Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất cồn

MUÏC LUÏC Phaàn 1:Giôùi thieäu chung 3 Phaàn 2: Sô ñoà quy trình 4 Phaàn 3:ÖÙng duïng cuûa VSV trong coâng ñoaïn ñöôøng hoùa dòch chaùo 6 I-Giôùi thieäu chung veà naám moác 6 1-Caáu taïo sôïi naám 7 2-Sinh saûn cuûa naám 7 II-Nhöõng loaøi naám thöôøng duøng 9 1-Rhizopus 11 2-Mucor 11 3-Aspergillus 12 III- Nuoâi caáy moác ñöôøng hoùa : caùc cheá phaåm enzym ñöôøng hoùa 16 IV- Ñöôøng hoaù tinh boät: 21 1-Taùc duïng cuûa enzym amylase leân maïch tinh boät 21 2- Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình ñöôøng hoùa tinh boät 23 Phaàn 4:ÖÙng duïng cuûa VSV trong coâng ñoaïn leân men dòch ñöôøng 31 A-Naám men 31 I-Saccharomyces cerevisiae 31 1-Ñaëc ñieåm 31 2-Moät soá chuûng Saccharomyces cerevisiae thöôøng duøng 32 3-Nghieân cöùu so saùnh khaû naêng leân men cuûa chuûng 12 vôùi chuûng MTB vaø 1 vaøi chuûng khaùc hieän coù ôû nöôùc ta. 33 4- Điều kiện lên men 35 5-Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae 36 II- Cơ chế lên men rượu 40 1- Cơ chế hóa sinh học của quá trình lên men 41 2- Tiến hành lên men rượu 44 III- Nhaän xeùt, ñaùnh giaù caùc phöông phaùp leân men 46 IV- Hieäu suaát quaù trình leân men töø naám men 48 B-Vi khuaån 48 I.Giới thiệu chung 48 II.Các vi khuẩn lên men cồn 49 1.Zymomonas mobilis 50 a.Đặc điểm 50 b.Điều kiện phát triển 52 c. Nuôi cấy 53 d- Quá trình lên men 55 e-Hiệu suất quá trình 55 2.Clostridium 57 a.Đặc điểm 57 b.Điều kiện phát triển 58 Phaàn 5: Hieäu suaát vaø toån thaát trong saûn xuaát 62 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO 67 PHAÀN 1: GIÔÙI THIEÄU CHUNG Coâng ngheä coàn etylic laø khoa hoïc veà phöông phaùp vaø quaù trình cheá bieán caùc nguyeân lieäu chöùa tinh boät, ñöôøng, xenluloza, etylen thaønh saûn phaåm etylic hay etanol. Quy trình coâng ngheä saûn xuaát coàn etylic coù theå chia thaønh caùc coâng ñoïan chính goàm : chuaån bò dòch ñöôøng leân men; gaây men gioáng, leân men dòch ñöôøng vaø xöû lyù dòch leân men. Chuaån bò dòch leân men: Neáu nguyeân lieäu chöùa tinh boät thì coâng ñoïan naøy goàm nghieàn, naáu, ñöôøng hoùa vaø laøm laïnh ñeán nhieät ñoä leân men. Neáu nguyeân lieäu laø maät ræ thì chuaån bò dòch leân men goàm pha loõang sô boä, xöû lyù maät ræ, boå sung nguoàn dinh döôõng, taùch caën roài pha loaõng tôùi noàng ñoä gaây men vaø leân men Gaây men gioáng vaø leân men: muoán leân men tröôùc heát caàn phaùt trieån men gioáng tôùi chaát löôïng vaø soá löôïng caàn thieát, thöôøng baèng 10% theå tích cuûa thuøng leân men. Sau ñoù ñöa men gioáng vaø dòch ñöôøng vaøo thuøng roài khoáng cheá ôû ñieàu kieän xaùc ñònh ñeå naâùm men chuyeån hoùa ñöôøng thaønh röôïu vaø CO2. Dòch nhaän ñöôïc sau leân men goïi laø giaám chín. Xöû lyù dòch leân men: coâng ñoaïn naøy coù lieân quan tôùi kieán thöùc lyù hoïc vaø chuyeån khoái. Thöïc chaát laø duøng heä thoáng chöng luyeän phuø hôïp ñeå taùch röôïu vaø caùc chaát deã bay hôi khoûi giaám chín, sau ñoù ñem tinh luyeän ñeå nhaän ñöôïc coàn saûn phaåm, thoûa maõn tieâu chuaån vaø yeâu caàu tieâu duøng. Saûn phaåm thu ñöôïc sau xöû lyù bao goàm coàn thöïc phaåm, coàn ñaàu, daàu fusel hoaëc ancol cao phaân töû. Ngoaøi caùc saûn phaåm keå treân, chuùng ta coøn thu ñöôïc baõ röôïu coù chöùa nhieàu chaát höõu ích, coù theå duøng laøm moâi tröôøng nuoâi caáy vaø thu nhaän naám men thoâ duøng cho chaên nuoâi, cheá bieán caùc loïai khaùng sinh… ÔÛ moät soá nöôùc, ngöôøi ta ñem coâ ñaëc baõ röôïu tôùi noàng ñoä chaát khoâ nhaát ñònh vaø boå sung tröïc tieáp vaøo khaåu phaàn aên cuûa vaät nuoâi. Trong baõ röôïu töø ræ ñöôøng coøn coù theå thu nhaän glyxerin, axít glutamic. Trong nhöõng naêm gaàn ñaây baõ röôïu töø maät ræ coøn ñöôïc nghieân cöùu vaø ñöa vaøo phuï gia cuûa vaät lieäu xaây döïng. Ôû nöôùc ta vieäc söû duïng baõ röôïu chöa ñöôïc nghieân cöùu aùp duïng neân coøn laõng phí nhieàu. Phaàn lôùn bò boû ñi , chæ phaàn raát ít ñöôïc söû duïng vaøo muïc ñích chaên nuoâi. PHAÀN 2: SÔ ÑOÀ QUY TRÌNH
 PHAÀN 3: ÖÙNG DUÏNG CUÛA VSV TRONG COÂNG ÑOAÏN ÑÖÔØNG HOÙA DÒCH CHAÙO Nấu xong, tinh bột trong dịch cháo đã chuyển sang trạng thái hòa tan nhưng chưa thể lên men trực tiếp để biến thành rượu được, mà phải trải qua quá trình thủy phân do xúc tác của amylase để biến thành đường. Quá trình trên được gọi là quá trình đường hóa, có vai trò rất quan trọng trong công nghệ sản xuất cồn ethylic. Nó quyết định phần lớn hiệu suất thu hồi rượu do giảm bớt hoặc gia tăng đường và tinh bột sót lại sau khi lên men. Muốn đạt hiệu quả cao trong quá trình thủy phân tinh bột thì phải chọn được tác nhân đường hóa tốt nhất. Hiện nay, người ta dùng amylase nhận được từ nuôi cấy vi sinh vật, trong đó nấm mốc được sử dụng nhiều nhất, sau đó đến vi khuẩn, cuối cùng là nấm men Endomycopsip. Các yếu tố cần chú ý khi nuôi cấy vi sinh vật là chọn giống, môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm, pH, oxy). I-GIÔÙI THIEÄU CHUNG VEÀ NAÁM MOÁC Naám moác (mold) laø teân chung ñeå chæ caùc loïai naám hieån vi coù caáu taïo sôïi. Chuùng thuoäc loaïi thöïc vaät haï ñaúng, coù baøo töû, khoâng coù dieäp luïc toá, khoâng coù khaû naêng toång hôïp caùc chaát höõu cô töø khí carbonic maø söû duïng tröïc tieáp chaát höõu cô coù saün ñeå sinh soáng. Naám moác chæ moïc toát trong moâi tröôøng coù nhieàu khoâng khí, vì vaäy chuùng thöôøng phaùt trieån treân lôùp beà maët cuûa cô chaát, döôùi daïng nhöõng lôùp luùn phuùn hình sôïi, lôùp mang nheän hay khoái sôïi boâng. Trong cô chaát, chuùng chæ sinh tröôûng trong caùc khoang hoång chöùa khoâng khí. Nhieàu loaïi naám moác coù giaù trò lôùn trong coâng nghieäp, traùi laïi nhieàu loaïi naám laïi gaây nhieàu thieät haïi trong coâng nghieäp, nhaát laø coâng nghieäp thöïc phaåm, y hoïc … 1-Caáu taïo sôïi naám Ña soá naám coù hình sôïi phaân nhaùnh, ñan keát laïi vôùi nhau thaønh moät khoái sôïi, töøng sôïi rieâng leû goïi laø sôïi naám (khuaån ty theå, mycelium). Coù 2 loaïi sôïi naám: sôïi naám coù maøng ngaên ngang vaø sôïi naám khoâng coù maøng ngaên ngang; trong tröôøng hôïp sau, toøan boä heä sôïi naám chæ laø 1 teá baøo phaân nhaùnh raát phöùc taïp. Chieàu roäng cuûa sôïi naám thay ñoåi töø 5-50μm. Moät soá sôïi naám sinh tröôûng baèng caùch ñaâm saâu vaøo trong cô chaát vaø huùt chaát dinh döôõng ôû trong ñoù (khuaån ty cô chaát), trong khi ñoù moät phaàn heä sôïi naám phaùt trieån treân beà maët cuûa cô chaát (khuaån ty kyù sinh), phaàn sôïi naám naèm ngoaøi naøy nhieàu hay ít tuøy theo loaøi vaø moâi tröôøng. ÔÛ nhieàu loaøi, caùc sôïi cuûa heä sôïi naám naèm beân ngoaøi cô chaát laø cô quan sinh saûn. ÔÛ moät soá naám khaùc, sôïi naám ñan keát laïi daøu ñaëc vôùi nhau vaø taïo thaønh quaû theå. Caáu taïo teá baøo cuûa naám khoâng khaùc vôùi caáu taïo cuûa caùc sinh vaät khaùc. Maøng teá baøo caáu taïo bôûi cellulose; ôû nhieàu loaïi naám, trong maøng teá baøo coù chöùa kitin. Trong teá baøo chaát coù khoâng baøo vaø caùc chaát khaùc. Caùc chaát döï tröõ thöôøng gaëp ôû naám laø glycozen, haït volutin vaø caùc gioït môõ. Teá baøo naám coù 1,2 hoaëc nhieàu nhaân. ÔÛ naám, hieän töôïng nhieàu nhaân raát phoå bieán. 