Ứng dụng kỹ thuật rt - Pcr xác định macrobrachium rosenbergii nodavirus (mrnv) extra small virus (xsv) trên tôm càng xanh (macrobrachium rosenbergii)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KYÕ THUAÄT RT-PCR XAÙC ÑÒNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VAØ EXTRA SMALL VIRUS (XSV) TRÊN TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM DUY LÃM Thành Phố Hồ Chí Minh 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KYÕ THUAÄT RT-PCR XAÙC ÑÒNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VAØ EXTRA SMALL VIRUS (XSV) TRÊN TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM DUY LÃM Th.S. NGÔ XUÂN TUYẾN Thành Phố Hồ Chí Minh 8/2005 iii LÔØI CAÛM ÔN Em xin chaân thaønh caûm ôn quyù thaày coâ tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm ñaõ taän tình daïy soã, truyeàn ñaït kieán thöùc cho em trong suoát thôøi gian em hoïc taïi tröôøng. Vôùi loøng bieát ôn saâu saéc em xin chaân thaønh caûm ôn thaày Nguyeãn Vaên Haûo, ngöôøi ñaõ taän tình chæ baûo, höôùng daãn vaø giaûi ñaùp nhöõng vaán ñeà khoù khaên vaø taïo ñieàu kieän toát nhaát ñeå hoaøn thaønh luaän vaên toát nghieäp. Em xin caûm ôn Anh Ngoâ Xuaân Tuyeán, chò Trì Thanh Thaûo, anh Cao Thaønh Trung, anh Chu Quang Troïng ñaõ nhieät tình höôùng daãn, trôï giuùp em veà nguyeân vaät lieäu, duïng cuï trong suoát thôøi gian em thöïc hieän ñeà taøi naøy. Em xin caûm ôn anh chò laøm vieäc taïi Trung Taâm Quoác Gia Quan Traéc Caûnh Baùo Moâi Tröôøng vaø Phoøng Ngöøa Dòch Beänh Thuyû Saûn Vieän Nghieân Cöùu Nuoâi Troàng Thuûy Saûn II, phoøng lab DNA TRung Taâm Chaån Ñoaùn YKhoa Hoaø Haûo, caùc anh chò ôû Traïi Thöïc Nghieäm Thuû Ñöùc, ñaõ quan taâm giuùp ñôõ, taïo ñieàu kieän cho em hoaøn thaønh ñeà taøi naøy. Böôùc ñaàu laøm quen vôùi coâng taùc nghieân cöùu khoa hoïc, baûn khoaù luaän naøy khoâng traùnh khoûi nhöõng khieám khuyeát nhaát ñònh, raát mong söï giuùp ñôõ chæ baûo cuõng nhö caùc yù kieán ñoùng goùp cuûa quyù thaày coâ, anh chò vaø caùc baïn sinh vieân. Sau cuøng, em xin caûm ôn gia ñình cuøng beø baïn ñaõ quan taâm, giuùp ñôõ, ñoäng vieân em hoaøn thaønh toát ñeà taøi. TpHCM, thaùng 8 naêm 2005 Sinh vieân Phaïm Duy Laõm iv TÓM TẮT Tôm càng xanh là một trong những đối tƣợng nuôi quan trọng của ngành nuôi trồng thủy sản. Ở Châu Á tôm càng xanh đƣợc mở rộng và tăng cƣờng nuôi với qui mô công nghiệp ở một số nƣớc nhƣ Ấn Độ, Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan, các nƣớc này chiếm sản lƣợng lớn tôm càng xanh của cả thế giới. Sự mở rộng và tăng cƣờng nuôi tôm càng xanh đã làm phát sinh nhiều bệnh mới. Một trong những bệnh mới đƣợc ghi nhận gần đây xuất hiện trong những bể ƣơng tôm càng xanh gây thiệt hại cho ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản ở Ấn Độ, sau đó xuất hiện ở Đài Loan và 5 tỉnh thuộc Trung Quốc. Bệnh này có biểu hiện hơi trắng ở đuôi nên đƣợc gọi là “bệnh trắng đuôi ”. Tác nhân gây bệnh chính là phức hợp hai loại virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV). Hiện nay, trong các bể ƣơng tôm càng xanh ở Việt Nam xuất hiện dấu hiệu lâm sàng hơi trắng ở đuôi, các bể này có tỷ lệ chết rất cao. Để xác định nguyên nhân gây chết trong các bể ƣơng có phải là do MrNV và XSV gây ra hay không. Chúng tôi tiến hành thử nghiệm qui trình Single - Step PCR của Widada và Sahul Hameed để xác định có hay không sự hiện diện MrNV và XSV trong mẫu bệnh nghi ngờ là bệnh trắng đuôi. Những kết quả thử nghiệm qui trình Single - Step PCR mà chúng tôi đạt đƣợc có kết quả nhƣ sau:  Xác định đƣợc sự hiện diện đồng thời MrNV và XSV trong mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ bằng qui trình Single - Step RT - PCR  Khảo sát đƣợc hai qui trình tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation Kit và Trizol trên mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi Ấn Độ bằng qui trình Single - StepRT - PCR.  Khảo sát đƣợc nồng độ mồi của hai virus cho phản ứng Single - Step RT- PCR là 20 mol cho MrNV và 20 mol cho XSV.  Khảo sát đƣợc nhiệt độ lai tối ƣu của hai virus cho phản ứng Single - Step PCR là 550C.  Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc trên 50 mẫu tôm càng xanh thu từ thực địa, kết quả phát hiện đƣợc 6 mẫu tôm mẹ, 1 mẫu tôm postlarvae có sự hiện diện đồng thời của MrNV và XSV trong mẫu tôm bệnh trắng đuôi. v ABSTRACT Freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) plays an economically important role in aquaculture. However, The recent report of new disease in freshwater prawn hatcheries, this disease is responsible for mortalities in hatchery - reared Freshwater Prawn which losses aquaculture industry in India. The disease was reported in Guadeloupe and Martinique (India) subsequently in the five provinces of China. The clinical sign of disease is whitish appearance of the tail and has given rise to the name “White tail disease”. Lately, scientists have been detected a nodavirus - like particles from freshwater prawn suffering from White tail disease (WTD), named Macrobrachium rosenbergii nodavirus. Subsequently a second virus - like particle, named XSV. XSV has always been found associated with the MrNV. Untill, The relationships between these two viruses remain unknown. Although White tail disease (WTD) caused by Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and virus-like particle (XSV) which hasn’t reported in Viet Nam. Therefore In this study, process of Single - Step RT - PCR of Widada and Sahul Hameed. et al was use to identify whether this disease existed in Viet Nam. To optimal of Single - Step RT-PCR of Widada and Sahul Hameed. et al for the laboratory, positive control from India was used. We experimented successful process of Single-Step RT-PCR of Widada and Sahul Hameed. The suitable condition for a Single-Step RT-PCR RT-PCR reaction is 1,5 mM Mg 2+ , 20 mol primer and 55 0 C annealing temperature. Based on this method, 50 samples of freshwater prawn collected in the Thu Duc and other provinces in Mekong Delta were extracted RNA and amplified with two couples of primer