Vi nhân giống và bảo tồn cây vani (vanilla) trong phòng thí nghiệm

-  PAGE 3 - ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KYÕ THUAÄT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  MÔN CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỀ TÀI: VI NHÂN GIỐNG VÀ BẢO TỒN CÂY VANI (VANILLA) TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM TP.HCM, tháng 6/2011 VI NHÂN GIỐNG VÀ BẢO TỒN CÂY VANI (VANILLA) TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM MỤC LỤC 1. GIỚI THIỆU 04 2. NGUYÊN VẬT LIỆU 07 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 09 4. CHÚ Ý 16 5. SO SÁNH VỚI PHƯƠNG PHÁP KHÁC 17 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 19 TÓM TẮT Cây Vani, nguồn gốc sản xuất hương vani tự nhiên, đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế của rất nhiều nước châu Mĩ. Tuy là loài cây bản địa ở Nam Mĩ, nhưng nguồn gen tự nhiên của giống này đang bị đe dọa bởi nạn phá rừng cũng như khai thác quá mức - lí do của sự biến mất dần của nhiều giống cây trồng và động vật hoang dã khác. Ngày nay, người ta có thể sản xuất hương vani bằng tổng hợp hóa học, nhưng sự đa dạng về gen của loài Vanilla đang thu hẹp dần nên vi nhân giống và bảo tồn giống cây này là điều tối quan trọng. Hoa của cây Vanilla Planifolia GIỚI THIỆU Vanilla planifolia thuộc họ lan, thân dây leo, là giống cây trồng quan trọng trong công nghiệp sản xuất hương vị và cũng là giống mang tính thương mại nhất thuộc họ lan. Nó được ứng dụng rộng rãi vào thực phẩm trong việc tạo mùi kem, sôcôla, thức uống, bánh ngọt… trong công nghệ sản xuất nước hoa, hay trong dược phẩm để ức chế vị đắng của thuốc… Cây Vanilla Planifolia là loài dây leo Quả Vanilla Planifolia Đây là loại cây được trồng khắp các nước, đặc biệt là vùng nhiệt đới. Tuy nhiên nguồn gốc xuất phát của nó là ở Nam Mĩ – nơi mà nguồn gen của nhiều loài động thực vật đang bị đe dọa tuyệt chủng. Vì giống cây này đang bị tàn phá nơi sinh sống nghiêm trọng mà người ta bắt buộc phải tìm cách để nhân giống, bảo tồn và làm đa dạng lại nguồn gen. Không chỉ bị đe dọa bởi nạn phá rừng mà Vanilla planifolia còn đối mặt với rất nhiều loại bệnh khác do các loại nấm gây ra như Phytophthora meadii, Fusarium oxysporum, Calospora vanillae… Vi nhân giống chắc chắn sẽ giúp phát triển một số lượng lớn cây sạch bệnh, cùng với việc bảo tồn giống cây trước khi nó tuyệt chủng là một điều cần thiết và cũng là một cách lý tưởng để có thể tìm ra nhiều phương pháp ex-situ. Phân bố của cây Vanilla Planifolia trên thế giới, tập trung nhiều nhất là ở Madagasca NGUYÊN VẬT LIỆU Vật liệu nuôi cấy - Đoạn thân mang chồi - Đỉnh sinh trưởng Dụng cụ - Erlen 500 ml bằng Borosilicate (hệ số giãn nở thấp) - 2 bình thủy tinh 250 ml - Ống môi trường 22cm x 3.5cm - Erlen 250 ml Chất gel - 7.0 g/l Bacteriological grade agar Môi trường - Dung dịch gồm khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, amino acids và chất điều hòa sinh trưởng. - Đường Sucrose 20–30 g/l. - Điều chỉnh pH về 5.8, trong thời gian đó nấu chảy agar trong lò viba rồi trộn agar vào hỗn hợp. - Khử trùng môi trường ở 121°C ở 1 atm trong 20 phút. Murashige and Skoog (MS) PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN : Gieo hạt in vitro: - Lấy một số quả