Vi sinh thực phẩm

SeminarVI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: GVHD: TS. Trịnh Thị Hồng Nhóm thực hiện: Vũ Tuyết Minh Nguyễn Văn San Huỳnh Công Thịnh Nguyễn Hữu Trí Đoàn Nguyễn Khánh Trình NỘI DUNG TRÌNH BÀY KHÁI QUÁT VỀ ĐẬU NÀNH TEMPEH MISO SHOYU KHÁI QUÁT VỀ ĐẬU NÀNH Đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L). Đậu nành là loại cây thân cỏ một năm, hoa tập trung trên những nách lá, kiểu bào nang. Quả đậu nành là loại quả giáp, mỗi quả có 2 - 3 hạt, hạt đậu hình ô van, khác nhau về màu sắc, có vỏ bao bọc. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG CỦA ĐẬU NÀNH Đậu nành là loại thực phẩm giàu protein nhưng lại ít calories, ít chất béo bão hòa và hoàn toàn không có cholesterol. Bảng : Thành phần hóa học của hạt đậu nành (tính theo % chất khô) Phần lớn thực phẩm từ đậu nành đều thuộc loại tiêu hóa dễ dàng. Đậu nành hội đủ thành phần amino acid thiết yếu và hàm lượng cần thiết. Bảng : Thành phần protein trong đậu nành Bảng : Thành phần acid amin trong protein đậu nành Hàm lượng chất khoáng trong đậu nành rất thấp, tổng cộng chỉ chiếm khoảng 4% trọng lượng hạt khô. Bảng : Thành phần khoáng trong đậu nành Bảng : Thành phần hydratcarbon trong đậu nành Vitamin trong hạt đậu nành có hàm lượng thấp và dễ bị mất đi trong quá trình chế biến. Đôi khi qua tiến trình chế biến, thực phẩm được biến đổi theo chiều hướng tốt hơn (như đậu hũ, qua tiến trình làm đông đặc với calcium sulphate, thường làm tăng lượng calcium, hàm lượng sắt). Bảng : Thành phần vitamin trong đậu nành GIÁ TRỊ KINH TẾ CỦA ĐẬU NÀNH Là một cây công nghiệp: Đậu nành chứa hàm lượng dầu cao(16-20%)dùng làm dầu ăn thực vật. Là cây nông sản thực phẩm và làm thức ăn gia súc, phân bón: Đậu nành có hàm lượng protein và lipid do đó sử dụng để chế biến làm thực phẩm giàu đạm trong bữa ăn hàng ngày. Trong chăn nuôi gia súc có thể tận dụng được các loại phụ phẩm của cây đậu nành như thân lá tươi, bột nghiền từ thân lá khô, vỏ quả và hạt lép, khô dầu (hạt đậu nành đã ép lấy dầu) để làm thức ăn gia súc. GIÁ TRỊ KINH TẾ CỦA ĐẬU NÀNH (tt) 3. Là cây trồng tăng vụ và cải tạo, bảo vệ đất. Cây đậu nành có thời gian sinh trưởng ngắn từ 2,5 – 4 tháng, do đó được trồng cả vụ xuân, hè và đông. Do có khả năng cố định đạm, cây đậu nành cũng thường được chọn đưa vào cơ cấu luân canh cải tạo đất trong chu kỳ sản xuất của cây công nghiệp, cây ăn quả dài ngày, cây thức ăn gia súc. MỘT SỐ THỰC PHẨM TỪ ĐẬU NÀNH Các sản phẩm không lên men. Các sản phẩm không lên men từ đậu nành được chế biến bằng cách biến tính đậu nành bằng sinh học, bằng cơ học, hóa học và bằng nhiệt: sữa đậu nành, đậu hũ (hay đậu phụ), tàu hũ… Bột đậu nành được dùng để ăn trực tiếp hoặc để chế biến ra nhiều loại mặt hàng có giá trị khác như: bánh, kẹo… Ngoài ra, đậu nành còn được cho nảy mầm để làm giá đậu nành đây là loại rau tươi có giá trị dinh dưỡng (đạm 15%, chất béo 6%, hydratcarbon 4%, và các muối vô cơ 3,5%). Sữa đậu nành Đậu hũ Tàu hũ Giá MỘT SỐ THỰC PHẨM TỪ ĐẬU NÀNH (tt) 2. Các sản phẩm lên men. Các sản phẩm lên men phổ biến từ đậu nành bao gồm: chao, tương, miso, tempeh, natto, đạm tương… Chao Tương Miso Tempeh Natto VI