2-Sinh saûn cuûa naám Moät ñaëc ñieåm cuûa naám laø coù nhieàu hình thöùc sinh saûn vaø nhieàu cô quan sinh saûn. Naám sinh saûn chuû yeáu baèng baøo töû, töø baøo töû moïc ra sôïi naám vaø sau ñoù laø heä sôïi naám. Maëc duø vaäy, baát cöù moät ñoïan sôïi naám hoaëc moät maûnh naøo cuûa heä sôïi cuõng coù theå duøng ñeå sinh saûn ñöôïc, caùc ñoïan naøy khi rôi treân moâi tröôøng dinh döôõng thì phaùt trieån vaø taïo thaønh moät heä sôïi naám môùi. Trong phoøng thí nghieäm thöôøng duøng phöông phaùp naøy ñeå nhaân gioáng vaø phaân laäp. Moät soá naám sinh saûn baèng oidi (baøo töû boät). Trong tröôøng hôïp naøy, sôïi naám bò caét ra thaønh töøng phaàn nhoû ñôn baøo vaø moãi moät teá baøo ñoù coù theå phaùt trieån thaønh moät heä naám môùi. Sôïi naám bò caét ra, töø ngoïn xuoáng, vaø hieän töôïng ñoù coù theå tieán haønh ôû toøan boä heä sôïi naám. Trong sinh saûn voâ tính cuûa naám coù 2 loaïi baøo töû : baøo töû ngoaøi (exospore) vaø baøo töû trong (endospore), baøo töû ngoaøi goïi laø haït ñính (ñính baøo töû, conidi) vaø sôïi naám mang caùc haït ñính goïi laø cuoáng haït ñính. Cuoáng haït ñính tröïc tieáp bò thaét laïi vaø sinh ra haït ñính, hoaëc coù caùc teá baøo ñaëc bieät naèm ôû ñaàu cuoáng phaân chia sinh ra caùc haït ñính. Haït ñính naèm ñôn ñoäc treân cuoáng hoaëc tuï laïi thaønh nhoùm hay thaønh chuoãi, v.v…
ÔÛ caùc loaøi naám khaùc, baøo töû laïi ñöôïc hình thaønh trong caùc teá baøo rieâng bieät naèm ôû ñaàu sôïi naám. Nhöõng baøo töû ñoù thöôøng coù kích thöôùc lôùn, hình caàu, goïi laø boïc baøo töû (sporangium) hay baøo töû nang, sôïi naám mang goïi cuoáng boïc baøo töø (cuoáng baøo töû nang). Cuoáng boïc baøo töø thöôøng phaùt trieån trong boïc baøo töû laøm thaønh moät truï coù nhieàu hình daïng khaùc nhau, goïi laø loõi (columelle) hay nang truï Trong sinh saûn höõu tính, naám taïo ra nang (asque) mang nang baøo töû (ascospore), vaø ñaûm (basidi) mang ñaûm baøo töû (basisospore), ñoù laø nhöõng cô quan sinh saûn ñaëc bieät. Ñoâi khi nang vaø ñaûm xeáp ñôn ñoäc treân sôïi naám, nhöng thöôøng laøm thaønh töøng nhoùm hoaëc töøng lôùp trong quaû theå. Veà hình daïng, maøu saéc vaø caáu taïo quaû theå thöôøng raát khaùc nhau. Moät soá naám thöôøng coù theå sinh saûn baèng caùch voâ tính vaø höõu tính. Moät soá khaùc khoâng coù khaû naêng sinh saûn höõu tính, ñoù laø nhöõng naám baát toaøn. Trong chu kyø sinh saûn cuûa nhieàu loaøi naám, ngoaøi caùc hình thöùc sinh saûn treân, coøn hình thaønh theâm haïch naám (sclecotium) vaø baøo töû maøng daày (chlamydospore). Haïch naám do sôïi naám keát chaët laïi raén chaéc vaø thöôøng coù maøu ñen ôû maët ngoaøi. Chuùng coù nhieàu hình daïng vaø kích thöôùc khaùc nhau, chöùa nhieàu chaát döï tröõ, ít nöôùc. Baøo töû maøng daày laø nhöõng ñoaïn sôïi naám xeáp chaëc laïi, coù maøng raát daøy. Haïch naám vaø baøo töû maøng daøy laø giai ñoïan nghó cuûa naám, ôû giai ñoïan naøy cbuùng coù theå vöõng beàn ñoái vôùi taùc duïng cuûa caùc ñieàu kieän khoâng lôïi cuûa moâi tröôøng beân ngoøai. Khi rôi vaøo choã coù ñieàu kieän chuùng laïi phaùt trieån toát, chuùng naûy maàm vaù phaùt trieån thaønh heä sôïi naám môùi hoaëc phaùt trieån thaønh cô quan sinh saûn II-NHÖÕNG LOAØI NAÁM THÖÔØNG DUØNG 1. Rhizopus : Rhizopus coù nhieàu loaïi: Rhi. japonicus, Rhi. Orysee, Rhi. pekaII, Rhi. Tonkinensis…
Rhizopus coù ñaëc ñieåm sinh tröôûng baèng “giaû chi” ñeå lan roäng treân beà maët. ÔÛ nhöõng ñieåm tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng ñaëc, thaønh oáng nghieäm… coù moät chuøm reã giaû. ÔÛ choã coù giaû caên, thaân boø tieáp tuïc phaùt trieån vaø sinh ra caùc cuoán töû nang chöùa nhieàu baøo töû. Baøo töû sinh ra töø nang truï ôû baàu cuoáng. Vì moät phaàn nang truï tieáp xuùc vôùi vaùch nang, do ñoù khi soi kính, nöûa döôùi cuûa nang loän ngöôïc nhö caùi oâ maø cuoáng nang truï laø caùn oâ. Luùc non, baøo töû nang traéng, luùc giaø maøu ñen, beân trong coù nhieàu baøo töû. Baøo töû hình tröùng hay hình baùn caàu, maët thöôøng coù neáp nhaên, kích thöôùc 5 - 8μm.Nhieät ñoä phaùt trieån thích hôïp 32-340C. Rhizopus sinh saûn höõu tính baèng tieáp hôïp nhöng ít gaëp. Chuû yeáu sinh saûn dinh döôõng baèng haäu baøo töû, khuaån ty vaø sinh saûn voâ tính baèng baøo töû noäi sinh. Nhìn beà ngoaøi deã nhaàm laãm Rhizopus vôùi Absidi. Absidi khaùc vôùi Rhizopus ôû choã : baøo töû nang hình quaû leâ vaø giaû caên moïc ôû giöõa thaân boø, khoâng cuøng goác cuoáng baøo töû nang. Rhizopus, Absidi thöôøng thaáy treân cuû, haït aåm, baùnh mì, côm, xoâi …ñeå trong khoâng khí vaøi ngaøy. Baèng maét thöôøng thaáy khuaån ty cuûa chuùng nhö nhöõng “taám” maïng nheän, baøo töû nang luùc non traéng, khi giaø ñen nhaït coù nhöõng chaám nhoû. Baøo töû deã bay trong khoâng khí, gaëp ñieàu kieän thuaän lôïi seõ naûy maàm. Rhizopus thöôøng ñöôïc nuoâi caáy, phaùt trieån treân moâi tröôøng dòch theå giaøu dinh döôõng vaø coù thoâng khí, heä enzym amylase töông ñoái hoøan chænh, neân thöôøng ñöôïc duøng trong saûn xuaát röôïu theo phöông phaùp amilose vaø nuoâi caáy naám moác loûng (phöông phaùp beà saâu). 2. Mucor
Mucor vaø Rhizopus raát gioáng nhau. Song coù theå phaân bieät giöõa Mucor vaø Rhizopus ôû 3 ñieåm : Mucor khoâng coù theå giaû caên, cuoáng baøo töû nang coù theå sinh ra ôû baát kyø choã naøo coù nang truï khoâng coù hình baùn caàu, khoâng saùt vôùi vaùch baøo töû nang Khuaån ty cuûa Mucor coù 2 loaïi (+) vaø (-) maøu traéng phaân nhaùnh, gioáng nhau veà hình thaùi, khaùc nhau veà sinh lyù. Töø moät loïai khuaån ty coù theå sinh saûn voâ tính. Töø 2 loaïi khuaån ty coù theå sinh saûn höõu tính theo kieåu tieáp hôïp ñeå cho baøo töû nang ña haïch, veà sau laø caùc baøo töû noäi sinh. Trong saûn xuaát thöôøng gaëp caùc loaïi : Mucor rouxii, Mucor mucedo, Mucor javanicus, Mucor hydrophilus… Nhöng söû duïng phoå bieán trong saûn xuaát röôïu ôû nöôùc ta laø Mucor rouxii. ÔÛ Mucor rouxii, ngoaøi heä men amylase coøn coù enzym röôïu hoùa neân trong ñieàu kieän yeám khí, enzym cuûa Mucor rouxii coù theå bieán ñöôøng thaønh röôïu. Hieän töôïng naøy raát hay gaëp trong quaù trình saûn xuaát naám moác beà maët treân moâi tröôøng chaát raén coù tinh boät