Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ

1 để xác định hàm lượng crinamidin. Sử dụng dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong CHCl3 để khảo sát chương trình nhiệt độ tối ưu cho phân tích trên thiết bị GC-MS/MS. Có 2 chương trình nhiệt độ được lựa chọn để khảo sát là:  Chương trình đẳng nhiệt: nhiệt độ đầu 100oC, giữ 1 phút, tăng nhiệt với tốc độ 10oC/phút đến 290oC, giữ 5 phút (*).  Chương trình gradient nhiệt độ (**) bao gồm 2 chương trình nhiệt độ:  Chương trình nhiệt độ 1: nhiệt độ đầu 100oC, giữ 1 phút, tăng nhiệt với tốc độ 20oC/phút đến 240oC, giữ 1 phút.  Chương trình nhiệt độ 2: tăng 5oC/phút lên đến 290oC, giữ 6 phút. 27 Kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.7 và 3.8. Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chương trình nhiệt độ (*) Hình 3.8: Sắc đồ của dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi CHCl3, chế độ tiêm chia dòng 10 : 1, chương trình nhiệt độ (**) Chương trình nhiệt độ (**) cho thời gian lưu của crinamidin chỉ khoảng 17 phút, pic gọn và đối xứng. Dựa trên điều kiện thực nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài với các điều kiện tối ưu hóa được thể hiện trong bảng 3.3. 28 Bảng 3.3: Điều kiện tối ưu hóa GC-MS/MS Thông số điều kiện sắc ký khí Cột DB5-MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 250oC Khí mang Heli Tốc độ khí mang 1,0 mL/phút Chế độ tiêm Chia dòng 10 : 1 Chương trình nhiệt độ gồm: Chương trình nhiệt độ 1 Nhiệt độ đầu 100oC, giữ 1 phút, tăng nhiệt với tốc độ 20 oC/phút đến 240oC, giữ 1 phút Chương trình nhiệt độ 2 Tăng 5oC/phút lên đến 290oC, giữ 6 phút Tổng thời gian phân tích 27 phút Thể tích tiêm 1 µL Dung môi pha mẫu CHCl3 Thông số điều kiện khối phổ Kiểu khối phổ Khối phổ ba tứ cực 7000 QQQ Nguồn ion hóa EI Năng lượng bắn phá 70 eV Nhiệt độ nguồn ion 270°C Nhiệt độ đường chuyển 260oC Thông số MRM Năng lượng bắn phá (eV) Mảnh m/z Crinamidin Mảnh định lượng 217 30 Mảnh xác nhận 244 25 288 20 Cafein Mảnh định lượng 82 30 Mảnh xác nhận 109 25 Thời gian cắt dung môi 5 phút 29 3.1.2. Kết quả khảo sát quá trình xử lý mẫu cho phƣơng pháp định lƣợng crinamidin bằng GC-MS/MS 3.1.2.1. Xây dựng quy trình chiết mẫu Dựa trên nguyên lý về chiết xuất alkaloid ra khỏi dược liệu [9], chúng tôi tiến hành khảo sát 3 quy trình xử lý mẫu, gồm có:  Quy trình 1, quy trình 2: chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ dựa trên phương pháp tiêu chuẩn DĐVN IV bản bổ sung [3] và cải tiến phương pháp phù hợp với điều kiện sắc ký GC-MS/MS.  Quy trình 3: chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung dịch acid loãng dựa trên nghiên cứu [38]. Khảo sát điều kiện chiết trên 3 nền mẫu riêng biệt: viên nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng. Viên nang cứng được loại bỏ vỏ nang, đồng nhất bột dược liệu trong nang bằng máy đồng nhất mẫu. Trà túi lọc được loại bỏ túi lọc, xay nhỏ đồng nhất. Cao lỏng được trộn đều đồng nhất. Tiến hành xử lý các mẫu song song theo quy trình xử lý mẫu bảng 3.4. Bảng 3.4: Khảo sát quy trình xử lý mẫu Quy trình 1 Quy trình 2 Quy trình 3 Kiềm hóa mẫu bằng NH3 đặc trong bình cầu. Sau 1 giờ, thêm hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH, siêu âm 30 phút mỗi lần đến khi chiết kiệt hoạt chất. Cô dịch chiết đến cắn, hòa tan cắn bằng HCl 0,1N. Loại tạp bằng CHCl3. Kiềm hóa bằng NH3 và chiết lỏng – lỏng bằng CHCl3. Kiềm hóa mẫu bằng NH3 đặc trong bình cầu. Sau 1 giờ, thêm hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH, đun hồi lưu 1 giờ mỗi lần đến khi chiết kiệt hoạt chất. Cô dịch chiết đến cắn, hòa tan cắn bằng HCl 0,1N, loại tạp bằng dung môi hữu cơ. Kiềm hóa và chiết lỏng – lỏng bằng CHCl3. Thêm nước nóng vào mẫu. Sau 30 phút, acid hóa mẫu bằng acid acetic đến pH 4. Loại tạp bằng light petroleum và CHCl3. Kiềm hóa dịch acid đến pH 9,0 bằng NH3 đặc. Chiết lỏng – lỏng bằng CHCl3. 30 Khảo sát và so sánh hiệu suất chiết của 3 quy trình trên dựa trên hàm lượng crinamidin của mỗi phương pháp trong cùng điều kiện sắc ký. Tiến hành làm 3 mẫu, mỗi mẫu tiêm lặp 2 lần đối với mỗi dạng bào chế. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.5 và hình 3.9. Bảng 3.5: Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu Quy trình Spic crinamidin trung bình (n = 3) Spic cafein trung bình (n = 3) Nồng độ (µg/mL) Hàm lượng (µg/g) Viên nang cứng 1 1105 1201 14,80 ± 0,60 147,4 ± 6,0 2 1421 1289 16,86 ± 0,71 167,7 ± 7,1 3 800 1174 12,10 ± 0,63 121,6 ± 6,3 Trà túi lọc 1 1707 1328 18,93 ± 0,66 188,7 ± 6,6 2 1821 1255 20,80 ± 0,75 200,4 ± 7,5 3 1226 1232 15,65 ± 0,82 157,1 ± 8,2 Cao lỏng 1 1116 1198 14,93 ± 0,72 149,9 ± 7,2 2 1228 1164 16,32 ± 0,70 163,3 ± 7,0 3 1076 1217 14,39 ± 0,61 143,1 ± 6,1 31 Hình 3.9: Biểu đồ kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu trên ba nền mẫu Nhìn chung, trên cả 3 đối tượng nền mẫu, quy trình chiết sử dụng kiềm trong dung môi hữu cơ (quy trình 1 và quy trình 2) cho hiệu suất chiết cao hơn quy trình chiết sử dụng dung dịch acid (quy trình 3), phù hợp với tài liệu tham khảo [9]. Có sự khác biệt lớn về hàm lượng crinamidin đối với các nền viên nang cứng và trà túi lọc, tuy nhiên không có sự khác biệt nhiều về hàm lượng crinamidin đối với nền cao lỏng khi phân tích khi phân tích theo 3 quy trình xử lý mẫu trên. Quy trình 1 được cải tiến dựa trên phương pháp xử lý mẫu của DĐVN IV bản bổ sung, phải siêu âm và lọc 5 lần, cần nhiều thời gian và khả năng mất mẫu trong quá trình xử lý lớn hơn. Quy trình 2 được cải tiến dựa trên quy trình 1 bằng cách thay thế 5 lần siêu âm bằng 2 lần đun hồi lưu. Quy trình 2 cho kết quả định lượng với hiệu suất chiết cao hơn, tiết kiệm thời gian và dung môi hơn so với quy trình 1. Vì vậy, quy trình 2 được lựa chọn để tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất như: tỷ lệ dung môi chiết, số lần chiết xuất và thời gian chiết xuất. Quy trình xây dựng và các yếu tố khảo sát được thể hiện trong hình 3.10. 32 Cân 2,5 g mẫu đã đồng nhất. Kiềm hóa bằng NH3. Để yên 1 giờ Thêm dung môi CHCl3 : MeOH và khảo sát tỷ lệ dung môi Đun sôi hồi lưu, lọc và khảo sát số lần đun hồi lưu, thời gian đun hồi lưu Cô dịch chiết đến cắn. Hòa tan bằng HCl 0,1N Loại tạp bằng CHCl3. Kiềm hóa dịch acid. Chiết lỏng – lỏng bằng CHCl3. Bổ sung chuẩn nội. Phân tích trên thiết bị GC-MS/MS Hình 3.10: Sơ đồ quy trình chiết xuất crinamidin từ chế phẩm TNHC 3.1.2.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu a. Khảo sát số lần chiết mẫu Số lần chiết mẫu là yếu tố quyết định hiệu suất chiết xuất. Không thể chiết kiệt hoạt chất nếu số lần chiết ít. Ngược lại số lần chiết quá nhiều gây lãng phí thời gian, công sức và dung môi. Để đạt được hiệu suất chiết cao nhất, tiết kiệm thời gian và dung môi, tiến hành khảo sát số lần chiết mẫu để lựa chọn số lần chiết tối ưu cho quy trình xử lý. Chiết mẫu với quy trình đã xây dựng. Giữ các thông số cố định và thay đổi số lần chiết mẫu. Sử dụng 100 mL hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 cho lần chiết đầu tiên và 50 mL hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 cho mỗi lần chiết tiếp theo, đun sôi hồi lưu 1 giờ cho mỗi lần chiết mẫu. Tiến hành làm 3 mẫu, mỗi mẫu tiêm lặp 2 lần. Lấy giá trị trung bình. Kết quả khảo sát được thể hiện trong bảng 3.6 và hình 3.11. 33 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát số lần chiết mẫu Số lần chiết mẫu Spic crinamidin trung bình (n = 3) Spic cafein trung bình (n = 3) Nồng độ (µg/mL) Hàm lượng (µg/g) Viên nang cứng 1 1333 1586 14,93 ± 0,77 149,0 ± 7,7 2 1863 1882 16,57 ± 0,73 166,1 ± 7,3 3 1615 1624 16,62 ± 0,85 166,9 ± 8,5 Trà túi lọc 1 1431 1416 16,80 ± 0,87 168,9 ± 8,7 2 1667 1348 20,80 ± 0,69 199,5 ± 6,9 3 1932 1527 19,59 ± 0,81 196,8 ± 8,1 Cao lỏng 1 1169 1624 13,61 ± 0,64 138,6 ± 6,4 2 1595 1853 15,15 ± 0,75 150,3 ± 7,5 3 1064 1317 14,57 ± 0,68 146,1 ± 6,8 Nhìn chung, hiệu suất chiết tăng khi tăng số lần chiết, tuy nhiên không có sự chênh lệch nhiều về hàm lượng crinamidin giữa 2 lần và 3 lần chiết. Vì vậy, để đạt được kết quả tối ưu nhất cho quy trình xử lý mẫu đồng thời tiết kiệm nhất, lựa chọn 2 lần chiết cho quy trình xử lý mẫu. Kết quả khảo sát số lần chiết xuất được thể hiện qua biểu đồ hình 3.11. 34 Hình 3.11: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và số lần chiết mẫu b. Khảo sát thời gian chiết Thời gian chiết là yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết và lượng tạp trong mẫu. Thời gian chiết xuất ngắn, không chiết kiệt được hoạt chất. Tuy nhiên thời gian chiết xuất quá dài sẽ kéo theo nhiều tạp, mất nhiều thời gian. Để khảo sát thời gian chiết xuất tối ưu cho mỗi lần chiết xuất, tiên hành chiết mẫu theo quy trình đã xây dựng. Giữ các thông số cố định và thay đổi thời gian chiết mẫu ở các thời điểm 30 phút; 60 phút; 90 phút và 120 phút. Đun sôi hồi lưu 2 lần. Sử dụng 100 mL hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 cho lần chiết đầu tiên và 50 mL hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 cho lần chiết thứ hai. Tiến hành làm 3 mẫu, mỗi mẫu tiêm lặp 2 lần. Kết quả khảo sát được thể hiện qua bảng 3.7 và hình 3.12. 35 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu Thời gian chiết mẫu Spic crinamidin trung bình (n = 3) Spic cafein trung bình (n = 3) Nồng độ (µg/mL) Hàm lượng (µg/g) Viên nang cứng 30 phút 1607 1988 14,58 ± 0,81 145,5 ± 8,1 60 phút 1658 1625 16,91 ± 0,76 169,7 ± 7,6 90 phút 1800 1813 16,60 ± 0,71 166,7 ± 7,1 120 phút 2060 2024 16,88 ± 0,77 169,5 ± 7,7 Trà túi lọc 30 phút 1496 1523 16,49 ± 0,76 163,6 ± 7,6 60 phút 1688 1375 19,18 ± 0,82 190,5 ± 8,2 90 phút 1842 1578 18,52 ± 0,79 186,8 ± 7,9 120 phút 2274 1862 19,11 ± 0,74 191,7 ± 7,4 Cao lỏng 30 phút 1008 1578 12,72 ± 0,64 128,6 ± 6,4 60 phút 1460 1704 15,11 ± 0,75 152,3 ± 7,5 90 phút 1754 1941 15,63 ± 0,68 156,1 ± 6,8 120 phút 1345 1428 16,04 ± 0,75 160,7 ± 7,5 36 Hình 3.12: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và thời gian chiết mẫu Nhận thấy hiệu suất tăng khi tăng thời gian chiết. Qua biểu đồ thấy hiệu suất chiết tăng khi tăng thời gian chiết từ 30 lên 60 phút trên cả 3 đối tượng nền mẫu, và không có sự thay đổi đáng kể về hiệu suất chiết thời điểm 60 phút và 2 thời điểm 90 phút và 120 phút. Vì vậy để đạt được kết quả tối ưu nhất đồng thời tiết kiệm thời gian và dung môi, khoảng thời gian 60 phút được lựa chọn cho mỗi lần chiết mẫu. c. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết Độ phân cực của dung môi phụ thuộc vào tỷ lệ các thành phần trong hỗn hợp dung môi chiết, ảnh hưởng đến hiệu suất chiết hoạt chất ra khỏi nền mẫu. Chiết mẫu với quy trình đã xây dựng. Giữ các thông số cố định và thay đổi tỷ lệ MeOH của hỗn hợp dung môi chiết mẫu (CHCl3 và MeOH) từ 25%; 50%; 75% và 100%. Đun sôi hồi lưu 2 lần, mỗi lần 1 giờ. Sử dụng 100 mL hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 cho lần chiết đầu tiên và 50 mL hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 cho lần chiết thứ hai. Mỗi tỷ lệ làm 3 mẫu, mỗi mẫu tiêm lặp 2 lần. Kết quả khảo sát được thể hiện qua bảng 3.8 và hình 3.13. 37 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết Tỷ lệ %MeOH trong hỗn hợp dung môi CHCl3:MeOH Spic crinamidin trung bình (n = 3) Spic cafein trung bình (n = 3) Nồng độ (µg/mL) Hàm lượng (µg/g) Viên nang cứng 25% 2835 2798 16,91 ± 0,69 169,0 ± 6,9 50% 2592 2630 16,59 ± 0,84 165,4 ± 8,4 75% 2517 2601 16,39 ± 0,74 163,6 ± 7,4 100% 2735 2819 16,42 ± 0,77 164,1 ± 7,7 Trà túi lọc 25% 3035 2532 18,86 ± 0,53 186,4 ± 5,3 50% 2599 2473 17,21 ± 0,64 173,5 ± 6,4 75% 2513 2638 16,12 ± 0,65 162,8 ± 6,5 100% 2435 2325 17,17 ± 0,79 170,4 ± 7,9 Cao lỏng 25% 1988 2415 14,67 ± 0,57 147,3 ± 5,7 50% 1800 2317 14,15 ± 0,73 142,1 ± 7,3 75% 1880 2535 13,76 ± 0,66 138,8 ± 6,6 100% 1883 2612 13,53 ± 0,62 136,2 ± 6,2 38 Hình 3.13: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và tỷ lệ dung môi chiết Nhìn chung, tỷ lệ 25% methanol (tức là tỷ lệ CHCl3 : MeOH = 3 : 1) cho hiệu suất chiết cao nhất trên cả 3 đối tượng nền mẫu, phù hợp với tài liệu tham khảo [38]. Đối với nền cao lỏng, hàm lượng crinamidin không thay đổi nhiều bởi tỷ lệ CHCl3 và MeOH. Vì vậy trong nghiên cứu này, tỷ lệ hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 được sử dụng làm dung môi chiết mẫu. Sau khi khảo sát các điều kiện cho quy trình xử lý mẫu trên ba nền mẫu: nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng, chúng tôi xây dựng quy trình xử lý mẫu chung và tối ưu theo sơ đồ hình 3.14. 39 Hình 3.14: Quy trình xử lý mẫu tối ưu Cân 2,5 g mẫu sau khi đồng nhất. Kiềm hóa bằng NH3 đến pH 9,0. Để yên 1 giờ Lần 1: thêm 100 mL dung môi CHCl3 : MeOH (3 : 1). Lần 2: thêm 50 mL dung môi CHCl3 : MeOH (3 : 1). Đun hồi lưu 1 giờ, lọc Gộp dịch chiết, cô đến cắn. Hòa tan cắn bằng 20 mL HCl 0,1N Loại tạp bằng CHCl3. Kiềm hóa dịch acid bằng NH3 đặc Chiết lỏng – lỏng bằng CHCl3 (lần 1: 15 mL, lần 2: 8 mL) Thêm chuẩn nội cafein. Định mức 25 mL bằng CHCl3 Phân tích trên thiết bị GC-MS/MS 3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 3.2.1. Tính thích hợp của hệ thống Tiến hành sắc ký lặp lại dung dịch chuẩn crinamidin có nồng độ 20 µg/mL chứa chuẩn nội cafein 0,5 µg/mL. Ghi lại thời gian lưu và diện tích crinamidin qua 6 lần sắc ký. Kết quả thời gian lưu, diện tích pic của crinamidin và cafein, tỷ lệ diện tích crinamidin/cafein được thể hiện trong bảng 3.9. 40 Bảng 3.9: Thời gian lưu và diện tích pic qua 6 lần tiêm mẫu Thời gian lưu crinamidin (phút) Diện tích pic crinamidin Thời gian lưu cafein (phút) Diện tích pic cafein Tỷ lệ diện tích pic crinamidin/ cafein Lần tiêm 1 16,737 982 8,054 1180 0,83220 Lần tiêm 2 16,732 1040 8,058 1233 0,84347 Lần tiêm 3 16,732 924 8,071 1145 0,80699 Lần tiêm 4 16,737 950 8,063 1178 0,80645 Lần tiêm 5 16,737 954 8,075 1254 0,76077 Lần tiêm 6 16,732 913 8,075 1135 0,80441 Trung bình 16,735 960,5 8,066 1187,5 0,80905 RSD (%) 0,02 4,78 0,11 3,99 3,53 Nhận xét: Từ kết quả trên nhận thấy độ lệch chuẩn trung bình của thời gian lưu và diện tích pic crinamidin của cùng dung dịch chuẩn qua 6 lần tiêm đều nằm trong giới hạn cho phép. Vì vậy, hệ thống đạt yêu cầu cho phân tích. Khi sử dụng cafein làm chuẩn nội để định lượng crinamidin, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của tỷ lệ diện tích pic crinamidin/diện tích pic cafein qua các lần tiêm là 3,53%; giá trị này nhỏ hơn độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic crinamidin khi không sử dụng chuẩn nội là 4,78%. Vậy việc sử dụng chuẩn nội cafein là hoàn toàn hợp lý trong nghiên cứu này. 3.2.2. Tính đặc hiệu, chọn lọc Tiến hành sắc ký dung môi CHCl3; dung dịch placebo viên nang chứa chuẩn nội cafein 0,5 µg/mL; dung dịch placebo cao lỏng chứa chuẩn nội cafein 0,5 µg/mL; dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL và mẫu thêm chuẩn crinamidin chứa chuẩn nội cafein 0,5 µg/mL. So sánh thời gian lưu của dung dịch chuẩn và mẫu thêm chuẩn crinamidin. 