MrNV-RNA2-F, MrNV-RNA2-R for MrNV and XSV-F, XSV-R for XSV. Seven samples were confirmed to be infected by MrNV and XSV. In short, MrNV and XSV have been detected in Viet Nam. It is essential to carry out further studies to identify the outbreak conditions and to suggest the treatment methods so that the freshwater prawn farming can be developed. vi Mục lục Lời cảm ơn ....................................................................................................................... iii Abstract ............................................................................................................................ iv Tóm tắt ............................................................................................................................. v Mục lục ............................................................................................................................ vi Danh mục các hình và các bảng ....................................................................................... ix Danh mục các từ viết tắt .................................................................................................. x PHẦN 1. LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 3 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GIỐNG TÔM CÀNG XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .......................................... 3 2.1.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới ........... 3 2.1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh ở Việt Nam ............ 3 2.2. MỘT SỐ BỆNH TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH ............................... 5 2.2.1. Bệnh hoại tử cơ ......................................................................................... 5 2.2.2. Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng ........................................................................ 5 2.2.3. Bệnh hoại tử do vi khuẩn .......................................................................... 5 2.2.4. Bệnh phát sáng .......................................................................................... 5 2.2.5. Bệnh lột xác dính vỏ ................................................................................. 6 2.2.6. Bệnh do Protozoa ...................................................................................... 6 2.2.7. Bệnh virus ................................................................................................. 6 2.2.8. Bệnh trắng đuôi ........................................................................................ 6 2.3. NHỮNG PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TRẮNG ĐUÔI DO VIRUS GÂY RA TRÊN TÔM CÀNG ........................................................................ 10 2.3.1. Phƣơng pháp mô học ................................................................................ 10 2.3.2. Phƣơng pháp lai Dot-lot............................................................................ 10 2.3.3. Phƣơng pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) ........................................ 11 2.3.4. Phƣơng pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent assay) ................................................................................................. 12 2.3.5. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................... 12 2.3.6. Phƣơng pháp RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction) ............... 15 vii PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ................................ 18 3.2. VẬT LIỆU ........................................................................................................... 18 3.2.1. Mẫu tôm .......................................................................................................... 18 3.2.2. Mồi sử dụng cho qui trình ............................................................................... 18 3.2.3. Hạt Bead RT - PCR: Ready - To - Go (Chế phẩm sử dụng ngay) .................. 19 3.2.4. Bộ Kit AquaPure RNA Isolation Kit............................................................... 19 3.2.5. Thang DNA X174 RF Hae III (Boehringer Mannheim) .......................... 20 3.2.6. Hoá chất khác .................................................................................................. 20 3.2.7. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................... 21 3.3. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................................. 21 3.3.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA virus ................................................................ 21 3.3.1.1. Tách chiết RNA bằng Trizol ................................................................ 21 3.3.1.2. Tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation kit (Bio-Rad) .................... 22 3.3.2. Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV .............. 22 3.3.3. Phƣơng pháp điện di nucleic acid trên gel agarose .................................... 23 3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM ........................................................................................ 24 3.4.1. Thử nghiệm qui trình Single - Step RT-PCR phát hiện MrNV, XSV từ mẫu tôm bệnh (chứng dƣơng) đƣợc cung cấp từ Ấn Độ ............................................ 24 3.4.2. Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT-PCR ................... 24 3.4.2.1. So sánh hai qui trình tách chiết RNA bằng Trizol (Peter Walker) và AquaPure RNA Isolation Kit (Bio-Rad)................................................................................. 24 3.4.2.2. Khảo sát nồng độ mồi ........................................................................ 25 3.4.2.3. Khảo sát nhiệt độ lai của mồi .............................................................. 25 3.4.3. Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc kiểm tra một số mẫu tôm càng xanh thu thực địa ......................................................................................................................................... 