vanilla trưởng thành từ 4-7 tháng. Khử trùng bề mặt mẫu trong ethanol 95% trong tủ cấy vô trùng. - Tách vỏ bên ngoài để lấy hạt giống và chuyển chúng vào môi trường nuôi cấy đã được vô trùng. - Môi trường rắn hay lỏng đều có thể sử dụng cho sự nảy mầm và nuôi cấy.Môi trường MS rắn có bổ sung 0.5mg/l kinetin, 20g/l sucrose và được đặt trên máy lắc với tốc độ 200rpm. - Cấy những hạt đã nảy mầm vào môi trường nhân giống, môi trường MS có bổ sung 1mg/l BA và 0.5mg/l IBA. Sự nảy mầm của các hạt tự nhiên và hột nhân tạo Vi nhân giống: - Lấy những đoạn chồi ngọn hay đốt thân từ các cây V.planifolia, V.aphylla, V.pilifera, V. andamanica. - Rửa và làm sạch các mẫu với 100ml/l teepol và khử trùng bề mặt với 1g/l HgCl2 từ 5-7 phút trong tủ cấy vô trùng. - Sau đó rửa lại với nước nhiều lần để loại bỏ hoàn toàn HgCl2. Sau đó tạo vết thương trước khi cấy vào môi trường MS có 1mg/l BA và 0.5mg/l IBA. - Cấy tế bào vào môi trường mới trong vòng 20 ngày. Các tế bào được nuôi cấy ở 222 oC với thời gian chiếu sáng 14h với tốc độ chiếu sáng 35µmol/ m2/s được cung cấp của nguồng sáng là ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang. - Sau 5-7 tháng, mỗi mô cấy sẽ tạo ra rất nhiều chồi con có thể gấp 12 lần ban đầu. Cảm ứng tạo chồi in vitro và sự phát triển sau đó Tạo rễ in vitro: Mỗi đốt thân hay chồi nuôi cấy có thể tạo ra rất nhiều rễ - Cảm ứng tạo rễ: cấy những đoạn chồi có chiều dài khoảng 2 cm vào môi trường MS cơ bản. Trong vòng 3 ngày ta sẽ thấy được sự hình thành rễ. - Để một khoảng thời gian để những đoạn chồi đã tạo rễ trở nên cứng cáp sau đó mới chuyển ra ngoài vườn ươm hay tiếp tục làm nguyên liệu cho chu trình nhân giống mới. - Nếu muốn tiến hành nhân giống tiếp ta tiếp tục cấy những đoạn chồi có 1 đốt thân hoặc cắt những đoạn có nhiều đốt thân thành những đoạn nhỏ và tiếp tục nhân giống. Cảm ứng tạo mô sẹo: - Nuối cấy mô, sau đó cắt các nguyên liệu nuôi cấy để chuẩn bọ cho quá trình cảm ứng tạo sẹo. - Cấy các mô vào môi trường MS có bổ sung 1mg/l BA và 0,5mg/l NAA. - Ban đầu giữ cho mô cấy ở trong tối từ 2-5 ngày để cảm ứng tạo sẹo. - Sau đó cấy các mô sẹo hình thành vào môi trường mới trong thời gian 20 ngày. Sự cảm ứng tạo rễ Tái sinh cây - Cấy các mô sẹo mới hình thành vào môi trường MS có chứa 1mg/l BA và 0,5mg/l IBA.Nuôi cấy cấp 2 trong mối trường MS trong vòng 20 ngày. - Mô sẹo sẽ phân hóa thành Protocorm, chồi có rễ trong khoảng 3-6 tháng. - Tách rời và nuôi cấy các chồi phát triển tốt và có tạo rễ cho đến khi cứng cáp rồi đem ra trồng ngoài vườn hay sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình nhân giống kế tiếp. Các giai đoạn khác nhau của quá trình tái sinh cây từ mô sẹo Sản xuất hạt nhân tạo: - Treo protocorm hay chồi ngọn (0,5-1 cm) trong hỗn hợp chất cơ bản MS medium chứa 4% (w/v) sodium alginate. - Sử dụng Pasteur pipet hút từng mẫu cây cùng chất cơ bản rồi nhỏ vào 1.036 g / 150ml CaCl2.2H2O - Ngâm các mô cấy vào dung dịch CaCl2.2H2O trong 30-40 phút. Đặt trên máy lắc với vận tốc 100 vòng/phút để hình thành hạt. - Các hạt được khôi phục bằng cách loại bỏ dung dịch CaCl2.2H2O.Sau đó rửa lại 2 lần với nước vô trùng. - Các hạt nhân tạo được sản xuất theo cách này có thể bảo quản được trong 10 tháng trong nước vô trùng ở 222 0C