41 Sử dụng kỹ thuật tính số điểm điểm IP (điểm nhận dạng – identification point) để xác định tính đặc hiệu của phương pháp GC-MS/MS. Đối với kỹ thuật GC- MS/MS, mỗi ion mẹ được tính 1 điểm và mỗi ion con được tính 1,5 điểm [12], [37]. Crinamidin được đặc trưng bởi 1 ion mẹ và 3 ion con, số điểm IP đạt được là 5,5. Cafein được đặc trưng bởi 1 ion mẹ và 2 ion con, số điểm IP đạt được là 4. Do đó đều đạt số điểm IP (điểm nhận dạng – identification point) quy định là 4 của EC về nhận dạng pic. Hình 3.15: Sắc ký đồ dung môi CHCl3 Hình 3.16: Sắc ký đồ placebo viên nang thêm chuẩn nội cafein 42 Hình 3.17: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chuẩn nội cafein Hình 3.18: Sắc ký đồ của dung dịch thêm chuẩn crinamidin 43 Nhận xét: Trên sắc ký đồ dung môi không xuất hiện pic crinamidin và cafein. Trên sắc ký đồ của 3 dung dịch placebo không xuất hiện pic crinamidin. Trên sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn có xuất hiện các pic với thời gian lưu tương tự mẫu chuẩn. Chọn pic của ion có cường độ mạnh nhất của crinamidin là pic cơ bản, chấp nhận là 100 để tính cường độ tương đối của các ion khác. Tỷ lệ cường độ tương đối các ion của crinamidin được tính toán và trình bày trong bảng 3.10 và hình 3.19. Bảng 3.10: Tỷ lệ các ion crinamidin của dung dịch thêm chuẩn crinamidin Chất phân tích Ion m/z Tỷ lệ cường độ ion chuẩn Khoảng sai số tối đa cho phép (%) Tỷ lệ cường độ ion trên mẫu thêm chuẩn Crinamidin 317/288 38,1 ± 30 38,3 317/244 17,2 ± 30 17,5 Hình 3.19: Sắc ký đồ tỷ lệ ion của crinamidin và cafein của dung dịch chuẩn 20 µg/mL Nhận xét: Tỷ lệ cường độ tương đối các ion trên mẫu thêm chuẩn nằm trong giới hạn cho phép theo quy định châu Âu (EC/657/2002). Phương pháp sắc ký có tính đặc hiệu cao. 44 3.2.3. Khoảng tuyến tính Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn crinamidin có nồng độ thay đổi từ 5 đến 50 µg/mL và chuẩn nội cafein có nồng độ cố định 0,5 µg/mL. Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu ngoại chuẩn và nội chuẩn tương ứng vào nồng độ. Kết quả được thể hiện qua bảng 3.11 và hình 3.20. Bảng 3.11: Phương trình đường chuẩn crinamidin và hệ số tương quan tuyến tính Nồng độ crinamidin (µg/mL) Spic crinamidin Spic cafein Phương trình đường chuẩn Hệ số tương quan (R 2 ) 5 79 1372 y = 0,0890747 x – 0,444131 R² = 0,9970 10 620 1509 20 1964 1566 40 4696 1442 50 5881 1495 Hình 3.20: Đồ thị đường chuẩn crinamidin, chuẩn nội cafein y = 0,0890747 x - 0,444131 R ^ 2 = 0,99697186 y 0,1 x 45 Nhận xét: đường chuẩn có hệ số tương quan R2 > 0,995 do đó trong khoảng nồng độ 5 – 50 µg/mL (tương ứng với 50 đến 500 µg/g) có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ tương ứng. Phù hợp để định lượng các chế phẩm có hàm lượng hoạt chất crinamidin nhỏ. 3.2.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn với nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu chất phân tích. Phân tích lặp lại 6 lần, xác định tỷ lệ S/N tự động theo phần mềm của máy. Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ tại đó tỷ lệ S/N = 3, giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N = 10. Kết quả xác định LOD và LOQ được thể hiện trong bảng 3.12 và hình 3.21. Bảng 3.12: Giá trị LOD và LOQ của crinamidin LOD LOQ Nồng độ (µg/mL) 0,3 1 Hàm lượng (µg/g) 3 10 Hình 3.21: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 0,3 µg/mL 46 Nhận xét: Với giá trị LOQ ở nồng độ 1 µg/mL (tương ứng 10 µg/g) cho thấy phương pháp hoàn toàn phù hợp để ứng dụng xác định hàm lượng crinamidin trong các chế phẩm có chứa TNHC, đặc biệt ở các chế phẩm thuốc và TPBVSK kết hợp nhiều thành phần, hàm lượng crinamidin giảm nhiều lần so với trong dược liệu TNHC. 3.2.5. Độ lặp lại Tiến hành phân tích lặp lại 6 lần trên 3 nền mẫu: viên nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng. Xử lý và phân tích trên thiết bị GC-MS/MS theo quy trình đã xây dựng. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua hệ số biến thiên RSD (%). Các kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp được thể hiện từ bảng 3.13 đến bảng 3.15, từ hình 3.22 đến hình 3.24. Bảng 3.13: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền viên nang cứng STT Spic crinamidin Spic cafein Nồng độ (µg/mL) Hàm lượng (µg/g) 1 2644 1567 17,07 167,5 2 3420 1912 17,91 172,7 3 2793 1827 15,76 157,3 4 2791 1722 16,52 162,9 5 2395 1630 15,27 150,7 6 3080 1979 15,99 158,3 TB 161,6 RSD(%) 4,9 47 Bảng 3.14: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền trà túi lọc STT Spic crinamidin Spic cafein Nồng độ (µg/mL) Hàm lượng (µg/g) 1 3774 1957 19,60 189,5 2 3864 1801 20,99 205,7 3 4343 1960 21,86 211,1 4 3714 1752 20,17 204,9 5 3321 1715 19,13 191,6 6 3259 1645 19,50 193,4 TB 199,4 RSD(%) 4,5 Bảng 3.15: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền cao lỏng STT Spic crinamidin Spic cafein Nồng độ (µg/mL) Hàm lượng (µg/g) 1 2248 1870 13,06 127,8 2 2293 2089 12,20 120,4 3 1854 1529 13,15 129,6 4 2311 2046 12,46 121,8 5 2058 1558 14,04 136,8 6 1914 1615 12,92 126,3 TB 127,1 RSD(%) 4,6 48 Hình 3.22: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền viên nang cứng Hình 3.23: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền trà túi lọc Hình 3.24: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền cao lỏng Các kết quả trên cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt với hệ số biến thiên RSD (%) nằm trong khoảng từ 4,5% - 4,9%; đều < 5,3%. Do đó độ lặp lại trên ba đối tượng nền mẫu: nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng đều đạt yêu của AOAC. 3.2.6. Độ thu hồi Để khảo sát độ đúng của phương pháp, thêm chuẩn ở 3 nồng độ khác nhau (thấp, trung bình, cao) vào 3 nền mẫu khác nhau bao gồm: viên nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng. Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng trên 3 đối tượng nền mẫu riêng biệt: nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng. Độ chính xác của phương pháp được đánh giá thông qua độ thu hồi R (%). Kết quả đánh giá độ thu hồi trên nền mẫu nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng được thể hiện từ bảng 3.16 đến bảng 3.18. 49 Bảng 3.16: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền viên nang cứng Crinamidin/mẫu (µg/g) Lượng chuẩn crinamidin thêm vào (µg) Spic crinamidin Spic cafein Nồng độ (µg/mL) Hàm lượng (µg/g) Độ thu hồi (%) 82,4 160 1120 1650 14,02 140,0 90,1 1108 1614 14,39 143,8 96,0 841 1234 14,17 141,5 92,5 200 991 1386 15,72 157,2 93,5 851 1180 16,03 160,1 97,2 870 1221 15,59 155,5 91,5 240 927 1227 17,62 175,8 97,5 1153 1546 17,16 171,5 92,8 1146 1509 17,81 177,6 99,4 Hình 3.25: Sắc ký đồ mẫu thực viên nang cứng Hình 3.26: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 160 µg chuẩn crinamidin 50 Hình 3.27: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 200 µg chuẩn crinamidin Hình 3.28: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 240 µg chuẩn crinamidin Kết quả phân tích độ thu hồi R% trên nền viên nang cứng nằm trong khoảng từ 90,1% - 99,4%, cho thấy phuơng pháp đáp ứng yêu cầu thuộc khoảng giới hạn 90% - 107% của AOAC. Kết quả độ thu hồi trên nền trà túi lọc và cao lỏng được thể hiện trong bảng 3.17 và 3.18. Bảng 3.17: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền trà túi lọc Crinamidin/mẫu (µg/g) Lượng chuẩn crinamidin thêm vào (µg) Spic crinamidin Spic cafein Nồng độ (µg/mL) Hàm lượng (µg/g) Độ thu hồi (%) 88,1 160 1064 2480 14,96 149,5 96,0 1203 2748 15,23 152,0 99,8 1189 2786 14,89 148,8 94,9 200 1367 2885 16,33 163,1 93,8 1529 3177 16,56 165,2 96,4 1307 2751 16,37 163,7 94,5 240 1578 2873 18,64 186,3 102,3 2023 3733 18,41 184,0 99,9 1945 3645 18,16 181,6 97,4 51 Bảng 3.18: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền cao lỏng Crinamidin/mẫu (µg/g) Lượng chuẩn crinamidin thêm vào (µg) Spic crinamidin Spic cafein Nồng độ (µg/mL) Hàm lượng (µg/g) Độ thu hồi (%) 63,2 80 284 811 12,55 125,2 96,9 214 621 12,38 123,7 94,5 195 572 12,27 122,5 92,7 100 291 712 14,34 143,1 99,8 238 575 14,50 144,9 102,2 239 575 14,55 145,7 103,1 120 472 1042 15,69 156,9 97,6 533 1141 16,13 161,1 102,0 705 1516 16,06 160,5 101,4 Nhận xét: Kết quả phân tích độ thu hồi R%:  Độ thu hồi R% trên nền nang cứng nằm trong khoảng từ 90,1% đến 99,4%.  Độ thu hồi R% trên nền trà túi lọc nằm trong khoảng từ 93,8% đến 102,3%.  Độ thu hồi R% trên nền cao lỏng nằm trong khoảng từ 92,7% đến 103,1%. Phuơng pháp xây dựng trên 3 nền mẫu: nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng đều đáp ứng yêu cầu thuộc khoảng giới hạn 90% - 107% của AOAC. Phương pháp đã xây dựng có độ lặp lại, độ thu hồi tốt, đạt yêu cầu của AOAC, phù hợp để xác định hàm lượng crinamidin trong nền chế phẩm khác nhau, với hàm lượng crinamidin giảm nhiều lần so với trong nguyên liệu lá TNHC. 52 3.3. So sánh phƣơng pháp xây dựng với phƣơng pháp tiêu chuẩn Dƣợc điển Việt Nam IV 3.3.1. So sánh về phương pháp thực hiện Xử lý mẫu sơ bộ: mẫu lá khô TNHC được nghiền nhỏ và trộn đồng nhất. Xác định hàm ẩm. Tiến hành phân tích song song trên 2 thiết bị HPLC và GC-MS/MS bằng 2 phương pháp được thể hiện trong bảng 3.19. Bảng 3.19: Quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký của phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp xây dựng Phương pháp tiêu chuẩn (HPLC) Phương pháp xây dựng (GC-MS/MS) Quy trình xử lý mẫu Cân chính xác khoảng 2,5 g bột dược liệu (rây qua số 355) vào bình nón nút mài 100 mL. Làm ẩm bằng NH3, để yên 1 giờ. Thêm 50 mL CHCl3 : MeOH (3 : 1), siêu âm 30 phút, lọc. Bã được chiết thêm 4 lần bằng 40 mL hỗn hợp dung môi trên. Gộp dịch chiết, cô cách thủy đến cạn. Dùng HCl 0,1N để hòa tan và chuyển toàn bộ cắn vào bình định mức 20 mL. Định mức bằng HCl 0,1N. Lọc qua màng lọc 0,45µm. Cân chính xác khoảng 2,5 g mẫu vào bình nón nút mài 250 mL. Kiềm hóa bằng NH3 đặc đến pH 9,0, để yên 1 giờ. Thêm 100 mL CHCl3 : MeOH (3 : 1), đun hồi lưu 1 giờ, lọc. Bã được đun sôi hồi lưu 1 giờ với 50 mL hỗn hợp dung môi trên. Gộp dịch chiết, cô quay chân không đến cắn. Sử dụng 20 mL HCl 0,1N để hòa tan và chuyển toàn bộ cắn vào ống ly tâm 50 mL. Quy trình loại tạp Thêm 20mL CHCl3, lắc ngang 3000 vòng/phút trong 30 phút, ly tâm 6000 53 Phương pháp tiêu chuẩn (HPLC) Phương pháp xây dựng (GC-MS/MS) vòng/ phút trong 5 phút. Lấy dịch acid thêm 5 mL NH3, lắc đều. Thêm 15 mL CHCl3, lắc ngang 30 phút, ly tâm. Chuyển dịch CHCl3 vào bình định mức 25 mL. Tiếp tục thêm 8 mL CHCl3, lắc ngang 30 phút, ly tâm. Gộp dịch CHCl3 và định mức 25 mL bằng CHCl3. Lọc qua màng lọc 0,2 µm. Điều kiện sắc ký Thiết bị phân tích Máy HPLC Shimadzu, detector PDA. Máy sắc ký khối phổ hai lần GC-MS/MS (kiểu ba tứ cực) 7000 Tripple Quad, Agilent. Cột Cột Symmetry C18 (250mm x 4,6mm x 5µm) và tiền cột C18 (3,9mm x 5mm x 5µm) DB5-MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) Pha động ACN : đệm phosphate 100 mM pH 3,0 Heli Tốc độ dòng 1,0 mL/phút 1,0 mL/phút Chương trình sắc ký Gradient pha động Gradient chương trình nhiệt độ Thể tích tiêm 20 µL 1 µL Kết quả sắc ký Thời gian lưu 35,5 phút 16,7 phút Tổng thời gian phân tích 65 phút 27 phút 54 Phương pháp xây dựng đã thay bước chiết siêu âm bằng cách đun hồi lưu mẫu. Do đó, quy trình xử lý mẫu của phương pháp xây dựng tiết kiệm thời gian, công sức và dung môi hơn phương pháp tiêu chuẩn. Không dừng lại ở đó, chúng tôi đã cải tiến phương pháp bằng cách loại tạp và thay đổi dung môi để đáp ứng tốt nhất điều kiện sắc ký của máy sắc ký khí khối phổ, bảo vệ cột, tránh nhiễm bẩn bộ phận khối phổ và kéo dài tuổi thọ máy. Phương pháp xây dựng tiết kiệm thời gian sắc ký so với phương pháp tiêu chuẩn, thể tích tiêm nhỏ hơn, độ đặc hiệu cũng tăng lên nhiều lần. Vì vậy, chúng tôi tiến hành so sánh giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) cũng như hàm lượng crinamidin có thể chiết xuất được bằng mỗi phương pháp. 3.3.2. So sánh về giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của hai phương pháp Để xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ nhỏ khác nhau, mỗi nồng độ lặp lại 6 lần. LOD được xác định thông qua đánh giá tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) và được xác định tại nồng độ thu được S/N bằng 3. LOQ được xác định tại nồng độ thu được S/N bằng 10. Kết quả xác định LOD và LOQ được tóm tắt trong bảng 3.20 và sắc đồ của crinamidin tại nồng độ LOD được trình bày như ở hình 3.29 và hình 3.30. Bảng 3.20: Giá trị LOD và LOQ của crinamidin Phương pháp LOD (µg/g) LOQ (µg/g) Tiêu chuẩn DĐVN IV 16 40 Xây dựng 3 10 55 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 min 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 mAU 285nm,4nm (1.00) / 2 0 . 5 0 4 / 3 5 . 7 0 7 Hình 3.29: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 2 µg/mL (HPLC) Hình 3.30: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 0,3 µg/mL (GC-MS/MS) Khi tiến hành sắc ký theo tiêu chuẩn DĐVN IV bằng HPLC, giá trị LOQ của crinamidin là 40 µg/g. Với phương pháp đã xây dựng phân tích bằng GC-MS/MS, giá trị LOQ của crinamidin là 10 µg/g. Nhận thấy định lượng bằng GC-MS/MS có độ đặc hiệu cao hơn so với khi sử dụng HPLC, có thể định lượng những chế phẩm có hàm lượng crinamidin nhỏ hơn nhiều lần so với phương pháp tiêu chuẩn hiện có. 3.3.3. So sánh về hiệu suất của quy trình chiết trên nền mẫu lá TNHC của hai phương pháp Kết quả định lượng crinamidin trên mẫu lá TNHC được thực hiện như sau:  Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 10 đến 100 µg/mL trong HCl 0,1N. Tiến hành sắc ký trên thiết bị HPLC.  Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 5 đến 50 µg/mL trong CHCl3. Tiến hành sắc ký trên thiết bị GC-MS/MS. Xây dựng mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn. Tiến hành trên 3 mẫu thử. Tính hàm lượng crinamidin dựa vào phương trình đường chuẩn đã xây dựng cho mỗi phương pháp. 56 Bảng 3.21: Kết quả phân tích hàm lượng crinamidin trong mẫu chuẩn và thử bằng phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp xây dựng Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.phút) Hàm lượng (µg/g) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic Hàm lượng (µg/g) crinamidin cafein crinamidin cafein Chuẩn crinamidin 5µg/mL 16,814 8,073 79 1372 Chuẩn crinamidin 10µg/mL 35,323 41742 16,741 8,067 620 1509 Chuẩn crinamidin 20µg/mL 35,588 83586 16,737 8,063 1964 1566 Chuẩn crinamidin 40µg/mL 35,195 169925 16,741 8,075 4696 1442 Chuẩn crinamidin 50µg/mL 35,204 228731 16,741 8,079 5881 1495 Chuẩn crinamidin 100µg/mL 35,034 469971 Mẫu Khối lượng (g) Khối lượng (g) Thử 1 2,5035 35,192 70890 138,36 2,5011 16,745 8,029 1871 1700 173,30 Thử 2 2,5066 35,214 73371 142,32 2,5034 16,745 8,024 1886 1882 162,11 Thử 3 2,5071 35,14 70261 137,12 2,5042 16,745 8,024 1695 1611 167,66 TB 35,2363 139,27 16,751 8,054 167,69 RSD (%) 0,46 1,95 0,15 0,3 3,34 57 Hình 3.31: Đường chuẩn crinamidin từ 10 đến 100 µg/mL (HPLC) Hình 3.32: Đường chuẩn crinamidin từ 5 đến 50 µg/mL, chuẩn nội cafein (GC- MS/MS) Nhận xét: Trên cùng một đối tượng mẫu lá, phương pháp xây dựng cho hiệu suất chiết cao hơn so với phương pháp tiêu chuẩn. Phương pháp đã xây dựng cho hiệu suất chiết cao, giới hạn phát hiện nhỏ, độ nhạy và độ chọn lọc cao có thể định lượng trên các chế phẩm hàm lượng crinamidin nhỏ đồng thời có sự kết hợp của nhiều thành phần dược liệu và tá dược, nền mẫu phức tạp. 3.4. Kết quả xác định hàm lƣợng crinamidin trên một số mẫu thuốc và TPBVSK Trên cơ sở phương pháp đã xây dựng, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng để xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu thuốc, cao và TPBVSK đã được mã hóa từ M1 đến M48. Kết quả xác định hàm lượng crinamidin và trình bày trong bảng 3.22 và bảng 3.23. 