Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm

chọn phương pháp phù hợp. Các phương pháp thông thường dùng nhiều dung môi độc hại cho con người và rất tốn kém. Trong những năm gần đây, người ta sử dụng phương pháp mới như sắc kí, ái lực miễn dịch, sắc kí lỏng hiệu quả nâng cao, và ngày càng được áp dụng rộng rãi để thay thế các phương pháp cũ . Xác định aflatoxin trong thực phẩm bằng các phương pháp sắc kí nhằm định lượng được hàm lượng aflatoxin có trong thực phẩm và chiết tách aflatoxin ra khỏi thực phẩm. Việc xác định aflatoxin có trong thực phẩm nhằm đảm bảo giá trị kinh tế trong sản xuất và bảo vệ sức khỏe cộng đồng nhất là ở nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới thích hợp cho sự phát triển của các loài vi nấm. Việc xác định hàm lượng aflatoxin có trong thực phẩm có ý nghĩa: + Xác định hàm lượng aflatoxin để hạn chế gây độc cho con người. + Loại bỏ bớt chất độc aflatoxin. + Đề ra phương pháp chế biến và bảo quản thực phẩm an toàn. Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.Độc tố nấm mốc trong thực phẩm. Aflatoxin thường có trong các loại hạt có dầu như lạc đậu nành, hạt điều, hạt hướng dương, vừng, kẹo lạc, kẹo hạt điều, lạc muối, lạc ranghay trên các loại hạt ngũ cốc, bột dinh dưỡng, thức ăn gia súc có nguồn gốc từ hạt ngũ cốc 1.1.Nguồn gốc aflatoxin. Aspergillus flavus và aspergillus parasiticus thuộc họ nấm cúc, là loại nấm sản sinh ra aflatoxin trong tự nhiên và trong môi trường nuôi cấy nhân tạo. Đây là loài nấm khá phổ biến, có thể tìm thấy trên khắp địa cầu, đặc biệt là các nước nhiệt đới. Hai loài nấm mốc này có thể phát triển trên nhiều loại cơ chất, các lọai hạt có dầu, thậm chí có trên cả bột cá và thịt giàu protein. Thức ăn chăn nuôi, Nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi là những đối tượng thích hợp nhất cho sự phát triển và sản sinh độc tố. 1.2 Các loài nấm có khả năng sản sinh aflatoxin. - Có hai loài Aspergillus flavus và aspergillus parasiticus sản sinh aflatoxin với các lượng khác nhau tùy thuộc vào chủng nấm, cơ chất, điều kiện khí hậu và môi trường. - Một số loài nấm mốc khác cũng có khả năng sinh aflatoxin với lượng rất ít như loài: Penicillium puberulum Bai, các chủng thuộc aspergillus như aspergillus tamariikita, aspergillus niger tiegh, aspergillus ostiamis wehmen, aspergillus ruper - Tuy nhiên cũng còn nhiều tranh cải vì trong quá trình phát triển, aspergillus flavus thường lẫn với nhiều loài nấm khác, đặc biệt là với penicillium rubrum stoll và khi đó có thể nhầm aflatoxin là do penicillium sản sinh ra . - Trong một số trường hợp khác cũng có nhầm lẫn độc tố sterigmatoxistin và avecsin có cấu tạo hóa học gần giống với aflatoxin 1.3. Điều kiện sản sinh aflatoxin. Khả năng sinh độc tố của các chủng aspergillus flavus và aspergillus parasiticus rất khác nhau. Điều đó phụ thuộc vào các yếu tố như chủng nấm mốc, các cơ chất, các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm của cơ chất và môi trường. 1.3.1. Chủng sinh độc tố . - Aflatoxin được sản sinh từ hai chủng nấm aspergillus flavus và aspergillus parasiticus aspergillus. Ngoài ra còn có chủng penicillium và parasium tiết ra độc tố vi nấm ochratoxin , patulin và fumonisin. - Không phải tất cả các chủng aspergillus flavus được khảo sát đều sản sinh ra aflatoxin, chỉ có 73% có khả năng sản sinh aflatoxin, trong 23% sản sinh aflatoxxin ở mức cao nhất. - Nấm mốc sản sinh ra một loại độc tố vi nấm có tên là aflatoxin B1. Loại độc tố này tích lũy trong cơ thể người và gia súc, là nguồn nguy cơ gây ra ung thư gan. Aflatoxin B1 được tìm thấy hầu hết các chủng thử nghiệm. - Ngoài ra, aflatoxin G1, B2, G2 cũng được tìm thấy ở nhiều chủng, trong đó aflatoxin G2 rất ít gặp và ít nguy hiểm hơn. 1.3.2.Cơ chất và môi trường. - Cơ chất là các hạt có dầu, đặc biệt là hạt lạc và các sản phẩm từ lạc. Lượng độc tố chứa trong lạc cao nhất. Các chủng phân lập từ các hạt khác nhau thường không thấy hoặc rất ít khả năng sinh độc tố. Ngay cả trên cùng một cơ chất, khả năng sản sinh aflatoxin của các chủng aspergillius flavus cũng khác nhau. Nguyên nhân của hiện tường này cũng có thể do một số giống lạc có tính kháng với aspergillius flavus sinh độc tố aflatoxin. Các nhà tạo giống đã dựa vào cơ sở phát hiện trên nhằm tạo ra những giống lạc không bị nhiễm aflatoxin. Đây là hướng nghiên cứu nhiều nhà khoa học sử dụng nhằm loại bỏ aflatoxin theo cách có lợi nhất. - Sự hình thành aflatoxin phụ thuộc vào sinh khối sợi nấm và thời gian phát triển khối lượng sợi nấm càng nhiều thì sản sinh độc tố càng nhiều và ngược lại. Thời gian sản sinh cực đại để sản sinh aflatoxin thường từ ngày thứ sáu đến ngày thứ bảy sau đó giảm đi. Lí do của sự giảm lượng aflatoxin trong những ngày tiếo theo là do quá trình tự phân giải của chính bản thân nấm mốc. - Nhiệt độ thích hợp nhất để sản sinh aflatoxin của các chủng nấm mốc là từ 25-28oc. Nếu nuôi cấy aspergillius flavus ở 45oc thì khả năng sản sinh aflatoxin sẽ bị ức chế. - Hàm lượng trong cơ thể đóng vài trò quan trọng trong quá trình hình thành aflatoxin. Ở lạc nhân có lượng nước từ 15-30%. Sự hình thành aflatoxin xuất hiện sau 2 ngày, trên gạo cần lượng nước là 24-26% và ở ngô là 19-24%. Như vậy có thể nói sự sản sinh aflatoxin diễn ra rất nhanh. Đặc biệt là sau thu hoạch. Cơ chất có hàm lượng nước khá cao, thời gian làm khô kéo dài là nguyên nhân dẫn đến nhiễm aflatoxin. 