Ứng dụng kỹ thuật Elisa chẩn đoán bệnh dịch tả heo

1  BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC [\ BÀI BÁO CÁO ĐÊ TÀI 09: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ HEO Giáo viên hướng dẫn : Sinh viên thực hiện: TS.NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN XUÂN KHÁNH Lớp: DH06SH MSSV: 06126055 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 2  Phụ lục: I.Đặt vấn đề ...................................................................................3 I.1. Đặt vấn đề ................................................................................3 I.2. Mục tiêu....................................................................................3 II. Tổng quan ..................................................................................4 II.1Giới thiệu về dịch tả heo............................................................4 II.1.1 Hình thái cấu trúc virus dịch tả heo .......................................4 II.1.2.Tính chất kháng nguyên........................................................5 II.1.3. Tính sinh miễn dịch ..............................................................5 II.2.Nguyên lý sử dụng bộ Kit Elisa: ...............................................5 III. Vật liệu và phương pháp tiến hành ...........................................6 III.1. Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm ...........6 III.2.Phương pháp tiến hành:..........................................................7 III.2.1.Chuẩn bị ...............................................................................7 III.2.2.Phương pháp: ......................................................................7 III.2.2.1.Phân phối đối chứng và mẫu.............................................7 III.2.2.2.Thêm kháng huyết thanh...................................................8 III.2.2.3. Thêm conjugate:...............................................................8 III.2.2.4. Phát hiện: .........................................................................9 III.2.2.5. Xử lý số liệu......................................................................9 IV. Tài liệu tham khảo:..................................................................10 3  I.Đặt vấn đề I.1. Đặt vấn đề Nghành chăn nuôi hiện nay đóng vai trò rất quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Bên cạnh những thành công trong chăn nuôi, sự hiện diện của một số dịch bệnh vẫn thường xuyên gây tổn thất đáng kể trong nghành chăn nuôi. Một trong những yếu tố nguy cơ phải kể đến là bệnh dịch tả heo. Bệnh xuất hiện trong cả nước, xảy ra tương đối nghiêm trọng ở nhiều tỉnh thành phía nam. Bệnh có tốc độ lây lan nhanh, xảy ra ở mọi lứa tuổi ở heo, trên gia súc non, tỷ lệ chết có thể lên tới 100%. Heo nái mang trứng tạo cảm nhiễm qua nhau thai, gây chết phôi, sẩy thai…..Vì vậy, tổ chức dịch tể thế giới xếp bệnh này thuộc bảng A, là bảng danh mục các bệnh nguy hiểm nhất. Xuất phát từ tình hình trên, nên