25 viii PHẦN 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TÔM BỆNH ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ. .................. 26 4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR ..................................................................................................................... 27 4.2.1. Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết. .............................................. 27 4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ mồi .............................................................. 30 4.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của mồi .................................................. 30 4.3. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH KHẢO SÁT ĐƢỢC KIỂM TRA MỘT SỐ MẪU TÔM CÀNG XANH THU THỰC ĐỊA ....................................................................................... 32 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận ............................................................................................................... 36 5.2. Tồn tại ................................................................................................................. 36 5.3. Đề xuất ................................................................................................................ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt .................................................................................................................. 38 Tiếng nƣớc ngoài ........................................................................................................ 39 ix Danh mục hình và các bảng Hình 2.1: Biểu hiện bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh ............................................. 8 Hình 2.2: Vị trí của MrNV trong họ gia đình Nodavirus ........................................... 8 Hình 2.3: Lai tại chỗ bằng cách sử dụng probes MrNV ............................................ 11 Hình 2.4: Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR để khuếch đại RNA bằng PCR ........ 17 Hình 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại từ mẫu tôm càng xanh nhiễm MrNV, XSV ............................................................................................................................ 26 Hình 4.2: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dƣơng đƣợc tách bằng bộ Kit và Trizol . .................................................................. 28 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR từ mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ mồi khác nhau ........................................................................................................... 29 Hình 4.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi trên hai virus MrNV, XSV ............................................................................................................ 30 Hình 4.5: Kết quả điện di phát hiện MrNV và XSV trên một số mẫu tôm càng xanh ..... 33 Hình 4.6: Kết quả điện di mẫu tôm mẹ thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức ........... 34 Biểu đồ 2.1: Số lƣợng trại giống và sản lƣợng tôm càng xanh ở ĐBSCL từ 1999 - 2003. ........ .4 Bảng 3.1: Các mồi sử dụng cho phản ứng RT- PCR ................................................. 18 Bảng 3.2: Thang DNA X174 RF Hae III ............................................................... 20 Bảng 3.3: Thành phần hai Mix sử dụng Single - Step RT - PCR ............................ 22 Bảng 3.4: Bảng khảo sát nhiệt độ lai của các mồi .................................................... 25 Bảng 3.5: Các loại mẫu tôm càng xanh thu ở các giai đoạn khác nhau ..................... 25 Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol .................. 28 Bảng 4.2: Kết quả biểu hiện tín hiệu của sản phẩm của hai dãy nhiệt độ .................. 31 Bảng 4.3: Kết quả thực hiện phản ứng RT - PCR trên 50 mẫu tôm càng xanh ........ 35 x Danh mục các từ viết tắt DNA: Deoxyribonucleic acid ss-DNA: Single strand - Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid mRNA: Messenger ribonucleic acid cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid Bp: Base pair (cặp base) dATP: 2’-deoxyadenosine-5’-triophosphate dCTP: 2’-deoxycytosine-5’-triophosphate dGTP: 2’-deoxyguanine-5’-triophosphate dTTP: 2’-deoxythymine-5’-triophosphate UV: Ultra Violet- tia cực tím TE: Tris-EDTA. DIG: Digoxigenin DEPC: Diethyl Prycacbonat ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long FAO: Food and Agrculture Organization NoV: Nodamura virus BoV: Boolaara virus AhNNV: Atlantic halibut nervous necrosis virus GGNNV: Greasy grouper nerous necrosis virus SJNNV: Striped jack nervous necrosis virus PaV: Pariacoto virus MrNV: Macrobrachium rosenbergii nodavirus XSV: Extra small virus PCR: Polymerase Chain Reaction RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Reaction RFLP: Restriction fragment lenght polymorphism S - ELISA: A sandwich enzyme linked immunosorbent assay Tm: Nhiệt độ lai của mồi 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Kể từ năm 1990 đến nay, bên cạnh sự phát triển của nghề nuôi tôm sú thì tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) đƣợc xác định là một trong những đối tƣợng nuôi thủy sản quan trọng đối với thủy vực nƣớc ngọt Việt Nam, đặc biệt là Đồng Bằng Sông Cửu Long, với lợi thế có diện tích mặt nƣớc ngọt gần 600.000 ha, nhiều sông ngòi, kênh rạch, ao, vƣờn, ruộng. ĐBSCL đƣợc xem là vùng có tiềm năng rất lớn cho nghề nuôi tôm càng xanh. Ở các tỉnh Trà Vinh, Bến Tre, Vĩnh Long, An Giang và Cần Thơ là những tỉnh có nghề nuôi tôm càng xanh phát triển. Theo số liệu thống kê của Bộ Thủy Sản năm 1999, ĐBSCL có 6000 ha diện tích nuôi tôm càng xanh với tổng sản lƣợng trên 2500 tấn và đến 2002 sản lƣợng tôm càng xanh đã tăng nhanh đáng kể với tổng sản lƣợng lên đến 10.000 tấn (Bộ Thủy Sản, 2003). Tuy nhiên, trở ngại lớn nhất hiện nay