1.4.Cấu tạo và tính chất vật lí, hóa học của aflatoxin. Các aflatoxin B1, B2, G1, G2 đã được nhiều phòng nghiên cứu xác định cấu tạo hóa học. Thoạt đầu các nhà hóa học đã xác định được hai aflatoxin có công thức là C17H12O6 và C17H12O7 với trọng lượng phân tử tương ứng 321 và 328. Hiện nay được biết là aflatoxin B1, G1. Trong cấu trúc phân tử có nhóm lacton và metoxyl, không có nhóm hidroxyl tự do . Aflatoxin B1 có màu huỳnh quang xanh da trời, aflatoxin G1 có màu huỳnh quang xanh lá cây. Aflatoxin G1 có chứa hai vòng lacton, aflatoxin B1có chứa 1 vòng lacton. Sau đó, hai aflatoxin B1, G2 cũng được phát hiện. Chúng có công thức hóa học hoàn toàn giống aflatoxin B1, G1, chỉ khác là nối đôi trong vòng hidrofuran đã bị khử. Năm 1966, Dutton và Heathcote đã phát hiện thấy trong môi trường nuôi cấy có hai dẫn xuất hydroxi-2 của aflatoxin B2 và aflatoxin G2 là aflatoxin B2a và aflatoxin G2a. Allcroft và Carnaaghan đã nhận thấy trong sữa và thịt bò cũng có dẫn xuất của aflatoxin B1và B2, được đặt tên là aflatoxin M1và M2. Cả hai chất này đều bắt màu huỳnh quang màu xanh tím. Ở gan, thận và nước tiểu của cừu cũng tìm được hợp chất như vậy. Theo Dalezios và Wogan, trong nước tiểu của khỉ có aflatoxin P1, dẫn chất của aflatoxin B1. Một aflatoxin khác cũng được phát hiện gọi là aflatoxin 3B hay parasiticol . -Tính chất lí hóa của các aflatoxin (Townsend, Stubblefied, Beljiccans) aflatoxinCông thứcTrọng lượng phân tửĐiểm nóng chảyHuỳnh quangHấp thụ tiaUv trong etohĐộ quay cực quang học AflatoxinB1 AflatoxinB2 AflatoxinG1 AflatoxinG2 AflatoxinM1 AflatoxinM2 C17H12O6 C17H14O6 C17H12O7 C17H34O7 C17H12O7 C17H14O7321 314 328 330 328 330268-269 286-289 244-246 229-231 299 293Xanhlam Xanhlam Xanhlục Xanhlục Xanhtím Xanhtím 223.2 243.2 222.2 221.2 226.2 221.2-558o -556o -492o -4730 -280o  II. Phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí. 2.1.Phương pháp sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromato graphi-TLC ) Phương pháp sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960. Người ta sử dụng các bản mỏng được tráng bởi silicagel, để xác định aflatoxin. Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là chloroforin: methnol và choloroform: aceton. Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin. Hệ dung môi gồm nước: aceton; chloroform( 1.5;12;88v/v) được đánh giá có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất. Các bản mỏng đã được chảy qua các dung môi chạy được đưa vào bởi đèn tử ngoại(uv)365mm. Các vết mẫu phân tích tạo màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây. Và có độ dài Rf được so sánh với các vết của aflatoxin tiêu chuẩn. Phương pháp này có thể được xác định lượng từ 3-4.10-4micromet(0.3-0.4mg). Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc vào người phân tích. Khi so sánh giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả từ 20-30%. * Phương pháp đó mật độ huỳnh quang trên máy Fluroclensytometer. Fluroclensytometer có nhiều tiến bộ hơn, chính xác hơn so với nhìn bằng mắt thường. Tuy nhiên có nhiều phòng thí nghiệm hiện đại vẫn sử dụng phương pháp nhìn để so sánh trực tiếp các vết trên bản mỏng vì dễ hơn nhiều khi sử dụng qua máy Densitometer. Hội hóa học phân tích (A.O.A.C-1980) đã lưu ý tới phương pháp phân tích định lượng sử dụng TLC. Phương pháp này được mở rộng thành chương trình phân tích mẫu của tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới. Các kết quả của chương trình phân tích trên đã chứng nhận sự chính xác của phân tích bằng TLC ví sai số rất cao. Hiện có 4 phương pháp phân tích bằng TLC, phổ biến nhất là CB( Contiamintion Branch), BF( the beft foods), EFC( the Eropean Economic Cmmunity) và Pon’s(Pons methods). Phương pháp CB có nhiều ưu điểm hơn cả và thường xuyên được sử dụng. Tuy nhiên phương pháp CB đắt tiền và sử dụng quá nhiều dung môi phân tích. Phương pháp BF có tính thực tế hơn nhiều, dể làm và tiêu thụ ít dung môi, dung môi sử dụng la nước và metanol ít độc hơn chloroform. Phương pháp Pon’s có nhiều ưu điểm, sử dụng hệ dung môi là aceton và nước, dung môi này không hòa tan mỡ. * Khẳng định sự có mặt của aflatoxin: Một số chất được tách ra từ mẫu đôi khi dễ nhầm lẫn với aflatoxin, dẫn đến sự khẳng định sai lệch. Phương pháp khẳng định sự có mặt của aflatoxin trực tiếp thực hiện trên bản sắc kí. Dựa vào sự biến đổi của aflatoxin thành các đồng phân có màu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban đầu, cả aflatoxin chuẩn và aflatoxin có trong mẫu phân tích đều chuyển sang cùng một đồng phân. Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin trong mẫu phân tích được phát hiện bởi Przybylski(1975) và Verhulsdonk (1977) và được hội phân tích hóa học Hoa Kì (A.O.A.C) công nhận. Aflatoxin B1 được được acid hóa để trở thành đồng phân aflatoxin B2a. Đồng phân này có nàu huỳnh quang màu xanh và có độ dài Rf thấp hơn so với độ dài Rf của aflatoxinB1. Theo phương pháp của Przybylski, aflatoxin Bi được chuyển thành aflatoxin B2a nhờ acid Tryloacetic( TFA) phun trực tiếp lên các bản mỏng trước khi chạy trong dung môi chạy. Acid sufuric làm thay đổi màu huỳnh quang xanh da trời của aflatoxin B1 thành màu vàng. Thử nghiệm này nhằm khẳng định sự không có mặt của aflatoxin nếu vết nghi ngờ không chuyển thành màu vàng. 2.2. Sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao(high ferformane thin layer chromatography-HPTLC): Do những khiếm khuyết trong phương pháp sắc kí lớp mỏng đơn thuần ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: đưa mẫu lên bản mỏng một cách tự động, cải thiện được sự đồng nhất cả lớp hấp phụ, chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát. Quá trình đưa mẫu vào bản mỏng được tự động hóa, do đó các vết được định đúng vị trí và đo lường độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy densitometess. Thể tích mẫu được dùng trong HPTLC có thể băng 1microlits so với 5-10l mẫu trong phương pháp TLC, như vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích của vết (=1mm). Nồng độ chất chuẩn có thể cần 5pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó có thể xác định tới 30pg (0.03microgam) aflatoxin B1 ở lạc. Sử dụng kĩ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TLC như một phương pháp định lượng aflatoxin có hiệu quả nhất. 2.3. Phương pháp sắc kí lỏng cao áp(high ferformane liquid chromatỏgaphy-HPLC): Hệ thống phân tích high ferformane tự động HPLC là hệ thông phân tích đát tiền, chọn lọc, dùng định lượng Aflatoxin. Phương pháp HPLC sử dụng cả hai pha: Pha bình thường và pha phản. Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (uv) và xác định cường độ huỳnh quang. Mẫu phân tích được tác bằng chloroform: nước. Ly tâm chất tác dụng làm sạch qua silicagel pha bình thường sử dụng cột nhối silicagel 0.5m và pha động sử dụng bezen: acetonitrit: acid formic. Giới hạn xác định là 0.5micromet/kg. Husst ( 1984) đã sử dụng pha phản kết hợp với TFA đồng phân để xác định được các Aflatoxin B1, B2, G1, G2 ở nồng độ 5pg. Davis(1980) cũng sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang của đồng phân iot của Aflatoxin B1. Kết quả dẫn đén việc phát triển phương pháp đồng phân cột . 