giöõ ôû nhieät ñoä cao (39-400C). Mucor rouxii phaùt trieån maïnh treân moâi tröôøng thaïch Csepek, khuaån ty phaân nhaùnh nhieàu, khoâng vaùch ngaên, ña nhaân, khuaån laïc cao, khoâng neáp nhaên, baùn vaøo naép hoäp loàng (petrie). Ñaëc bieät cuoáng baøo töû nang phaân nhaùnh khoâng coù thöù töï nhaát ñònh. Baøo töû nang thöôøng troøn, ñöôøng kính 60-80 μm. Nang truï 20-25 μm. Baøo töû troøn, ñöôøng kính 6-7 μm. Khuaån ty luùc non maøu traéng, giaø coù maøu xaùm nhaït. Baøo töû nang töø maøu traéng chuyeån daàn sang maøu hôi vaøng, ñoû xaùm, ñen, laøm cho maøu khuaån laïc xaùm daàn. Maët döôùi khuaån laïc khoâng coù neáp nhaên, khoâng maøu. 3. Aspergilus Aspergilus coù theå tìm thaáy deã daøng ôû khaép moïi nôi, treân moïi cô chaát. Vaøo khoaûng naêm 1877, ôû Nhaät, ngöôøi ta ñaõ phaùt hieän vaø söû duïng Aspergilus vaøo saûn xuaát röôïu, phaân giaûi acid… Aspergilus goàm raát nhieàu loaïi, nhöng trong coâng nghieäp saûn xuaát röôïu thöôøng duøng caùc loaïi : Asp.flavus, Asp.orysee, Asp.batatae, Asp.awamorii, Asp.niger,Asp.usami…
Aspergilus coù ñaëc ñieåm sau : khuaån ty khoâng maøu hay vaønh nhaït. Coù 2 loaïi : khuaån ty kyù sinh phaùt trieån treân maët moâi tröôøng vaø khuaån ty dinh döôõng aên saâu vaøo trong moâi tröôøng. Khuaån ty phaân nhieàu nhaùnh, coù nhieàu ngaên teá baøo moãi teá baøo coù moät nhaân. Nang vaø nang baøo töû laø quaû theå maøu vaøng kim. Khi Aspergilus hình thaønh ñính baøo töû deã phaân bieät vôùi caùc moác khaùc. Cuoáng ñính baøo töû daøi vaø thaúng, khoâng phaân nhaùnh maø ñaàu phình to taïo thaønh chop nang. Teá baøo sinh cuoáng ñính baøo töû phaân bieät vôùi caùc teá baøo khaùc goïi laø teá baøo chaân. Choùp nang coù theå hình caàu, hình chuøy, hình baùn caàu… Xung quanh ñaàu coù nhieàu cuoáng nhoû. Tuøy loaøi maø cuoáng nhoû coù 1 hay 2 taàng. Theo Thom vaø Raper (1945), goïi chuùng laø cuoáng nhoû sô sinh vaø cuoáng nhoû thöù sinh. Taát caû cuoáng nhoû ñeàu coù hình chai. Ñính baøo töû xeáp thaønh chuoãi daøi, caøng gaàn baøo töû caøng lôùn daàn. Nhöõng chuoãi ñính baøo töû xeáp ñoái xöùng toûa troøn treân choùp nang. Ñính baøo töû thöôøng coù hình caàu ñôn baøo, ña nhaân, beà maët xuø xì. Do cuoáng ñính baøo töû vaø baøo töû coù maøu saéc, phaùt trieån maïnh, neân maøu cuûa chuùng trôû neân maøu cuûa khuaån laïc. Maøu khuaån laïc Aspergilus raát khaùc nhau : ñen, ghi, naâu, vaøng, vaøng luïc, luïc vaøng, luïc, traéng… Maøu saéc coù thay ñoåi tuøy ñieàu kieän moâi tröôøng, thôøi gian nuoâi caáy… treân moâi tröôøng nhaát ñònh (ví duï moâi tröôøng Csepek); maøu khuaån laïc laø moät daáu hieäu ñeå phaân loaïi. Asp raát nhaïy ñoái vôùi nguyeân toá vi löôïng, taïo ra maøu saéc ñaëc bieät cuûa khuaån laïc. Mulder ñaõ xaùc ñònh : Asp. Niger coù maøu saãm nhaát khi moâi tröôøng coù Cu2+ vôùi noàng ñoä 0,00025%; ôû noàng ñoä thaáp hôn, maøu khuaån laïc nhaït daàn. Khi khoâng coù ñoàng, ñính baøo töû coù maøu vaøng (bình thöôøng laø ñen hay naâu) Aspergilus Orysee : nuoâi treân thaïch Csepek thì treân vuøng baøo töû coù maøu vaøng luïc troäi veà maøu vaøng. Vuøng khoâng coù baøo töû heïp vaø traéng. Khuaån laïc khoâng coù neáp nhaên hoaëc khoâng roõ reät. Baøo töû nang ñaàu troøn 40-60 μm, cuoáng ñính baøo töø daøi 0,8-1,5mm, ñöôøng kính 8-12 μm, coù theå thaáy baèng maét thöôøng. Ñính baøo töû hình baàu duïc hay quaû leâ, kích thöôùc 4-6×5-7 μm. Teá baøo chai ñaëc tröng cuûa Aspergilus deã thaáy. Baøo töû nang luùc non traéng, luùc giaø vaøng luïc, caøng giaø maøu caøng saãm. Ñính baøo töû traàn deã bay. Moác naøy sinh ra caùc enzym amylase, invectase, maltase, protease vaø catalase. Hoaït tính men amylase, protease raát cao. Moác naøy phaùt trieån trong khoaûng nhieät ñoä 15 - 400C, toái thích 30 - 320C. Moác naøy ñöôïc söû duïng nhieàu roäng raõi trong coâng nghieäp saûn xuaát röôïu, töông, chao, thuoäc da, nöôùc chaám leân men v.v… Aspergilus Flavus : nuoâi treân thaïch Csepek thì maët treân vuøng baøo töû coù maøu luïc vaøng, troäi veà maøu luïc. Khuaån laïc thaáp, ñính baøo töû naèm saùt maët thaïch, do cuoáng ngaén. Maët döôùi khuaån laïc thöôøng khoâng maøu, ñoâi khi vaøng nhaït. Baøo töû nang ñaàu troøn 40 - 60 μm. Cuoáng ñính baøo töû ngaén 0,3 - 0,5mm. Ñính baøo töû troøn hay baàu duïc 3,5 - 5 μm. Teá baøo chaân roõ deã thaáy. Baøo töû deã bay. Aspergilus orysee raát gioáng Asp. Flavus, chæ khaùc laø kích thöôùc lôùn hôn, khuaån laïc coù maøu troäi hôn veà maøu vaøng. Moác naøy sinh ra heä enzym gioáng A.Orysee, ñaëc bieät laø protease raát hoaït ñoäng vaø cheá phaåm tinh khieát cuûa enzym naøy ñöôïc duøng laøm taùc nhaân oån ñònh bia. ÔÛ moät soá moâi tröôøng coù chaát beùo (treân laïc), moác naøy coù theå sinh ra ñoäc toá aflatoxin. Coù moät soá taùc giaû xeáp hai gioáng moác naøy thuoäc nhoùm A.orysee-flavus. Aspergillus niger : thöôøng goïi laø moác ñen. Treân moâi tröôøng thaïch Csepek, khuaån laïc troøn, xoáp, vuøng baøo töû maøu naâu ñen hoaëc ñen. Khuaån laïc coù neáp nhaên roõ. Vuøng giöõa khuaån laïc sau 3 - 4 ngaøy (2 - 4mm) cao hôn xung quanh. Maët döôùi thöôøng khoâng maøu, ñoâi khi vaøng nhaït, thaáy roõ neáp nhaên töø taâm khuaån laïc ñi ra. Baøo töû nang ñaàu troøn, khaù lôùn (100 - 160 μm). Cuoáng ñính baøo töû daøi 0,5 - 1,5mm hoaëc hôn, ñöôøng kính 7 - 17 μm, thaáy roõ baèng maét thöôøng. Cuoáng nhoû hay theå hình chai, coù hai lôùp hình laêng truï. Lôùp ñaàu daøi lôùn 15 - 25×3 - 4 μm. Ñính baøo töû troøn, ñöôøng kính 3 - 4 μm. Teá baøo chaân deã nhaän thaáy. Moác sinh ra enzym amylase, invectase, maltase, protease, pectinase, glucooxydase. Moác naøy ñöôïc duøng trong saûn xuaát röôïu , saûn xuaát acid citric, acid fumaric. Protease do moác naøy hoïat ñoäng ôû pH 2,5 - 3,5 coøn ôû protease cuûa A. orysee khoâng hoaït ñoäng ôû vuøng pH naøy. Treân theá giôùi, 90% saûn löôïng acid citric ñöôïc saûn xuaát baèng phöông phaùp leân men. Aspergillus usami (söû duïng ôû nhaø maùy röôïu Haø Noäi) laø chuûng niger ñaõ ñöôïc ñoät bieán baèng tia phoùng xaï Coban 60. Qua nghieân cöùu chuùng toâi nhaän thaáy Asp.Usami cuûa nhaø maùy röôïu coù nhöõng ñaëc ñieåm: Ñính baøo töû to, khi giaø coù maøu hôi naâu ñen Nhieät ñoä thích hôïp 33 - 340C, ñoä aåm 90 - 100% Heä men amylase töông ñoái ñaày ñuû, nuoâi treân moâi tröôøng raén (caùm, traáu, boät ngoâ) trong ñieàu kieän thích hôïp, chæ sau 36 - 40 giôø, khaû naêng tích luõy men cao nhaát. Ngoaøi tích luõy amylase, Asp.usami coøn sinh ra moät löôïng acid khaù lôùn (2 - 3% trong moâi tröôøng), vì vaäy amylase cuûa Asp.usami coù theå thuûy phaân tinh boät ôû pH 4 - 4,5. Maët khaùc amylase cuûa Asp.usami vaãn giöõ ñöôïc hoaït tính ôû nhieät ñoä cao 600C ± 10C.