SINH VẬT SỬ DỤNG VÀ CƠ CHẾ SINH HÓA 1. Vi sinh vật sử dụng: Vi sinh vật dùng trong công nghệ chế biến các sản phẩm lên men từ đậu nành chủ yếu là các loại nấm mốc (Mucor, Rhyzopus, Aspergillus…), vi khuẩn (Bacillus subtilis, B. natto, Lactobacillus…), nấm men… Mucor Lactobacillus Aspergillus oryzae Rhyzopus Zygosaccharomyces rouxii 2. Cơ chế sinh hóa Gồm 2 quá trình sinh hóa quan trọng: Thuỷ phân tinh bột thành đường (glucose, maltose, dextrin). Thuỷ phân protein thành acid amin và peptid. 3. Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc: Độ ẩm của môi trường: 55 - 58% Độ ẩm tương đối của không khí: Từ 80% trở lên đến bão hoà. pH: 5.5 - 6.5 Ảnh hưởng của không khí: các chủng mốc hoàn toàn hiếu khí. Nhiệt độ: 15 - 40סC, tối thích 30 – 32סC Thời gian nuôi cấy: tùy thuộc vào loài nấm mốc: mốc giống từ 60 – 70 giờ, mốc có E. amylase 30 – 36 giờ, protease 36 – 42 giờ. 4. Quy trình nhân giống nấm mốc. Hình : Quy trình nhân giống nấm mốc A.oryzae TEMPEH TEMPEH là gì? Tempeh là một loại thực phẩm cổ truyền của người Indonesia làm từ đậu nành lên men. Tempeh chứa 85% protein, là một loại bánh xốp làm bằng: Đậu nành (bánh kedele) Đậu phộng (bánh ontjom) Dừa (bánh bongkrek) Tempeh là loại thực phẩm: Có giá trị dinh dưỡng cao Dễ tiêu hóa Giàu riboflavin và niacin Tempeh làm theo phương pháp lên men truyền thống có chứa cả vitamin B12. Vitamin B12 được tổng hợp nhờ: Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii Đặc tính hoá học và giá trị dinh dưỡng của tempeh Giá trị dinh dưỡng trong 100g tempeh Nguồn: USDA Nutrient Database for Standard Reference Vi sinh vật sử dụng Tempeh truyền thống là sản phẩm của sự lên men của một nhóm đa dạng các vi sinh vật: Nấm mốc Nấm men Vi khuẩn sinh acid lactic Một số vi khuẩn gram âm khác. Trong đó, Rhizopus oligosporus là loại nấm có ý nghĩa nhất, ngoài ra còn có các loại nấm mốc khác như R.oryzae, R. arrbizus, Mucor spp cũng góp phần làm tăng hương vị và dinh dưỡng cho sản phẩm. Rhizopus oligosporus Rhizopus oryzae Điều kiện sinh trưởng của Rhizopus oligosporus Độ ẩm môi trường: 45 -55 % pH môi trường: 5,0-7,5 Độ ẩm không khí: 85 – 95% Nhiệt độ 27 -30°C, thời gian 24- 48 giờ. Ưu điểm của Tempeh Rhizopus oligosporus có khả năng ức chế sự phát triển của: Aspergillus flavus và A.parasiticus (sinh độc tố aflatoxin B1) Một số vi khuẩn gram (+) bao gồm cả vi khuẩn yếm khí và hiếu khí. Các vi khuẩn sinh acid lactic (Lactobacillus plantarum, L.fermentum) làm tăng độ an toàn cho sản phẩm lên men. Các vi khuẩn này đặc biệt quan trọng trong 2 giai đoạn của quá trình lên men tempeh đậu nành là: Giai đoạn ngâm đậu và giai đoạn lên men Do sự phát triển của mốc và tác dụng của các enzym làm các chất hòa tan tăng từ 13 đến 28%. Lên men sẽ xảy ra quá trình thủy phân các thành phần -glucozid cũng như 30% triglycerid, làm giải phóng ra loại acid béo chủ yếu là acid linoleic (2,5g/100g) Sau khi lên men từ 20 - 24 giờ: Lượng lipid trong tempeh vẫn gần bằng lượng lipid trong đậu nành, tức là khoảng 20 - 26% trọng lượng khô. Lượng chứa protein tăng lên và đạt đến 50 - 56% trọng lượng khô Độ pH tăng từ 5 lên đến 7,6. Lượng xơ tăng từ 3,7% ở đậu nành đã tách vỏ đến 5,85% ở tempeh. 