2.4. Phương pháp sắc kí cột. Phương pháp cột mini nhằm xác định nhanh aflatoxin có trong mẫu. Phương pháp này đơn giản, ít tốn kém, chỉ xác định định tính. Kĩ thuật nhồi cột mini là cột sắc kí bằng thủy tinh hay chất dẻo có kích thước khoảng 3-6mm chiều rộng và 20cm chiều dài. Dung dịch chiết tách được làm sạch bằng dung môi, dung môi và hòa tan trong một lượng nhỏ benzen hay chloroform. Cột được nhồi silicagel như một chất hấp thụ và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại(uv) để xác định màu huỳnh quang xanh chỉ ra sự có mặt của aflatoxin. Nhiều tác giả như Davis và cộng sự(1981), Holaday(1976), Holaday và Lansden(1975) đã cải tiến phương pháp này nhằm phát hiện nhanh aflatoxin trong mẫu. Phương pháp cột mini của Romes(1975) đã được A.O.A.C (1980) công nhận. Aflatoxin được tách bằng aceton và nước (85: 45), các chất tạp được loại trên gel cacbonat đồng và chloric sắt. Sau đó, aflatoxin được tách ra băng một pha nước với chloroform. Chloroform tách được đưa vào cột có chứa một lớp bột nhôm trung tính, silicagel và florisil ở phía dưới, sunfat canxi khô ở cả trên và dưới. Cột được chạy trong choloroform và aceton(9:1) để giữ aflatoxin trên đỉnh của lớp flosisil. Chương III: Đối tượng và phướng pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu: Thiết bị sắc kí bản mỏng và và sắc kí cột. Mẫu phân tích từ nông sản thực phẩm thủy sản. 3.2 Phương pháp nghiên cứu: Tham khảo tài liệu. Chương 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU I.Phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc ký: 1.1Nguyên tắc: Trên những hạt gel kháng thể đặc hiệu đối với aflatoxin được gắn đồng trị một cách bền vững nhưng không mất hoạt tính. Các gel này được gắn vào những cột nhỏ. Khi cho dịch chiết dẫn mẩu đi qua các cột, Aflatoxin sẽ bị kháng thể giữ lại. Sau khi toàn bộ mẫu đã qua cột, rửa cột trong điều kiện nhẹ nhàng bằng nước cất để loại bỏ tất cả những thành phần không đặc hiệu bám lại. Sau đó Aflatoxinsex được giải hấp ra khỏi cột bằng methanol. Định lượng Aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng. 1.2 Tiến hành: 1.2.1 Chuẩn bị mẫu: Xay 1kg mẫu đủ lọc sàng 1mm. Trộn đều, cân 25g mẫu, 5g NaCl và 125ml dung dịch chiết mẫu Methanol 75% cho vào bình định mức. Lắc đều trong 30 phút. Để lắng trong vòng 10- 15 phút . Lọc dịch chiết qua giấy lọc . Lấy 15 ml dịch lọc pha loãng 1/3 với nước lọc lại lần nữa, lấy 15 ml dịch lọc (tương đương 1g mẫu). 1.2.2Phân tích mẫu: Qua cột sắc ký ái lực miễn dịch : Gắn xiranh 20-30ml lên giá đỡ. Mở nắp cột sắc ký ái lực miễn dịch cho đầy nước vào trong ống (để tránh tạo bọt khí trong cột ) và gắn vào xiranh . Cho 20ml PBS qua cột để rửa cột . Khi lớp nước vừa tới đầu cột cho 15 ml dịch chiết mẫu đã lọc vào xiranh (tránh có bọt khí trong cột). Cho dịch lỏng chảy qua cột với tốt độ khoảng 1 giọt/giây. Dùng bơm tay để điều chỉnh tốc độ dòng chảy. Khi dịch mẫu tới đầu cột ,cho 10ml nước cất vào xiranh để rửa cột. Lặp lại một lần nữa với 10ml nước cất. Khi toàn bộ nước rửa đã ra khỏi cột, bơm 2-3ml không khí qua cột để cột ráo nước. Tháo cột ra khỏi xiranh, lau nước bám ở đầu cột và xiranh. Gõ nhẹ cột lên khăn giấy để hoàn toàn ráo nước . Cho 1ml methanol (LC grade) rửa giải qua cột, hứng lấy dịc chảy ra. Để methanol chảy từ từ qua cột, cuối cùng dùng xiranh thổi 2-3ml không khí đẩy hết những giọt cuối cùng ra khỏi cột . 1.2.3. Định lượng bằng sắcký bản mỏng(TLC) Làm khô dịch giải hấp thu trong N2 ở 40-45oc.Hoà tan cặn lại trong 200l Benzen-Acetonitrit (98:2). Trên tấm bản silicagelkẻ một đường cách đáy 1,5cm, trên đó chấm nhẹ bằng bút chì cách nhau 1cm trở lên. Chuẩn bị Aflatoxin B1 0,5ppm pha trong Benzen –Acetonitril(98:2) Dùng Microsyringe chấm lên bản silicagel từ trái sang phải theo thứ tự sau : + 3 chấm mẫu: 2, 5, 10l + 1 nội chuẩn: 10l mẫu và 10l chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B1) + 3 chấm chuẩn: 10, 5, 2l chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B1) Lưu ý: Chấm trong tủ hút để dung môi bay hơi nhanh, chấm từ từ để các chấm thật nhỏ, kích thước chỉ khoảng 1mm/chấm . Pha dung dịch triển khai: Chloroform- Aceton (9:10. Cho khoảng 20ml dịch triển khai vào bình triển khai. Cho bản silicagel vào bình, đậy kín .Chờ cho dung dịch triển khai lên đến cách mép trên của bản khoảng 0,5cm . Lấy bản ra, làm khô tại nhiệt độ phòng. Soi trên đèn UV. Các chấm Aflatoxin B1 sẽ phát sáng . So sánh các chấm chuẩn với các chấm mẫu. Để khẳng định mẫu có nhiễm Alatoxin B1 thì Rf của các chấm chuẩn phải bằng Rf của các chấm mẫu. So sánh độ sáng của các chấm chuẩn và chấm mẫu, chọn một thể tích là Xl mẫu có độ phát sáng bằng S l chuẩn. Tính toán nồng độ Alatoxin B1 có trong mẫu . 1.3 Kết quả và tính toán : Nồng độ Afatoxin B1 có trong mẫu : S.Y.V X.W Trong đó S : thể tích của Aflatoxin chuẩn có độ sáng bằng X l mẫu () Y : nồng độ Aflatoxin B1 chuẩn (0,5g/ml hoặc 0,5ppm) V : thể tích hoà cặn (200 l) X : Thể tích của mẫu có độ sáng bằng S l chuẩn W : số gam mẫu đi qua cột (1g) Chú ý an toàn khi tiếp xúc với Aflatoxin : Đeo găng tay khi làm thí nghiệm . Các vết Aflatoxin phải dược lau sạch bằng nước javen 10% Dụng cụ thuỷ tinh hay nhựa đã tiếp xúc với Aflatoxin phải dược ngâm trong nước javen 10% tói thiểu là 30 phút trước khi rửa. II. PHÂN TÍCH AFLATOXIN B1 DÙNG CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC MIỄN DỊCH KẾT HỢP SẮC KÍ BẢN MỎNG. 2.1. Nguyên lý: Trên những hạt gel kháng thể đặc hiệu đối với aflatoxin được gắn đồng trị một cách bền vững nhưng không mất hoạt tính. Các gel này được đóng vào những cột nhỏ. Khi cho dịch chiết mẫu đi qua các cột aflatoxin sẽ bị kháng thể giữ lại. Sau khi toàn bộ mẫu đi qua cột, cột sẽ được rửa bằng nước cất để loại bỏ tất cả những thành phần bám một cách yếu ớt. Sau đó aflatoxin sẽ được giải hấp ra khỏi cột bằng methanol. Định lượng aflatoxin bằng sắc kí lỏng cao áp, sắc kí bản mỏng. 2.2. Chiết mẫu. *Xay 1kg mẫu đủ lọt sàng 1 mm. Cân 25g to vào bình Erlen meyer 500ml, cho 5g NaCl và 125ml dung dịch chiết mẫu(75% methanol). Lắc trong 30 phút. *Lọc dịch chiết qua giá lọc. *Lấy 15ml dịch lọc pha loãng 1/3 với nước lọc lại một lần nữa lấy 15 ml dịch lọc(tương đương 1g mẫu). 