Ứng dụng sinh học phân tử trong các bệnh lý ung thư

ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CÁC BỆNH LÝ UNG THƯ TS.BS. Hoàng Anh Vũ Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 03 năm 2013 1 2 NỘI DUNG TRÌNH BÀY 1.GIỚI THIỆU CÁC BẤT THƯỜNG GEN TRONG UNG THƯ 2.PHÁT HIỆN NGUY CƠ DI TRUYỀN CỦA UNG THƯ 3.PHÁT HIỆN CÁC ĐÍCH NHẮM PHÂN TỬ CHO ĐIỀU TRỊ UNG THƯ MÔ HÌNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG (Jones S, PNAS 2008) 4 UNG THƯ LÀ “BỆNH” CỦA GEN Rối loạn hoạt động của gen: 1. Bất thường nhiễm sắc thể 2. Đột biến gen: Thêm chức năng gen sinh ung và mất chức năng gen đè nén khối u ĐỘT BIẾN GEN KRAS TRONG UNG THƯ ĐỘT BIẾN GEN P53 TRONG UNG THƯ VAI TRÒ P53 TRONG APOPTOSIS (CHẾT TẾ BÀO THEO LẬP TRÌNH) (Wiman KG, Oncogene 2010) CHIẾN LƯỢC ĐIỀU TRỊ DỰA TRÊN P53 (PRIMA-1: P53 reactivation and induction of massive apoptosis) CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG CỦA PRIMA-1 10 Đỏ: đột biến thêm chức năng; xanh lá: đột biến mất chức năng; xanh dương: tăng biểu hiện gen. BC: breast cancer; CRC: colorectal cancer; EC: endometrial cancer; GB: glioblastoma; HNC: head and neck cancer; LC: lung cancer; Me: melanoma; OC: ovarian cancer; PC: pancreatic cancer; PrC: prostate cancer; TC: thyroid cancer (Laurent-Puig P, Clin Cancer Res 2009) BẤT THƯỜNG PHÂN TỬ TRONG UNG THƯ 11 (Ma W, CA Cancer J Clin 2009;59;111-137) THUỐC NHẮM TRÚNG ĐÍCH PHÂN TỬ (Aggarwal S, Nature Review Cancer 2010) THỊ PHẦN THUỐC ĐIỀU TRỊ UNG THƯ 12 CÁC NHÓM GEN TRONG QUÁ TRÌNH UNG THƯ (Chiang AC, NEJM 2008) CÁC NHÓM GEN TRONG QUÁ TRÌNH UNG THƯ THỜI GIAN TIỀM ẨN CỦA DI CĂN (Nguyen DX, Nat Rev Cancer 2009) DI CĂN PHỔI Epiregulin (EREG), prostaglandin G/H synthase 2 (PTGS2) Lysyl oxidase (LOX), angiopoietin-like 4 (ANGPTL4), transforming growth factor-β (TGFβ) (Nguyen DX, Nat Rev Cancer 2009) (Micalizzi DS, J Mammary Gland Biol Neoplasia 2010) CÁC THAY ĐỔI CHÍNH TRONG SỰ CHUYỂN DẠNG BIỂU MÔ – TRUNG MÔ (EMT) (Epithelial – mysenchymal transformation) EMT trong quá trình phát triển phôi 3 lá EMT trong quá trình phát triển phôi thần kinh EMT TRONG PHÁT TRIỂN PHÔI (Micalizzi DS, J Mammary Gland Biol Neoplasia 2010) EMT THÚC ĐẨY DI CĂN THAY ĐỔI FOCAL ADHESION KINASE (FAK) VÀ DIỄN TIẾN UNG THƯ (Tế bào đậm màu là tế bào biểu hiện mạnh FAK) (Gabarra-Niecko V, Cancer and Metastasis Reviews 2003) (N: normal; B: benign; PI: preinvasive; M: metastatic; IHC: immunohistochemistry) TƯƠNG TÁC FAK-SRC THUỐC ỨC CHẾ FAK VÀ SRC (Bolos V, OncoTargets and Therapy 2010) 26 1.GIỚI THIỆU CÁC BẤT THƯỜNG GEN TRONG UNG THƯ 2.PHÁT HIỆN NGUY CƠ DI TRUYỀN CỦA UNG THƯ 3.PHÁT HIỆN CÁC ĐÍCH NHẮM PHÂN TỬ CHO ĐIỀU TRỊ UNG THƯ GEN MẪN CẢM VỚI UNG THƯ APC: adenomatous polyposis coli; FAP: familial adenomatous polyposis; GWA, genome-wide association (Fletcher O, Nat Rev Cancer 2010) Hội chứng Gen liên