40% acid linolenic bị mốc sử dụng Niacin, riboflavin, pantothenic acid và vitamin B6 của đậu nành tăng Lượng tanin giảm nhẹ. Những biến đổi hoá học trong sản xuất tempeh Sử dụng Tempeh Do sự phát triển của tơ mốc, các hạt đậu liên kết với nhau thành bánh. Bánh này có hương vị thơm ngon, được cắt thành những lát mỏng, ngâm trong nước muối và rán trong dầu dừa hoặc dùng để nấu súp. Bảo quản Tempeh Nếu không sử dụng ngay phải có các biện pháp bảo quản, nếu không do sự hoạt động của các enzym chuyển hóa tạo NH3 sẽ làm cho sản phẩm có mùi khó chịu. Có thể kéo dài thời gian bảo quản bằng nhiều cách khác nhau: Bảo quản đơn giản nhất là cắt tempeh thành từng lát rồi phơi khô dưới ánh sáng mặt trời. Bảo quản thích hợp nhất là: làm mất hoạt tính mốc và enzym bằng cách làm tái tempeh, sau đó làm lạnh. Bảo quản ở – 29°C, bằng cách này có thể giữ được 10 tuần mà chất lượng tempeh vẫn tốt. Quy trình sản xuất tempeh Đậu nành 1. Ngâm nước (8-22 giờ): Bổ sung 0,5-1% a.acetic hay acid lactic. Xảy ra qúa trình lên men lactic → pH = 4.3-5.3 2. Luộc đậu : trong 45-60 phút Làm chín đậu. Phá chất gây ức chế trypsin. Quy trình chế biến Tempeh. 3. Ủ với bào tử nấm: Ragi (Tempeh starter) : Rhizopus, Mucor. Cho vào hỗn hợp 1 ít dấm ăn  trộn → rắc Ragi → trộn đều 4. Đóng gói kín: Chia thành nhiều phần nhỏ, bao gói bằng lá chuối . Hiện nay dùng túi nhựa bên ngoài có đục các lỗ nhỏ (0.6mm) các lỗ cách nhau 1cm để nấm mốc phát triển qua lỗ. 5. Ủ Nhiệt độ : 30-38oC trong 24 – 48 giờ < 30oC thời gian lên men là 2-3 ngày. Nếu ủ quá lâu thì sản phẩm có mùi amoniac do sự phân hủy mạnh protein Đây là giai đoạn tạo: Hệ sợi nấm trắng  liên kết hỗn hợp thành bánh rắn chắc Các enzyme . Các Vitamin như: B2, B3, B12… Rhizopus oligosporus không đòi hỏi nhiều không khí như nhiều loại mốc khác, trong thực tế, nhiều không khí quá có thể gây ra sự tạo thành bào tử, điều này không thích hợp cho sản xuất tempeh. Đặc biệt là trong giai đoạn ủ, có vi khuẩn Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii tổng hợp vitamin B12. Quá trình lên men kết thúc khi thu được bánh dạng rắn, chắc có thể cắt thành lát mỏng.  Một số dạng tempeh Tempe Gembus Indonesia Quy trình sản xuất sử dụng giống Rhizopus oryzae, R. ologosporus, R. arrhizus. Tempe benguk Indonesia Tên chung: bánh đậu lên men rắn. Tên địa phương Indonesia: Tempeh benguk Nguyên liệu: đậu nành Velvet 99.9%, giống ragi 0.1% (R oligosporus, R.oryzae, R.arrbizus). Tempe Kedelai Indonesia Tên chung: đậu nành lên men Tên địa phương của Indonesia: Tempeh kedelai Nguyên liệu: đậu nành 60-100%, một trong những nguyên liệu (khô dừa 10 -20%, khoai mì 10 - 30%, bột khoai mì 10 - 30%, bột bắp 10 - 30%, đu đủ xanh 10 - 40%), phụ gia 0-4%, giống ragi 0.1% (Rhizopus oligosporus, Rhizopus sp., R. oryzae). Dage Tên chung: bánh dừa lên men Tên điạ phương: Dage( Indonesia) Nguyên liệu: bánh dưà tách dầu 99%, giống vi sinh vật Rhyzopus sp 1% Oncom hitam Tên chung: bánh đậu phộng lên men màu đen Tên điạ phương : Oncom hitam ( Indonesia) Nguyên liệu: bánh dưà đậu phộng 40-90%, bột khoai mì 10%, bánh dầu dừa 40-60%, Tahu 50%, giống vi sinh vật 0.1% (Rhyzopus