Asgergillus awamori vaø Asgergillus usami gaàn vôùi A.niger coù khaû naêng sinh ra nhieàu dextrinase vaø glucomylase, amylase sinh ra ít hoaëc trung bình. Moác naøy ñöôïc duøng nhieàu trong coâng nghieäp röôïu ñeå ñöôøng hoùa tinh boät. III- NUOÂI CAÁY MOÁC ÑÖÔØNG HOÙA : CAÙC CHEÁ PHAÅM ENZYM ÑÖÔØNG HOÙA Nuoâi caáy moác ñeå saûn xuaát töông hoaëc xì daàu ôû caùc nöôùc phöông Ñoâng coù töø thôøi coå xöa. Naêm 1884 J.Takamine (Nhaät Baûn) ñaõ nuoâi caáy A.orysee treân gaïo, sau ñoù thay gaïo baèng caùm mì vaø thu cheá phaåm enzym baèng caùch chieát qua nöôùc roài keát tuûa baèng coàn. Naêm 1915 moác naøy ñöôïc duøng roäng raõi trong saûn xuaát röôïu ôû Myõ theo quy trình coâng ngheä cuûa Takamine vaø ñöôïc duøng phoå bieán treân theá giôùi ñeå ñöôøng hoùa caùc nguoàn nguyeân lieäu tinh boät tröôùc khi leân men röôïu cho ñeán nay. Hieän nay trong coâng nghieäp röôïu thöôøng duøng caùc chuûng khaùc nhau cuûa moác nhoùm A.orysee, A.niger, A.awamoni, A.usami, A.batatae theo hai phöông phaùp nuoâi caáy beà maët vaø nuoâi caáy chìm. Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët : Khuaån ty theå cuûa naám moác taïo thaønh moät lôùp moûng treân beà maët moâi tröôøng nuoâi caáy, lôùp khuaån ty coù theå daøy töø 3 - 5cm ; ñoái vôùi moâi tröôøng raén, khuaån ty theå xuyeân saâu vaøo nhöõng choã hoång cuûa moâi tröôøng. Trong coâng nghieäp saûn xuaát röôïu, chæ aùp duïng phöông phaùp nuoâi caáy naám moác beà maët treân moâi tröôøng dinh döôõng chaát raén, coù thoâng khoâng khí hoaëc khoâng thoâng khí. Ñoái vôùi phöông phaùp nuoâi caáy beà maët treân moâi tröôøng loûng, chæ aùp duïng trong coâng nghieäp saûn xuaát acid citric. Phöông phaùp nuoâi caáy naám moác beà saâu: Naám moác nuoâi caáy trong moâi tröôøng dinh döôõng dòch theå, coù thoâng khoâng khí. Khuaån ty theå hình thaønh ñöôïc phaân boá vaø lô löûng trong moâi tröôøng. Ñaëc bieät, trong quaù trình nuoâi caáy, men amylase ñöôïc khuyeách taùn ra moâi tröôøng. Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët naám moác ñöôøng hoùa thöôøng duøng caùm mì laøm cô chaát. Caùm mì caàn phaûi lôùn vaø coù hôn 20% tinh boät. Caùm ñöôïc theâm 1 ít formalin vaø acid clohydric ñeå taêng hieäu quaû thanh truøng döôùi aùp löïc hôi nöôùc noùng 1 atm trong khoaûng 1-2 giôø. Noùi chung nuoâi caáy moác ñöôøng hoùa theo phöông phaùp ñöôøng hoùa goàm 4 giai ñoaïn: Chuaån bò gioáng vaø nhaân gioáng ñeå thu ñöôïc moác trung gian; Chuaån bò vaø thanh truøng moâi tröôøng nuoâi caáy; Nuoâi caáy moác treân khay, maønh, nong, nia… treân caùc giaù trong caùc buoàng nuoâi moác coù nhöõng ñieàu kieän thích hôïp ñeå moác sinh ra enzym toái ña; Ñaäp nhoû, saáy vaø ñoùng goùi moác caùm khoâ Moác gioáng A. awamori ñöôïc giöõ trong phoøng thí nghieäm treân moâi tröôøng thaïch – malt ôû choã toái 180C. Cöù 3 thaùng 1 laàn caáy truyeàn treân moâi tröôøng nöôùc malt coù 7% chaát khoâ vôùi 3% thaïch vaø 0,09% acid citric. Moác tröôùc khi ñöa vaøo saûn xuaát ñöôïc caáy treân moâi tröôøng thaïch – malt 7 - 8 ngaøy roài chuyeån vaøi bình tam giaùc 500ml coù 10g caùm mì ñöôïc laøm aåm baèng 6ml nöôùc ñaõ acid hoùa qua thanh truøng 1 giôø. Nuoâi ôû buoàng aám 300C trong 3 ngaøy, sau ñoù chuyeån sang nuoâi ôû khay nhoâm hoaëc maønh vôùi ñieàu kieän töông töï ñeán khi moác sinh baøo töû nhieàu. Moác caùm thu ñöôïc naøy goïi laø moác trung gian duøng ñeå caáy troän vaøo moâi tröôøng saûn xuaát tieáp theo. Moâi tröôøng saûn xuaát cuõng ñöôïc chuaån bò töông töï vaø san ñeàu treân caùc khay hoaëc maønh, nong… Chieàu daøy lôùp moâi tröôøng 2,5 - 3cm. Tyû leä moác caáy chuyeàn tieáp khoaûng 0,2 - 0,4%. Nuoâi moác treân khay trong caùc buoàng 28 - 320C coù thoâng gioù vaø giöõ ñoä aåm khoâng khí 90 - 95%. Thôøi gian nuoâi moác töø 24 - 26 ñeán 30 - 36 giôø vaø keát thuùc khi moác saép ñeán giai ñoaïn baøo töû. Trong quaù trình nuoâi caàn laät vaø beû nhoû caùm vì heä sôïi moác phaùt trieån laøm cô chaât keát thaønh baùnh. Moác caùm sau khi nuoâi caáy coù ñoä aåm 40 - 50% caàn phaûi saáy khoâ khoâng quaù 450C ñeán khi ñoä aåm coøn 10 - 12%, nghieàn nhoû. Moác caùm khoâ ñöïng trong caùc bao hoaëc thuøng kín, baûo quaûn ôû choå maùt (döôùi 200C) vaø ñeå duøng daàn. Cuõng coù theå duøng moác caùm coù ñoä aåm 45 - 50%(chöa saáy) vaøo ñöôøng hoùa tröïc tieáp. Qua nghieân cöùu vaø thöïc teá thaáy duøng caùm mì laøm cô chaát raén nuoâi caáy moác ñöôøng thu ñöôïc keát quaû cao nhaát. Tröôøng hôïp khoâng coù caùm mì coù theå thay baèng caùc moâi tröôøng coù caùc thaønh phaàn sau: Moâi tröôøng boät ngoâ : boät ngoâ nhoû mòn, vaøng – 75%; traáu nhoû coù 1/8 - 1/10 voû luùa - 25%; (NH4)2SO4 - 0,5% Moâi tröôøng caùm boåi: caùm gaïo coù 0,5% (NH4)2SO4 Quaù trình nuoâi caáy moác treân nhöõng moâi tröôøng naøy töông töï nhö treân moâi tröôøng caùm mì. Phöông phaùp nuoâi caáy chìm thöôøng duøng caùc moác A.niger, A.usami, A.batatae-61. Quaù trình nuoâi caáy goàm caùc giai ñoïan : Chuaån bò gioáng vaø nhaân gioáng Pha cheá moâi tröôøng dinh döôõng Nuoâi caáy moác trong thuøng men, thu dòch men coù hoaït löïc cao. Moác gioáng duøng töø oáng nghieäm hoaëc töø moác caùm trong caùc bình tam giaùc nhaân gioáng nhö trong phöông phaùp beà maët. Nhaân gioáng coù theå qua caáp 1 ôû trong bình tam giaùc vaø caáp 2 trong caùc thuøng nhaân gioáng coù suïc khí. Moâi tröôøng nhaân gioáng goàm: dòch loïc baõ röôïu töø caùc nguyeân lieäu tinh boät ñöôïc boå sung 1,5 boät mì hoaëc boät ngoâ (coù khi duøng 2 - 3% caùm); 0,5 cao ngoâ; 0,5% KNO3; 0,1 - 0,2% MgO hoaëc 0,2% Ca2CO3; pH=5,6 - 5,8. Moâi tröôøng than truøng 1 - 1,5 atm/giôø. Trong moãi bình tam giaùc 750 coù 130 - 150 ml moâi tröôøng. Nhaân gioáng trong bình tam giaùc treân maùy laéc 200 - 220 v/phuùt ôû 30 - 320C khoaûng 72 giôø, sau ñoù nhaân gioáng tieáp trong caùc noài 2 voû coù khuaáy vaø suïc khí (40 - 60 m3/h) ôû 30 - 320C khoaûng 24 - 30 giôø. Moâi tröôøng dinh döôõng nuoâi