đối với nghề nuôi tôm càng xanh ở nƣớc ta nói chung và ĐBSCL nói riêng là vấn đề con giống. Từ lâu, ngƣời nuôi vẫn quen sử dụng nguồn giống tự nhiên đƣợc thu gom từ sông rạch, vì thế nguồn giống ngày càng khan hiếm, chất lƣợng không đảm bảo. Do đó, đã có nhiều công nghệ sản xuất giống tôm càng xanh đƣợc đẩy mạnh nhƣ: công nghệ sản xuất giống tôm càng xanh trong ao đất ở vùng nhiễm mặn, sản xuất giống nƣớc xanh và nƣớc xanh cải tiến ở vùng nội đồng, sản xuất tôm càng xanh toàn đực bằng con cái giả thông qua kỹ thuật vi phẫu. Sau những thành công của các công nghệ sản xuất giống, nối tiếp là hàng loạt những trang trại sản xuất giống nuôi thâm canh ra đời, sự khai khác tối đa nguồn nƣớc tự nhiên, sự đáp ứng không đủ về mặt năng lực chuyên môn, nghiêm trọng hơn là áp dụng mô hình nuôi bừa bãi dẫn đến sự giảm thiểu về môi trƣờng, phá vỡ môi trƣờng sinh thái làm phát triển nhanh chóng sự lây lan dịch bệnh. Trong số những tác nhân gây bệnh tìm thấy trên tôm nuôi, virus là một tác nhân quan trọng nhất gây nên sự bùng nổ dịch bệnh (Lightner, 1993). Một trong những virus đƣợc ghi nhận gần đây xuất hiện đầu tiên ở Ấn Độ (Arcier và cộng sự, 1999) gây thiệt hại nghiêm trọng trên các đàn postlarvae ở các trại sản xuất giống (Bonami và cộng sự, 2005), tỷ lệ chết lên đến 100% (Vijayan và cộng sự, 2003). Bệnh do hai loại virus là Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) 2 (Vijayan và cộng sự, 2003) và Extra small virus (XSV)(Qian và cộng sự, 2003) gây bệnh trắng đuôi (White tail disease). Ở Việt Nam chƣa tìm thấy một công bố nghiên cứu nào về hai loại virus trên nhiễm trên tôm càng xanh. Chính vì vậy đƣợc sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, chúng tôi tiến hành đề tài “ Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) ” với: Mục đích  Xác định sự hiện diện hai loại virus MrNV và XSV trên tôm càng xanh bằng kỹ thuật RT-PCR. Nội dung nghiên cứu  Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện MrNV, XSV từ mẫu chứng dƣơng đƣợc cung cấp từ Ấn Độ.  Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR.  Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc kiểm tra sự hiện diện MrNV, XSV ở một số mẫu tôm càng xanh thu thực địa. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GIỐNG TÔM CÀNG XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.1.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) là một loài có giá trị kinh tế cao trong nghề nuôi thủy sản nƣớc ngọt. Theo số liệu thống kê của FAO năm 1998, Đài Loan 14.000 tấn (1991), Thái Lan 10.000 tấn. Đến năm 2002 Trung Quốc chiếm 58% về sản lƣợng tôm càng xanh của thế giới. Vì tôm càng xanh mang lại lợi nhuận cao, dễ nuôi, ít bị bệnh hơn so với các loại tôm nuôi khác nên từ lâu đã có nhiều công trình nghiên cứu về nuôi và ngày càng hoàn thiện về quy trình kỹ thuật nuôi (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2000). Sau thành công của Ling (1969) về sinh sản nhân tạo tôm càng xanh ở Malaysia. Năm1972, Fujimura và Okamoto đã cải tiến thành công phƣơng pháp sản xuất tôm càng xanh đại trà. Năm 1974, cũng Fujimura đƣa ra qui trình nƣớc xanh. Sau đó hàng loạt các tác giả khác đã cố công nghiên cứu việc sinh sản nhân tạo và phát triển nuôi chúng nhƣ Adisukressno (1980), Liao (1980), Malecha (1980), Sandifer (1977), Smith (1879) (Trần Thanh Phục, 2001). Hiện nay, trên thế giới có ba qui trình sản xuất giống tôm càng xanh đã đƣợc phổ biến là qui trình nƣớc trong hở (clear open water system), qui trình nƣớc trong kín (clear closed water system), và qui trình nƣớc xanh (green water system) (Nguyễn Việt Thắng, 1993). 2.1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh ở Việt Nam Ở Việt Nam tôm càng xanh cũng đƣợc nghiên cứu từ năm 1974, sau năm 1980 tiếp tục đƣợc nghiên cứu tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Đến năm 1982, Trung Tâm Nghiên Cứu Sản Xuất Tôm Vũng Tàu (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II) đã cho tôm càng xanh sinh sản nhân tạo thành công (Phạm Văn Tình, 2000). Từ 1987-1992, Trung Tâm Nghiên Cứu Sản Xuất Tôm Vũng Tàu đã sản xuất tổng cộng đƣợc 2.1 triệu postlarvae (Trần Thanh Phục, 2001). 4 Ngoài ra còn nhiều tác giả: Trần Đức Can (1987), Phan Hữu Đức (1988), Nguyễn Quang Ly (1988), Nguyễn Việt Thắng (1995), Phạm Văn Tình (1999)... đã nghiên cứu về đặc điểm sinh học, vùng phân bố, mùa vụ sinh sản của tôm càng xanh, cũng nhƣ kỹ thuật sản xuất giống và nuôi tôm càng xanh thƣơng phẩm ở các thủy vực ao, đầm, ruộng, lúa và mƣơng vƣờn (Trần Thanh Phục, 2001). Nguyễn Việt Thắng (1993), đã khảo nghiệm một số qui trình sản xuất giống tôm càng xanh và đạt kết quả khả quan: quy trình nƣớc trong hở đạt tỷ lệ sống trung bình 35,46% (10,5% - 66%), ƣơng với mật độ từ 60 - 100 ấu trùng/l; quy trình nƣớc trong tuần hoàn kín đạt tỷ lệ sống trung bình 38,67% với mật độ 60 - 110 ấu trùng/l và quy trình nƣớc xanh đạt tỷ lệ sống trung bình 40,16% với mật độ 40 - 55 ấu trùng/l. Năm 1997, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã chuyển giao thành công các công nghệ sản xuất giống và nuôi tôm càng xanh thƣơng phẩm ở một số tỉnh phía Nam nhƣ: Cần Thơ, Trà Vinh, Vĩnh Long, TPHCM (Nguyễn Việt Thắng, 1997). Biểu đồ 2.1: Số lƣợng trại giống và sản lƣợng tôm càng xanh ở ĐBSCL từ năm 1999- 2003 (Đại Học Cần Thơ, 2003; trích từ Bộ Thủy Sản, 2004). Từ năm 1998 đến nay, Viện Hải Sản - Trƣờng Đại Học Cần Thơ đã tiến hành nghiên cứu ƣơng nuôi ấu trùng tôm càng xanh theo mô hình “nƣớc xanh cải tiến” và đang triển khai ứng dụng tại một số tỉnh nhƣ: Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, An Giang (Trần Ngọc Hải, 2000). 5 Từ 1999 - 2003, số lƣợng trại sản xuất giống cũng nhƣ sản lƣợng tôm giống sản xuất ở ĐBSCL không ngừng gia tăng theo thời gian, năm 2003 có 97 trại giống tăng 95 trại so với năm 1999 và tổng sản lƣợng tôm giống sản xuất đƣợc trong năm 2003 là 76.5 triệu con (Đại Học Cần Thơ, 2003; trích từ Bộ Thủy Sản, 2004). 