với tỉ lệ nảy mầm 80%. - Cấy các hạt này vào môi trường nhân giống, môi trường MS có bổ sung 1mg/l BA và 0.5 mg/l IBA. Hột nhân tạo Bảo quản phôi Bảo quản trung hạn in vitro nhờ sự sinh trưởng chậm. Nguyên tắc Có nhiều cách khác nhau để kéo dài sự sống của mô và cơ quan thưc vật. Phương pháp tăng trưởng chậm thích hợp cho mọi loại cây trồng được nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng hay chồi ngọn. Có 3 loại tăng trưởng chậm: Nhân giống in vitro với tăng khoảng cách giữa các lần cấy chuyền Giảm tăng trưởng Ngừng tăng trưởng Thực hiện Sự sinh trưởng chậm xảy ra trong môi trường nuôi cấy vanilla bẳng cách giảm nguồn carbon, giảm nồng độ cơ bản của môi trường, bổ sung mannitol, và giảm thiểu sự mất hơi nước chủ yếu để tăng khoảng cách giữa các lần cấy chuyền. Chuyển chồi vanilla in vitro, dài 2 cm,vào môi trường MS cơ bản chứa 15g/l sucrose và mannitol, đặc biệt không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thực vật. Đậy kín chai chứa môi trường bằng nắp poly propylene hoặc parafilm giảm thiểu sự thoát hơi nước nhưng vẫn có thể trao đổi khí và duy trì chúng ở 22±2C, chiếu sáng trong vòng 12h với cường độ ánh sáng là 30 μmol/m2/s. Những chồi này sẽ sinh trưởng rất chậm, có thể bảo quản trong ống nghiệm từ 7 đến 10 năm, mỗi năm cấy chuyền 1 lần vào môi trường mới. Để chồi phát triển bình thường, chuyển cây con vào môi trường MS cơ bản chứa 1.0 mg/l BA và 0.5 mg/l IBA ở 22±2C với cường độ ánh sáng dưới 35 μmol/m2/s. Bảo quản dài hạn bằng Phương pháp đông sâu Nguyên tắc Nguyên liệu: mô chưa phân hóa, phôi soma và tổ chức đỉnh sinh trưởng. Phương pháp có tác dụng làm cho nước trong tế bào bị đông lại, tế bào không có nước để thực hiện các phản ứng sinh hóa. Thực hiện Tiền xử lý và làm khô Cẩn thận chọn những hạt nhỏ,tròn đều, đường kính từ 4-5 mm. Tăng nồng độ từng bước trong môi trường MS: tăng nồng độ sucrose lên 0.1, 0.3, 0.5, 0.7 và 1.0M trong 5 ngày, mỗi ngày ứng với một nồng độ. Làm khô những hạt đã được tiền xử lý trên giấy lọc vô trùng trong đĩa Petri 90mm và sấy khô trên đĩa mỏng từ 1-10h ở nhiệt độ phòng. Xác định thời gian sấy tối ưu bằng cách kiểm tra sự nảy mầm của hạt. Kỹ thuật trữ lạnh Chuyển 10 hạt khô vào mỗi 2.0ml lọ cryo. Làm đông nhanh bẳng cách cho trực tiếp lọ cryo vào dd nitơ lỏng. Mẫu có thể được dự trữ trong dd nitơ lỏng trong vòng 10 năm. Hoá lỏng, rã đông tái tạo thành cây hoàn chỉnh Hoá lỏng mẫu bằng cách nhúng trực tiếp lọ cryo vào nước ở 40C trong vòng 5-10 phút. Trồng những hạt đã được rã đông vào đĩa Petri chứa 25 ml môt trường MS rắn gồm 30 g/l sucrose, 1 mg/l BAP, và 0.5 mg/l IBA, đặt trong tối 7 ngày đầu và sau đó chiếu sáng với cường độ 35 μmol/m2/s để cây mẹ phát triển. Tốc độ hồi phục là 50-70%. Sau 2 tuần, chồi mọc lên từ vỏ hột nhân tạo được cấy chuyền vào môi rường MS cơ bản để giúp cho sự phát triển của chồi và hệ thống rễ và cuối cùng huấn luyện cây và chuyển ra vườn.  