58 Bảng 3.22: Kết quả xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu thuốc và TPBVSK STT Mẫu thực đƣợc mã hóa Dạng bào chế Hàm lƣợng (µg/viên) 1 M1 (*) Viên nang cứng 206,9 2 M2 Viên nang cứng 45,0 3 M3 Viên nang cứng (-) 4 M4 Viên nang cứng 40,1 5 M5 Viên nang cứng 33,4 6 M6 Viên nang cứng 42,2 7 M7 Viên nang cứng 19,5 8 M8 Viên nang cứng 18,3 9 M9 Viên nang cứng 35,6 10 M10 Viên nang cứng 103,8 11 M11 Viên nang cứng (-) 12 M12 Viên nang cứng (-) 13 M13 Viên nang cứng 42,9 14 M14 Viên nang cứng 94,9 15 M15 Viên nang cứng (-) 16 M16 Viên nang cứng (-) 17 M17 Viên nang cứng (-) 18 M18 Viên nang cứng (-) 19 M19 Viên nang cứng (-) 20 M20 Viên nang cứng 60,2 21 M21 Viên nang cứng 105,3 22 M22 Viên nang cứng 54,0 23 M23 Viên nang cứng (-) 24 M24 Viên nang cứng 223,7 25 M25 Viên nén 117,8 26 M26 Viên nén 110,5 59 STT Mẫu thực đƣợc mã hóa Dạng bào chế Hàm lƣợng (µg/viên) 27 M27 Viên nén (-) 28 M28 Viên nén 181,4 29 M29 Viên nén 54,6 30 M30 Viên nén 100,9 Bảng 3.23: Kết quả xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu cao và trà túi lọc STT Mẫu thực đƣợc mã hóa Dạng bào chế Hàm lƣợng (mg/100g) 31 M31 Cao khô 6,33 32 M32 Cao khô 14,2 (**) 33 M33 Cao khô 1,56 34 M34 Cao khô 6,33 35 M35 Cao khô 0,95 36 M36 Cao khô 2,70 37 M37 Cao phun sấy 4,11 38 M38 Cao phun sấy 1,63 39 M39 Cao phun sấy 9,61 40 M40 Cao phun sấy 0,065(***) 41 M41 Cao phun sấy 0,97 42 M42 Cao lỏng 0,26 43 M43 Cao lỏng 2,17 44 M44 Trà túi lọc 1,31 45 M45 Trà túi lọc 0,99 46 M46 Trà túi lọc 2,18 47 M47 Trà túi lọc 1,73 48 M48 Trà túi lọc 2,05 Chú thích: (-) là không phát hiện. 60 (*): Mẫu thuốc thảo dược (**) : Khối lượng cân mẫu là 1 g. (***) : Khối lượng cân mẫu là 5 g Nhận xét: Qua khảo sát 48 mẫu cao, thuốc và TPBVSK trên thị trường, nhận thấy hàm lượng crinamidin trong các chế phẩm thay đổi trong khoảng rộng, cụ thể:  Hàm lượng crinamidin trong 30 chế phẩm dạng viên (viên nang cứng và viên nén) dao động trong khoảng từ 0 đến 223,7 µg/viên. Trong đó có 10 mẫu không phát hiện crinamidin, chủ yếu ở dạng viên nang cứng.  Hàm lượng crinamidin trong 13 mẫu dạng cao thay đổi rộng, cụ thể: dao động từ 0,95 mg/100g đến 14,2 mg/100g đối với dạng cao khô, từ 0,065 mg/100g đến 9,61 mg/100g đối với dạng cao phun sấy và cao lỏng. Điều này cho thấy chất lượng nguyên liệu đưa vào sản xuất chưa được chuẩn hóa và/hoặc quy trình chiết xuất chưa được tối ưu hóa.  Hàm lượng crinamidin trong 5 mẫu trà túi lọc đồng đều hơn do quy trình sản xuất đơn giản, chỉ bao gồm xay thô và đóng gói. 61 Phần 4. BÀN LUẬN 4.1. Về phƣơng pháp chiết xuất crinamidin từ các chế phẩm chứa TNHC Trên cơ sở 2 phương pháp chính chiết alkaloid từ dược liệu [9]: - Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ ít phân cực cho hiệu suất chiết cao do dịch chiết rút ra sạch, dễ tinh chế loại tạp. Hiện nay, đây vẫn là phương pháp được sử dụng nhiều để chiết alkaloid từ dược liệu, đặc biệt là các dược liệu có nhiều chất nhầy có độ trương nở cao. - Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước có ưu điểm là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, thiết bị đơn giản, đầu tư ít. Tuy nhiên dịch chiết rút ra lẫn nhiều tạp, mất mát nhiều trong khâu tinh chế nên thường cho hiệu suất chiết thấp. Qua thực tế nghiên cứu, nhận thấy phương pháp chiết kiềm trong dung môi hữu cơ cho hiệu suất cao hơn so với phương pháp chiết alkaloid bằng dung dịch acid loãng, phù hợp với tài liệu tham khảo [9]. Vì vậy, với mục đích tạo được hiệu suất chiết cao nhất trong thời gian chiết xuất ngắn nhất phục vụ việc định lượng một cách chính xác nhất, cần lựa chọn và cải tiến phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ dựa trên phương pháp tiêu chuẩn của DĐVN IV. Tiến hành khảo sát trên 3 đối tượng nền mẫu: nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng nhằm xây dựng phương pháp chiết chung áp dụng cho các nền mẫu của các chế phẩm chứa TNHC. 4.2. Về xác định hàm lƣợng crinamidin bằng GC-MS/MS GC-MS/MS là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có độ lặp lại tốt nên rất thích hợp để phân tích các chế phẩm chứa TNHC. DĐVN IV bản bổ sung đã đưa ra tiêu chuẩn cho hàm lượng crinamidin trong lá TNHC (Crinum latifolium L.) bằng HPLC. Đây là phương pháp phổ biến, có thể áp dụng đại trà tại các đơn vị kiểm nghiệm tuy nhiên tiêu chuẩn này chỉ dừng lại ở đối tượng nguyên liệu lá TNHC. Bên cạnh đó, chế phẩm TNHC trên thị trường vô cùng phong phú và đa dạng, được bào chế từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, theo tiêu chuẩn và phương pháp của từng cơ sở sản xuất, do đó hàm lượng crinamidin không đồng nhất 62 giữa các cơ sở sản xuất và giữa các dạng bào chế. Ngoại trừ trà túi lọc có quy trình sản xuất đơn giản, chỉ bao gồm xay