2.2. MỘT SỐ BỆNH XẢY RA TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH 2.2.1. Bệnh hoại tử cơ cá thể (Idiopathic Muscle Necrosis-IMN) Bệnh hoại tử cơ đó là nguyên nhân gây tử vong hàng loạt cho tôm ấu trùng trong trại giống. Nash và cộng sự (1987) đã báo cáo rằng bệnh hoại tử cơ là nguyên nhân gây tử vong nhanh chóng đến 60% số hậu ấu trùng 28 ngày tuổi trong hệ thống ƣơng tôm thâm canh ở Thái Lan. Bệnh này biểu hiện với nhiều điểm trắng lan rộng trên cơ (Akiyama và cộng sự, 1982; Nash và cộng sự, 1987; Brock, 1988). 2.2.2. Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng (Larvae Mid Cycle Disease-MCD) Bệnh này thƣờng xảy ra trong các giai đoạn ấu trùng từ IV-XI. Anderson và cộng sự (1990) đã báo cáo hiện tƣợng tử vong hàng loạt ấu trùng tôm càng xanh ở Malaysia khoảng 16 ngày sau khi nở. Bệnh này tƣơng tự nhƣ bệnh hoại tử do vi khuẩn. Ấu trùng bỏ ăn và những cá thể bệnh sẽ bị các con khỏe ăn thịt. Ấu trùng nhiễm bệnh thƣờng có màu xám xanh lơ, bơi lội yếu ớt và thƣờng bơi theo hình xoắn ốc. Nguyên nhân gây bệnh vẫn chƣa xác định đƣợc nhƣng có lẽ do nhiễm tự nhiên. Nguyên nhân có thể là vi khuẩn Enterobacter aerogenes (vi khuẩn sinh bọt khí trong đƣờng ruột) (Johnson, 1978; Brock, 1988). 2.2.3. Bệnh hoại tử do vi khuẩn Triệu chứng cấp tính của bệnh này là ấu trùng chuyển sang màu xanh lơ nhạt, dạ dày rổng, ấu trùng chìm xuống đáy bể và có những chấm nâu trên râu và các phụ bộ mới hình thành. Các quan sát cho thấy có sự nhiễm phức hợp vi khuẩn dạng sợi Leucothix spp, trực khuẩn và cầu khuẩn trên các tơ lông, mang, và các phụ bộ. Ấu trùng càng nhỏ thì bệnh càng nghiêm trọng. Theo tạp chí Aquacop (1977) cho biết bệnh này ảnh hƣởng đến ấu trùng tôm càng xanh (giai đoạn IV-V) ở Tahiti dẫn đến tử vong 100% trong 48 giờ. 6 2.2.4. Bệnh phát sáng Ấu trùng ở giai đoạn nhỏ rất mẫn cảm đối với bệnh do Vibrio harveyi gây ra. Bệnh này rất phổ biến trong các trại giống đối với tôm càng xanh nƣớc ngọt và tôm biển. Biểu hiện của bệnh này là sự phát sáng có thể quan sát dễ dàng vào ban đêm. Ấu trùng nhiễm bệnh bị đóng rong, đục cơ và bơi lội chậm chạp, cắn xé nhau, tỷ lệ chết 100%. Vi khuẩn phát sáng (Vibrio harveyi) ở Thái Lan đã đƣợc phân lập đƣợc trên tôm ấu trùng càng xanh đƣợc xem là loại bệnh khá phổ biến (Tonguthai,1997). 2.2.5. Bệnh lột xác dính vỏ Bệnh này ảnh hƣởng đến các giai đoạn hậu ấu trùng và các giai đoạn đầu của hậu ấu trùng gây tử vong khi tôm lột xác. Ấu trùng nhiễm bệnh không thể rút các phụ bộ, mắt hoặc chủy ra khỏi vỏ lột. Nếu thoát ra đƣợc vỏ lột thì phụ bộ bị dị tật và không lâu sau thì chết (Brock, 1983, 1988). Sự tử vong do bệnh này thƣờng không nghiêm trọng. Nguyên nhân của bệnh vẫn chƣa biết nhƣng chất lƣợng nƣớc kém hoặc dinh dƣỡng thiếu có khả năng dẫn đến bệnh. 2.2.6. Bệnh do Protozoa Các loại Protozoa có thể gây bệnh cho tôm là Zoothamnium sp, Epystulis sp, Vorticella sp, và Acineta sp. Ấu trùng bị nhiễm Protozoa có màu hơi đục. Nếu nhiễm nhẹ, bệnh có thể hết sau khi lột xác, nhƣng nếu nhiễm nặng có thể ngăn cản quá trình lột xác, đình trệ sự tăng trƣởng và làm tôm chết . Khi quan sát thấy Protozoa trên ấu trùng thì phải cải thiện chất lƣợng nƣớc. Ngâm formalin 20-30 ppm trong 24 giờ có hiệu quả và an toàn trong việc trị bệnh Zoothamnium trên ấu trùng ( Roegge và cộng sự,1979). 2.2.7. Bệnh virus Anderson và cộng sự (1990) đã báo cáo một loại Parvo - like virus ở hậu ấu trùng tôm càng xanh trong các trại giống ở Malaysia. Đây là loại virus đƣợc báo cáo đầu tiên trên tôm càng xanh. Hậu ấu trùng bị nhiễm virus với triệu chứng nhƣ sự mờ đục ở các mô, gây hoại tử cơ. 7 2.2.8. Bệnh trắng đuôi Bệnh trắng đuôi (White tail disease ) gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến đàn ấu trùng. Tác nhân gây bệnh chính là phức hợp hai loại virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV). Sự mở rộng và tăng cƣờng nuôi trồng thủy sản nhiều và nhiều bệnh mới sẽ xuất hiện. Những báo cáo gần đây về bệnh trắng đuôi (White tail disease) xuất hiện trong những bể ƣơng tôm càng xanh và những trang trại vừa gây thiệt hại cho ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản ở Ấn độ. Thông tin này đƣợc đƣa ra từ hội nghị “Freshwater Prawn 2003 International Symposium” ở Cochin (Ấn Độ) (Sahul Hameed, 2003). Bệnh đƣợc ghi nhận đầu tiên ở Guadeoupe năm 1997 (Arcier và cộng sự,1999) sau đó ở Martinique (Ấn Độ), Đài Loan (Tung và cộng sự, 1999) và 5 tỉnh khác thuộc Trung Quốc (Qian và cộng sự, 2003). Trong những bể ƣơng tôm càng xanh bị nhiễm bệnh, dấu hiệu chủ yếu của đàn hậu ấu trùng (postlarvae) là lờ đờ, biếng ăn và mờ đục ở vùng cơ đuôi. Trong những trƣờng hợp bệnh nặng sự mờ đục khắp cơ thể và dẫn đến thoái hoá phần phụ bộ đuôi. Khoảng 2 - 3 ngày, tỷ lệ chết lên đến 100%. Tôm bệnh có dấu hiệu hơi trắng ở đuôi nên đƣợc gọi là “bệnh trắng đuôi ” (Sahul Hameed, 2003; Salin và Nair, 2003; Vijayan và cộng sự, 2003). Khi làm thí nghiệm cảm nhiễm virus gây bệnh trắng đuôi vào tôm postlarvae và tôm trƣởng thành, các nhà khoa học nhận thấy dấu hiệu bệnh và tỷ lệ chết ở tôm postlarvae cảm nhiễm giống nhƣ tôm postlarvae đƣợc nghi ngờ là bệnh trắng đuôi trong tự nhiên. Nhƣng ở tôm trƣởng thành khi cảm nhiễm có những dấu hiệu nhƣ vùng đầu ngực phình to chứa đầy chất lỏng (Sahul Hameed và cộng sự, 2004). Tuy nhiên dấu hiệu lâm sàng hơi trắng ở đuôi không là dấu hiệu đặc trƣng cho bệnh trắng đuôi ở giai đoạn sớm của postlarvae (Yoganadhan và cộng sự, 2005). Khi quan sát tổ chức học trên mẫu tôm bệnh cho thấy sự hiện diện các thể virus có kích thƣớc nhỏ (25 nm - 30 nm) (Tung và cộng sự, 1999). Theo Acier và cộng sự (1999) bệnh này gây bởi nodavirus - like virus đƣợc đặt tên là Macrobranchium rosenbergii nodavirus (MrNV). Một dạng virus khác đƣợc phát hiện là cộng hƣởng với Macrobranchium rosenbergii nodavirus (MrNV) là Extra small virus (XSV) (Qian và cộng sự, 2003). 