việc nghiên cứu các phương pháp phát hiện bệnh là yêu cầu cấp thiết để phòng chống bệnh, giảm tổn thất trong chăn nuôi, giữ cho đàn heo mắc bệnh ở tỷ lệ thấp nhất. Có nhiều phương pháp phát hiện bệnh đã được nghiên cứu, trong bài này tôi sẽ trình bày về phương pháp ELISA gián tiếp để phát hiện virus dịch tả heo. I.2. Mục tiêu: Sử dụng bộ kit Elisa để phát hiện bệnh dich tả heo sớm. 4  II. Tổng quan II.1Giới thiệu về dịch tả heo II.1.1 Hình thái cấu trúc virus dịch tả heo a. Phân loại Họ Flavividae Giống Pestivirus Virus dịch tả heo rất gần về mặt cấu trúc gen và cấu trúc kháng nguyên vơi các loài như sau: Bovine diarrhea virus Equine arteritis virus Border diesease virus b.Hình thái, cấu tạo: Kích thước nhỏ 40-50 nm Có dạng hình cầu với cấu trúc nucleocapsid đối xứng 20 mặt Bộ gen virus là một chuỗi RNA, độ dài khoảng 12.5kb, một khung đọc mở (ORF) Có vỏ bọc, trên vỏ có tua gai với bản chất glycoprotein.Virus dịch tả heo có glycoprotein E1 (55 kDa) và E2 (46 kDa) ở trên bề mặt và một protein 36 kDa của nucleocapsid. Protein cấu trúc: P14 tạo nucleocapsid, gp48, gp 25, gp 53. P125 là protein không cấu trúc, có một đầu amio acid rất ưa nước và hoạt tính protease. Người ta cho rằng protein này tham gia vào quá trình nhân đôi DNA. c. Tính chất lý hóa Virus dịch tả heo được coi là virus có sức đề kháng yếu. Ổn định ở PH 5-10, ngoài khoảng PH này thì virus bị phá hủy nhanh. Những chất tan lipid như ether, chloroform và deoxycholate làm bất hoạt virus nhanh. 5  II.1.2.Tính chất kháng nguyên Kháng thể kháng virus dịch tả heo có thể phát hiện bằng kỹ thuật huyết thanh học khác nhau như phản ứng trung hòa, kết tủa khuếch tán trên thạch, kết hợp bổ thể, miễn dịch huỳnh quang, ngưng kết hồng cầu thụ động. Chỉ có một typ kháng nguyên dịch tả heo, tuy nhiên, những nghiên cứu định lượng bằng phản ứng trung hòa huyết thanhcho phép phân biệt hai nhóm phụ vì huyết thanh: Nhóm phụ A: bao gồm những chủng cường độ chủng độc lực thấp, chủng biến đổi. Nhóm phụ B: chủng độc lực thấp gây xáo trộn sinh sản. II.1.3. Tính sinh miễn dịch Miễn dịch xuất hiện trên heo khỏi bệnh dịch tả heo thì dài và chắc chắn. Tuy nhiên, những chủng virus dịch tả heo mãn tính hay cận lâm sàng có tính sinh miễn dịch yếu. Tính sinh miễn dịch cũng truyền cho heo con (qua sữa đầu) của những heo nái khỏi bệnh, tính miễn dịch này duy trì khoảng 6 tuần lễ. II.2.Nguyên lý sử dụng bộ Kit Elisa: Dưa trên nguyên tắc kết hơp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Kit SERELISA® HCV Ag sử dụng kỹ thuật miễn dịch gián tiếp cho việc phát hiện kháng nguyên (p125 không cấu trúc protein), mà nó có tối thiểu một epitope chung cho tất cả các dòng Hog Cholera Virus. Việc phát hiện được thực hiện trực tiếp trên mẫu máu, huyết tương , huyết thanh, bạch cầu, hoặc dịch chiết mô, cho phép xác định sớm những heo bị nhiễm virus. Gồm 4 bước: 1. Các đối chứng và mẫu được cho vào những giếng có kháng thể đơn dòng kháng HCV (p125). Protein của virus hiện diện trong mẫu