc: Đoạn AND càng ngăn càng chạy xa so với điểm xuất phát trên bản điện di đồ. 3. Ví dụ: Cho đoạn mạch đơn AND 5’ ATTGACTTAGCC 3’ ↓Gắn 32P vào đầu 5’ * ATTGACTTAGCC ↓xử lí hoá chất G * ATT * ATTGACTTA * ATTGACTTAGCC A+ G * ATT * ATTG * ATTGACTT * ATTGACTTA * ATTGACTTAGCC C+T * A * AT * ATTGA * ATTGAC * ATTGACT * ATTGACTTAG * ATTGACTTAGC * ATTGACTTAGCC C * ATTGA * ATTGACTTAG * ATTGACTTAGC * ATTGACTTAGCC ↓ điện di trên 1 gel + chụp phóng xạ Trình tự AND: 5’ ATTGACTTAGCC 3’