quan Loại khối u Ung thư vú/buồng trứng gia đình BRCA1, BRCA2 Ung thư vú, ung thư buồng trứng Bệnh polyp tuyến gia đình APC Ung thư đại trực tràng, u xương U nguyên bào võng mạc gia đình RB1 U nguyên bào võng mạc, u xương Hội chứng Lynch (ung thư đại tràng không polyp gia đình) hMLH1, hMSH2, hPMS2, hMSH6 Ung thư đại trực tràng, ung thư nội mạc tử cung, ung thư dạ dày, ung thư buồng trứng Hội chứng Li Fraumeni P53, hCHK2 Sarcoma mô mềm, ung thư vú, u não, leukemia Hội chứng Bloom BLM U đặc Hội chứng Cowden PTEN Ung thư vú, hamartoma Thiếu máu Fanconi FACC, FACA Leukemia cấp dòng tủy Ung thư thận gia đình MET Ung thư thận, các ung thư khác 1. Estrogen receptor (+): 60-70% 2. HER2(+): 20-30% 3. Đột biến gen BRCA1/2: 5-10% 29 UNG THƯ VÚ: CÁC DẤU ẤN PHÂN TỬ Upon generation of a double-strand break , the MRN complex (Mre11–Rad50–Nbs1) recognizes the lesion. The MRN complex recruits CtIP and BRCA1/BARD1. MRN nuclease activity is stimulated following its interaction with CtIP. This nuclease activity, together with other unconfirmed factors, generates 3’-ssDNA overhangs on either side of the break that rapidly bind RPA (replication protein A). Through its interaction with PALB2, BRCA1 leads to the recruitment of BRCA2, which, in turn, recruits and loads the Rad51 recombinase, displacing RPA. This RAD51 nucleoprotein filament catalyzes strand invasion and initiates the homology search on the intact sister chromatid. CÁC GEN MẪN CẢM VỚI UNG THƯ VÚ VAI TRÒ CÁC GEN TRONG UNG THƯ VÚ BRCA1: BREAST CANCER 1 GENE Đột biến mầm: •Gặp trong 5% ung thư vú chung •Gặp trong 20 – 40% các gia đình có nhiều người bị ung thư vú •Người mang gen đột biến có 80% nguy cơ ung thư vú 34 Đối với người mang gen đột biến: •Chương trình tầm soát: Chụp nhũ ảnh, siêu âm và MRI •Can thiệp phòng ngừa: Tamoxifen, đoạn nhũ hoặc cắt buồng trứng BRCA1 LÀ MỘT GEN RẤT LỚN • Genomic DNA = 100 kb • mRNA = 7,8 kb • Protein = 1863 amino acid 35 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PCR 1 PCR 2 PCR 3 PCR 4 PCR 5 11 12 PCR 6 PCR 7 13 14 15 16 17 PCR 8 PCR 9 PCR 10 PCR 11 18 19 20 21 22 23 24 PCR 12 PCR 13 PCR 14 PCR 15 36 BRCA1: VỊ TRÍ MỒI TRONG PCR 37 BRCA1: SẢN PHẨM PCR 38 Điện di GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN Tinh sạch sản phẩm Giải trình tự DNA 39 BRCA1: 18 KIỂU THAY ĐỔI (VIỆT NAM) 40 A BÌNH THƯỜNG ĐỘT BIẾN 21 31 33 46 30 20 29 32 43 49 37 36 42 44 45 48 34 35 41 B 38 47 50 39 BRCA1: ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH 1792 STOP MUTATION WILD-TYPE 41 BRCA1: ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH R1751X • Bệnh nhân 38 tuổi, có 2 người trong gia đình ung thư vú • Đã từng được phát hiện trên 3 bệnh nhân Việt Nam sống tại Mỹ (Kurian AW, J Clin Oncol 2008) ĐỘT BIẾN GEN RB TRONG RETINOBLASTOMA Phát hiện đột biến gen RB: •Tầm soát ung thư cho người