Ứng dụng phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono để phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm thủy sản

ement 1 (Bio-Rad,356-4039) Thành phần môi trường - Polymixin B - Caftazidime c) A.L. Supplement 2 (Bio-Rad, 356-4040) Thành phần môi trường - Nalidixic acid - Cychloheximide - Phosphatidylinositol Cách pha chế thạch ALOA Cân 35 gam Listeria selective Agar Base acc OTTAVIANI and AGOSTI vào 476 ml nước cất vô trùng sau đó làm tan bằng Microwave. Sau đó ủ ở bể điều nhiệt ở nhiệt độ 45-500C. Bổ sung thêm 1 chai A.L. supplement 1 và 1 chai A.L. supplement 2. Lắc nhẹ và tiến hành đổ đĩa ngay. Sau đó sấy khô bề mặt đĩa ở nhiệt độ (37-440C) A.L. Supplement 1: dạng chai nhỏ dạng bột: hút 4ml dung dịch cồn/nước = 1:1 vào Supplement 1 hòa tan. A.L. Supplement 2 dạng trai lớn dung dịch chứa 20ml. 2.3.4. Thạch Oxford a) Oxford Listeria selective Agar (base) (Merck,1.07004.0500) Thành phần môi trường (gam/lít) Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 15 - Peptone 23.0 - Starch 1.0 - Sodium chloride 5.0 - Agar-agar 13.0 - Aesculin 1.0 - Ammonium-iron (III) citrate 0.5 - Lithium chloride 15.0 b) Oxford Listeria Selective Supplement (Merck, 1.07006) Thành phần môi trường - Cycloheximide - Colistin sulfate - Acriflavine hydrochloride - Cefotetan - Fosfomycin - Ethanol - Pha thạch Oxford Cân 29,25 gam Oxford Listeria selective Agar (base) cho vào 500ml nước cất, hòa tan sau đó đem thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Ủ ở bể điều nhiệt ở nhiệt độ 45-500C. Sau đó bổ sung 5 ml Oxford Listeria Selective Supplement vào môi trường. Lắc đều và tiến hành đổ đĩa khoảng 15-20ml/đĩa. Oxford Listeria Selective Supplement: chứa trong chai nhỏ dạng bột phải hòa tan bằng dung dịch cồn/nước= 1:1. 2.3.5. Môi trường không chọn lọc TSYEA, TSYEB a) Trytone soya broth (Merck, 1.5459.0500) Thành phần (gam/lít) - Peptone from casein 17.0 - Peptone from Soymeal 3.0 - D(+) Glucose 2.5 - Sodium chloride 5.0 - Di- potasodium hydrogen phosphate 2.5 b) Yeast extract (Merck, 1.03753.0500) c) Agar (Merck, 1.01614.1000) Cách pha chế - TSYEA: Cân 30gam/lít Trytone soya broth, 6gam/lít Yeast extract, 15gam/lít Agar, 1000ml nước. Hòa tan hỗn hộp trên. Chỉnh pH hỗn hợp Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 16 dung dịch 7,3± 0,2. Sau đó hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, sau thanh trùng làm nguội ở bể điều nhiệt (45-500C). Đỗ đĩa. Chú ý đổ một lớp thật mỏng để xem Henry illumination. - TSYEB: Cân 30gam/lít Trytone soya broth, 6gam/lít Yeast extract, 1000ml nước. Hòa tan hỗn hộp trên. Chỉnh pH hỗn hợp dung dịch 7,3± 0,2, sau đó tiến hành đỗ vào ống nghiệm khoảng 3ml/ống. Hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 2.3.6. Rhramnose, Xylose. Môi trường sử dụng Purple Broth làm nền. Sau đó bổ sung đường Rhramnose, Xylose. a) Purple Broth Base (BBLTM, 211558) Thành phần môi trường - Pancreactic Digest of Gelatin 10.0gam - Sodium chloride 5.0gam - Bromcresol purple 0.02gam b) Đường D(+)(-) Xylose (Merck, 1.08689.0100) c) Đường L(+)- Rhramnose monohydrate (Merck, 1.07361.0025) Cách Pha chế môi trường Cân 15gam/lít Purple Broth Base thêm vào 1000ml nước cất, khuấy tan dung dịch, chỉnh pH 6,8± 0,2. Sau đó đem thanh trùng ở nhiệt độ 1180C trong 15 phút. Làm nguội ta có chất nền purple Broth. Sau đó bổ sung đường Rhramnoes hoặc xylose bằng cách dùng nền purple broth hòa tan đường sau đó lọc qua màng lọc và cho vào nền purple broth. Phân ống 5ml/ống. 2.3.7. Môi trường thạch máu (Blood agar) Tryptic Soy Agar (TSA) (Merck, 1.05458.0500) Thành phần môi trường - Casein peptone - Soymeal pepton - Agar Pha môi trường thạch máu: Cân 40gam/lít TSA, làm tan đều và chỉnh pH 7,3± 0,2. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, làm nguội ở bể điều nhiệt 45-470C. Sau đó bổ sung 5->7ml máu thỏ hoặc bò vào 100ml chai TSA đã làm nguội ở bể điều nhiệt. Đổ đĩa 10-15ml/đĩa. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 17 2.3.8. Motility Agar Thành phần môi trường - Casein peptone - Meat peptone - Agar - Nước Pha môi trường Motility agar: Cân 22gam/lít motility agar, bổ sung 0.05gam TTC (2,3,5-Triphenyl Tetrazodium Chloride) chỉnh pH 7,3± 0,2. Làm tan dung dich bằng Microwave. Phân ống (5-7ml/ống). Sau đó hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. 2.3.9. Môi trường lỏng BHI (Brain Heart Infusion) Cân 37gam/lít Brain Heart Infusion hòa tan chỉnh pH 7,4± 0,2. Phân ống (5ml/ống). Sau đó hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 18 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Vật liệu 3.1.1. Mẫu thực phẩm Mẫu thực phẩm sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ các công đoạn trong quy trình chế cá tra fillet đông lạnh tại nhà máy chế biến thủy sản. 3.1.2. Môi trường, hóa chất -Canh thang Fraser Listeria selection Enrichment Broth (Merck 1. 10398.500) -Canh thang Fraser Listeria selection Enrichment Supplement (Merck 1. 10399.0001/2) -Thạch ALOA (Agar Listeria according to Ottaisani and Agosti (Biorad 356-4038) -AL supplement 1 (Biorad 356-4039) -AL supplement 1 (Biorad 356-4040) -Palcam Listeria selection agar (Merck VM 1.07004) -Palcam Listeria selection supplement (Merck VM 1.12122) -Oxford Listeria selective agar (Merck 1.07004) -Oxford Listeria selective supplement (Merck 1.07006) -Purple carbonhydrate Broth (Difco 217510 hoặc Merck 1.07361) -Xylose (BDH 305905B) -Tripptose Soya Broth (Merck 1.05459) -Yeast extract (Difco 212750) -Agar (Difco 214010) -Motility agar -Thuốc thử H2O2 30% -Thuốc thử KOH 3% hoặc bộ thuốc nhuộm gram -Thạch Blood Agar (Merck 1.10328) -Máu cừu, máu bò. -Đĩa thạch RAPID’L.mono 3.1.3. Thiết bị và vật dụng -Bể điều nhiệt 45,0± 1,00C -Tủ ấm: 25,0± 1,00C, 30,0± 1,00C 37,0± 1,00C -Thiết bị đồng nhất mẫu - Kính hiển vi Và một số vật dụng khác dùng trong phòng thí nghiệm vi sinh Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 19 3.1.4. Lấy mẫu Mẫu phải đại diện cho sản phẩm không bị hư hỏng và không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản. 3.2. Phương pháp thí nghiệm 3.