8 Hai virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) vừa đƣợc tìm thấy liên quan đến bệnh trắng đuôi (Bonami và Widada, 2003). Hiện nay chƣa có một biện pháp điều trị nào cho bệnh trắng đuôi. Vì vậy, các nông trại và bể ƣơng phải đƣợc quản lý tốt để giảm thiểu sự lan rộng của bệnh trắng đuôi. Hình 2.1: Biểu hiện bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh MrNV có dạng lập thể 20 mặt (icosaherdral), trần không có vỏ bọc, thƣờng định vị trong tế bào chất của tế bào chủ, phát triển trong tất cả các bộ phận của tôm càng xanh bị bệnh ngoại trừ gan và tụy tạng, MrNV có kích thƣớc lớn hơn XSV và có đƣờng kính 20 - 30 nm đƣợc quan sát trong kính hiển vi điện tử (Acier và cộng sự,1999). MrNV có vật liệu di truyền là hai sợi đơn RNA (RNA -1 và RNA - 2), với kích thƣớc tƣơng ứng là 2,9 kb và 1,3 kb, và tham gia cấu trúc capsid với một chuỗi polypeptide có kích thƣớc 43 kDa. Dựa vào đặc tính và kết quả giải trình tự đoạn RNA1 của MrNV, Bonami và cộng sự (2005) đề nghị MrNV là thành viên của họ Nodaviridae, nhƣng khác biệt với hai loài Alphanodavirus và Betanodavirus. 9 Hình 2.2: Vị trí của MrNV trong họ gia đình Nodavirius (Bonami và cộng sự, 2005). Họ Nodaviridae chia làm hai nhóm: Alphanodavirus gây bệnh chủ yếu cho côn trùng và Betanodavirus gây nhiễm cho cá. Thể virus này không có màng bao, hình đa mặt, đƣờng kính 25 - 30 nm, bộ gen gồm hai sợi RNA(+) đơn. Trong đó, RNA - 1 (3,1 kb) mã hoá cho một protein không cấu trúc có kích thƣớc 100 kDa với chức năng nhƣ là RNA polymerase. RNA - 2 (1,4 kb) mã hoá cho hai phân tử protein vỏ lớn có kích thƣớc lớn khoảng 43 kDa và 41 kDa đƣợc hình thành do quá trình đồng sao chép một chuỗi polypeptide. Một RNA - 3 cũng đƣợc phát hiện trong các tế bào bị nhiễm nhƣng không tồn tại trong thể virus. Hiện nay, sản phẩm của RNA phụ này (0,4 kb) vẫn chƣa xác định chức năng (Mori và cộng sự, 1992). XSV là một satellite virus có kích thƣớc nhỏ hơn virus MrNV với đƣờng kính 15 nm, có vật liệu di truyền là RNA với chiều dài khoảng 0,8 - 0,9 kb (Qian và cộng sự, 2003). Sau khi giải trình tự bộ gen của XSV cho thấy virus có chiều dài sợi đơn RNA dài 796 nucleotide và đuôi ngắn poly (A) khoảng 15 - 20 nucleotide kết thúc ở đầu 3’(GenBank acc.no.AY247793). Phân tích protein bằng SDS - PAGE cho thấy thể XSV chứa hai polypeptide là capsid 17 kDa (CP - 17) và capsid 16 kDa (CP - 16) (Qian và cộng sự, 2003). So sánh trình tự của CP - 17 của XSV với cấu trúc protein của họ satellite virus đã biết từ trƣớc, kết quả cho thấy có sự khác biệt rất xa với họ satellite virus (Ban,1995; Zhang và cộng sự, 1991). Sự hiện diện đồng thời của XSV và MrNV trong bệnh trắng đuôi đặt ra giả thuyết là vai trò mỗi virus nhƣ thế nào trong việc phát triển cũng nhƣ trong sự phát SjNNV AhNNV GNNV beta-nodaviruses MrNV1B5A PaV alpha-nodaviruses FHV BoV NoV o V BBV 10 sinh mầm bệnh. Theo Widada và Bonami (2004) giả thuyết rằng XSV không có gen mã hoá cho RNA polymerase. Vậy yếu tố nào cung cấp và cần cho XSV cộng hƣởng. Hay XSV cộng hƣởng và làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh. Sự cộng hƣởng này ít thấy trong những virus. Những virus cộng hƣởng (dependovirus) này vừa đƣợc biết trong khoảng thời gian gần đây (Van Regenmortel và cộng sự, 2000), và chúng phụ thuộc vào hiệu quả sự sao chép của những virus giúp đỡ (helper virus) nhƣ adenovirus hoặc herpes virus. Những virus giúp đỡ này có đƣờng kính 20 nm, có vật liệu di truyền là ss - DNA (4,7 kb), chứa một gen DNA polymerase. Một nhóm virus khác là thể satellite virus, nhóm virus này thì sống sót khi thiếu một gen polymerase cần cho sự sao chép của chúng (Van Regenmortel và cộng sự, 2000). Điều này cho thấy là XSV sử dụng enzym RNA polymerase của MrNV nhƣng XSV sẽ mã hoá một chức năng cần thiết cho sự phát triển của MrNV hay làm phát sinh thêm mầm bệnh của MrNV thì không biết đƣợc (Widada và Bonami, 2004). Nhƣng XSV thiếu một enzym sao chép thì XSV thật sự là một satellite virus (Widada và Bonami, 2004). XSV liên quan gần phân nhóm 2 (tobacoo nercrosis satellite virus - like) hơn là phân nhóm 1 (chronic bee - paralysis associated satellite virus - like) của satellite virus. Đến bây giờ các nhà khoa học chỉ quan sát đƣợc những satellite virus trong những ký chủ là thực vật. XSV là kiểu virus satellite đầu tiên đƣợc báo cáo là gây bệnh trong động vật. XSV cũng đƣợc ghi nhận là satellite-nodavirus cộng hƣởng đầu tiên (Widada và Bonami, 2004). 2.3. NHỮNG PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐUÔI TRẮNG DO VIRUS GÂY RA TRÊN TÔM CÀNG XANH 2.3.1. Phƣơng pháp mô học. Mẫu phải đƣợc cố định trong Davidson trong 24 giờ. Cắt thành từng lát mỏng rồi đặt trên lam kính, nhuộm bằng Pryonin methyl green, đậy lam và quan sát tiêu bản trên kính hiển vi thấy thể vùi của virus có hình mắt lƣới trong mô tế bào kế cận của tất cả các cơ quan và các mô (Tung và cộng sự, 1999). Thể vùi của virus MrNV nằm trong nhân tế bào hồng cầu bắt màu xanh với thuốc nhuộm Pryonin methyl green (Tung và cộng sự, 1999). 11 2.3.2. Phƣơng pháp lai Dot - blot Probe sử dụng trong phƣơng pháp lai Dot - blot là một đoạn DNA thu đƣợc từ RNA - 1 của MrNV. Đoạn DNA đƣợc đánh dấu bằng phƣơng pháp PCR với tác nhân digoxygenine. Probe này lai với đoạn RNA - 1 từ mô bị nhiễm hoặc từ dịch chiết virus. Mỗi mẫu (1 l) là mỗi điểm trên màng lai. Sau khi qua các công đoạn xử lý bằng dung dịch lai (hybridization) và tiền lai (prehybridization), mẫu dò đƣợc thêm vào để quá trình lai xảy ra, rửa phần mẫu dò không lai ra khỏi màng lai. Tiếp đó thêm vào phản ứng kháng thể kháng DIG (anti digoxygenine antibody) có gắn enzyme alkaline phosphatase, ở quá trình này nếu có sự hiện diện của mẫu dò thì kháng thể sẽ kết hợp với mẫu dò. Cuối cùng loại bỏ phần kháng thể không phản ứng và thêm cơ chất của enzyme alkaline phosphatase để thực hiện phản ứng tạo màu ngay trên màng lai. Phản ứng dƣơng tính (tạo màu) chỉ xảy ra khi có RNA của MrNV trên màng lai (Widada và cộng sự, 2003). 