moác ñeå sinh enzym nhö sau: Dòch loïc baõ röôïu 97,8% Boät 1,5 - 2% Cao ngoâ 0,5% MgO hoaëc CaCO3 0,2% pH 5,6 - 5,8% Trong moâi tröôøng caàn coù 1,2 - 1,7g% chaát khöû (khoâng tính pentose) vaø N toång: 220 - 280 mg% Moâi tröôøng thanh truøng ôû 1,5 - 2 atm khoaûng 45 - 60 phuùt. Tieáp theo tyû leä 1 - 5% (ñoái vôùi A.batatae chæ caàn 1%) Quaù trình nuoâi moác caàn phaûi suïc khí (15 - 20 m3/giôø) vaø khuaáy, coù theå trong 18 giôø ñaàu khoâng caàn khuaáy vì moác môùi phaùt trieån, ñoä nhôùt thaáp, vì vaäy chæ caàn suïc khí cuõng ñuû troän moâi tröôøng. Thôûi gian nuoâi caáy khoaûng 60 - 72 giôø ôû 30 - 320C. Dòch men sau khi nuoâi caáy ñöôïc theâm 0,25 formalin laøm chaát baûo veä vaø duøng ñeå ñöôøng hoùa dòch chaùo ôû nhieät ñoä 56 - 570C vôùi tyû leä 75 - 100% (tuøy thuoäc vaøo hoaït löïc enzym). Ñoái vôùi naám men leân men caùc dòch ñöôøng töø tinh boät trong moâi tröôøng caàn phaûi coù caùc hôïp chaát nitô deã ñoàng hoùa. Trong tröôøng hôïp duøng moác ñöôøng hoùa laø A.awamori chæ coù caùc enzym amylase (coøn protease hoaøn toaøn khoâng coù). Vì vaäy, trong dòch ñöôøng hoùa khoâng coù caùc hôïp chaát nitô deã ñoàng hoùa ñoái vôùi naám men. Caùc hôïp chaát nitô naøy laø hoãn hôïp caùc acid amin ñaõ ñöôïc thuûy phaân töø protein döôùi taùc duïng cuûa enzym protease. Ñeå giaûi quyeát vaán ñeà naøy coù theå duøng hoãn hôïp cheá phaåm enzym A.orysee nuoâi caáy theo phöông phaùp beà maët giaøu protease vaø cuûa A.awamori nuoâi caáy theo phöông phaùp chìm. Söû duïng hoãn hôïp naøy cho pheùp giaûm löôïng cheá phaåm caàn thieát xuoáng 2 laàn vaø naâng cao ñöôïc hieäu suaát leân men noùi chung. Ngöôøi ta coøn duøng hoãn hôïp A.orysee nuoâi caáy beà maët vaø A.usami-45 hoaëc A.batatae nuoâi caáy chìm cuõng cho keát quaû toát. Ñaùnh giaù chaát löôïng ñöôøng hoùa theo hoaït löïc amylase, dextrinase, glucoamylase vaø protease. IV- ÑÖÔØNG HOAÙ TINH BOÄT: Khoái naáu khoâng theå tröïc tieáp leân men röôïu (vì trong naám men khoâng coù phöùc heä Enzym Amylase) maø phaûi thuûy phaân sô boä tinh boät baèng phöùc heä Enzym Amylase cuûa naám moác hoaëc cuûa malt. Trong saûn xuaát, quaù trình naøy ñöôïc goïi laø ñöôøng hoùa tinh boät ( hay söï ñöôøng hoùa); baùn saûn phaåm nhaän ñöôïc – dòch ñöôøng hoùa. Trong saûn xuaát röôïu töø nguyeân lieäu coù chöùa tinh boät, ñöôøng hoùa laø 1 trong nhöõng quaù trình coâng ngheä quan troïng aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men, hieäu suaát toång thu hoài, chaát löôïng saûn phaåm, chu kyø saûn xuaát….. Khi noùi ñeán quaù trình ñöôøng hoùa, laø keå caû caùc giai ñoaïn laøm nguoäi khoái naáu töø nhieät ñoä 105 - 110oC xuoáng nhieät ñoä thích hôïp cho taùc duïng cuûa men Amylase (60 ± 2oC) vaø laøm nguoäi dòch ñöôøng hoùa ñeán nhieät ñoä thích hôïp cho leân men (33 - 36oC). 1-Taùc duïng cuûa enzym amylase leân maïch tinh boät: Amilose vaø Amilopectin laø hai thaønh phaàn chính cuûa nguyeân lieäu tinh boät, sau khi naáu, chuùng ñöôïc giaûi phoùng ra vaø ôû traïng thaùi hoøa tan. Döôùi taùc duïng cuûa phöùc heä men Amylase, trong nhöõng ñieàu kieän thích hôïp, Amilose vaø Amilopectin bò phaân caét, taïo thaønh nhöõng saûn phaåm trung gian khaùc nhau (coøn goïi chung laø Dextrin) vaø caùc saûn phaåm cuoái cuøng laø Maltose vaø Glucose. Saûn phaåm trung gian vaø cuoái cuøng ñöôïc taïo ra phuï thuoäc vaø caáu truùc cuûa maïch Amilose vaø Amilopectin vaø vaøo phöùc heä men Amylase söû duïng. Trong caáu truùc maïch Amilopectin cuû tinh boät cuûa caùc loaïi haït, khoâng thaáy coù söï lieân keát cuûa acid Phosphoric (H3PO4) ôû vò trí ( 1 - 6Glucoside nhöng ôû tinh boät khoai taây laïi coù moái lieân keát ñoù:
Phöùc heä Enzym Amylase cuûa naám moác khaùc vôùi phöùc heä men Amylase trong malt. Trong phöùc heä men Amylase cuûa Malt, haàu nhö khoâng thaáy coù men Glucoamylase (glA), neân saûn phaåm cuoái cuøng cuûa quaù trình leân ñöôøng hoùa tinh boät baèng men Amylase cuûa thoùc taïo Malt laø Maltose, löôïng ñöôøng Glucose do men ( - Amylase taïo ra khoâng ñaùng keå. Ngöôïc laïi, khi thuûy phaân tinh boät baèng phöùc heä men Amylase cuûa 1 soá loaøi naám moác, thì saûn phaåm cuoái cuøng haàu nhö laø ñöôøng Glucose. Veà vò trí taùc duïng cuûa men ( - Amylase cuûa naám moác leân maïch tinh boät, coù nhieàu yù kieán maâu thuaãn. Coù yù kieán cho raèng taùc duïng cuûa men ( - Amylase trong naám moác Asp.Orysee chæ taïo thaønh ñöôøng Maltose vaø Dextrin, töùc laø taùc duïng cuûa ( - Amylase cuûa naám moác chæ gioáng nhö men ß - Amylase trong Malt; coù yù kieán khaùc cho raèng döôùi taùc duïng cuûa ( - Amylase cuûa naám moác, taïo ra hoãn hôïp hydrat carbon goàm caùc Dextrin coù phaân töû löôïng khaùc nhau, Glucose, Maltose, vaø caùc Oligosacchrit khaùc. Men Oligo - 1,6Glucozidase caét ñöùt caùc lieân keát ( - 1,6Glucozid trong phaïm vi cuûa Dextrin, Isomaltase chæ caét ñöùt lieân keát cuûa caùc Disaccharide maø thoâi (ñöôøng Isomaltose). Quan saùt caùc hieän töôïng xaûy ra trong quaù trình ñöôøng hoùa tinh boät baèng men Amylase, ta thaáy: Ñoä nhôùt cuûa dung dòch giaûm daàn. Khaû naêng khöû (ñoái vôùi caùc dung dòch oxy hoùa) taêng leân. Phaûn öùng ñònh tính vôùi Iod thay ñoåi töø maøu xanh, tím xanh, ñoû naâu, ñeán khoâng maøu. 2- Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình ñöôøng hoùa tinh boät: a) Noàng ñoä cuûa men: Trong saûn xuaát, toác ñoä cuûa söï thuûy phaân, tinh boät laø haøm soá cuûa söï taùc duïng toång coäng cuûa men Amylase trong naám moác hoaëc trong malt. Trong phöùc heä men Amylase cuûa naám moác hoaëc trong malt coù nhöõng men khaùc nhau, soá löôïng khaùc nhau, hoaït tính khaùc nhau. Nhöõng ñieåm ñoù ñöa tôùi söï thuûy phaân tinh boät khaùc nhau (veà möùc ñoä ñöôøng hoùa, toác ñoä ñöôøng hoùa vaø saûn phaåm cuoái cuûa quaù trình ñöôøng hoùa). Tinh boät ñöôïc hoà hoùa trieät ñeå, noàng ñoä tinh boät 12%, pH - 5, ñöôøng hoùa ôû nhieät ñoä 57oC trong thôøi