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono. a) Mục đích Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono với vi khuẩn Listeria monocytogenes và các chủng vi sinh vật khác không phải Listeria monocytogenes bằng phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono. Phân tích trên nền mẫu cá tra nhiễm Listeria monocytogenes và các chủng vi sinh vật khác để khẳng định tính đặc hiệu của môi trường RAPID’L.mono. b) Sơ đồ thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí một cách ngẫu nhiên, nhân tố thay đổi là các chủng loại vi sinh vật. Thí nghiệm được lặp lại 10 lần. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau đây: A1 A2 A3 A4 A5 A6 A. Tăng sinh trong BHI Ủ 370C, 8 giờ C. Đọc kết quả trên RAPID’L.mono D. Chọn khuẩn lạc điển hình khẳng định bằng cách cấy ria lên ALOA. Ủ 370C, 24 giờ B. Phân lập trên RAPID’L.mono E. Đọc kết quả Ủ 370C, 24 giờ Hình 3.2.1: Sơ đồ thí nghiệm 1 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 20 Bảng 3.2.1. Danh mục các chủng vi sinh vật thử nghiệm Mẫu Tên chủng A1 Listeria monocytogenes A2 Listeria ivanovii A3 Salmonella spp. A4 Staphylococcus aureus A5 Coliform A6 Mẫu đối chứng không chứa vi sinh vật c) Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị các chủng vi sinh vật chuẩn như Bảng 3.2.1. Các chủng vi sinh vật chuẩn được lấy từ phòng thí nghiệm của Nafiquad 6 - Cần Thơ, được bảo quản cẩn thận ở nhiệt độ 40C có nhãn ghi đầy đủ các thông tin như: tên, ký hiệu chủng, ngày, số lần cấy chuyển. Các ống môi trường lỏng BHI đã được chuẩn bị sẵn, đánh ký hiệu lên các ống BHI tương ứng. Cấy chuyển từ ống chủng vi sinh vật chuẩn sang các ống BHI. Ủ ở 370C trong 8 giờ. Cấy ria từng chủng vi sinh vật chuẩn trong ống BHI tương ứng lên từng đĩa RAPID’L.mono tương ứng. Các bước sau thực hiện theo quy trình phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono như mô tả ở Trang 12 Mục 2.2.2.3. d) Phương pháp thu thập số liệu Quan sát khuẩn lạc trên môi trường RAPID’L.monno ở các đĩa cấy các vi sinh vật khác nhau. Có hình thành hay không hình thành khuẩn lạc, hình dạng và màu sắc khuẩn lạc. 3.2.2. Thí nghiệm 2: Xác định độ nhạy của phương pháp phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono a) Mục đích thí nghiệm Xác định độ nhạy (giới hạn pháp hiện – LOD50) của phương pháp thông qua phân tích dãy nồng độ pha loãng chủng Listeria monocytogenes để tìm nồng độ thấp nhất mà phương pháp có khả năng phát hiện. . Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 21 b) Sơ đồ bố trí thí nghiệm: c) Cách tiến hành -Xác định hàm lượng tế bào từ 10-100 tế bào/ml dựa vào độ đục McFarland Độ đục chuẩn McFarland 0.5 có thể mua từ nhà sản xuất. Nếu tự pha thì theo công thức sau: thêm 0.5ml dung dịch BaCl2.2H20 1,175% vào 99,5ml dung dịch H2SO41%. Sau đó, độ đục chuẩn này được chia thành các thể tích nhỏ chuyển sang các ống nghiệm giống nhau. Các ống này được dùng để so sánh dịch vi khuẩn. Trước khi sử dụng, lắc đều để dung dịch đồng nhất. - Thực hiện dãy pha loãng nhị phân So sánh độ đục của dịch khuẩn chuẩn có độ đục gần giống độ đục của ống McFarland khi đó ống dung dịch khuẩn chuẩn có mật độ tế bào khoảng 108 tế bào/ml. Pha loãng dịch khuẩn đến mật độ từ 10-100 tế bào/ml. Từ dịch pha loãng dự đoán có mật độ từ 10-100 tế bào/ml (xem đây là nồng độ 20) pha Dựa vào độ đục chuẩn McFarland để xác định hàm lượng tế bào Listeria monocytogenes có từ 10-100 tế bào/ml Pha loãng dịch tế bào có mật độ 10-100 thành dãy nhị phân (20, 2-1, 2-2, 2-3,….) Mỗi nồng độ hút 1ml cho vào bao PE chứa 25 gam mẫu trắng (mẫu không có Listeria monocytogenes), mỗi nồng độ lặp lại 10 lần) Mỗi bao PE chứa 25 gam mẫu đã spike chủng được phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes bằng phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono Dựa vào các số liệu phân tích và áp dụng công thức tính LOD50 để xác định giới hạn phát hiện của phương pháp. Hình 3.2.2: Sơ đồ thí nghiệm 2 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 22 loãng nhị phân (bằng cách hút 15ml ở nồng độ 20 cho vào chai nước muối sinh lý 15ml) tương tự pha loãng 2-1, 2-2 , 2-3 , 2-4. - Cho chủng vào mẫu Tại mỗi nồng độ pha loãng 20, 2-1, 2-2 , 2-3 , 2-4 hút 1ml vào bao PE chứa 25gam mẫu trắng + 225ml dung dịch Half Fraser (lặp lại 10 lần), và 1ml vào đĩa petri (hai đĩa petri), cho vào các đĩa petri 15-20ml PCA lắc đều và ủ ở 370C trong 24 giờ, còn các bọc PE đã cho chủng ủ ở 300C trong 24 giờ. - Phân tích trên RAPID’L.mono. Mỗi bao PE chứa 25 gam mẫu đã cho chủng được phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes bằng phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono được mô tả ở Mục 2.2.2.3 Trang 12. d) Thu thập số liệu · Đếm số khuẩn lạc trên PCA · Chọn tất cả các kết quả có cùng số lượng chủng cho vào thấp nhất mà tại đó các kết quả đều dương tính. · Chọn tất cả các kết quả có cùng số lượng chủng cho vào mà tại đó >50% kết quả dương tính. · Chọn tất cả các kết quả có cùng số lượng chủng cho vào mà tại đó các kết quả đều dương tính. Cách tính toán LOD50 · Xác định giá trị L: log của số lượng tế bào được cho vào thấp nhất mà tại đó 100% phép thử cho kết quả dương tính. · Xác định d: log của nồng độ pha loãng (VD sử dụng dãy pha loãng thập phân d=log10, sử dụng dãy pha loãng nhị phân d=log2) · Xác định pi: tỉ lệ phản ứng dương tính³50% và 100% đối với nồng độ pha loãng thứ i Sau khi xác định các giá trị trên tính LOD50 như sau: Giới hạn phát hiện được tính toán theo LOD50 – phương pháp Speaman- Karber. Log(LOD)= L – d(å Pi – 0.5)= m Với độ tin cậy 95% LOD50 nằm trong khoảng (10m-2SQRT(Um); 10m-2SQRT(Um)) Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 23 Trong đó · LOD50: giới hạn phát hiện của phương pháp mà tại đó 50% phép thử cho kết quả dương tính. · Um: ước lượng sai số của m · Um= d 2å Pi(1-Pi)/(n-1) · n: số lần lặp lại đối với nồng độ pha loãng thứ i. 3.