2.3.3. Phƣơng pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) Mẫu tôm càng xanh đƣợc cố định Davidson và đƣa vào trong paraffin. Mẫu tôm đƣợc cắt khoảng 7 m và đƣợc đặt trên lam kính và đƣợc làm khô trong tủ sấy ở (60 0C). Lát cắt qua nhiều bƣớc xử lý, cho lai với mẫu dò DNA đƣợc đánh dấu digoxigenin có gắn Alkaline phosphatase (AP), Anti - Digoxigenin sẽ kết hợp với Digoxigenin theo nguyên tắc phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Sau bƣớc này những phân tử lai đặc hiệu giữa DNA/RNA của mẫu đính trên lame và mẫu dò đƣợc gắn thêm Anti - DIG kết hợp với enzyme Alkaline phosphatase. Sau bƣớc rửa Anti - DIG thừa và nhuộm màu, quan sát dƣới kính hiển vi thấy những tế bào kết tủa màu tím đen, màu này cho biết sự hiện diện tƣơng ứng RNA của MrNV, mẫu âm tính có màu vàng cam sau quá trình lai. Việc kết tủa đã đƣợc quan sát trong tế bào chất, vài phản ứng dƣơng thì cũng đƣợc quan sát xung quanh vùng cơ hoại tử. Không có dấu hiệu của virus đƣợc quan sát trong mang, gan, tụy tạng hoặc biểu mô ống tiêu hoá và biểu bì cơ (Widada và cộng sự, 2003). 12 Hình 2.3: Lai tại chỗ bằng cách sử dụng probes MrNV (Widada và cộng sự, 2003). Hình a: tổng thể phần đầu ngực của tôm postlarvae bị nhiễm MrNV. Phần 1a: vùng mang không bị nhiễm có màu vàng cam. Phần 2a: vùng đầu ngực bị nhiễm MrNV có màu tím đen. Phần 3a: vùng tụy tạng không bị nhiễm có màu vàng cam Hình b: lai dƣơng tính với những sợi cơ. phần 1b: vùng cơ bị nhiễm MrNV có màu tím đen. 2.3.4. Phƣơng pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent assay) Kỹ thuật này phát triển bởi Romestand và Bonami (2003) để chẩn đoán bệnh trắng đuôi của tôm càng xanh, nguyên nhân gây ra bởi MrNV. Kháng thể đa dòng sản xuất bằng gây sự miễn dịch trên chuột Balb/C và sau đó tinh sạch dung dịch nổi của virus và kháng thể kháng MrNV, dịch nổi chứa kháng thể kháng MrNV đƣợc tinh sạch từ dịch tràng ở màng bụng của chuột. Kháng thể đầu tiên bắt kháng nguyên và kháng thể thứ hai có gắn cơ chất, dƣới tác dụng của enzym avidin - peroxidase conjugate phản ứng với cơ chất tạo màu, sự tạo màu này cho thấy phản ứng xảy ra. Đây là một phƣơng pháp chẩn đoán bệnh trắng đuôi nhanh, độ đặc hiệu và độ nhạy cao. 2.3.5. Phƣơng pháp PCR 2.3.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR 2a 3a 1a 1b 13 Phƣơng pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 cho phép làm tăng bội DNA cần đƣợc nghiên cứu. PCR đƣợc thực hiện in vitro theo con đƣờng enzyme (Bùi Trang Việt, 2002). Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đã đƣợc hình thành dựa vào cấu trúc đặc tính đó của các DNA polymerase. Thực vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm mồi xuôi (sens primer), mồi ngƣợc (antisnes primer). 2.3.5.2. Phản ứng PCR Phản ứng PCR là một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc: Bƣớc 1: giai đoạn biến tính (denaturation), trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính cao hơn Tm của phân tử; thƣờng là 94 - 950C trong 30 - 60 giây. Mạch đôi DNA tách thành mạch đơn. Bƣớc 2: giai đoạn lai (anealation) nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn Tm của các mồi, cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 700C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây. Bƣớc 3: giai đoạn tổng hợp (elongation), nhiệt độ đƣợc tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase (polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bƣớc này tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Một phản ứng PCR không vƣợt quá 50 chu kỳ. Vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó kết quả khuếch đại giảm hẳn nên số chu kỳ cho một phản ứng tuỳ thuộc vào số lƣợng bản mẫu ban đầu. 2.3.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 14 DNA mẫu: Phản ứng khuếch đại tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Ngoài ra phƣơng pháp PCR còn có một số ƣu điểm là có thể khuếch đại cả những mẫu DNA không đƣợc bảo quản tốt. Enzyme Taq - polymerase chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus. Enzym này không bị phá huỷ bởi nhiệt biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Tth polymerase là một enzym tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động nhƣ một enzym phiên mã ngƣợc khi có mạch RNA khuôn và ion Mn++, nhƣng với sự hiện diện của của DNA khuôn và ion Mg ++ , Tth - polymerase lại xúc tác cho phản ứng khuếch đại DNA. Enzym này cho phép khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA. Nồng độ enzyme tối ƣu trong khoảng 1 -> 5 đơn vị trên một phản ứng. Mồi và nhiệt độ lai: Mồi là chỉ tiêu quan trọng để đạt đƣợc sự khuếch đại đặc trƣng, chuyên biệt và có đặc hiệu cao. Việc chọn mồi phải tuân theo một số nguyên tắc:  Trình tự của mồi đƣợc chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc”, cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp khác nhau của một mồi.  Nhiệt độ nóng chảy của mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc”, không cách nhau quá xa. Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng, tránh các cặp G - C lặp lại quá nhiều lần.  Các mồi chọn cần phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen.  Trình tự nằm giữa mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc” không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ƣu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb. 2.3.5.4. Các thành phần khác của phản ứng PCR Bốn loại nucleotide thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 20 - 200 M/mỗi nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong các thành phần trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. 15 Mg 2+ là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA polymerase chịu nhiệt. Nồng độ Mg2+ ảnh hƣởng mạnh tới quá trình chạy PCR. Nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế. Nồng độ Mg2+ quá cao tuy ổn định mạch kép DNA nhƣng lại hạn chế sự biến tính hoàn toàn sản phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản phẩm cuối cùng. Quá thừa Mg2+ dẫn đến sự bắt cặp sai giữa mồi và khuôn, kết quả là tạo ra nhiều sản phẩm không đặc hiệu. Nồng độ tối ƣu Mg2+ phải đƣợc xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. 2.3.5.5. Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR. Trong thực tế sử dụng, số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR không vƣợt quá 40 chu kỳ do sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp thƣờng có khuynh hƣớng kết hợp với nhau, kết quả là hiệu quả khuếch đại càng về sau càng giảm vì những nguyên nhân sau:  Sự phân huỷ cạn kiệt các thành phần phản ứng.  