sp, Mucor sp). Tempe Kecipir Indonesia Tempe Lamtoro Indonesia Tempe Koro Pedang Indonesia Oncom Merah Bogor Tempeh Malaysia Tempeh Singapore Tempeh Vietnam Một số cải tiến Đậu nành đã hấp chín và cấy giống đem bảo quản trong tủ lạnh ở 5– 6°C hoặc để đông lạnh (-10°C), khi nào dùng mới đem ra lên men. Đối với đậu đỗ trong tủ lạnh, khi lên men chỉ cần 21 – 22 giờ nhưng đối với đậu để lạnh đông thì cần 36 - 38 giờ. Phương pháp này có lợi rõ rệt vì nó cho phép chuẩn bị một lượng lớn rồi bảo quản để lên men dần theo yêu cầu. Chế biến tempeh theo kiểu công nghiệp hay bán công nghiệp cũng gồm các bước như kiểu lên men truyền thống. Các phương pháp mới này không những đảm bảo sản phẩm có chất lượng dinh dưỡng cao mà còn loại bỏ được các chất độc hại các chất ức chế có trong đậu nành. Các nhà khoa học Mỹ đã ứng dụng cách chế biến tempeh của Indonesia vào việc chế biến ngũ cốc và sắn. Bột mì được lên men bằng nấm mốc Rhizopus oligosporus ở nhiệt độ 31°C trong 20 giờ, có thể tạo thành loại sản phẩm có lượng chứa protein cao hơn ban đầu từ 6 - 7 lần, lượng chứa riboflavin cũng cao hơn 5 lần và lượng chứa niacin cao hơn 2 lần. Rhizopus oligosporus tạo ra ít amylase, do đó bột mì không bị thủy phân và không xảy ra quá trình lên men rượu. Tempeh MISO Miso, sản phẩm đậu nành lên men, là món ăn truyền thống của Nhật Bản nhưng có nguồn gốc lâu đời từ Trung Quốc. Ở Nhật Bản, miso được biết đến vào thế kỷ thứ 7 bởi các nhà sư đạo Phật. Miso được làm từ gạo, lúa mạch và/hoặc đậu nành lên men cùng với muối và koji. Ở đây, thuật ngữ “koji” chính là ngũ cốc (chủ yếu là gạo, hoặc lúa mạch) hoặc đậu nành được lên men bởi nấm mốc Aspergillus oryzae. Sản phẩm lên men sau cùng là một loại sốt đặc sánh dùng để làm tương, nước sốt; để muối rau cải hay thịt các loại; hoặc nấu chung với nước dùng để tạo ra món (súp)... Phân loại MISO Thành phần : gạo trắng, lúa mạch hoặc đậu nành Chứa hàm lượng prôtein cao nhất trong các loại miso Màu sắc : từ đỏ đến nâu Thời gian : từ 1 đến 3 năm Thành phần : sử dụng koji gạo (khoảng 60 %) và ít đậu nành hơn. Chứa hàm lượng carbohydrate cao nhất nên có vị ngọt nhất. Thời gian lên men nhanh, chỉ trong vài tuần. Có hạn sử dụng ngắn(1-2 tuần ở nhiệt độ phòng, 2 tháng ở điều kiện lạnh) Miso đỏ Thành phần : lúa mạch, đậu nành và koji lúa mạch Có màu rất sậm và vị đậm đà Thời gian : từ 1 đến 3 năm Thành phần : chỉ làm từ đậu nành Chứa hàm lượng carbohydrate thấp nên thời gian lên men rất dài, ít nhất là một năm. Miso trắng Miso lúa mạch Miso đậu nành ĐẶC TÍNH HÓA HỌC VÀ GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG Tuỳ vào nguyên liệu sử dụng mà giá trị dinh dưỡng của mỗi loại miso khác nhau: ở miso đậu nành, chất béo cao hơn miso gạo và lúa mạch nhưng ngược lại lượng đường khử lại thấp hơn nhiều. Bảng : Thành phần (%) của một số loại miso Vi sinh vật sử dụng trong sản xuất MISO Gồm các loại : Nấm mốc Aspergillus oryzae ,nấm men Zygosaccharomyces rouxii, Torulopsis, Pediococcus halophilus và Streptococcus faecalis . Ý nghĩa nhất trong sản xuất miso là Aspergillus oryzae.Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc Aspergillus oryzae: Độ ẩm 45-55%, pH môi trường 5,5–6,5, độ ẩm không khí 85-95%, nhiệt độ nuôi 27-30°C, thời gian 30 – 36 giờ. Zygosaccharomyces rouxii Aspergillus oryzae Pediococcus halophilus Streptococcus faecalis QUY TRÌNH SẢN XUẤT MISO Có nhiều phương pháp khác nhau để sản xuất các loại miso, nhưng những điểm cơ bản của qui trình sản xuất là giống nhau, gồm các bước: Làm sạch và nấu đậu nành. Chuẩn bị koji. Lên men hỗn hợp đậu nành, koji, muối và nấm men trong điều kiện yếm khí. Trộn và đóng gói sản phẩm. Chuẩn bị Koji Koji được làm từ gạo tấm, ngâm trong nước lạnh (khoảng 15°C) qua đêm cho đến khi độ ẩm khoảng 35%. Loại bỏ nước thừa. Nấu ở áp lực thường trong 40 - 60 phút làm nguội đến 35°C. Cấy giống với tỷ lệ 0,1% (dùng chủng Asp. oryzae). . Để mốc sinh trưởng tốt, độ ẩm được duy trì khoảng 90%, phải thông khí nhiều để cung cấp đầy đủ O2 và loại CO2. Trong khoảng 40 - 48 giờ, gạo được phủ hoàn toàn bằng những sợi tơ trắng (giai đoạn này chưa có sự hình thành bào tử). Kết thúc giai đoạn vào lúc koji còn trắng, lúc này koji có mùi dễ chịu, vị ngọt, không có mùi mốc. XỬ LÝ ĐẬU NÀNH Loại đậu nành được dùng nhiều nhất là loại có màu vàng sáng, vỏ hạt mỏng và mịn, rốn hạt màu vàng nhạt hoặc trắng, hàm lượng protein cao, hấp thu nước đồng đều và chín nhanh, đậu có kích thước lớn. Hạt được nhặt sạch, rửa, ngâm nước qua đêm, lượng nước hấp thụ khoảng l,2 lần trọng lượng hạt. Đối với miso đỏ, đậu được nấu dưới áp lực 4 - 6 kg/cm2 cho tới khi chúng hoàn toàn mềm có thể dùng ngón tay bóp nhuyễn nhưng đối với miso trắng hoặc vàng, đậu không cần nấu áp lực. Nhiệt độ và thời gian nấu có ảnh hưởng đến màu sắc và hương vị của sản phẩm cuối cùng. LÊN MEN Đậu được trộn với koji gạo, muối và nước (khoảng 10%) có chứa giống để nhận được độ ẩm mong muốn. Người ta cũng có thể dùng giống là miso của lần lên men trước có chứa hỗn hợp nấm men và vi khuẩn bền vững với muối. Chúng có khả năng sinh trưởng dưới những điều kiện yếm khí. Quan trọng nhất là nấm men (Saccharomyces rouxii) và một số chủng vi khuẩn sinh acid lactic (Pediococcus halophilus, Streptococcus faecalis). LÊN MEN (tt) Hỗn hợp sau khi trộn được chuyển sang những thùng làm bằng gỗ hoặc bêtông. Nhiệt độ lên men được tiến hành ở 30-38°C. Thời gian lên men khác nhau đối với các loại miso. Miso vàng nhạt cần ít nhất 1 tháng, miso đỏ cần 3 tháng, loại miso sẫm màu hơn có nồng độ muối cao có thể tiến hành từ 3-12 tháng, loại này có thể bảo quản được lâu, không cần lạnh do có nồng độ muối cao ức chế được các tạp khuẩn. Một số cải tiến trong sản xuất Miso Áp dụng giống thuần khiết Sử dụng nấm mốc thuần khiết để làm koji. Dùng các chủng nấm men và vi khuẩn cấy vào miso trong giai đoạn lên men để rút ngắn thời gian lên men và ngấu của miso, bằng cách này miso cũng có hương vị tốt hơn. Các chủng nấm men và vi khuẩn được dùng nhiều là Saccharomyces rouxii, Torulopsis, Pediococcus halophilus và Streptococcus faecalis với số lượng 103 tế bào/g miso. 2. Áp dụng các thùng nấu và thiết bị nuôi mốc kiểu mới Thùng nấu kiểu gián đoạn: được áp dụng rộng rãi trong các nhà máy làm miso để nấu đậu nành. Thùng nấu kiểu quay tròn có khả năng nâng nhiệt độ đến 120°C. Sau khi nấu, hạ nhiệt bằng cách giảm áp lực bên trong nhờ một bơm chân không. Thùng nấu kiểu liên tục: có băng chuyền bằng thép không gỉ được ứng dụng rộng rãi để nấu gạo hoặc đại mạch. Gạo đã ngâm và gạn nước được trải trên băng chuyền qua hấp trong 20 phút. Thiết bị nuôi mốc: mặc dù có nhiều loại thiết bị nuôi mốc, loại quay tròn được dùng nhiều trong các nhà máy chế biến miso. Trong quá trình nuôi mốc, nhiệt độ và độ ẩm có thể kiểm tra và điều chỉnh một cách tự động. Một số cải tiến trong sản xuất Miso (tt) Sản xuất miso bằng chế phẩm enzym Mặc dù phương pháp sản xuất koji đã được đơn giản đi rất nhiều nhờ vào việc áp dụng các thiết bị nuôi mốc kiểu mới nhưng vẫn cần có thợ máy để điều khiển, mất không ít thời gian và hao hụt đến 10% nguyên liệu do nấm mốc sử dụng trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Dùng enzym thương phẩm để lên men miso đậu nành thay thế enzym được sinh ra trong quá trình làm koji (protease và amylase ). Cho enzyme vào đậu nành đã nấu chín, trộn đều với nước muối và cho lên men, thu được loại miso có hương vị tốt hơn, thời gian lên men giảm và hiệu suất tăng lên. Một số ứng dụng của Miso Sườn nướng sốt miso Lẩu miso Rau cải sốt miso Cà tím nướng miso Súp miso Cá tuyết nướng miso Shoyu Giới thiệu Shoyu (“Sho” là chữ “tương” nghĩa là nước tương, “yu” nghĩa là “dầu”, “dầu ăn”) là thuật ngữ để chỉ nước tương lên men của Nhật. Shoyu bắt đầu xuất hiện trong các thực đơn của Nhật vào khoảng giữa thời kỳ Muromachi (1333-1568) và vào cuối thế kỷ 16, shoyu đã trở nên phổ biến đối với người Nhật. Hàng năm ở Nhật sản xuất l,2 triệu tấn shoyu, chiếm khoảng 20 - 50% thị phần thực phẩm trong các chợ ở Nhật. Có 5 dạng chính của shoyu ở Nhật là koikuchi, usukuchi, tamari, saishikomi và shiro. Trong đó, koikuchi là loại phổ biến nhất, chiếm hơn 80% sản lượng nước tương tại Nhật. 1.Thành phần và giá trị dinh dưỡng Từ lâu đời, shoyu được sử dụng như một loại gia vị trong bữa ăn. Ngoài việc cung cấp một lượng calories, shoyu còn được xem là nguồn giàu niacin (vitamin B3), mangan và protein. Nguồn: USDA Nutrient Database for Standard Reference 2.Vi sinh vật sử dụng Những loại thường gặp nhất là Mucor mucedo, Rhizopus nigricans, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Penicillium protatum, Tricoderma liguorum. Chủng mốc thường được dùng trong sản xuất shoyu là A. oryzae và A. sojae. Trong 65 chủng mốc koji dùng trong sản xuất shoyu thì 80% là A. oryzae và 20% là A. sojae. 3.Phương pháp sản xuất shoyu truyền thống  a.Sơ lược quy trình sản xuất koikuchi- shoyu b.Quá trình vi sinh, sinh hóa diễn ra trong giai đoạn ủ koji Enzyme được tạo ra trong quá trình làm koji Sự phân giải protein, tinh bột và những chất cao phân tử khác đều nhờ vào enzyme được tạo ra trong quá trình làm koji. Hoạt tính enzyme trong koji Khi so sánh với các loại nấm mốc khác, Aspergillus oryzae có hoạt tính peptidase cao nhất. Chúng chứa protease kiềm và acid và tất cả hoạt tính enzyme quan trọng trong sự phân giải các mô thực vật như pectin, tinh bột, cellulose. A. oryzae cũng chứa glutaminase. Định vị enzyme trong mốc koji Một số enzyme của A. oryzae được tìm thấy cả ở nội bào và