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định độ lặp lại của phương pháp phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono a) Mục đích Xác định độ lặp lại của phương pháp phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono trên cùng một mẫu thử. b) Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện với mẫu trắng (không nhiễm Listeria monocytogenes) thêm chủng Listeria monocytogenes tại giá trị số lượng tế bào được cho vào thấp nhất mà tại đó 100% phép thử cho kết quả dương tính từ thí nghiệm 2. Cách tiến hành được thực hiện theo sơ đồ sau: A. Tăng sinh 25g mẫu + 225ml Half Fraser Đồng nhất, gây nhiễm Ủ 300C trong 24 giờ C. Đọc kết quả trên RAPID’L.mono D. Chọn khuẩn lạc điển hình khẳng định bằng cách cấy ria lên ALOA. Ủ 370C trong 24 giờ B. Phân lập trên RAPID’L.mono E. Đọc kết quả Ủ 370C trong 24 giờ Hình 3.2.3: Sơ đồ thí nghiệm 3 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 24 c) Cách tiến hành thí nghiệm Sử dụng nồng độ dịch pha loãng ở thí nghiệm 2, gây nhiễm ở mật độ tế bào nói trên vào 25gam mẫu + 225ml Half Fraser tiến hành phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo phương pháp phân tích nhanh trên RAPID’L.mono. Thí nghiệm được lặp lại 10 lần trên cùng mẫu thử. Thực hiện song song mẫu trắng không gây nhiễm Listeria monocytogenes. d) Thu thập số liệu Tống số cho kết quả dương tính. 3.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono so với phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 a) Mục đích Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono so với phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo tiêu chuẩn ISO 11290-1: 2004 trên các mẫu nhiễm được lấy từ công đoạn sản xuất cá tra phi lê đông lạnh. b) Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau: Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 25 Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên mẫu cá tra phi lê đông lạnh. Phân tích song song mẫu bằng hai phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono và theo ISO 11290-1:2004. c) Thu thập số liệu · Tổng hợp kết quả từ thí nghiệm 1, 2, 3. · Tổng số cho kết quả dương tính sau khẳng định bằng phương pháp RAPID’L.mono. · Tổng số cho kết quả dương tính sau khẳng định bằng phương pháp ISO 11290-1: 2004. F. Khẳng định trên ALOA D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB F. Khẳng định G. Đọc kết quả A.Tăng sinh lần 1 25 g mẫu + 225ml HF B.Tăng sinh lần 2 0,1ml dịch tăng sinh lần 1 + 10ml FB C. Cấy ria trên ALOA + Palcam hoặc Oxford 300C, 24 giờ D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB C. Cấy ria trên ALOA + Palcam hoặc Oxford 370C,48 giờ 370C, 48 giờ 370C, 48 giờ 250C, 8-24 giờ (TSYEB) 370C, 24 giờ (TSYEA) F. Khẳng định: - Henry illumination - Catalase - Gram - Tan huyết - Khả năng sử dụng đường Xylose, Rhamnose - Thử nghiệm CAMP - Di động 250C, 8-24 giờ (TSYEB) 370C, 24 giờ (TSYEA) G. Đọc kết quả Hình 3.2.4. Sơ đồ thí nghiệm 4 J. Cấy ria lên RAPID’L.mono 370C, 24giờ Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 26 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Hình dạng khuẩn lạc trên 3 loại môi trường đặc hiệu cho Listeria monocytogenes 4.1.1. Trên môi trường ALOA · Trên ALOA khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình có màu xanh da trời, khuẩn lạc bóng lồi, đường kính khuẩn lạc từ 1- 4mm sau 24 giờ, xung quanh khuẩn lạc có quầng trắng đục mờ bao quanh (Hình 4.1.a) · Môi trường ALOA chứa các chất ức chế như Sodium Chloride, Lithium Chloride, Disodium hydrogen phosphate ức chế một số vi sinh vật khác không phải là Listeria spp. Mặt khác trong môi trường nền của ALOA có 5-Bromo-1-Chloro-3- Indolyl- b -D- Glucosidase. Khi phát triển trên môi trường ALOA hệ enjyme b -D- Glucosidase của Listeria monocytogenes bẻ gãy liên kết của chất nền 5-Bromo-1-Chloro-3- Indolyl- b -D- Glucosidase tạo gốc 5-Bromo-1-Chloro-3- Indolyl có màu xanh vì vậy khuẩn lạc Listeria monocytogenes phát triển trên ALOA sẽ tạo khuẩn lạc màu xanh. Mặt khác trong A.L. supplement 2 có Phosphatidylinositol kích thích hoạt động của enjyme Phospholipase trong Listeria monocytogenes phân giải Lipid và protein tạo vùng tủa trắng đục mờ xung quanh khuẩn lạc. 4.1.2. Trên môi trường Oxford · Trên môi trường Oxford khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình có màu xám bóng đường kính khuẩn lạc từ 1-2mm, luôn có quầng đen bao quanh, sau 48 giờ tâm khuẩn lạc lõm xuống (Hình 4.1.b) · Trên môi trường Oxford chứa các chất ức chế như Sodium Chloride, Lithium Chloride ức chế tương tự như trên ALOA. Trong môi trường còn có hợp chất Esculin. Listeria monocytogenes có hệ enjyme b -D- Glucosidase sẽ chuyển hóa Esculin thành Glucose và Esculetine, Esculetine kết hợp với amononium Iron (III) citrate tạo phức màu đen. Vì vậy tạo quầng màu