Sự xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng.  Các bản sao kết hợp với nhau. 2.3.6. Phƣơng pháp RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction) Phƣơng pháp RT - PCR là sự kết hợp giữa phƣơng pháp phiên mã ngƣợc và phƣơng pháp PCR. Phƣơng pháp này có thể phát hiện các mRNA tồn tại với lƣợng rất thấp, mà không thể phát hiện bằng phƣơng pháp nhƣ Northern blot. Ngoài ra, RT-PCR kết hợp với kỹ thuật RFLP có thể dễ dàng phát hiện ra các đột biến và sự đa hình trong đoạn khuếch đại và xác định độ dài của gen biểu hiện khi một mRNA quan tâm biểu hiện ở mức độ rất thấp. Nhờ RT - PCR sẽ khuếch đại mRNA bình thƣờng và mRNA đột biến tạo thành các DNA, sau đó dùng cùng loại men cắt giới hạn, DNA bình thƣờng phân biệt với DNA đột biến qua sự sai biệt trọng lƣợng phân tử (Bùi Trang Việt, 2002). Do Taq polymerase sử dụng trong bƣớc PCR không hoạt động trên RNA nên trƣớc hết cần chuyển RNA thành cDNA nhờ enzym phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase). Sau đó cDNA sẽ đƣợc nhân bản nhờ Taq polymerase (Walker, 2000). Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gene đặc hiệu của virus. Sự hiện diện của sản phẩm đƣợc nhận biết qua điện di trên gel agarose. 16 Các phương pháp khuếch đại RNA bằng PCR  Oligo (dT) bắt cặp với đuôi poly (A) trên mRNA của động vật hữu nhũ , có thể dùng nhƣ mồi ngƣợc không đặc hiệu để tổng hợp sợi cDNA đầu tiên. Sau đó, phản ứng khuếch đại bằng PCR sẽ rất có hiệu quả khi bổ sung thêm một hoặc nhiều mồi xuôi đặc hiệu cho vùng gen mong muốn (Frohman, 1995 ; Schaefer, 1995 ; Bespalova và cộng sự, 1998).  Sự tổng hợp sợi cDNA đầu tiên có thể đƣợc thực hiện bằng một đoạn mồi oligonucleotide bắt cặp đặc hiệu (gene - specific priming, GSP) với vùng đã đƣợc chọn trên sợi RNA hoặc mRNA đặc trƣng GSP đƣợc gọi là mồi ngƣợc, sự khuếch đại sau đó sẽ đƣợc bổ sung thêm một mồi xuôi tƣơng thích với trình tự đặc hiệu trên cDNA (Frohman, 1995 ; Schaefer, 1995 ; Bespalova và cộng sự, 1998).  Một đoạn gồm 6 nucleotide ngẫu nhiên có thể dùng làm mồi để tổng hợp cDNA tại nhiều điểm dọc theo sợi RNA mẫu, tạo ra nhiều đoạn bản sao khác nhau trên toàn bộ phân tử RNA. Phƣơng pháp này rất hữu dụng để khuếch đại sợi RNA quá dài hoặc chứa nhiều cấu trúc bậc hai không thể tổng hợp bằng oligo (T) hoặc GSP (Lee và Caskey, 1990). Trong việc chẩn đoán bệnh trắng đuôi, phƣơng pháp Single - Step RT - PCR dùng để khuếch đại RNA của hai virus ở trong cùng dung dịch tách chiết (Widada , 2003, 2004 ; Sahul Hameed, 2004a và cộng sự). Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành bằng cách phiên mã ngƣợc và khuếch đại đoạn gen mong muốn trong một ống phản ứng đơn cho mỗi virus (single reaction tube) bằng một chu kỳ nhiệt không liên tục. Kỹ thuật này phát hiện MrNV bằng cách sử dụng một cặp mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R đặc hiệu cho RNA - 2 của MrNV đƣợc thiết kế từ trình tự của bộ gen MrNV (Genbank accession no. AY222840) (Widada, 2003; Sahul Hameed và cộng sự, 2004a). Phát hiện XSV bằng cách cặp mồi XSV - F và XSV - R đƣợc công bố (Widada và cộng sự, 2004). Nguyên tắc phản ứng giống (hình 2.4) sử dụng hai mồi MrNV - RNA2 - R và XSV - R là hai mồi ngƣợc sẽ bắt cặp với tƣơng ứng với RNA của từng virus, sau đó sẽ tạo cDNA trong một thời gian, rồi gia nhiệt để bất hoạt enzym phiên mã ngƣợc, chu kỳ tiếp tục đƣợc thực hiện cùng với hai mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R và XSV - F và XSV - R cho từng virus. Kích thƣớc sản phẩm khuếch đại 681 bp là MrNV và 500 bp là XSV. 17 18 Hình 2.4: Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR để khuếch đại RNA bằng PCR ( Dieffenbach và Dveksler, 1995;Widada , 2003; Sahul Hameed và cộng sự, 2004a). RNA tách chiết Tổng hợp cDNA MrNV XSV Tạo cDNA Bất hoạt enzym RT Khuếch đại Tạo cDNA Bất hoạt enzym RT Khuếch đại Tiếp tục chu kỳ Tiếp tục chu kỳ 681 bp 500 bp 19 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR (Widada, 2003, 2004; Sahul Hameed và cộng sự, 2004a) trên mẫu tôm càng xanh bệnh trắng đuôi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ.  Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR nhƣ phƣơng pháp tách chiết, nồng độ mồi, nhiệt độ lai của mồi.  Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc kiểm tra sự hiện diện MrNV, XSV ở một số mẫu tôm càng xanh thu thực địa. 3.1.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN Thời gian nghiên cứu: từ 7/3-7/8/2005. Địa điểm thực hiện: Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 3.2. VẬT LIỆU 3.2.1. Mẫu tôm Các mẫu tôm càng xanh gồm: 30 mẫu ấu trùng, 2 mẫu postlarvae và 10 mẫu tôm mẹ thu tại trại Thực Nghiệm Thủ Đức, 8 mẫu tôm mẹ thu ở khu vực ĐBSCL. Trong các mẫu chúng tôi thu đƣợc có 8 mẫu tôm mẹ thu ở khu vực ĐBSCL và 1 mẫu postlarvae có triệu chứng lâm sàng bệnh trắng đuôi . Các mẫu tôm càng xanh đƣợc bảo quản trong tủ âm - 700C. 3.2.2. Mồi sử dụng cho qui trình Mồi đƣợc thiết kế bởi tác giả Yoganandhan và cộng sự (2005) dựa trên trình tự của RNA virus (MrNV: Ac No. AY222840; XSV Ac No). Bảng 3.1: Các mồi sử dụng cho phản ứng Single - Step RT - PCR Virus Primer Trình tự GenBank AC Kích cỡ sản phẩm MrNV MrNV-RNA2-F 5’-GATACAGATCCACTAGATGACC-3’ AY222840 681 bp MrNV-RNA2-R 5’-GACGATAGCTCTGATAATCC-3’ XSV XSV-F 5’-GGAGAACCATGAGATCACG-3’ 500 bp XSV-R 5’-CTGCTCATTACTGTTCGGAGTC-3’ 20 3.2.3. Hạt bead RT - PCR: READY - TO - GO (Chế phẩm sử dụng ngay) Sản phẩm này do công ty Amersham pharmacia biotech, Mỹ sản xuất. Đây là chế phẩm có sẵn các thành phần để thực hiện phản ứng RT - PCR, khi sử dụng ta chỉ cần thêm bản mẫu và mồi sử dụng . Mỗi loại hạt Bead đƣợc thiết kế cho một phản ứng với thể tích cuối 50 µl. Thành phần của hạt bead gồm:  2 đơn vị Taq DNA polymerase  10 nM Tris - HCL (pH 9, nhiệt độ phòng)  60 nM KCl  1.5 mM MgCl2  20 M mỗi loại dNTP  M - MulV Reverse Transcriptase  RNA guard TM  Ribonuclease Inhibitor và chất ổn định không chứa Rnase/DNase 3.2.4. Bộ Kit AquaPure RNA Iso