ngoại bào. Trong môi trường nuôi cấy rắn A. oryzae trong sản xuất shoyu truyền thống, glutaminase có hoạt tính nội bào, trong khi các enzyme khác như protease và -amylase thì hầu như có hoạt tính ngoại bào. Trong môi trường bị nhận chìm, A. oryzae tạo ít glutaminase hơn, và hầu hết đều thải ra ngoài tế bào. Sự nuôi cấy A. oryzae theo phương pháp này làm giảm sự tạo glutaminase, nhưng lại tăng tạo protease. Sự giải phóng enzyme ra ngoài rất quan trọng cho việc thủy giải protein và tinh bột, vì vậy chủng nào có lượng enzyme ngoại bào cao sẽ được ưa chuộng hơn. Nếu không, phải cần những phương pháp để giải phóng enzyme nội bào ra ngoài. Vai trò phân giải protein của enzyme trong Koji c.Những biến đổi hóa học trong quá trình ủ moromi Trong sản xuất, một lượng koji được khuấy trộn với nước muối (22 – 23% muối)  hỗn hợp moromi  lên men kín (6 - 12 tháng). Trong quá trình lên men, nồng độ muối cao và sự thay đổi pH đã tiêu diệt A. oryzae và A. sojae. Cơ chất trong đậu nành và lúa mì được thủy giải bởi hệ enzym như proteinase, amylase và peptidase sinh ra trong quá trình koji trước đó. Suốt giai đoạn đầu của quá trình lên men moromi, Pediococcus halophilus phát triển và sản sinh ra acid lactic, làm giảm pH. Loài Pediococcus halophilus là vi khuẩn chịu mặn và đặc trưng cho sản phẩm shoyu, được xác định như là lactobacillus chính trong hỗn hợp moromi. pH của vật liệu khởi đầu là 6,5 - 7,0; nồng độ muối 16-18%, tạo tính hoạt động trong nước (water activity - WA) là 0,80, đây là điều kiện thích hợp cho P. halophilus. pH ban đầu của hỗn hợp nhanh chóng giảm xuống vì enzyme phân giải protein và tạo thành acid lactic. Khi pH đạt đến 5,5; lactobacilli được thay thế bằng sự phát triển của Zygosaccharomyces rouxii. Đi kèm với sự giảm pH là sự lên men rượu xảy ra mạnh bởi Z.rouxii. Sau 60 ngày, một lượng lớn ethanol được tạo ra bởi tác động của sự thông khí và tăng nhiệt. Kết quả thu được là 2-3% ethanol và nhiều thành phần hương thơm được sản xuất bởi nấm men. d.Tinh chế Bước đầu tiên trong quá trình tinh chế là sự ép hỗn hợp moromi. Chất lọc sau khi ép được khử trùng Pasteur ở 70-80oC để dừng phần lớn các phản ứng vi sinh vật và enzyme. Sức nóng là nguyên nhân hình thành màu nâu và sự đông tụ các chất. Khối đông tụ chủ yếu là protein, chiếm khoảng 10% về thể tích và 0,025-0,05% về trọng trọng của shoyu. e.Chất lượng của shoyu Chất lượng của shoyu được đánh giá dựa trên thành phần hóa học, màu sắc, hương vị và mùi thơm được xác định bằng cảm quan. Nhìn chung, shoyu chất lượng tốt chứa 1,0-l,6% đạm tổng số; 2-5% đường khử; 1-2% acid hữu cơ, 2,0- 2,5% ethanol và 17–19% NaCl. Lượng alcohol có ảnh hưởng quan trọng đến mùi thơm của shoyu lên men. Màu, vị và mùi thơm là 3 tiêu chuẩn quan trọng cho sự đánh giá bằng cảm quan đối với shoyu. 