đen xung quanh khuẩn lạc. 4.1.3. Trên môi trường RAPID’L.mono · Trên RAPID’L.mono khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình có màu xanh dương, khuẩn lạc bóng lồi đường kính từ 1-4mm sau 24 giờ. Không có quầng màu vàng xung quanh. Đối với Listeria ivanovii khuẩn Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 27 lạc có màu xanh xung quanh có quầng màu vàng. Các Listeria spp khác khuẩn lạc điển hình là màu trắng có hoặc không có quầng màu vàng xung quanh (Hình 4.1.c) · Trên RAPID’L.mono chứa một số chất ức chế cao các vi sinh vật khác không phải là Listeria spp. Phát hiện ra Listeria monocytogenes bằng phát hiện màu do hoạt tính PIPLC (Phosphatidyl Inositol phospholipase C) trong Listeria monocytogenes tạo khuẩn lạc màu xanh dương. Listeria monocytogenes không lên men đường Xylose nên không làm đổi màu nền của RAPID’L.mono. (a): Khuẩn lạc màu xanh da trời có quầng đục bao quanh. (b): khuẩn lạc màu xám, có quầng đen bao quanh. (c): khuẩn lạc màu xanh dương không có quầng màu vàng bao quanh. 4.2. Kết quả thí nghiệm 1: Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono. Để khẳng định tính đặc hiệu của môi trường RAPID’L.mono đối với Listeria monocytogenes chúng tôi sử dụng các chủng vi sinh vật ở Bảng 3.2.1 để thực hiện thí nghiệm. Các chủng này đều được nuôi trong môi trường lỏng BHI trong cùng một khoảng thời gian 8 giờ. Sau đó cấy lên đĩa môi trường RAPID’L.mono ủ ở 370C. Kết quả thu được như Bảng 4.2.1. Hình 4.1: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình trên ALOA (a), Oxford (b), RAPID’L.Mono (c) được phân lập tại phòng kiểm nghiệm vi sinh Nafiqad 6 - Cần Thơ. (a) (b) (c) Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 28 Bảng 4.2.1. Kết quả thí nghiệm 1 Mẫu Chủng vi sinh vật Phát triển/không phát triển trên RAPID’L.mono Hình dáng, màu sắc khuẩn lạc A1 Listeria monocytogenes Phát triển mạnh Tròn không có quầng xung quanh, màu xanh dương đậm. A2 Listeria ivanovii Phát triển mạnh Tròn có quầng màu vàng xung quanh, màu xanh dương nhạt. A3 Salmonella spp. Không phát triển Không hình thành khuẩn lạc. A4 Staphylococcus aureus Không phát triển Không hình thành khuẩn lạc. A5 Coliform Không phát triển Không hình thành khuẩn lạc. A6 Mẫu đối chứng không chứa vi sinh vật. Không phát triển Không hình thành khuẩn lạc. Thí nghiệm được lặp lại 10 lần trên các chủng Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Coliform và mẫu đối chứng. Kết quả cho thấy có hình thành khuẩn lạc của Listeria monocytogenes (Bảng 4.2.1, Hình 4.2.1), khuẩn lạc của Listeria ivanovii (Bảng 4.2.1, Hình 4.2.2) trên môi trường RAPID’L.mono, các chủng khác không phải là Listeria spp. không hình thành khuẩn lạc trên RAPID’L.mono (Bảng 4.2.1, Hình 4.2.3). Mẫu đối chứng không hình thành khuẩn lạc (Bảng 4.2.1, Hình 4.2.4) Ngoài ra thí nghiệm còn được tiến hành trên 20 nền mẫu cá tra phi lê đông lạnh trên môi trường RAPID’L.mono. Kết quả như Bảng 4.2.2. Bảng 4.2.2: Kết quả phân tích trên nền mẫu cá tra phi lê đông lạnh Mẫu Số lượng mẫu Số mẫu có hình thành khuẩn lạc Số mẫu không hình thành khuẩn lạc M1 nhiễm Listeria monocytogenes 10 10 0 M2 nhiễm Listeria spp. khác không là Listeria monocytogenes 2 2 0 M3 nhiễm Salmonella spp. 2 0 2 M4 nhiễm Staphylococcus aureus 2 0 2 Coliform 2 0 2 Mẫu bị nhiễm các chủng M1, M2, M3, M4 2 2 0 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 29 Từ Bảng 4.2.2 cho thấy tất cả các mẫu có nhiễm Listeria monocytogenes và Listeria spp. không là Listeria monocytogenes thì có hình thành khuẩn lạc trên môi trường RAPID’L.mono, các mẫu bị nhiễm bởi các chủng vi sinh vật khác thì không hình thành khuẩn lạc. Cho thấy nếu như mẫu bị nhiễm Listeria spp. cùng với các chủng vi sinh vật khác thì môi trường RAPID’L.mono chỉ đặc hiệu phát hiện Listeria spp.. Do khác nhau về màu sắc khuẩn lạc của Listeria monocytogenes và Listeria spp. không là Listeria monocytogenes nên dễ dàng nhận dạng được Listeria monocytogenes trên môi trường RAPID’L.mono Kết luận: môi trường RAPID’L.mono đặc hiệu phát ra Listeria monocytogenes. Hình 4.2.1: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình trên RAPID’L.mono được phân lập tại phòng kiểm nghiệm vi sinh của Nafiqad 6-Cần Thơ.(Khuẩn lạc màu xanh dương không có quầng màu vàng xung quanh) Hình 4.2.2: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria ivanovii điển hình trên RAPID’L.mono được phân lập tại phòng kiểm nghiệm vi sinh của Nafiqad 6- Cần Thơ (Khuẩn lạc màu xanh quầng màu vàng lớn nên làm biến đổi màu môi trường RAPID’L.mono) Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 30 (A1): Listeria monocytogenes khuẩn lạc màu xanh dương (A2): Listeria ivanovii khuẩn lạc màu xanh có quầng màu vàng (A3): Salmonella spp. không hình thành khuẩn lạc (A4): Staphylococcus aureus không hình thành khuẩn lạc (A5): Coliform không hình thành khuẩn lạc Hình 4.2.4: Ảnh chụp mẫu A6 mẫu đối chứng không chứa vi sinh vật trên RAPID’L.mono tại phòng kiểm nghiệm vi sinh của Nafiqad6- Cần Thơ (không hình thành khuẩn lạc) Hình 4.2.3: Ảnh chụp khuẩn lạc các chủng vi sinh vật trên RAPID’L.mono tại phòng kiểm nghiệm vi sinh của Nafiqad6-Cần Thơ. A4 A1 A5 A2 A3 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 31 4.3. Kết quả thí nghiệm 2: Xác định độ nhạy của phương pháp phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono Để xác định độ nhạy của phương pháp một cách chính xác, xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường PCA. Cách thức tiến hành được mô tả chi tiết tại Mục 3.2.2 Trang 21. Bảng 4.3: Kết quả thí nghiệm 2 Nồng độ 20 