2.3.Quy trình phân tích : *Qua cột sắc kí ái lực miễn dịch. Gắn xylanh 20-30 ml lên giá đỡ. Mỡ nắp cột sắc kí ái lực miễn dịch cho đầy nước vào trong ống(để tránh bọt khí trong cột ) và gắn vào xylanh Cho 20ml PBS qua cột để rửa cột Khi lớp vừa nước tới đầu cột cho 15ml dịch chiết mẫu đã lọc vào xylanh Cho dịch lọc chảy qua cột với tốc độ khoảng 1 giọt/s. Dùng bơm tay để điều chỉnh tốc độ dòng chảy Khi dịch mẫu tới đầu cột, cho 10ml nước cất vào xylanh để rửa cột . Lặp lại một lần nữa với 10 ml nước cất. Khi toàn bộ nước rửa đã ra khỏi cột, bơm 2-3ml không khí qua cột để cột ráo nước. Tháo cột khỏi xylanh lau nước bám ở đầu cột và xylanh. Gõ nhẹ cột lên khăn giấy để hoàn toàn ráo nước. Cho 1ml methanol rữa giải qua cột hứng lấy dịch chảy ra. Để methanol chảy từ từ qua cột, cuối cùng dùng xylanh thổi 2-3 ml không khí để đẩy hết những giọt cuối cùng ra khỏi cột . *Phân tích nồng độ aflatoxin: +Bán định lượng bằng florifil tip: Cho dung dịch giải hấp qua cột florifil. Quan sát nó dưới đèn UV 365nm. So sánh độ phát huỳnh quang của mẫu với những tip aflatoxin chuẩn 10-20-50 ppb để ước lượng nồng độ aflatoxin trong mẫu. + Định lượng bằng sắc kí lỏng cao áp: Pha loãng ½ dịch giải hấp thu được với nước (cho thêm 1 ml nước HPLC vào, lắc đều) Tiêm vào máy HPLC Thời gian chạy 20s. Tốc độ dòng 1ml/s. Thể tích tiêm 20microlit. Cột Supelcosil LC –18,150x4.6 mmID,5 micromet Particle size. Detector fluorescent Excitation:360nm Emission :440nm Dựng đường chuẩn và tính toán nồng độ aflatoxin dựa trên đường chuẩn. + Định lượng bằng sắc kí bản mỏng : -Làm khô dịch giãi hấp thu được trong N2 ở 40-45oC. Hòa cặn lại trong 20l Benzen-acetonitril(98/2) -Trên tấm bản silicagel kẻ một đường cách cạnh đáy 1.5cm, trên đó chấm nhẹ kèm bút chì cách nhau 1cm trở lên. -Chuẩn bị aflatoxin B1 0.5ppm pha trong benzen- acetonitril -Dùng micro siringe chấm trên bảng silicagel từ trái sang phải theo thứ tự sau: 3 chấm mẫu: 2, 5, 10 l 1 nội chuẩn 10l mẫu và l 3 chấm chuẩn: 10, 5, 2 l chuẩn. -Pha dịch triển khai: chloroform-aceton(9:1). Cho khoãng 20ml dịch triển khai vào bình triển khai. Cho bản silicagel vào bình đậy kín. Chờ cho dung dịch triển khai lên đến cách mép trên bản khoảng 0.5cm. -Lấy bản ra làm khô tại nhiệt độ phòng. Soi trên đèn UV, aflatoxin B1 sẽ phát sáng . - So sánh các chấm chuẩn với các chấm mẫu. Để khẳng định mẫu có nhiễm aflatoxin thì Rf của các chấm chuẩn phải bằng Rf của các chấm mẫu . - So sánh độ sáng của các chấm chuẩn và mẫu, chọn một thể tích là x mẫu có độ phát sáng bằng S chuẩn. -Tính toán nồng độ aflatoxin có trong mẫu như sau: S.Y.V X.W Trong đó : S : thể tích của Aflatoxin chuẩn có độ sáng bằng X l mẫu Y : nồng độ Aflatoxin B1 chuẩn (0,5 g/ml hoặc 0,5ppm) V : thể tích hoà cặn (200 l) X : Thể tích của mẫu có độ sáng bằng S l chuẩn W : số gam mẫu đi qua cột (1g) III.Kỹ thuật định tính và bán định lượng độc tố vi nấm mốc 3.1 Nguyên lý của phương pháp: Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc. Dịch chiết được lọc và một phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicagen. Làm bay hơi dung dịch rửa giải và hoà cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzen – axetonitril. Sau đó chấm một phần xác định mẫu thử lên bản mỏng,chạy sắc ký và so sánh Rf, màu sắc vết sắc ký của mẫu phân tích với vết aflatoxin chuẩn dưới đèn tử ngoại có bước sóng 365nm. Lượng aflatoxin có thể xác định bằng mắt hay bằng máy đo mật độ huỳnh quang. 3.2. Đối tượng áp dụng của phương pháp: Dùng để xác định hàm lượng aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong các sản phẩm ngũ cốc, đậu đỗ, hạt có dầu. Silicagel G – 60 dùng cho sắc ký cột, cỡ hạt 0,063¸ 0,2 mm. Hoạt hoá bằng cách sấy khô ở 105 o C trong một giờ, sau đó trút vào bình tam giác nút nhám, thêm nước với tỷ lệ 1ml nước cho 100g silicagel, đậy nút, lắc đến khi trộn hoàn toàn đều, bảo quản 15 giờ trong bình kín. Chuẩn bị dung dịch aflatoxin chuẩn (điều kiện tiến hành: trong phòng mát, tránh ánh sáng): Dung dịch aflatoxin chuẩn gốc (dung dịch A): Dùng ống chuẩn 1 mg, mỗi loại aflatoxin chuẩn B1, B2, G1, G2 lần lượt cho vào 4 bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng hỗn hợp toluen – axetonitril 98: 2 (v/v) (nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn là 10 m g/ml). Cho vào một bình định mức 10ml lần lượt 0,5 ml aflatoxin B1; 0,5 ml aflatoxin G1; 0,1 ml aflatoxin B2, 0,1 ml aflatoxin G2 (từ dung dịch A ở trên), định mức đến 10ml bằng hỗn hợp toluen – axetonitril 98: 2 (v/v), nồng độ dung dịch là 0,5 m g/ml đối với B1, G1, và 0,1 m g/ ml đối với B2, G2. Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn (dung dịch A mg/ml) bằng quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS, bước sóng 350nm, tính kết quả theo công thức: C ( m g/ml) = 1000.m.A / e Trong đó: m – Khối lượng phân tử aflatoxin A – Mật độ quang ở bước sóng hấp thụ. e - Độ hấp thụ phân tử của aflatoxin Aflatoxin m Dung môi benzen – axetonitril (v/v) l max (nm)  e B1 312 98: 2 350 19800 B2 314 98: 2 350 20900 G1 328 98: 2 350 17100 G2 330 98: 2 350 18200 Bảo quản: Bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn 00C, dung dịch A để được 6 tháng và dung dịch B để được hai tuần trước khi dùng hoạt hoá ở 1100C trong 1 giờ. 3.3. Phương pháp tiến hành: (Điều kiện tiến hành: ở phòng mát, tránh ánh nắng ) 3.3.1. Chuẩn bị mẫu: Nghiền mẫu sao cho có thể qua được rây có lỗ cỡ 1mm. Chú thích: Với các mẫu thử có hàm lượng chất béo lớn hơn 5%, cần loại chất béo bằng cách chiết với dung môi ête dầu hoả (độ sôi 40 – 600C ) sau khi đã hoàn thành công đoạn nghiền mẫu.3.3.2. Tiến hành thí nghiệm: 3.3.2.1. Chiết xuất: Cân 50g mẫu đã nghìên nhỏ cho vào bình nút mài 500ml. Cho tiếp 25ml nước, 25g celite 545, 250ml clorofoc, đậy nút chặt. Lắc trong 30 phút bằng máy lắc quay tròn hay máy khuấy từ (hoặc lắc kỹ bằng tay) rồi lọc qua giấy lọc gấp cạnh, bỏ 10ml dịch lọc đầu, sau đó lấy 50ml dịch lọc tiếp theo (tương đương 10g mẫu thử). Nếu tốc độ dịch lọc xuống chậm, chuyển sang phểu Bucher có chứa 1 lớp celite 545 dày 5mm trên giấy lọc và lọc hút chân không. 