4.Quy trình sản xuất shoyu theo phương pháp công nghiệp 5.Một số cải tiếna.Những nghiên cứu và tiến bộ kỹ thuật trong sản xuất shoyu  Sử dụng bột đậu nành tách dầu thay vì toàn bộ là đậu nguyên. Tăng sự phân giải protein của nguyên liệu thô từ 65 - 90% bằng cách lựa chọn và gây biến tính nấm mốc; xác định các thông số tối ưu: nhiệt độ, pH, chủng giống lactobacilli và nấm men, và các thành phần hóa học. Sử dụng giống thuần chủng lactobacilli và các nấm men. Tự động hóa thiết bị và mở rộng sản xuất. Giảm thời gian cho quá trình nuôi cấy koji từ 72 giờ xuống còn 48 giờ. Giảm giai đoạn lên men của hỗn hợp từ l-3 năm xuống còn 6 tháng. Cải thiện chất lượng và giảm giá thành . b.Sản xuất shoyu bằng hệ phản ứng sinh học (bioreactor) -Tiến trình sản xuất: Phương pháp sử dụng hệ bioreactor khác với phương pháp dân gian ở một số điểm như sau : Enzyme protease được sử dụng liên tục trong nuôi cấy chìm. Sự lên men được thực hiện ở trạng thái lỏng. Giai đoạn lên men ngắn (mất một vài tháng cho sự lên men dân gian nhưng chỉ khoảng 2 ngày cho phương pháp dùng hệ bioreactor). Trong phương pháp dùng hệ bioreactor, dịch lỏng chưa tinh chế trải qua các khâu sau: Sử dụng enzyme glutaminase cố định để gia tăng hàm lượng acid glutamic. Sử dụng Pediococcus halophilus để thực hiện sự lên men lactic. Sử dụng Zygosaccharomyces rouxii thực hiện sự lên men rượu và sử dụng Candida versatilis để tạo các hợp chất phenol như 4 - ethylguaiacol. Sự lên men liên tục: Sự lên men liên tục nhờ những tế bào ổn định của Pediococcus halophilus, Zygosaccharomyces rouxii, Candida versatilis diễn ra trên 100 ngày mà không có bất kỳ vi sinh vật gây hỏng nào. Tổng thời gian tồn tại do lên men acid lactic và alcohol khoảng 30 giờ. Thời gian này ngắn hạn so với giai đoạn lên men dân gian khoảng từ 3-4 tháng để cho ra cùng một hàm lượng acid lactic và ethanol. Số lượng lớn của những tế bào không xác định hiện diện trong chất rắn và chất lỏng ở mỗi tác nhân, tổng số từ 10-100, cao hơn gấp đôi khối moromi. Sự thu hẹp không gian trong phương pháp dùng hệ bioreactor thích hợp với mật độ cao của các tế bào cố định trong chất rắn và những tế bào tự do trong chất lỏng. Những thành phần hóa chất chính của chất lỏng lên men từ hệ bioreactor đã được kiểm tra bao gồm acid lactic, glucose, ethanol và những hợp chất nitrogen. -Đánh giá: Hương vị là một trong những yếu tố quan trọng đối với shoyu. So sánh giữa hai phương pháp cho thấy shoyu làm bằng hệ bioreactor có hương vị yếu hơn so với shoyu dân gian. Sản xuất shoyu bằng hệ bioreactor bao gồm enzyme phân giải những vật liệu thô, lên men với những tế bào cố định. Mọi tiến trình tinh chế khoảng 2 tuần. Thời gian ngắn hơn 6 tháng so với phương pháp dân gian bao gồm chế tạo koji, ủ tương moromi và tinh chế (lọc). c.Kết luận Shoyu được phổ biến ở phương Đông và cả phương Tây được làm bởi sự lên men hỗn hợp đậu nành, bột mì nghiền, nước và muối. Enzyme là chìa khóa để tạo thành shoyu từ đậu nành và bột mì không theo phương pháp hóa học. Trong sản xuất shoyu truyền thống, enzyme được sản xuất bởi mốc koji thường là A. oryzae và/hoặc A. sojae phát triển trên nguyên liệu thô trong quá trình làm koji. Trong cách làm moromi, koji được trộn với muối và nước, enzyme thủy giải protein từ đậu nành thành acid amin và tinh bột từ bột mì thành đường. Đường là cơ chất cho sự lên men. Bằng cách thêm enzyme, sự thủy giải enzym hữu hiệu giúp thời gian làm moromi cũng được giảm mà không làm thay đổi chất lượng của shoyu khi so sánh với shoyu dân gian.