gắn với những vị trí chuyên biệt. 6  2. Sau đó là một bước rửa để loại bỏ những đoạn không liên kết, thêm vào kháng huyết thanh thỏ kháng HCV. Nó sẽ gắn kết với kháng nguyên hiện diện trong mẫu. 3. Tiến hành rửa lần hai, sau đó cho kháng thể dê kháng kháng thể thỏ có gắn enzyme peroxidase cho phép phát hiện dạng kháng huyết thanh thỏ kháng HCV theo phức hợp: (Mab) - (Ag HCV [p125]) - (Rabbit Ig anti-HCV [p125]) - (Goat Ab anti-rabbit Ig /peroxidase). 4. Sau bước rửa thứ 3, enzyme gắn với lại conjugate được phát hiện bởi việc thêm vào cơ chất nó làm biến đổi thành sản phẩm có màu. Cường độ màu được ghi lại và được dùng để xác định có hay không có sự hiện diện của kháng nguyên, dựa trên giá trị ngưỡng có được nhờ mẫu đối chứng dương. III. Vật liệu và phương pháp tiến hành: III.1. Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm • Dụng cụ Các dụng cụ để tiến hành thí nghiệm bao gồm: ống nghiệm, eppendorf các loại, pipet, đầu tip, lọ thủy tinh đựng hóa chất, đầu lọc hóa chất, thùng đựng nước đá, bình tam giác, bộ kit SERELISA® HCV Ag • Các thiết bị, máy móc 9 Bồn ổn nhiệt 9 Máy li tâm 9 Tủ lạnh 9 Máy đo OD 9 Tủ sấy dụng cụ • Thành phần của kit: 9 Conjugate: là phức hợp kháng huyết thanh dê kháng kháng thể thỏ có gắn enzyme peroxidase, (nồng độ 10X). 9 Kháng huyết thanh thỏ kháng HCV [p125] nồng độ 10X ( anti-HCV [p125] rabbit antiserum- AS ) 9 Dung dịch cơ chất peroxidase (Buffered peroxidase substrate (PS) ). 9 Đối chứng âm ( Negative control (N)). 7  9 Đối chứng dương ( Positive control (P)). 9 Mẫu máu pha loãng (Blood sample diluent (SD)). 9 Dung dịch rửa (W) (10X nồng độ). 9 Conjugate và kháng huyết thanh pha loãng (CD) 9 Dung dịch dừng phản ứng (S) 9 Các màng dính • Vật liệu và yêu cầu chất phản ứng 9 Nước cất hoặc nước khử ion. 9 Điều chỉnh hoặc cài đặt các pipet để ước lượng hoặc phân phối giữa 0 đến 1000 μl. Sai số đo lường có thể ≤ 10% cho thể tích ≤ 10 μl và≤ 5% cho tất cả các thể tích khác. 9 Xi lanh chia độ (100 ml and 1000 ml). 9 Dụng cụ rửa bằng tay, tự động hoặc bán tự động cho các bản vi chuẩn độ. 9 Máy đo OD tại 450 và 630 nm, cũng có thể đọc được với một bước sóng 450 nm. • Mẫu 9 Kiểm tra được thực hiện trực tiếp trên mẫu máu với chất kháng đông, huyết thanh, huyết tương pha loãng 1:2, cũng như trên bạch cầu và dịch chiết mô. 9 Mẫu nên được lưu trữ như sau: III.2.Phương pháp tiến hành: Sử dụng 2 đối chứng âm và đối chứng dương cho mỗi lần kiểm tra, cho mỗi đĩa. 8  III.2.1.Chuẩn bị Cẩn thận cho việc phân phối và xác định đối chứng và mẫu. Tất cả các thuốc thử phải đạt tới nhiệt độ phòng (18-25oC) trước khi sử dụng.  