3.3.2.2. Làm sạch mẫu bằng cột sắc ký: Kỹ thuật nhồi cột sắc ký: Cho một ít bông vào đáy cột sắc ký, thêm 5g natri sunfat khan. Đổ clorofoc đến 2/3 cột, sau đó cho 10 g silicagel dùng cho sắc ký cột (3 - 15), vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột cho silicagel lắng đều, dùng đũa thuỷ tinh khuấy nhẹ để tránh bọt khí. Mở khoá cho clorofoc chảy xuống từ từ. Khi tốc độ lắng của silicagel chậm lại, rút hết clorofoc chỉ để lại một lớp 5cm phía trên lớp silicagel. Thêm từ từ 15g natri sunfat khan, sau đó rút bớt clorofoc đến gần sát lớp natri sunfat khan trên. Cột silicagel thu được phải mịn, không có bọt khí và chú ý không để cột bị khô kể từ lớp natri sunfat khan trên. Trộn 50ml dịch lọc trên (5 - 2) với 150ml n – hexan, đổ cẩn thận vào cột sắc ký đã chuẩn bị như trên. Loại bỏ dung dịch chảy ra. Cho tiếp 150ml ête êtylic khan, loại bỏ dung dịch chảy ra. Chú ý không để cột bị khô, lưu lượng dòng chảy khoảng 8 – 12ml /phút. Dung dịch rửa giải aflatoxin trên bằng 150ml hỗn hợp metanol – clorofoc (3 : 97). Lấy toàn bộ dịch chảy ra từ khi bắt đầu cho dung dịch rửa giải cho đến hết. Lưu lượng dòng chảy như trên. Làm bay hơi dung dịch rửa bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ thấp hơn 50oC cho đến khi còn khoảng 2 – 3 ml. Chuyển sang ống nghiệm 10ml, tráng rửa bình cầu bằng clorofoc và làm bay hơi đến khô trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ thấp hơn 500C, tốt nhất dưới luồn khí nitơ nhẹ cặn còn lại trong ống nghiệm là mẫu phân tích. Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc ký lớp mỏng. 3.3.2.3. Sắc ký lớp mỏng một chiều: Chuẩn bị: Hoà cặn thu được ở trên bằng 0,5ml hỗn hợp benzen – axetonitril (98: 2) và lấy dịch này để chấm lên bản sắc ký. Với bản mỏng tráng sẵn trước khi chấm sắc ký phải cạo sạch lớp silicagel ở hai cạnh bên tấm sắc ký với chiều rộng 0,5cm. Sau đó cách cạnh đáy 2 cm, dùng mao quản hay micropipet chấm các vết dung dịch chuẩn aflatoxin và dung dịch mẫu thử như sau: 1. Lấy 2; 5;10; 20 m l dung dịch chuẩn B ( 3.17. 2). 2. Lấy 10 m l dịch chiết với 10 m l dung dịch chuẩn B (3 .17.2). 3. Lấy 10, 20 m l dịch chiết. - Với từng thể tích như trên, 4 dung dịch aflatoxin B1, B2, G1, G2 chuẩn có thể được chấm chồng lên nhau. Khai triển bản sắc ký ở chỗ tối với hệ dung môi clorofoc – axeton (9: 1). Sau khi tiếp tuyến dung môi chạy lên khoảng 10cm (khoảng 30 phút), lấy bản sắc ký ra để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau đó soi dưới đèn tử ngoại với bước sóng 365 nm. Các vết aflatoxin B1, B2 có huỳnh quang màu xanh da trời; G1, G2 có huỳnh quang màu xanh lá cây. Nếu mẫu thử có aflatoxin sẽ xuất hiện các vết cùng giá trị Rf với các vết aflatoxin chuẩn. Rf của các vết aflatoxin trong hệ dung môi clorofóc - axêtôn (9-1) có trị số trung bình như sau: Aflatoxin B 1 : 0,72 Aflatoxin B 2 : 0,67 Aflatoxin G 1 : 0,59 Aflatoxin G 2 : 0,54 3.3.2.4. Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin: -Phun dung dịch axit sunfuric 50% (v/v) lên bản sắc ký, huỳnh quang của các vết aflatoxin sẽ chuyển sang màu vàng dưới tia tử ngoại có bước sóng 365nm. -Rót dung dịch iốt 5 – 10% trong ête lên một tấm thuỷ tinh 20 x 20cm, dàn đều ở khu vực giữa, để cho ête bay hơi hết còn lại một lớp iốt mỏng. Đặt úp tấm thuỷ tinh này lên bản sắc ký đã triển khai, cách khoảng 1 cm trong thời gian 20 – 30 giây. Lấy bản sắc ký ra quan sát dưới đèn tử ngoại, nếu huỳnh quang của chất chuẩn và dung dịch thử không mất đi, chứng tỏ sự có mặt của aflatoxin. -Chia bản mỏng silicagel 20 x 20 cm làm hai phần bằng nhau (cách 10cm ở giữa), chấm các vết dịch chiết mẫu thửvà dung dịch aflatoxin chuẩn như sau: Phần 1: Bên trái, chấm 4 vết như sau. - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) - 10 m l dịch chiết - 10 m l dịch chiết với10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) Phần 2: Bên phải,chấm 4 vết như sau. - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) - 10 m l dịch chiết - 10 m l dịch chiết với 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) Chấm xong dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay hết. Nhỏ lên 4 vết chấm ở phần 1 bên trái, mỗi vết một giọt axít trifluoraxetic. Che phần 1 (bên trái) bằng một tấm thuỷ tinh khác, phun lên phần 2 (bên phải) dung dịch axitsunfuric 50% (v/v). Dùng máy sấy nhẹ làm khô các vết chấm rồi mới cho vào bình khai triển. Dung môi khai triển: Nước/metanol/ete etylic – 1/3/96 (v/v). Khi dung môi lên khoảng 13 cm, lấy bản sắc ký ra để khô ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng, soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách đèn 10 cm. 3.3.3. Đánh giá kết quả: - Nửa bên trái: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn và của vết dịch chiết (nếu có) sẽ cùng có trị số Rf ngắn hơn bình thường, vẫn giữ nguyên màu huỳnh quang xanh . - Nửa bên phải: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn và của vết dịch chiết (nếu có)sẽ cùng có trị số Rf bình thường, và màu huỳnh quang xanh chuyển sang màu vàng. 3.3.4. Định lượng 3.3.4.1. Bằng mắt: Xác định hàm lượng aflatoxin trong dịch chiết bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn. Vết huỳnh quang của vết chấm dung dịch aflatoxin chuẩn chồng lên vết dịch chiết phải mạnh hơn huỳnh quang của vết 10 m l dịch chiết và phải trùng nhau. Nếu mật độ huỳnh quang của vết 10 m l dịch chiết đậm hơn mật độ huỳnh quang của vết 20 m l dung dịch chuẩn thì phải pha loãng dịch chiết và tiến hành làm sắc ký lớp mỏng lại. Tính kết quả Hàm lượng aflatoxin (C) tính bằng microgam trong 1 kilogam mẫu được tính theo công thức: C = S xY x V / W x X Trong đó: S – Nồng độ aflatoxin của dung dịch chuẩn m g / ml ( Dung dịch B ) V – Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, m l. W – Khối lượng của mẫu thử, ( tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột) g. X – Thể tích dịch chiết có mật độ huỳnh quang giống thể tích Y của dung dịch chuẩn chấm trên bản mỏng, m l. Y – Thể tích dung dịch chuẩn có mật độ huỳnh quang giống thể tích X của dịch chiết chấm trên bản mỏng, m l. 3.3.4.2. Bằng máy đo mật độ huỳnh quang. Bước sóng kích thích là 365nm và bước sóng phát xạ là 443 nm. Định lượng aflatoxin trên các chấm của dịch chiết bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn. Tính kết quả. Hàm lượng aflatoxin (C), tính bằng microgam trong 1 kilogam mẫu thử tính như sau: C = A m x S x V x Y / A s x W x X Trong đó: A m - mật độ huỳnh quang của vết mẫu. A s - mật độ huỳnh quang của vết chuẩn. X – Thể tích của dịch chiết chấm lên bản mỏng ( m l ). Y – Thể tích của dịch chuẩn chấm lên bản mỏng ( m l ). S – Hàm lượng aflatoxin của dung dịch chuẩn,( ng). V– Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, ( m l). W – Khối lượng của mẫu thử, tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột,( g). 