2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 Ngày phân tích Độ lặp lại Số tế bào cho vào đọc được trên PCA Kết quả Số tế bào cho vào đọc được trên PCA Kết quả Số tế bào cho vào đọc được trên PCA Kết quả Số tế bào cho vào đọc được trên PCA Kết quả Số tế bào cho vào đọc được trên PCA Kết quả Số tế bào cho vào đọc được trên PCA Kết quả 10/3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 54 Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 29 Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 14 Pos Pos Pos Pos ND Pos Pos ND Pos Pos 9 Pos ND ND Pos Pos ND Pos ND ND Pos 4 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Tỉ lệ dươn g tính 100% 100% 80% 50% 0% 0% Ghi chú: Pos: dương tính ND: không phát hiện Tính toán LOD50 · Giá trị L: L = log29 (Mật độ tế bào thấp nhất tại đó có 100% đều cho kết quả dương tính) · Giá trị d: d = log2 (Hệ số pha loãng) · Các giá trị pi: p1 = 1,0 (100% dương tính tại mật độ tế bào thấp nhất) p2 = 0,8 (Tỉ lệ dương tính) p3 = 0,5 (Tỉ lệ dương tính) å pi = 2,3 Theo công thức tính toán LOD50 – phương pháp Speaman- Karber Mục 3.2.2 Trang 22 Ta tính được: m= 0,92 LOD50 = 8.32 Um = 0,001 m- 2SQRT(Um) = 0.86 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 32 m+2SQRT(Um)=0.98 Cận trên 7,24 Cận dưới 9,55 Kết luận: giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono là LOD50 = 8 (số liệu làm tròn từ LOD50=8,32). Với độ tin cậy 95% LOD50 nằm trong khoảng 7 – 10 tế bào/25g (số liệu làm tròn giữa cận trên 7,24 và cận dưới 9,55). Hình 4.3.1: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình với mật độ tế bào gây nhiễm trên mức LOD50 (L= 29) phân lập tại phòng kiểm nghiệm vi sinh Nafiqad 6- Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 33 Hình 4.3.2: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình với mật độ tế bào gây nhiễm ở mức LOD50 (L= 9) phân lập tại phòng kiểm nghiệm vi sinh Nafiqad 6- Cần Thơ. Hình 4.3.3: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình với mật độ tế bào gây nhiễm ở dưới LOD50 (L= 4) phân lập tại phòng kiểm nghiệm vi sinh Nafiqad 6- Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 34 4.4. Kết quả thí nghiệm 3: Xác định độ lặp lại của phương pháp phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono Do phương pháp này ứng dụng để phát hiện định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes nên chúng tôi bố trí thí nghiệm lặp lại ở giá trị lớn hơn LOD50 để kiểm tra sự ổn định của phương pháp. Thí nghiệm được lặp lại 10 lần (Bảng 4.4). Với 10 lần phân tích với L= 29 tế bào. Bảng 4.4. Kết quả thí nghiệm 3 Mật độ gây nhiễm Số lần lặp lại Tỉ lệ dương tính 29 tế bào/ml 10 10/10 Kết luận: Với 10 lần phân tích với L=29 tế bào/ml thì kết quả dương tính là 10 (100%). 4.5. Kết quả thí nghiệm 4: Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono so với phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 Phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 trên nền mẫu cá có độ đặc hiệu cho Listeria monocytogenes ở các phép thử sinh hóa, độ nhạy LOD50 = 12 với độ tin cậy 95% LOD50 nằm trong khoảng 9-15 tế bào/25gam, độ lặp lại ở mức L= 45 là 100% (Báo cáo thẩm tra phương pháp phân tích định tính Listeria monocytogenes trong thực phẩm ISO 11290-1:2004 của Trung Tâm chất lượng, an toàn vệ sinh & thú y thủy sản vùng 6) Tổng hợp kết quả từ thí nghiệm 1, 2, 3 xác định được phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên môi trường RAPID’L.mono có độ đặc hiệu, độ nhậy, độ lặp lại nằm trong chuẩn mực cho phép tương đương với phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004. Bảng 4.5 Bên cạnh đó chúng tôi cũng đã tiến hành phân tích song song 10 mẫu cá tra phi lê đông lạnh nhiễm Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii bằng phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo ISO 11290- 1:2004 và trên RAPID’L.mono. Kết quả cho thấy rằng: · 10 mẫu phân tích trên RAPID’L.mono đã định danh được Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii. Sau khi thử nghiệm sinh hóa cho kết quả đúng là 92%. · 10 mẫu phân tích theo ISO 11290-1:2004 đã định danh được Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii trên ALOA. Sau khi thử nghiệm Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 35 sinh hóa cho kết quả đúng là 80%, trên Oxford sau khi thử nghiệm sinh hóa cho kết quả đúng là 70% Bảng 4.5 Bảng 4.5: Xác định độ tương đồng Phương pháp TT Tên thí nghiệm RAPID’L.mono ISO 11290-1:2004 1 Độ đặc hiệu Đặc hiệu cho khuẩn Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii và Listeria spp. trên môi trường RAPID’L.mono. Chọn lọc khuẩn lạc Listeria spp. Trên môi trường ALOA, Oxford Đặc hiệu các phép thử sinh hóa ở Bảng 2.1 2 Độ nhạy LOD50 7-10 tế bào 9-15 tế bào 3 Độ lặp lại Với L=29 tế bào lặp lại 100% Với L=45 tế bào lặp lại 100% 4 Thử nghiệm song song hai phương pháp 10 mẫu cho nhiễm Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii trên môi trường RAPID’L.mono cho kết quả đúng với thử nghiệm sinh hóa là 92%. 10 mẫu cho nhiễm Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii trên ALOA , Oxford cho kết quả đúng với thử nghiệm sinh hóa là 80% (ALOA), 70%(Oxford) Kết luận: phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono so với phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004: · Cho kết quả phân tích tương đồng với nhau · Thời gian cho kết quả 2-3 ngày bằng phương pháp RAPID’L.mono so với 4 – trên 7 ngày bằng phương pháp phân tích theo ISO 11290- 1:2004. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 36 Phần 5: KẾT LUẬN CHUNG Phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono được so sánh với phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 kết quả thu nhận được có thể kết luận rằng: độ nhạy, độ đặc hiệu và độ lặp lại tương đồng với nhau. Ưu điểm của phương pháp RAPID’L.mono là độ chọn cao hơn. Cụ thể trên môi trường thạch RAPID’L.mono được thiết kế đặc hiệu để chọn lọc Listeria monocytogenes [màu xanh dương không có quầng màu vàng xung quanh (Xylose (-)], Listeria ivanovii [màu xanh dương-xanh lá có quầng màu vàng xung quanh (Xylose (+)] và Listeria spp. màu trắng có hoặc không có quầng màu vàng xung quanh. Do khác nhau về màu sắc của khuẩn lạc trên môi trường RAPID’L.mono nên dễ dàng nhận dạng và phân lập Listeria monocytogenes. Trong khi đó trên môi trường ALOA không có khả năng phân biệt Listeria monocytogenes hay Listeria ivanovii do các khuẩn lạc này đều có màu xanh da trời. Do vậy để tìm ra Listeria monocytogenes nhất thiết phải tiến hành các pháp thử sinh hóa. Kết quả thu được trong thời gian 2 ngày (trường hợp âm tính) và 3 ngày (trường hợp dương tính) bằng phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono. So với phương pháp phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 thời gian cho kết quả 4 ngày (trường hợp âm tính) và trên 7 ngày (trường hợp dương tính). Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 37 Phần 6: KIẾN NGHỊ Do phương pháp RAPID’L.mono tương đồng với phương pháp ISO 11290-1: 2004 và thời gian phân tích nhanh (2-3 ngày) nên chứng tôi đề nghị nên áp dụng phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono ở các phòng kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm. Nếu có thời gian và điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm trên các nền mẫu khác nhau như thịt, rau, củ, quả.... Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 38 PHỤ LỤC HÌNH 1) Môi trường sử dụng trong luận văn Hình 2: Listeria selective Agar Base acc OTTAVIANI and AGOSTI (ALOA) Hình 1:Fraser Listeria Base Broth Supplement selective, Amonium Iron (III) Citrate. Hình 3:A.L supplement 1, A.L. supplement 2 Hình 6: Oxford Listeria selective Agar (base) Hình 4: Oxford Listeria SelectiveSupplement Hình 5: Yeast extract (trái), Trytone soya broth (giữa), Agar (phải) Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 39 Hình 8: Purple Broth Base Hình 7: Tryptic Soy Agar Hình 10: L(+)- Rhramnose monohydrate Hình 9: L(+)- Xylose Hình 11: Một số môi trường đã pha chế Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 40 2) Môi trường phân lập ALOA Oxford RLM Hình 12: Đĩa ALOA và khuẩn lạc Listeria monocytogenes trên ALOA Hình 13: Đĩa Oxford và khuẩn lạc Listeria monocytogenes trên Oxford Hình 14: Đĩa RAPID’L.mono và khuẩn lạc Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 41 3) Môi trường thử sinh hóa Hình 17: Khuẩn lạc Listeria trên TSYEA Hình 18: Phản ứng Henry illumination của Listeria spp Hình 19: Hoạt tính tan huyết của Listeria monocytogenes Hình 20: Di động dù của Listeria monocytogenes Hình 15: Khuẩn lạc Listeria spp. trên RAPID’L.mono Hình 16: Khuẩn lạc Listeria ivanovii và Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 42 Hình 21: Đường Xylose và Rhamnose Hình 22: Listeria monocytogenes Xylose (-) và Rhamnose (+) Hình 23: Thử nghiệm CAMP Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản - Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội – 2004. 2. Hướng dẫn quản lý hoạt động kiểm nghiệm tại cơ sở chế biến thủy sản - nhà xuất bản Nông Nghiệp. 3. Ứng dung phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) trong phát hiện nhanh Listeria monocytogenes (Nguyến Thị Kim Hoa, Tô Kim Anh – Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội 1, Đại Cồ Việt, Hai Bà Trưng Hà Nội, Fax: 48682452, tokimanh@mail.hut.edu.vn ) 4. Báo cáo thẩm tra phương pháp phân tích định tính Listeria monocytogenes trong thực phẩm ISO 11290-1:2004 của Trung Tâm chất lượng, an toàn vệ sinh & thú y thủy sản vùng 6) 5. www.google.com.vn. 6. Một số tài liệu Nafiqad 6 Cần Thơ cung cấp Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 44 LỜI CẢM ƠN Trãi qua thời gian dài học tập, đến nay kiến thức về chuyên môn tôi đã nắm được nhiều vấn đề. Trong thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu tại Trung Tâm quản lý chất lượng thực phẩm & thú y thủy sản vùng 6 để hoàn thành luận văn tốt nghiệp tôi cũng đã học hỏi rất nhiều từ thực tế. Có thể vận dụng tốt vào công việc trong tương lai. Đạt được kết quả như ngày nay ngoài công sức của bản thân tôi còn được sự giúp đỡ của nhiều người. Trước tiên tôi xin gởi ngàn lời tri ân đến ba mẹ, các anh chị em trong gia đình tôi đã hỗ trợ rất nhiều về mặt vật chất cũng như tinh thần, giúp tôi vượt qua nhiều khó khăn trong quá trình học tập tại trường. Tôi xin chân thành cảm tập thể giáo viên, cán bộ Bộ môn Dinh Dưỡng & chế biến thủy sản Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Đặc biệt, tôi vô cùng xúc động, cám ơn thầy Phạm Văn Hùng phó giám đốc Trung Tâm quản lý chất lượng thực phẩm & thú y thủy sản vùng 6 đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và góp ý để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng chân thành cảm ơn các anh chị trong phòng kiểm nghiệm vi sinh của Trung Tâm quản lý chất lượng thực phẩm & thú y thủy sản vùng 6. Đặc biệt cám ơn chị Trang, chị Hà, chị Trinh anh Bình, anh Thế Anh, anh Thư anh Thiệt đã tận tình đóng góp chỉ dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Trong quá trình thực hiện đề tài tôi cũng nhận được rất nhiều lời động viên từ bạn bè trong lớp đã giúp ích cho tôi rất nhiều về mặt tinh thần. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ Sinh viên thực hiện Hồ Linh Phương Trang i Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 45 TÓM LƯỢC Để ứng dụng phương pháp phân tích nhanh trên RAPID’L.mono phát hiện Listeria monocytogenes trong sản phẩm thủy sản thay thế phương pháp phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 thì phương pháp phải có ưu điểm hơn và tương đồng với phương pháp thay thế. Đề tài đã tiến hành nghiên cứu các vấn đề sau trên phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono: xác định độ đặc hiệu, xác định độ nhạy, xác định độ lặp lại. Từ đó tổng hợp đánh giá mức độ tương đồng của hai phương pháp phân tích RAPID’L.mono và ISO 11290-1:2004. Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono có độ đặc hiệu cho khuẩn lạc Listeria monocytogenes, độ nhạy của phương pháp (LOD50 = 8. Với độ tin cậy 95% LOD50 nằm trong khoảng 7 – 10 tế bào/25g), độ lặp lại của phương pháp với L = 29 tế bào là 100%, hai phương pháp tương đồng với nhau về độ đặc hiệu, độ nhạy, độ lặp lại. Thời gian cho kết quả của phương pháp theo ISO 11290-1:2004 là 4 – trên 7 ngày, RAPID’L.mono là 2-3 ngày. Trang ii Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 46 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT L. Listeria R. equi Rodococcus equi S. aureus Saphylococcus aureus AOAC Association of Analytial Communities (Hiệp hội các nhà phân tích) FDA Food and Drug Administration (Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ) ISO International Standard Organization (Tổ chức tiêu chuẩn Quốc Tế) PCR Polymerase Chain Reacion HF Half Fraser Broth ALOA Listeria selective Agar Base acc OTTAVIANI and AGOSTI TSYEA Trytone soya broth Yeast extract Agar TSYEB Trytone soya broth Yeast extract TSA Tryptic Soy Agar BHI Brain Heart Infusion Nafiqad 6 Trung Tâm quản lý chất lượng thực phẩm & thú y thủy sản vùng 6. Trang iii Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 47 MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn ..........................................................................................................i Tóm lược ............................................................................................................ii Danh mục từ viết tắt ..........................................................................................iii Mục lục..............................................................................................................iv Danh sách bảng .................................................................................................vi Danh sách hình .................................................................................................vii Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ .....................................................................................1 1.1. Giới thiệu .................................................................................................1 1.2. Mục tiêu của đề tài...................................................................................1 1.3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................2 1.4. Thời gian thực hiện đề tài ........................................................................2 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 2.1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes .....................................................3 2.1.1. Phân loại học.....................................................................................3 2.1.2. Hình thái học.....................................................................................3 2.1.3. Đặc điểm sinh lý ...............................................................................4 2.1.4. Khả năng chịu đựng ..........................................................................4 2.1.5. Phân bố, nguồn lây nhiễm.................................................................5 2.1.6. Đặc điểm gây bệnh……………………………………………………..5 2.2. Phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogens ..........................7 2.2.1. Theo ISO 11290 -1:2004 ..................................................................7 2.2.2. Phương pháp phân tích nhanh trên RAPID’L.mono ......................11 2.3. Một số môi trường chính. ......................................................................13 2.3.1. Môi trường Half Fraser Broth (HF) ................................................13 2.3.2. Môi trường Fraser Borth .................................................................13 2.3.3. Thạch ALOA ..................................................................................13 2.3.4. Thạch Oxford ..................................................................................14 2.3.5. Môi trường không chọn lọc TSYEA, TSYEB................................15 2.3.6. Rhramnose, Xylose. ........................................................................16 2.3.7. Môi trường thạch máu (Blood agar) ...............................................16 2.3.8. Motility Agar ..................................................................................17 2.3.8. Môi trường lỏng BHI (Brain Heart Infusion) ................................. 