III.2.2.Phương pháp: III.2.2.1.Phân phối đối chứng và mẫu a, Phân phối đối chứng: Đối chứng được sẵn sàng sử dụng. Lắc ống đựng đối chứng, cho 100µ đối chứng âm vào giếng A1, A2, cho 100µl đối chứng dương vào giếng B1, B2. b,Phân phối mẫu: ƒ Mẫu huyết thanh, huyết tương, và cả mẫu máu được kiểm tra sau khi pha loãng với tỷ lệ 1:2 trực tiếp trong giếng, dùng 100µl/giếng. ƒ Phân phối 50µl mẫu pha loãng(SD) và thêm 50µl mẫu được kiểm tra. ƒ Mẫu bạch cầu và dịch chiết mô: phân phối 100µl supernatant từ dịch chiết mô không pha loãng hơn nữa. ƒ Mẫu có thể được kiểm tra một lần hoặc hai lần. ƒ Giếng phải được phủ phim dính, nó được cắt theo chiều dài phù hợp với số giếng sử dụng. ƒ Trộn bằng cách lắc nhẹ đĩa(plate) hoặc máy trộn. c. Ủ đĩa(plate) Ủ 2 giờ ± 5 phút ở 37°C ± 3°C hoặc qua đêm (14-18 giờ) ở 20°C ± 5°C. d.Rửa: dung dịch đệm rửa, pha loãng nồng độ dung dịch rửa 1:10 trong nước cất hoặc nước khử ion. Cẩn thận loại bỏ phim dính và rửa 4 lần. III.2.2.2.Thêm kháng huyết thanh a. Chuẩn bị kháng huyết thanh: pha loãng kháng huyết thanh 1:10 với chất pha loãng. b. Phân phối kháng huyết thanh: cho 100µl của kháng huyết thanh pha loãng vào toàn bộ giếng và phủ với một phim dính mới. c. Ủ: kháng huyết thanh 1 h ± 5 phút ở 37°C ± 3°C. d. Rửa: cần chú ý loại bỏ lớp phim dính và rửa 4 lần. III.2.2.3. Thêm conjugate: a. Chuẩn bị conjugate: chuẩn bị dung dịch conjugate pha loãng nồng độ 1:10. 9  b. Phân phối conjugate: thêm 100µl conjugate pha loãng vào tất cả các giếng và phủ 1 mẫu phim dính mới. c. Ủ: conjugate 1 h ± 5 phút ở 37°C ± 3°C. d. Rửa: loại bỏ phim dính, rửa 4 lần. III.2.2.4. Phát hiện: a. Thêm cơ chất: Thêm 100 µl cơ chất peroxidase trên một giếng (không phủ lớp phim dính ở bước này). Trộn bằng cách lắc nhẹ hoặc sử dụng máy trộn. b. Ủ: cơ chất 30 phút ± 5 phút ở nhiệt độ phòng ( 20°C ± 5°C), tránh ánh sáng. c. Thêm dung dịch dừng phản ứng: thêm 50µl dung dịch dừng phản ứng trong một giếng. Trộn bằng cách lắc nhẹ hoặc sử dụng máy trộn. Đảm bảo rằng không có bọt khí trên giếng. d. Đo OD: ở 2 bước sóng hấp thu 450 và 630nm hoặc 1bước sóng hấp thu 450nm bằng máy đọc Elisa Thu kết quả nếu có giá trị :OD đạt được đối với đối chứng dương là ≥ 0.300, và OD đạt được đối với đối chứng âm là < 70% ODP III.2.2.5. Xử lý số liệu: Hai phương pháp để tính toán và giải thích: a. Dựa vào chỉ số OD mẫu: Cho mỗi mẫu: Trong đó: — ODMẫu= trung bình các OD mẫu, nếu kiểm tra được thực hiện với hai mẫu — ODP= trung bình OD của đối chứng dương. • Bất kỳ mẫu máu có chỉ số ≥0 xem như dương tính, < -0.15x coi như âm tính. Bất kỳ mẫu dịch chiết mô, bạch cầu, huyết tương, hoặc huyết thanh có chỉ số ≥0.1x xem như dương tính, < -0.1 x coi như âm tính. — • Chỉ số OD Mẫu đối với mẫu máu nằm trong khoảng [-0.15,0) là kết quả nghi ngờ. — • Chỉ số OD Mẫu đối với mẫu dịch chiết mô, bạch cầu, huyết tương, hoặc huyết thanh nằm trong khoảng — — 10  [ 0.1xODP , 0.1xODP) là kết quả nghi ngờ b. Phân tích OD: Trong đó: OD CO được tính theo công thức: IV. Tài liệu tham khảo: • Công nghệ sinh học trong thú y. Nguyễn Ngọc Hải. • Phylogenetic of hog cholera virus in Tien Giang province Trân Thị Dân, Lương Quý Phương, Nguyen Ngọc Tuân, Thái Quôc Hiêu, Hô Huỳnh Mai Đại học Nông Lâm TPHCM, CCTY Tiền Giang • Mignon B., Waxweiler S., Thiry E., Boulanger D., Dubuisson J. and Pastoret P.P. 1992 J. Virol. Methods, 40 ; 85-94.