lành mang gen đột biến •Đánh giá nguy cơ xuất hiện bệnh ở mắt còn lại trên bệnh nhân đang điều trị ĐỘT BIẾN GEN RB TRONG RETINOBLASTOMA 44 1.GIỚI THIỆU CÁC BẤT THƯỜNG GEN TRONG UNG THƯ 2.PHÁT HIỆN NGUY CƠ DI TRUYỀN CỦA UNG THƯ 3.PHÁT HIỆN CÁC ĐÍCH NHẮM PHÂN TỬ CHO ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Protein HER-2 Gen HER-2 FISH Hóa mô miễn dịch (IHC: Immunohistochemistry) UNG THƯ VÚ: KHUẾCH ĐẠI GEN HER2 High amplification 1+ 2+ Negative/0 Normal Normal 3+ Low amplification ĐÁNH GIÁ HER2 BẰNG IHC VÀ FISH 47 UNG THƯ VÚ: KHUẾCH ĐẠI GEN HER2 HER2 (NST 17) Bình thường: 2 tín hiệu màu đỏ Ung thư vú: nhiều tín hiệu đỏ Trastuzumab (Herceptin) 48 (Kitamura Y, Cancer Sci 2003) Exon 9 Exon 11 Exon 13 Exon 17 49 PHÂN BỐ ĐỘT BIẾN KIT TRONG GIST 50 KIT-wt KIT-mt (Science 2003;299:708-710) 51 HOẠT HÓA THỤ THỂ (Tzen CY, Journal of Cancer Surgery 2007) KHÔNG IMATINIB: ĐỘT BIẾN KIT CÓ TIÊN LƯỢNG XẤU 52 53 (Blanke, J Clin Oncol 2008) HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ GIST BẰNG IMATINIB ĐÁP ỨNG BAN ĐẦU VỚI IMATINIB TÙY THUỘC ĐỘT BIẾN KIT (Heinrich, J Clin Oncol 2008) (Blay, Cancer 2010) (Wozniak, Cancer Investigation 2010) (Pierotti, Nat Rev Clin Oncol 2011) 54 55 ĐỘT BIẾN KIT VÀ PDGFRA KHÁNG IMATINIB (Lasota, Histopathology 2008) • Xanh: đột biến nguyên phát/ GIST mắc phải • Vàng: đột biến nguyên phát/ GIST di truyền • Đỏ: đột biến kháng thuốc 56 SAU KHÁNG IMATINIB: ĐÁP ỨNG SUNITINIB TÙY THUỘC KIỂU ĐỘT BIẾN (Wozniak, Cancer Investigation 2010) (PFS: Progression-free survival) • Khảo sát các exon 9, 11, 13 và 17 • Tỷ lệ đột biến 69% (33/48) Exon 9 Exon 11 Exon 13 Exon 17 VIỆT NAM: ĐỘT BIẾN GEN KIT TRONG GIST Exon 11 Exon 11 Exon 11 Exon 17 • Protein EGFR tăng biểu hiện trong 40-80% ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC: Non-small Cell Lung Cancer) • Gefitinib ức chế đặc hiệu EGFR • Chỉ 10% bệnh nhân NSCLC có đáp ứng với gefitinib (Lynch TJ, N Engl J Med 2004) 58 59 ĐỘT BIẾN EGFR TRONG UNG THƯ PHỔI (Fukui T, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008) • Carcinôm tuyến > carcinôm gai-tuyến • Nữ > nam • Không hút thuốc lá > hút thuốc • Theo chủng tộc: Âu, Mỹ: 3 – 5% Nhật: 32% Hàn Quốc: 36.4% Đài Loan: 55% Thái Lan: 57,4%  Việt Nam: ? 60 ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRONG UNG THƯ PHỔI 61 ĐÁP ỨNG VỚI THUỐC ỨC CHẾ EGFR PHỤ THUỘC KIỂU ĐỘT BIẾN Vai trò quan trọng của giải phẫu bệnh KHUẾCH ĐẠI CÁC VÙNG GEN EGFR VÀ KRAS 55/135 có đột biến EGFR (40,7%) • Exon 19: 22 • Exon 21: 22 • Exon18 và 20: 10 • Intron 18: 2 • 135 bệnh nhân: 81 nam/ 54 nữ • Tuổi trung bình: 60 tuổi (20 – 85) • 106 carcinoma tuyến (78%) Kỹ thuật giải trình tự DNA phù hợp cho chẩn đoán đột biến EGFR trong ung thư phổi ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRÊN BỆNH NHÂN VIỆT NAM UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ • 35/106 có đột biến (33%) • Đột biến codon 12/13: 24,5% • Đột biến đôi của KRAS: 7 trường hợp • Đột biến KRAS đi kèm EGFR: 12 EGFR KRAS 43 12 23 ĐỘT BIẾN GEN KRAS TRÊN BỆNH NHÂN VIỆT NAM UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ 65 HÌNH ẢNH ĐỘT BIẾN GEN EGFR 66 HÌNH ẢNH ĐỘT BIẾN GEN KRAS UNG THƯ PHỔI: ĐẢO ĐOẠN NST • 2007: Đảo đoạn của NST 2 tạo gen tổ hợp EML4/ALK trong ung thư phổi không tế bào nhỏ • Tháng 8/2011: FDA chấp thuận chỉ định crizotinib cho ung thư phổi có biểu hiện EML4/ALK • Đột biến EGFR trong ung thư đại trực tràng: rất hiếm. • 70% - 80% có biểu hiện EGFR: Đích điều trị của kháng thể đơn dòng • Cetuximab có hiệu quả hơn trên bệnh nhân có biểu hiện mạnh EGFR dạng hoạt động (pEGFR) hoặc có khuếch đại gen EGFR qua khảo sát bằng FISH BẤT THƯỜNG EGFR TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG KHẢO SÁT BIỂU HIỆN EGFR BẰNG FISH Bệnh phẩm DNA PCR: EGFR (exon 6 – 14) Sequencing (Goncalves A, BMC Cancer 2008;8:169) 71 72 73 PR: partial response, SD: stable disease, PD: progressive disease LIÊN HỆ GIỮA EGFR, KRAS VÀ BRAF (Uramoto H, British Journal of Cancer 2007;96,857 – 863) DỰ ĐOÁN ĐÁP ỨNG VỚI THUỐC ỨC CHẾ EGFR (Xám: nhạy, đen: kháng) 76 TÓM TẮT NHỮNG ĐIỂM CHÍNH 1. Bệnh ung thư do bất thường gen gây nên, nhưng không hoàn toàn đồng nghĩa là bệnh di truyền. 2. Đột biến gen trong ung thư thường gây mất chức năng gen đè nén khối u (như APC, P53, BRCA1,...) và thêm chức năng gen sinh ung (như KRAS, BRAF và các gen mã hóa cho thụ thể xuyên màng tế bào như EGFR, KIT, PDGFRA,…) 3. Gia tăng biểu hiện FAK và SRC cùng với sự chuyển dạng biểu mô trung mô (EMT) ở các tế bào ung thư góp phần quan trọng vào hiện tượng di căn của ung thư. 4. Đột biến một gen nhất định có thể gặp trong các ung thư khác nhau. Một loại ung thư nhất định có thể mang bất thường của cùng lúc nhiều gen. 5. Có nhiều gen đột biến gây tăng tính mẫn cảm với ung thư vú, trong đó quan trọng nhất là đột biến BRCA1 và BRCA2. 6. Trong ung thư vú, khuếch đại gen HER2 là một chỉ định của điều trị kháng thể đơn dòng trastuzumab. 7. U mô đệm đường tiêu hóa (GIST) có thể được điều trị bằng imatinib do có mang đột biến gen KIT hoặc PDGFRA. Đột biến gen KIT gặp chủ yếu ở exon 11. 8. Đột biến gen EGFR gây ung thư phổi thường gặp ở exon 18 đến 21. Mỗi kiểu đột biến lại có tính nhạy cảm với thuốc đặc hiệu erlotinib hoặc gefitinib khác nhau. Đột biến exon 19 và 21 thường cho đáp ứng với thuốc tốt nhất, trong khi đột biến T790M của exon 20 gây kháng thuốc. 9. Gen tổ hợp EML4/ALK là do đảo đoạn của nhiễm sắc thể số 2 tạo nên. Tuy chỉ gặp không quá 10% trong ung thư phổi không tế bào nhỏ, nhưng EML4/ALK là đích điều trị hiệu quả của crizotinib. 10. Đột biến gen KRAS trong ung thư gây kháng thuốc khi đích điều trị là các thụ thể xuyên màng. Đột biến thường gặp nhất ở codon 12 và 13.