Huấn luyện cây và chuyển ra vườn Cây con in vitro với hệ thống rễ phát triển tốt được rửa sạch môi trường bám vào rễ. Dìm chúng trong 0.3% Dithane-M45 trogn vòng 5-10 phút và trồng lại trong tui poly chứa hh đất trong vườn, cát và chất khoáng với tỷ lệ bằng nhau (1:1:1) Giữ độ ẩm từ 70-80%, và cường độ ánh sáng 25-30 μmol/m2/s từ 3-4 tuần để huấn luyện cây. Sau đó chuyển cây ra vườn ươm, sau 1 năm chuyển cây ra vườn. CHÚ Ý Khi làm nóng hạt, quá trình được lặp lại để tránh sự nhiễm khuẩn và cẩn thận để tránh phá huỷ hạt, ảnh hưởng bất lợi đến sự phát triển của hạt. Môi trường đã dùng cần được loại bỏ và hấp khử trùng trước khi bỏ đi. Hầu hết cây mẹ vanilla bị nhiễm 1 hay nhiều loại virus. Do đó, dùng bộ chẩn đoán virus, xét nghiệm miễn dịch enzyme và hoạt động phiên mã ngược để ngăn chăn cây mẹ nhiệm khuẩn. Chắc chắn rằng cây mẹ hoàn toản sạch bệnh. Khi môi trường MS chứa 30 g/l sucrose được dùng bảo quản in vitro, chồi phát triển nhanh và trong vòng 180 ngày xuất hiện rất nhiều chồi, môi trường cạn kiệt chất dinh dưỡng và mất nước. Để hạn chế hiện tượng này, điều chỉnh môi trường nuôi cấy bằng cách giảm nồng độ đường xuồng 10-15 mg/l, một nửa cchất dinh du7õng, và bổ sung 10-15 mg/l mannitol. sự thay đổi này sẽ hạn chế sự sinh trưởng của chồi 2-3 cm trong 360 ngày, và tỷ lệ sống sót thấp nhất là 80%. SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP KHÁC Phương pháp 2: Nhân giống vô tính cây Vani bằng phương pháp nuôi cấy mô của Vũ Ngọc Phượng, Lê Hoàn Hảo, Thái Xuân Du trong phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới. Vật liệu - Giống Vanilla tahitiensis - Mẫu được lấy từ chồi bên cây trưởng thành - Khử trùng bằng hypoclorit canxi 3% trong 15 ph. - Sau đó rửa lại bằng nước vô trùng. Môi trường nuôi cấy - Môi trường nuôi cấy có khoáng đa lượng Vacin & Went 1949 như sau (mg/l): KNO3 52,5, (NH4)2SO4 50,0, KH2PO4 25,0, Ca3(PO4)2. 2H2O 20,0, MgSO4. 7H2O 25,0. - Vi lượng và Fe-EDTA theo môi trường MS (Murashige & Skoog 1962). - Thiamin HCL1mg/l, m-inositol 100mg/l. Nước dừa 10%. pH 5,8. Đường 30gr/l. Agar 7gr/l. - Môi trường tạo chồi có bổ xung chất sinh trưởng và phụ gia hữu cơ là: 6-Benzyn Adenin (BA) 5mg/l. Adenin 15mg/l. Tyrosin 20mg/l - Môi trường tạo cây và ra rễ có bổ xung chất sinh trưởng là: α-Naphthalene Acetic Acid (NAA) 0,5mg/l. Phương pháp thực hiện - Bình cấy chồi được chiếu sáng 2000 lux bằng đèn huỳnh quang. Thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày. Nhiệt độ 28oC3. - Bình cấy cây sử dụng ánh sáng tự nhiên để ngoài hành lang - Cường độ chiếu sáng thay đổi liên tục trong ngày từ 500-7000lux. Nhiệt độ ngày đêm dao động trong khoảng 29oC+2. Kết quả - Cây nuôi cấy 60 ngày đạt chiều dài trên 5cm được ươm trên dớn cọng trong 15 ngày. - Dớn cọng là một loại giá thể trồng lan có độ giữ nước ít, giúp cho bộ rễ khô ráo phù hợp với việc ươm vanilla trong 15 ngày đầu. Trong những ngày này không sử dụng phân bón. - Khi đầu rễ vani bắt đầu nhú lên chứng tỏ sự hồi phục cây vani được chuyển sang bầu có giá thể gồm: phân bò 60%, tro trấu 20%, đất 20%. - Phân bón trong giai đoạn này là NPK 30-10-10 và vi lượng HP-306 Chồi Vani cấy mô TÀI LIỆU THAM KHẢO NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG, LÊ THỊ THỦY TIÊN, Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM, 2002 MINOO DIVAKARAN, K.NIRMAL BABU, Micropropagation and In Vitro Conservation of Vanilla (Vanilla planifolia Andrews), 2009 VŨ NGỌC PHƯỢNG, LÊ HOÀN HẢO, THÁI XUÂN DU, Nhân giống vô tính cây Vani bằng nuôi cấy mô, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới 2007