17 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ........................18 3.1. Vật liệu ..................................................................................................18 3.1.1. Mẫu thực phẩm ...............................................................................18 3.1.2. Môi trường, hóa chất.......................................................................18 3.1.3. Thiết bị và vật dụng ........................................................................18 3.1.4. Lấy mẫu ..........................................................................................19 3.2. Phương pháp thí nghiệm ........................................................................19 3.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định độ đặc hiệu của phương pháp . ................19 3.2.2. Thí nghiệm 2: Xác định độ nhạy của phương pháp........................20 Trang iv Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 48 3.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định độ lặp lại của phương pháp......................23 3.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp .............24 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................26 4.1. Hình dạng khuẩn lạc trên 3 loại môi trường đặc hiệu ...........................26 4.1.1.Trên môi trường ALOA ...................................................................26 4.1.2.Trên môi trường Oxford .................................................................26 4.1.3.Trên môi trường RAPID'L.mono ...................................................26 4.2. Kết quả thí nghiệm 1 .............................................................................27 4.3. Kết quả thí nghiệm 2 ...........................................................................311 4.4. Kết quả thí nghiệm 3 ...........................................................................344 4.5. Kết quả thí nghiệm 4 ...........................................................................344 Phần 5: KẾT LUẬN CHUNG .......................................................................36 Phần 6: KIẾN NGHỊ......................................................................................37 PHỤ LỤC HÌNH ............................................................................................38 1) Môi trường sử dụng trong luận văn.......................................................38 2) Môi trường phân lập..............................................................................40 3) Môi trường sinh hóa ..............................................................................41 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................43 Trang v Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 49 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1. Đặc điểm khác nhau của các loài thuộc giống Listeria .....................4 Bảng 2.2. Một số thông số cơ bản của Listeria ..................................................4 Bảng 3.2.1. Danh mục các chủng vi sinh vật thử nghiệm................................19 Bảng 4.2.1. Kết quả thí nghiệm 1…….............................................................28 Bảng 4.2.2. Kết quả phân tích trên nền mẫu cá tra phi lê đông lạnh ...............28 Bảng 4.3. Kết quả thí nghiệm 2………............................................................31 Bảng 4.4. Kết quả thí nghiệm 3…………........................................................33 Bảng 4.5. Xác định độ tương đồng……. .........................................................35 Trang vi Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 50 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.2.1.2: Sơ đồ phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290 -1: 2004..............................................................................................................8 Hình 2.2.2.2: Sơ đồ phân tích nhanh Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono ...............................................................................................12 Hình 3.2.1: Sơ đồ thí nghiệm 1 .......................................................................19 Hình 3.2.2: Sơ đồ thí nghiệm 2 .......................................................................21 Hình 3.2.3: Sơ đồ thí nghiệm 3 .......................................................................23 Hình 3.2.4: Sơ đồ thí nghiệm 4 .......................................................................25 Hình 4.1: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình trên ALOA (a), Oxford (b) và RAPID’L.mono (c) ..............................................27 Hình 4.2.1: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình trên RAPID’L.mono ..............................................................................................29 Hình 4.2.2: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria ivanovii điển hình trên RAPID’L.mono ...............................................................................................29 Hình 4.2.3: Ảnh chụp khuẩn lạc các chủng vi sinh vật trên RAPID’L.mono ..............................................................................................30 Hình 4.2.4: Ảnh chụp mẫu A6 mẫu đối chứng không chứa vi sinh vật trên RAPID’L.mono .......................................................................................30 Hình 4.3.1: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình với mật độ gây nhiễm trên mức LOD50 .................................................................32 Hình 4.3.2: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình với mật độ gây nhiễm ở mức LOD50 .....................................................................33 Hình 4.3.3: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình với mật độ gây nhiễm dưới mức LOD50................................................................33 Trang vii