gian 30 phuùt, sau ñoù laøm nguoäi tôùi 30oC vaø tieáp tuïc phaân tích haøm löôïng ñöôøng sinh ra trong suoát thôøi gian laøm ñöôøng hoùa, cho ñeán khi coù keát quaû phaân tích nhieàu laàn khoâng thay ñoåi. Keát quaû thí nghieäm ñöôïc theå hieän trong baûng sau: Tyû leä men söû dung, %  Löôïng ñöôøng khöû sinh ra, %    Sau 12h  Sau 24h  36 - 48h   2 4 6 8  6.42 6.42 8.70 9.50  8.45 8.95 8.95 10.23  9.20 10.46 10.50 _   Nhöõng thí nghieäm töông töï vôùi tyû leä men söû duïng 8 - 10% cuõng chæ ñaït 9,5 - 10% löôïng ñöôøng sinh ra. ( Vôùi haøm löôïng tinh boät ban ñaàu cao hôn thì haøm löôïng ñöôøng cuøng sinh ra cao hôn töông öùng). Vì vaäy, khi noùi ñeán aûnh höôûng cuûa noàng ñoä men töùc laø noùi ñeán hoaït tính, soá löôïng vaø söï caân ñoái cuûa phöùc heä Amylase. b) Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä: Toác ñoä phaûn öùng cuûa men cuõng nhö phaàn lôùn phaån öùng hoùa hoïc taêng leân khi taêng nhieät ñoä. Tính phuï thuoäc cuûa haèng soá vaän toác vôùi nhieät ñoä, ñöôïc theå hieän trong phöông trình Arenius: (dlnK)/(dT)=E/(RT2) Trong ñoù: T nhieät ñoä tuyeät ñoái,oK R haèng soá chaát khí Sau khi laáy tích phaân phöông trình treân trong giôùi haïn T1 vaø T2 ta coù E = ((lnK1-lnK2)RT1T2) / (T1-T2) Vôùi K1 vaø K2 laø haèng soá vaän toác töông öùng vôùi nhieät ñoä T1 vaø T2 Ñaëc tröng cuûa phaûn öùng thuûy phaân tinh boät baèng Amylase laø dieãn ra trong phaïm vi nhieät ñoä töông ñoái heïp, giôùi haïn laø 35 - 63oC ( ñaây laø khoaûng nhieät ñoä toái thích cuûa Enzym Amylase). Neáu ñöôøng hoùa ôû nhieät ñoä cao laø toap cuûa Dextrinase thì löôïng Dextrin taïo ra seõ nhieàu trong khi ñoù Maltose sinh ra ít, hieäu suaát quaù trình thuûy phaân bò giaûm. Taùc duïng cuûa nhieät ñoä leân caùc Enzym khoâng phaûi töùc thôøi, caùc Enzym giöõ ñöôïc hoaït tính cao trong 1 thôøi gian ngaén. Ñoâi khi, trong quaù trình laøm nguoäi töø 105 - 109oC xuoàng nhieät ñoä thaáp hôn (55 - 60oC) ta coù theå theâm vaøo Enzym ñeå tieán haønh phaân caét sô boä, laøm loaõng khoái naáu, deã ñöa chuùng vaøo maùy laøm nguoâi. Neáu ñöôøng hoùa ôû nhieät ñoä khoaûng 40 - 50oC thì thöïc ra khoâng coù lôïi vì chuùng deã nhieãm khuaån maëc duø coù theå taïo ra löôïng ñöôøng khöû lôùn hôn. Nhìn chung, nhieät ñoä toái öu khoaûng 35 - 62oC
c) Aûnh höôûng cuûa pH: Baûn chaát cuûa men gaàn gioáng nhö baûn chaát cuûa Protein, haàu heát Protein laø nhöõng hôïp chaát löôõng tính. Caùc Enzym cuõng coù baûn chaát laø Protein vôùi caùc trung taâm hoaït ñoäng. Ion H+ coù theå taùc duïng vaøo trung taâm hoaït ñoäng vaø caùc nhoùm beân 1 caùch tröïc tieáp hay giaùn tieáp (nhoùm beân laø nhoùm amin NH2 hay nhoùm carboxylic COOH). Qua nghieân cöùu heä Enzym Amylase ta thaáy pH toái thích laø 4 – 5, khi pH = 2 hay pH = 10 thì Enzym bò voâ hoaït. Aûnh höôûng pH cuûa Enzym phuï thuoäc vaøo nhieät ñoä vaø caùc yeáu toá khaùc ( neáu nhieät ñoä taêng thì pHap taêng höôùng veà phía kieàm) Ñoä pH khoái naáu phuï thuoäc 2 yeáu toá: Baûn thaân nguyeân lieäu naáu (tinh boät vaø nöôùc) Caùc chaát phuï trôï trong quaù trình naáu (H2SO4, acid lactic…) Bôûi vì caùc nguyeân lieäu treân coù ñoä acid thöôøng khoaûng töø 0.2 - 0.5o töông ñöông pH cuûa ngueân lieäu laø 4.9 - 5.6, pH naøy khoâng thích hôïp vì khoâng baèng vôùi pH toái thích cuûa Enzym Amylase vì theá khi naáu nguyeân lieäu ngöôøi ta hay cho theâm vaøo acid voâ cô (H2SO4 hay HCl) hay acid höõu cô nhö acid Lactic ñöôïc nuoâi caáy rieâng, hay söû duïng baõ röôïu trong ñeå naáu nguyeân lieäu. Nhieàu nghieân cöùu cuõng cho thaáy roõ raøng raèng khi duøng acid Lactic ñeå ñieàu chænh pH trong quaù trình naáu vaø ñöôøng hoùa ñaõ naâng cao hieäu suaát toång thu hoài röôïu 2 - 3% so vôùi duøng caùc acid voâ vô nhö HCl hay H2SO4. Ngoaøi vieäc ñieàu chænh pH thích hôïp acid Lactic coøn laø nguoàân thöùc aên cho naám men sau naøy. d) Söï thay ñoåi nhöõng yeáu toá khaùc trong quaù trình ñöôøng hoùa: Trong quaù trình ñöôøng hoùa baèng Amylase cuûa Malt, caùc chaát Hemicellulose vaø Pectin trong khoái naáu haàu nhö khoâng bò thay ñoåi nhieàu veà maët hoùa hoïc. Nhöng ñöôøng hoùa baèng Amylase cuûa naám moác thì caùc chaát treân coù nhöõng bieán ñoåi ñaùng keå. Trong naám moác, ngoaøi Enzym Amylase coøn coù theâm Enzym Pectinase, Xitase……giuùp thuûy phaân caùc Pectin, Hemicellulose, 1 phaàn Cellulose taïo ra ñöôïc nhöõng chaát ñöôøng töông öùng leân men ñöôïc nhö Saccharose hay caùc ñöôøng khoâng leân men ñöôïc nhö Arabinose, Xylose. Do ñoù taïo nhieàu saûn phaåm phuï trong quaù trình ñöôøng hoùa. Söï bieán ñoåi cuûa chaát ñaïm trong quaù trình ñöôøng hoùa coù yù nghóa quan troïng. Trong Malt vaø cuõng nhö trong naám moác ñeàu coù men Protease. pH thích hôïp cho Protease cuûa Malt laø 4.5 - 5.0; cuûa Peptidase laø 7.3 - 7.9. ÔÛ pH naøy vaø nhieät ñoä 60oC, Protease töông ñoái beàn vöõng. Nhieät ñoä toái thích cuûa Peptidase laø 45 - 47oC, khi nhieät ñoä taêng leân, laøm ñình chæ nhanh choùng men Peptidase. Tuy nhieân, trong ñieàu kieän khoâng thích hôïp nhö vaäy, quaù trình ñöôøng hoùa, Peptidase ñaõ laøm taêng haøm löôïng acid amin trong dung dòch ñöôøng hoùa taêng leân 2.3-3 laàn so vôùi ban ñaàu trong khoái naáu (20%N ôû daïng hoøa tan). Nhieät ñoä naáu nguyeân lieäu coù aûnh höôûng ñeán söï phaân caét caùc Albumin. Sau khi ñöôøng hoùa khoái naáu laø luùa mì, trong daïng ñaïm hoøa tan soá löôïng Nitô nhö sau: Nhieät ñoä naáu, oC  Nitô hoøa tan, % so toång soá.    