3.3.5 - Độ nhạy của phương pháp : 5 m g / kg (5 ppm) - Hệ số thu hồi của phương pháp : 90 ± 5%. - Sai số trung bình của phương pháp : ± 10%. IV.HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG THỦY SẢN-PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO  4.1Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1,5 mg/kg. 4.2. Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp chuẩn số 49.2.05 của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) công bố năm 1997. 4.3 Nguyên tắc Aflatoxin có trong mẫu thủy sản bao gồm các nhóm B1, B2, G1 và G2 được chiết tách ra bằng clorofom. Dịch chiết đựơc làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên silicagel. Hàm lượng aflatoxin có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn. 4.4. Dung dịch chuẩn và dung dịch thử: Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100,0 mg/l), B2 (nồng độ 20,0 mg/l), G1 (nồng độ 100 mg/l) và G2 (nồng độ 20 mg/l). Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp aflatoxin có nồng độ : B1 (nồng độ 100,0 mg/l), B2 (nồng độ 20,0 mg/l), G1 (nồng độ 100 mg/l) và G2 (nồng độ 20 mg/l) trong metanol từ các ống chuẩn. Tùy theo nồng độ các aflatoxin có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng metanol thích hợp. Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ là B1 (10,0 mg/l), B2 (2,0 mg/l), G1 (10,0 mg/l) và G2 (2,0 mg/l): hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào bình định mức 10 ml rồi định mức tới vạch bằng metanol Dung dịch chuẩn: hút chính xác lần lượt 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian vào các bình định mức 10 ml rồi định mức tới vạch bằng metanol. Các dung dịch chuẩn thu được có nồng độ aflatoxin lần lượt như sau: a. Chuẩn 1 : B1 (0,0 mg/l), B2 (0,0 mg/l), G1 (0,0 mg/l), G2 (0,0 mg/l). b. Chuẩn 2 : B1 (1,0 mg/l), B2 (0,2 mg/l), G1 (1,0 mg/l), G2 (0,2 mg/l). c. Chuẩn 3 : B1 (2,0 mg/l), B2 (0,4 mg/l), G1 (2,0 mg/l), G2 (0,4 mg/l). d. Chuẩn 4 : B1 (4,0 mg/l), B2 (0,8 mg/l), G1 (4,0 mg/l), G2 (0,8 mg/l). đ. Chuẩn 5 : B1 (8,0 mg/l), B2 (1,6 mg/l), G1 (8,0 mg/l), G2 (1,6 mg/l). e. Chuẩn 6 : B1 (10,0 mg/l), B2 (2,0 mg/l), G1 (10,0 mg/l), G2 (2,0 mg/l). Dung dịch pha động: pha hỗn hợp các dung môi axetonitril, metanol và nước cất loại dùng cho HPLC theo tỉ lệ về thể tích là 2 : 2 : 6. 4.5 Phương pháp tiến hành 4.5.1 Chuẩn bị mẫu thử Dùng cân phân tích cân chính xác 50,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml. Thêm 100,0 ml clorofom vào ống rồi trộn đều trong khoảng 2 phút bằng máy nghiền đồng thể . Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm trong khoảng 5 phút ở tốc độ 5 000 vòng/phút. Tiến hành lọc dịch chiết và rửa phần bã bằng clorofom rồi cho tất cả dịch thu được vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml . 4.5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có aflatoxin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử 4.5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn 3 vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể. Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử. Phải chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi đồng thời với chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng. 4.5.4 Làm sạch dịch chiết 4.5.4.1Chuẩn bị cột Ðặt 1 lớp bông thủy tinh vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon . Ðóng khóa và cho clorofom tới khoảng 2/3 cột rồi thêm lần lượt 5,0 g sulfat natri khan , 20,0g silicagel đã hoạt hóa , 15 g sulfat natri khan . Chú thích: để tránh khô cột luôn giữ mực clorofom cao hơn lớp sulfat natri khan trên cùng khoảng 1,5 cm. 4.5.4.2 Làm sạch dịch chiết Cô dịch chiết thu được trên hệ thống cô quay chân không còn khoảng 5,0 ml ở nhiệt độ 40 oC. Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình cầu vào cột làm sạch đã chuẩn bị và tráng rửa bình cầu bằng clorofom. Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy của dung dịch ra khỏi cột khoảng từ 1,0 đến 1,5 ml/phút. Trong giai đoạn này, aflatoxin sẽ hấp phụ lên các hạt silicagel. Thêm vào cột lần lượt 50,0 ml n-hexan, 50,0 ml ete etylic . Ðiều chỉnh tốc độ dung môi chảy qua cột ở 1,0 ml/phút. Sau đó loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột. Giải hấp các aflatoxin khỏi cột làm sạch bằng 50,0 ml hỗn hợp clorofom và metanol theo tỉ lệ về thể tích là 97: 3 với tốc dộ 1,0 ml/phút. Hứng dung dịch chảy ra khỏi cột vào bình cầu dung tích 100 ml. Cô dịch thu được trên hệ thống cô quay chân không ở nhiệt độ 40o C cho đến khô hoàn toàn. Hoà tan cặn bằng 5,0 ml (V) dung dịch pha động trong bình định mức 5 ml . Tiến hành phân tích hàm lượng các aflatoxin trên HPLC theo phân tích trên HPLC. Tiến hành làm sạch mẫu trắng và mẫu để xác định độ thu hồi giống như với mẫu thử. 4.5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC 4.5.5.1 Ðiều kiện phân tích a. Cột sắc ký : RP-LC 18, kích thước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt 5 -10 mm. b. Nhiệt độ cột : 35oC. c. Pha động : Hỗn hợp gồm: axetonitril, metanol và nước cất (4.3.5. d. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang là: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm. e. Thể tích tiêm : 20 ml. 4.5.5.2 Tiêm các dung dịch chuẩn vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại aflatoxin theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b). 4.5.5.3 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng và dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình. 4.5.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm: Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu trắng đã cho vào một lượng dung dịch aflatoxin chuẩn đã biết hàm lượng chính xác (5.3). Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %. Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99. 4.6 Tính kết quả Hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được. Với đường chuẩn ở dạng y = ax +b, hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính theo công thức sau: (Y - b) C (mg/kg) = ------------ x F a Trong đó: - C là nồng độ aflatoxin có trong mẫu, tính theo mg/kg - Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích - a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b. - F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V và khối lượng mẫu m sử dụng. V. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH AFLATOXIN TRÊN CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC MIỄN DỊCH VÀ SO SÁNH VỚi PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH TRÊN CỘT CHIẾT PHA RẮN   Tóm tắt: Qua khảo sát trên 10 mẫu thực phẩm các loại với 2 phương pháp chiết tách khác nhau: chiết tách trên cột sắc ký ái lực miễn dịch (IAC) và trên cột chiết pha rắn (SPE) tại labo Xét Nghiệm Trung Tâm thuộc Viện Vệ Sinh Y Tế Công Cộng cho thấy: Hiệu suất thu hồi (H) trên SPE (85%-89%) trên cột miễn dịch (91%-97%). Giới hạn phát hiện (LOD: Limit of detecting), trên SPE (51-81ppt) trên cột miễn dịch (60-88ppt). Giới hạn định lượng (LOQ: limit of quanlity), trên cột SPE (15-24ppt), trên cột miễn dịch (18-26ppt). 80% số mẫu kiểm tra phát hiện có AflatoxinB1. Với phương pháp chiết tách mẫu bằng cột miễn dịch xác định được hàm lượng AflatoxinB1 ở mức 0.05ppb. Với phương pháp chiết tách bằng cột SPE ở hàm lượng 0.07ppb không phát hiện được    5.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Aflatoxin là những chất chuyển hóa có độc tính cao của nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus. Các loài nấm này rất dễ sinh sản trên các nguyên liệu giàu tinh bột hay những hạt có dầu nên Aflatoxin có thể tìm thấy trên rất nhiều loại thực phẩm như : Đậu phộng, càfe, sữa, tương , chao bắp và các loại ngũ cốc khác…Đến nay đã có ít nhất 16 cấu trúc hóa học gần nhau của các Aflatoxin được xác định song song với độc tính của chúng. Dựa trên đặc tính lý hóa và tính độc khác nhau các Aflatoxin được chia thành nhiều nhóm : B ( B1 , B2); G (G1, G2); M (M1, M2); P1 và Q1. Các loại Aflatoxin này khác biệt về hóa học không nhiều nhưng khác biệt về độc tính là rất lớn. Aflatoxin B1 và G1 có khả năng gây ung thư cao hơn nhiều so với aflatoxin B2 và G2. Aflatoxin được xem như là một trong các tác nhân gây ung thư gan ở người (cũng như các động vật nhạy cảm) và gây ra dị tật thai ở phụ nữ mang thai. Điều cần ghi nhận là tác động bệnh lý của Aflatoxin có tính cộng hưởng với những tác nhân khác như : HBV, hoặc những độc tố di truyền. Đối với người để tránh hậu quả hạn do nhiễm Aflatoxin trong lương thực thực phẩm là việc xác định lượng nhiễm cho phép để không gây ảnh hưởng lâu dài đến sức khỏe, không bị ung thư gan sau 50 năm, không tạo khuyết tật cho thai nhi, để nuôi con an toàn. ở Pháp quy định mức nhiễm Aflatoxin B1 trong sữa nước dùng cho trẻ em dưới 3 tuổi là ( 0.03ng/kg (ppb); sữa nước thông dụng £ 0.05ng/kg. Vì vậy, việc kiểm tra Aflatoxin trong lương thực và thực phẩm là việc làm tối cần thiết nhằm đảm bảo giá trị kinh tế trong sản xuất và bảo vệ sức khỏe cộng đồng, nhất là ở nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới rất thích hợp cho sự phát triển các loài vi nấm. Phương pháp phân tích Aflatoxin chính thức được chấp nhận trên toàn thế giới là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) . Ngoài ra phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) được lựa chọn khi phòng thí nghiệm không được trang bị HPLC. Đây là phương pháp thường được dùng ở phần lớn các phòng phân tích tại các nước đang phát triển. Hiện nay quy trình phân tích Aflatoxin trong các mẫu thực phẩm đang được sử dụng tại các TTYTDP ở nước ta phải qua nhiều công đoạn từ khâu chiết tách và làm sạch mẫu nên: Việc định tính và định lượng Aflatoxin dễ bị sai số lớn trong các công đoạn. Tốn nhiều thời gian. Quá trình tách chiết cần sử dụng các dung môi rất độc và gây ô nhiễm môi trường. Khi chuẩn bị mẫu cho HPLC , cần phải sử dụng các dung môi siêu tinh khiết- rất tốn kém. Để khắc phục những nhược điểm trên, cần có quy trình kỹ thuật thích hợp, thực hiện đơn giản và cho kết quả chính xá. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp chiết tách Aflatoxin trên cột sắc ký ái lực miễn dịch (IAC) so sánh với phương pháp chiết tách trên cột chiết pha rắn (SPE) nhằm khẳng định tính ưu việt của cột sắc ký ái lực miễn dịch và giúp cho kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi trong cả nước, tham gia đưa khoa học vào phục vụ đời sống. Mục tiêu nghiên cứu: Sử dụng cột sắc ký ái lực miễn dịch (IAC) để tách Aflatoxin B1 trong một số thực phẩm, so sánh với phương pháp sử dụng cột chiết pha rắn (SPE). 5.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 5.2.1. Đối tượng : 10 mẫu bao gồm (mẫu thức ăn gia súc đã chế biến sẵn: cám, bắp đậu phộng hạt , cà phê, bột ngũ cốc, bánh snack). Mẫu do các công ty & cơ sở chế biến gởi tới kiểm nghiệm 5.2.2. Phương pháp : -          Cột SPE của hãng MACHEREY-NAGEL (Đức) -          Cột sắc ký ái lực miễn dịch của hãng VICAM (Mỹ) -          Cột sắc ký ái lực miễn dịch của Viện Pasteur Tp. HCM -          Máy Sắc ký lỏng cao áp (HPLC). -          Dung môi acetonitrile, methanol, TFA -          Chuẩn Aflatoxin Phương pháp lấy mẫu: Các mẫu dùng để phân tích được lấy vào túi nylong sạch, khô hoặc chai thuỷ tinh. Mẫu được giữ ở nhiệt độ phòng 25-280C khô, thoáng, mát. Phương pháp tách chiết: Chiết Aflatoxin B1 trên 2 loại cột: cột SPE và cột miễn dịch IAC. Đo dịch chiết trên máy HPLC với đầu dò huỳnh quang tại bước sóng Ex = 365 nm, Em =455nm Tính giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) trên hai loại cột theo công thức sau:  Trong đó : LOQ : giới hạn định lượng; LOD : giới hạn phát hiện; CSTD : nồng độ của AFB1 chuẩn (10 ppb); HSTD : chiều cao của sắc ký đồ AFB1 chuẩn tại nồng độ 10 ppb; Sn : độ lệch chuẩn student. 5.3. KẾT QUẢ   Bảng 1. Hiệu suất thu hồi và hàm lượng AFB1 trên các loại mẫu khi được chiết tách bằng cột SPE và cột ái lực miễn dịch TTTên mẫuCột SPECột IACHàm lượng AFB1 (ppb)Hiệu suất thu hồi (%)Hàm lượng AFB1(ppb)Hiệu suất thu hồi (%)1Đậu phộng rang2,12 872.31 92.12Đậu phộng hạt8,71 859.22 913Cám5,02 895.31 92.74Caffe0,38 850.42 93.65Bột ngũ cốc0,13 89,30.14 94.66Bắp0,21 85.50.23 92.67Gạo0,08 890.09 95.78Bánh SNACK0,12 870.14 979Cơm dừaKhông phát hiện87.70.0592.010Bột gia vịKhông phát hiện86.20.0793.5  Qua bảng 1 cho thấy: Trên 10 mẫu các loại được khảo sát có 8 mẫu phát hiện có AFB1, chiếm tỉ lệ 80% nhưng đều nằm trong giới hạn cho phép theo 867/ QĐ- BYT (10ppb). Hàm lượng AFB1 trên cùng một mẫu với 2 loại cột chiết khác nhau thì khác nhau , với cột sắc ký ái lực miễn dịch phát hiện được hàm lượng cao hơn cột SPE. Có 2 mẫu cơm dừa và bột gia vị ở cột SPE không phát hiện được thì cột miễn dịch phát hiện được ở hàm lượng 0.05ppb và 0.07ppb. Hiệu suất thu hồi trên cột miễn dịch cao hơn cột SPE do cột miễn dịch có độ chọn lọc cao hơn. Hiệu suất thu hồi trên cùng cột miễn dịch nhưng các loại mẫu khác nhau thì khác nhau   Bảng 2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của AFB1 trên cột IAC và cột SPE. TÊN MẪUCỘT IACCỘT SPESn LOD (ppb)LOQ(ppb) Sn LOD (ppb)LOQ (ppb) ĐẬU PHỘNG RANG0.01680.07780.0230.01900.08770.026ĐẬU PHỘNG HẠT0.06290.07520.0220.01820.08320.025CÁM0.0 1480.06840.0200.01630.07380.022CÀFE0.01760.08120.0240.01900.08770.026BỘT NGŨ CỐC0.01230.05670.0170.01490.06920.021BẮP0.01540.07100.0210.01600.07380.022GẠO0.01290.05950.0180.01410.06460.019BÁNH SNACK0.01100.05100.0150.01410.06460.019CƠM DỪA0.01130.05200.0150.01310.06000.018 BỘT GIA VỊ0.01440.06920.0190.01520.06640.021  Chuyển hàm lượng đo được từ ppb sang ppt ( ppb = 1000 ppt). Giới hạn phát hiện trên cột miễn dịch nằm trong khoảng 51-81 ppt và giới hạn định lượng là 15-24 ppt. Giới hạn phát hiện trên cột SPE nằm trong khoảng 60-88 ppt và giới hạn định lượng là 18-26 ppt. Giới hạn phát hiện và giới hạn định luợng trên cột miễn dịch nhỏ hơn giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng trên cột SPE như vậy ta có thể phát hiện được AFB1 ở nồng độ thấp. 5.4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.4.1 Kết luận: Qua nghiên cứu cho thấy:         Có 80% số mẫu nhiễm Aflatoxin B1 mặc dầu hàm lượng nằm trong giới hạn cho phép (10 ppb).         Phương pháp chiết tách mẫu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch (IAC) cho kết quả tốt hơn hẳn cột SPE về : -          Độ nhạy , hiệu suất thu hồi, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng. -          Giá thành rẻ hơn vì sử dụng dung môi ít hơn. -          ít độc hơn và không gây ô nhiễm môi trường. -          Thời gian ngắn. -          Phù hợp với các TTYTDP tuyến tỉnh, các cơ quan xuất khẩu nông sản thực phẩm……Vì dụng cụ đơn giản, rẻ tiền. dễ mua. Đây là phương pháp chính thức hiện nay được chấp nhận trên thế giới . ........Cục QLCLVSATTP nghiên cứu để được áp dụng rộng rãi. Chương V: KẾT LUẬN Aflatoxin là độc tố do nấm mốc sinh ra. Trong đó có họ Aflatoxin thì có độc tố Aflatoxin B1,B2,G1,G2 là phổ biến. Aflatoxin B1 xuất hiện chủ yếu và là chất có độc tính cao nhất. Aflatoxin là những chất có khả năng gây ung thư. Aflatoxin khi vào trong cơ thể người có thể làm giảm sức đề kháng, gây tổn thương gan hoặc ung thư gan. Qua các phương pháp nghiên cứu trên cho thấy việc kiểm tra Aflatoxin trong thực phẩm là việc cần thiết nhằm đảm bảo giá trị kinh tế trong sản xuất và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Phương pháp phân tích Aflatoxin được chấp nhận trên toàn thế giới là phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao. Phương pháp sắc kí bản mỏng được dùng nhiều trong phòng thí nghiệm. Hiện nay các quá trình phân tích Aflatoxin trong mẫu thực phẩm đang được sử dụng tại các trung tâm y tế dự phòng ở nước ta phải qua nhiều giai đoạn từ khâu chiết tách và làm sạch mẫu .Do phải qua nhiều giai đoạn nên việc định tính và định lượng Aflatoxin dễ bị sai số lớn và tốn nhiều thời gian . Qua phương pháp nghiên cứu cho thấy có 80% số mẫu nhiễm Aflatoxin B1 mặc dầu hàm lượng nằm trong giới hạn cho phép (10ppb).Phương pháp chiết tách mẫu bằng cột sắc kí ái lực miễn dịch cho kết quả tốt hơn phương pháp chiết tách trên cột chiết pha rắn về : + Độ nhạy, hiệu suất thu hồi , giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng + Giá thành rẽ hơn vì sử dụng dung môi ít + Ít độc hơn và không gây ô nhiễm môi trường + Thời gian ngắn +Phù hợp với các trung tâm y tế dự phòng tuyến tỉnh, các cơ quan xuất khẩu nông sản thực phẩm Ở nước ta quy định về hàm lượng Aflatoxin tối đa cho phép ở thực phẩm cho người là 5ng/g(ppb) đối với Aflatoxin B1 và 10ng/g đối với Aflatoxin tổng số . Đối với trẻ em không được phép có Aflatoxin. Ở Việt Nam các phương pháp phân tích độc tố Aflatoxin đã được sử dụng rộng rãi như phương pháp bản mỏng , phương pháp sắc kí lỏng cao áp  Chương VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tiêu chuẩn Việt Nam: Ngũ cốc – phương pháp xác định Aflatoxin – TCVN 5617 – 1991. 2. Tài liệu tập huấn phân tích nhanh dư lượng thuốc trừ sâu và độc tố nấm mốc trong nông sản thực phẩm - Trường CĐ LT – TP Đà Nẵng 23 –24/10/2003. 3. Giáo trình phân tích thực phẩm - Trường CĐ LT – TP Đà Nẵng. 4. Nấm mốc và độc tố Aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi. 5. Áp dụng cột sắc kí ái lực miễn dịch trong mẫu thực phẩm - Viện sinh học y tế cộng đồng, viện Passteur TPHCM. 6. vietnamfood MỤC LỤC Chương I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 Độc tố nấm mốc trong thực phẩm 2 1.1 Nguồn gốc aflatoxin 2 1.2 Các loài nấm có khả năng sản sinh aflatoxin 2 1.3 Điều kiện sản sinh aflatoxin 2 1.4 Cấu tạo và tính chất vật lí hoá học của aflatoxin 4 II. Phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí 5 2.1 Phương pháp sắc kí lỏng 5 2.2 Sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao 6 2.3 Phương pháp sắc kí lỏng cao áp 6 2.4 Phương pháp sắc kí cột 7 Chương III: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 8 3.1 Đối tượng nghiên cứu 8 3.2 Phương pháp nghiên cứu 8 Chương IV:Kết quả nghiên cứu 8 I.Phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí 8 1.1Nguyên tắc 8 1.2Dụng cụ 8 1.3Hoá chất 9 1.4Tiến hành 9 1.5Đọc kết quả 10 II.Quy trình phân tích aflatoxin B1 dùng sắc kí ái lực miễn dịch kết hợp sắc kí bản mỏng 11 2.1.Nguyên lí 11 2.2.Dụng cụ và hoá chất 11 2.3.Chiết mẫu 12 2.4.Quy trình phân tích 12 III.Kỹ thuật định tính và bán định lượng độc tố vi nấm mốc 13 3.1.Nguyên lý của phương pháp 13 3.2.Đối tượng áp dụng của phương pháp 14 3.3 .Dụng cụ ,hoá chất ,thuốc thử 14 3.4.Phương pháp tiến hành 17 IV.Hàm lượng aflatoxin trong thuỷ sản-phương pháp định lượng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao 23 4.1.Phạm vi ứng dụng 23 4.2.Phương pháp tham chiếu 23 4.3.Nguyên tắc 23 4.4.Thiết bị ,dụng cụ 24 4.5.Phương pháp tiến hành 26 4.6. Đọc kết quả 28 V.Phương pháp chiết tách aflatoxin trên cột sắc kí ái lực miễn dịch và so sánh với phương pháp chiết tách trên cột chiết pha rắn 29 5.1Đặt vấn đề 29 5.2.Phương pháp nghiên cứu 30 5.3.Kết quả nghiên cứu 31 5.4.Kết luận và kiến nghị 33 Chương V:Kết luận 34 Cương VI:Tài liệu tham khảo 35