Toång soá  Thaønh phaàn Albumin   100 200 300  32.8 40.0 41.9  20.7 14.1 7.0   Nhö vaäy laø nhieät ñoä naáu nguyeân lieäu caøng cao thì, trong quaù trình ñöôøng hoùa, söï phaân caét cuûa Albumin caøng giaûm. Nhöng , ñoái vôùi nguyeân lieäu laø ngoâ thì quaù trình naøy ngöôïc laïi: Nhieät ñoä naáu  Nito hoøa tan, % trong toàng soá    Toång soá  Trong ñoù Albumin   100 135  16.5 36.0  7.5 9.1   Men Protease cuûa naám moác (tröø Asp. Awamori) hoaït ñoäng thích hôïp ôû moâi tröôøng acid yeáu vaø pH hôi thaáp. Trong thôøi gian ñöôøng hoùa xuaát hieän hoaït tính cuûa men Phosphatase, men naøy giaûi phoùng Phospho trong caáu truùc cuûa maïch tinh boät. Haøm löôïng phospho hoøa tan cuõng taêng leân coù taùc duïng toát ñoái vôùi quaù trình sinh tröôûng cuûa naám men, naâng cao ñöôïc tính ñeäm cuûa dung dòch ñöôøng hoøa vaø giaûm pH trong quaù trình leân men röôïu. e) Nhöõng yeáu toá aûnh höôûng khaùc: e.1) Aûnh höôûng cuûa chaát saùt truøng Na2SiF6: ñeå haïn cheá vaø ngaên chaën söï nhieãm khuaån trong quaù trình ñöôøng hoùa, caùc nhaø maùy saûn xuaát röôïu thöôøng duøng chaát saùt truøng nhö formol, Na2SiF6 ….vôùi tyû leä 0.02 - 0.025% so vôùi khoái löôïng. Caùc chaát saùt truøng coù theå cho vaøo dung dòch naám moác hay dòch söõa Malt, hoaëc coù theå cho ñoàng thôøi vaøo caû khoái naáu vaø dòch men Amylase. Veà phöông dieän vi sinh vaät hoïc, caùc chaát saùt truøng treân ñeàu coù taùc duïng öùc cheá, vôùi tyû leä lôùn seõ ñình chæ söï phaùt trieån cuûa naám moác. Nhöng ngöôïc laïi, caùc chaát saùt truøng naøy khoâng aûnh höôûng tôùi hoaït tính naám men, khi söû duïng phöùc heä Enzym ñaõ taùch ra ( hoaëc söû duïng ôû daïng canh tröôøng). e.2) Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä röôïu: nhö ñaõ trình baøy ôû treân, quaù trình ñöôøng hoùa trong 1 thôøi gian ngaén, tinh boät khoâng hoaøn toaøn bò thuûy phaân, maø quaù trình thuûy phaân tinh boät coøn tieáp tuïc ñeán khi keát thuùc quaù trình leân men röôïu. Vì vaäy, caàn xeùt theâm aûnh höôûng cuûa noàng ñoä coàn ñoái vôùi phöùc heä men Amylase. Iarovanko vaø caùc coäng söï ñaõ nghieân cöùu vaø ruùt ra nhöõng keát luaän sau: Thôøi gian ñöôøng hoùa(thuûy phaân), giôø  Maãu ñoái chöùng  Ñöôøng Glucose taïo thaønh,%     Noàng ñoä röôïu cho vaøo, % v     4  6  10   12 24 36 50  4.47 5.12 6.35 6.82  5.15 6.18 6.43 6.82  4.00 5.92 6.35 6.82  4.66 6.18 5.97 7.04   e.3) Thôøi gian ñöôøng hoùa: choïn thôøi gian ñöôøng hoùa thích hôïp khoâng nhöõng coù yù nghóa veà maët lyù thuyeát maø coøn coù yù nghóa lôùn trong saûn xuaát thöïc tieãn. Vieäc löïa choïn thôøi gian ñöôøng hoùa coøn phuï thuoäc vaøo phöông phaùp laøm nguoäi khoái naáu vaø phöông phaùp ñöôøng hoùa. Thôøi gian laøm nguoäi vaø ñöôøng hoùa quyeát ñònh naêng suaát thieát bò, chaát löôïng cuûa dung dòch ñöôøng hoùa vaø hieäu suaát toång thu hoài. Theo lyù thuyeát, thôøi gian ñöôøng hoùa coù aûnh höôûng ñeán söï hoøa tan tinh boät khoâng ñöôøng hoùa. Khi ñöôøng hoùa khoái naáu ôû nhieät ñoä 55 - 58oC trong khoaûng thôøi gian töø 15 - 120 phuùt, haàu nhö ñöôøng leân men trong dòch ñöôøng hoùa khoâng taêng, nhöng noàng ñoä chaát tan chung cuûa dung dòch laïi taêng 1 caùch roõ reät. Sau 15 phuùt ñöôøng hoùa, noàng ñoä chaát tan laø 13.8% vaø sau ñoù 120 phuùt thì noàng ñoä chaát tan laø 14.8%, nhöng ñöôøng leân men khoâng taêng. Nhö vaäy, thôøi gian ñöôøng hoùa naâng cao haøm löôïng chaát khoâ hoøa tan ( chuû yeáu laø ñaïm hoøa tan) vaø naâng cao tính ñeäm cuûa dung dòch. Song, keùo daøi thôøi gian ñöôøng hoùa ôû nhieät ñoä 55 - 58oC seõ laøm giaûm hoaït tính cuûa Enzym Amylase, khaû naêng nhieãm khuaån taêng leân vaø hieäu suaát toång thu hoài giaûm. Trong 1 thí nghieäm veà aûnh höôûng cuûa vieäc keùo daøi thôøi gian ñöôøng hoùa ñeán hoaït tính men cuûa Amylase cuûa chuûng Asp.orysee nhö sau: Sau moãi giai ñoaïn ñöôøng hoùa, xaùc ñònh hoaït tính cuûa men Amylase( chuû yeáu laø AC vaø DC) nhö sau: Thôøi gian ñöôøng hoùa ñôn vò AC ñôn vò DC 0 102.0 100% 114.0 100% 5 100.1 106.0 30 98.3 90.3 60 90.2 88.4% 52.8 51.7% Nhö vaäy laø thôøi gian ñöôøng hoùa toát nhaát laø 5 phuùt, cho hieäu suaát toång thu hoài taêng 37lit coàn/taán tinh boät so vôùi ñöôøng hoùa ôû 60 phuùt. ÔÛ caùc nhaø maùy saûn xuaát röôïu coù thieát bò laøm nguoäi chaân khoâng ñeàu thöïc hieän thôøi gian ñöôøng hoùa laø 5 phuùt. Neáu laøm nguoäi baèng phöông phaùp trao ñoåi nhieät beà maët thoâng thöôøng thôøi gian ñöôøng hoùa laø 15 - 30 phuùt. PHAÀN 4: ÖÙNG DUÏNG CUÛA VSV TRONG COÂNG ÑOAÏN LEÂN MEN DÒCH ÑÖÔØNG A-NAÁM MEN Nấm men là tác nhân cơ bản gây ra quá trình lên men ethanol. Thường sử dụng nấm men thuộc họ Saccharomycetaceac, loài S.cerevisiae I-SACCHAROMYCES CEREVISIAE 1-Ñaëc ñieåm - Hình dạng: tế bào hình bầu dục nếu ở môi trường giàu chất dinh dưỡng. Trong điều kiện yếm khí, tế bào có hình tròn; ngược lại, trong điều kiện hiếu khí tế bào kéo dài hơn. - Kích thước thay đổi trong khoảng 2,5 - 10 µm × 4,5 -21µm. - Chu kì sống: Các tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) có thể tiếp hợp với nhau để tạo thành tế bào dinh dưỡng lưỡng bội (2n). Sau quá trình giảm phân sẽ sinh ra các bào tử túi (thường là 4 bào tử túi). Bình thường khi không có sinh sản hữu tính, chúng vẫn liên tục nảy chồi để sinh sôi nảy nở. - Saccharomyces cerevisiae thuộc loại nấm men lên men nổi. Trong quá trình lên men, tế bào của chúng nổi lơ lửng trong dung dịch lên men và tập trung trên bề mặt. Nhờ đó tăng diện tích tiếp xúc với cơ chất, quá trình lên men xảy ra nhanh chóng và mạnh mẽ. -Lên men được nhiều loại đường (glucose, fructose, saccharose, maltose, 1/3 rafinose, các dextrin …)v à nhiều loại nguyên liệu khác nhau ( như gạo, ngô, khoai, sắn… với lượng đường trong dung dịch là 12 – 14%, có khi là 16 – 18%). - Có khả năng lên men ở nhiệt độ cao ( 36 – 400C), chịu được độ acid. - Chịu được thuốc sát trùng Na2SiF6 nồng độ 0,02 – 0,025% nên có thể lên men trong điều kiện bắt buộc phải dùng thuốc sát trùng. - Sinh sản theo kiểu nảy chồi, có khả năng sinh bào tử, sống kị khí không bắt buộc. 2-Moät soá chuûng Saccharomyces cerevisiae thöôøng duøng: - Chủng XII phaân laäp từ naám men bánh mì 1902. Tế bào hình tròn hoaëc oval, coù kích thöôùc lôùn vaø maäp hôn caùc chuûng khaùc (5-8(). Chu kyø sinh tröôûng cuûa 1 theá heä laø 1giôø 39 phuùt.Sinh sản bằng cách nảy chồi. Ở điều kiện khắc nghiệt, ở nhiệt độ 250C chỉ trong vòng một ngày cụ thể tạo thành bào tử (1 – 4 bào tử). Trong tế bào già thường chứa nhiều glycogen và metaxromatin. Nấm men chủng XII sinh sản mạnh trong 12 giờ đầu nuôi cấy sau đó chậm dần và lên men rất mạnh. Chúng có khả năng lên men rất mạnh glucose, matose, fructose, galactose, saccharose, maltose và 1/3 rafinose. Chuûng naøy khoâng leân men ñöôïc caùc ñöôøng lactose, kxilose, arabinose, inulin. Noàng ñoä röôïu trong dòch leân men coù theå ñaït tôùi 13% V. Theo giaùo sö Manxep thì chuûng XII ñöôïc xem laø toát nhaát khi leân men dòch ñöôøng töø tinh boät ôû caùc nhaø maùy röôïu cuûa Lieân Xoâ cuõ. -Chuûng XV coù tính chaát töông töï chuûng XII vaø hay duøng ñeå leân men dòch ñöôøng hoãn hôïp goàm tinh boät vaø ræ ñöôøng - Chủng số II (do Linder tách ra từ 1889 trong nhà máy rượu). Đây là chủng đầu tiên được ứng dụng trong sản xuất rượu và các ngành sản xuất khác. Tế bào dài, hình đứng, lớn và sinh sản bằng cách nảy chồi. Ở 25oC trong 30 giờ nuôi cấy có thể tạo thành bào tử (thường trong tế bào có 3 bào tử); lên men được các loại đường như chủng XII nhưng khả năng sinh sản kém hơn. - Chủng M.10 (được tách từ năm1916) dùng để sản xuất các loại nguyên liệu chứa đường. Tế bào chủng này có hình tròn hay hình oval với kích thước 5-6 x 6-7µ; có khả năng lên men các loại đường như 2 chủng trên.Chúng có khả năng sản sinh rất nhanh và lên men được ở nồng độ rất cao. Bền vững với acid sulfuric và tồn tại được ở pH =2. - Chủng B, cũng như M.10, được sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu từ mật rỉ. Tế bào hình trụ, hình oval với kích thước tế bào 3,9-9,7 x 39-8,9 (; có khả năng lên men rượu rất tốt, đồng thời có đặc tính lên men bánh mì cao. - Chủng M (thu được vào 1905) do Ghenebec phân lập từ hỗn hợp của 4 chủng nấm men nổi. Chủng được dùng để lên men trong môi trường chứa các hỗn hợp đường khác nhau. Chúng rất bền và ổn định, thích nghi được những điều kiện không bình thường trong thực tế sản xuất. - Chủng MTB (Ở nước ta trước 1975, các nhà máy rượu chỉ dùng chủng này do nhà máy rượu Hà Nội cung cấp). Chủng này có khả năng sinh sản nhanh và cho hiệu suất lên men tương đối tốt. - Chuûng IA : do Iacubopski phaân laäp töø thuøng leân men töø ræ ñöôøng. Leân men ñöôïc caùc ñöôøng glucose, maltose, fructose, saccharose, galactose vaø 1/3 rafinose. Chuûng IA khoâng coù khaû naêng leân men dextrin vaø lactose cuõng nhö ñöôøng 5 C. 3-Nghieân cöùu so saùnh khaû naêng leân men cuûa chuûng 12 vôùi chuûng MTB vaø 1 vaøi chuûng khaùc hieän coù ôû nöôùc ta. Traïng thaùi sinh lyù cuûa naám men sau 20 giôø nuoâi caáy: Chuûng naám men  Teá baøo cheát, %  Teá baøo naûy choài, %  Soá teá baøo trong 1ml x 106   MTB T 33 XII  3,6 4,8 6,7 2,5  12,0 8,5 10,3 14,9  164,2 160,8 140,2 103,7   Nghieân cöùu cho bieát, sau 20 giôø nuoâi caáy löôïng teá baøo trong 1 ml vaøo khoûang 100- 160 trieäu/ml. Trong ñoù chuûng MTB vaø T nhieàu hôn chuûng 33 vaø XII töø 1,1-1,6 laàn. Xeùt veà hình thaùi thì caû 4 chuûng ñeàu coù hình oval nhöng chuûng XII coù kích thöôùc lôùn vaø maäp hôn so vôùi caùc chuûng khaùc. Soá löôïng teá baøo trong 1 ml laø moät trong nhöõng chæ tieâu quan troïng ñeå ñaùnh giaù chaát löôïng men gioáng. Tuy nhieân, khi duøng caùc chuûng men khaùc nhau ñeå leân men dòch ñöôøng, chuùng ta khoâng neân chæ döøng laïi ôû soá teá baø trong 1 ml maø phaûi caên cöù theâm vaøo caùc chæ soá cuûa dòch leân men cuoái cuøng nhö ñoä coàn, haøm löôïng ñöôøng vaø tinh boät soùt trong giaám chín… Ñeå xeùt xem chuûng naøo coù khaû naêng cho hieäu suaát leân men cao, ngöôøi ta tieán haønh thí nghieäm tieáp baèng caùch nuoâi caáy 4 chuûng men gioáng trong nhöõng ñieàu kieän nhö nhau, sau 20 giôø ñem laøm men gioáng vôùi soá löôïng 10% so vôùi dòch ñöôøng leân men. Sau 72 giôø leân men, ngöôøi ta ñem phaân tích caùc chæ tieâu cuûa giaám chín vaø tính löôïng CO2 thoaùt ra trong quaù trình leân men. Keát quaû trung bình cuûa ñôït thí nghieäm cuûa 1 soá chuûng naám men Caùc chæ tieâu  Chuûng naám men    XII  MTB  T  33   Noàng ñoä ñöôøng hoùa , %khoái löôïng Chaát khöû tính theo Glucose, g/l Ñoä chua, g H2SO4/l pH dòch ñöôøng hoùa Löôïng CO2 thoaùt ra sau 72 giôø, g/200ml Ñoä chua giaám chín, g H2SO4/l pH giaám chín Chaát khöû soùt trong giaám chín, g/l Noàng ñoä röôïu, %V  14,0 30,3 1,06 4,95 12,69 1,51 4,66 9,21 7,12  14,0 30,3 1,06 4,95 11,85 1,67 4,50 10,6 6.73  14,0 30,3 1,06 4,95 11,21 1,85 4,55 11,27 6,45  14,0 30,3 1,06 4,95 10,89 1,92 4,42 11,55 6.30   Theo doõi quaù trình leân men vaø caên cöù vaøo soá lieäu thu ñöôïc, ta thaáy chuûng XII cho hieäu suaát keân men cao hôn so vôùi caùc chuûng ñem so saùnh. Trong saûn xuaát coàn etylic, muoán ñaït hieäu suaát cao tröôùc tieân phaûi tuyeån choïn chuûng naám men coù hoaït löïc leân men maïnh. Trong ñieàu kieän nöôùc ta hieän nay, ta coù theå duøng chuûng XII ñeå leân men dòch ñöôøng tinh boät vaø chuûng IA ñeå leân men ræ ñöôøng. Caàn chuù yù : moät chuûng toát ôû nôi naøy chöa haún thích nghi ngay ôû moät nôi khaùc vì vaäy tröôùc khi aùp duïng caàn nghieân cöùu kó ñaëc tính sinh lí vaø khaû naêng sinh saûn cuõng nhö saûn löôïng saûn phaåm taïo thaønh. Trong saûn xuaát coù nhöõng tröôøng hôïp ngaãu nhieân ngöôøi ta tìm ñöôïc chuûng toât hôn baèng caùch phaân laäp töø caùc thuøng leân men. Chuûng XII vaø IA nhaän ñöôïc baèng con ñöôøng keå treân. 4- Điều kiện lên men: Cơ chất (nguồn C): tinh bột, rỉ đường Nồng độ đường: 10 – 16% pH: 4 – 5 Nhiệt độ: 28 – 300C Nhu cầu về oxy: Giai đoạn đầu của lên men cần cung cấp một lượng nhỏ O2 vì đây là thành phần cần thiết trong sự sinh tổng hợp các chất béo chưa bão hòa và lipid. Áp suất của O2 vào khoảng 0,05 – 0,10 mmHg. Đến giai đoạn sau không cung cấp oxy nữa. Nhu cầu dinh dưỡng: + Cần một lượng tương đối các chất dinh dưỡng dùng trong sự tổng hợp ethanol, gồm C, H, O, N. Nó tỉ lệ thuận với thành phần chính của tế bào nấm men.