thô và đóng gói, các chế phẩm khác đều trải qua quá trình chế biến và kết hợp với nhiều thành phần dược liệu và tá dược khác nhau, do đó hàm lượng crinamidin giảm nhiều lần so với nguyên liệu lá TNHC đồng thời nền mẫu trở nên phức tạp hơn. Phương pháp xây dựng sử dụng chuẩn nội cafein, kết quả thu được độ lặp lại tốt hơn so với khi không có chuẩn nội và được biểu thị bằng RSD (%) giữa các lần tiêm. Cafein là alkaloid nhân purin tìm thấy trong hạt cà phê và các bộ phận của cây chè (Camellia sinensis L.) [9], cacao (Theobroma cacao L.), cây cô la (Cola sp.) [10], công thức phân tử: C8H10N4O2 (M = 194,19 g/mol). Cafein ở dạng tinh thể, không màu, không mùi, vị đắng. Thăng hoa ở 178oC, nhiệt độ nóng chảy 238oC. Tan nhiều trong nước và CHCl3 [36]. Cafein có tác dụng trợ tim và lợi tiểu nhẹ [9], kích thích thần kinh trung ương, tăng cường sự tỉnh táo, có thể gây nhịp tim nhanh, khả năng gây nghiện [28]. Khoảng tuyến tính giữa nồng độ và tỷ lệ diện tích pic crinamidin/diện tích cafein với R2 = 0,9970 > 0,995 trong khoảng nồng độ từ 5 đến 50 µg/mL (tương ứng với 50 – 500 µg/g). Phương pháp xây dựng có độ lặp lại tốt, độ thu hồi trên ba nền mẫu khác nhau (viên nang cứng, trà túi lọc, cao lỏng) đều đạt yêu cầu của AOAC. Do đó phương pháp này phù hợp để xác định crinamidin trong các chế phẩm TNHC. Tuy nhiên, chỉ ba đối tượng nền mẫu của các chế phẩm phổ biến được lựa chọn để thẩm định mà chưa thẩm định được trên tất cả các đối tượng nền mẫu. Qua thực nghiệm so sánh hiệu quả của phương pháp tiêu chuẩn của DĐVN IV sử dụng phương pháp HPLC và phương pháp xây dựng sử dụng kỹ thuật GC- MS/MS, đồng thời tham khảo tài liệu [11], nhận thấy phương pháp xây dựng cho hiệu suất chiết cao hơn, LOD và LOQ nhỏ hơn nhiều lần, có thể định lượng chế phẩm hàm lượng nhỏ hơn nhiều lần, tiết kiệm thời gian và dung môi, hóa chất. Vì vậy phương pháp xây dựng phù hợp trong việc góp phần tiêu chuẩn hóa các chế phẩm có chứa thành phần TNHC. 4.3. Ứng dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng crinamidin trên mẫu thực 63 Qua xác định hàm lượng crinamidin từ 48 mẫu viên nang cứng, viên nén, trà túi lọc, cao khô, cao phun sấy và cao lỏng thu thập trên thị trường và mẫu tại Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia. Kết quả hàm lượng crinamidin không đồng đều, cụ thể như sau:  Hàm lượng crinamidin trong 30 chế phẩm dạng viên (viên nang cứng và viên nén) dao động trong khoảng từ 0 đến 223,7 µg/viên. Trong đó có 10 mẫu không phát hiện crinamidin, chủ yếu ở dạng viên nang cứng. Viên nang cứng và viên nén chủ yếu được bào chế từ nguyên liệu lá TNHC với dung môi chiết là nước. Qua khảo sát quy trình chiết xuất nhận thấy việc sử dụng dung môi nước cho hiệu suất chiết không cao, là một trong những nguyên nhân gây ra sự dao động hàm lượng crinamidin trong các chế phẩm. Bên cạnh đó, 10 mẫu chứa hàm lượng crinamidin nhỏ hơn giá trị LOQ có thể do nguồn nguyên liệu không đạt tiêu chuẩn, sử dụng các bộ phận khác của cây TNHC hoặc có sự nhầm lẫn, thay thế bằng các loại dược liệu khác không chứa crinamidin.  Hàm lượng crinamidin trong 13 mẫu cao thay đổi rộng, cụ thể: dao động từ 0,95 mg/100g đến 14,2 mg/100g đối với dạng cao khô, từ 0,065 mg/100g đến 9,61 mg/100g đối với dạng cao phun sấy và cao lỏng. Dạng cao phun sấy và cao lỏng chủ yếu được bào chế từ nguyên liệu lá TNHC với dung môi chiết là nước. Dạng cao lỏng thay đổi trong khoảng rộng do được chiết xuất ban đầu từ hỗn hợp nguyên liệu. Điều này cho thấy chất lượng nguyên liệu đưa vào sản xuất chưa được chuẩn hóa và/hoặc quy trình chiết xuất chưa được tối ưu hóa.  Hàm lượng crinamidin trong 5 mẫu trà túi lọc có hàm lượng đồng đều hơn do quy trình sản xuất đơn giản, chỉ bao gồm xay thô và đóng gói. Hàm lượng crinamidin trong các chế phẩm TNHC thay đổi trong khoảng rộng. Nghiên cứu đã góp phần trong từng bước tiêu chuẩn hóa các chế phẩm chứa thành phần TNHC để đạt được sự đồng đều hàm lượng crinamidin trong các chế phẩm, bảo đảm quyền lợi người sử dụng, đồng thời giải quyết được vấn nạn thuốc và TPBVSK thật hay giả hiện nay. 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1. Đã khảo sát và lựa chọn điều kiện chiết xuất crinamidin từ các chế phẩm viên nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng bằng phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base sử dụng dung môi hữu cơ. Từ đó xây dựng quy trình chiết chung cho cả 3 nền mẫu đã khảo sát. Cụ thể: - Lựa chọn số lần chiết cho mỗi đối tượng là 2 lần. - Lựa chọn được thời gian chiết tối ưu cho mỗi lần chiết xuất là 1 giờ. - Lựa chọn tỷ lệ hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1. 2. Lựa chọn được chuẩn nội là cafein cho định lượng crinamidin. 3. Đã lựa chọn được điều kiện phân tích crinamidin bằng GC-MS/MS - Tách bằng sắc ký khí sử dụng cột DB5-MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ đầu 100oC, giữ 1 phút, tăng nhiệt với tốc độ 20 oC/phút đến 240oC, giữ 1 phút. Tiếp tục tăng 5oC/phút lên đến 290oC, giữ 6 phút. - Phân tích MS/MS với EI 70 eV, chế độ MRM. 4. Đã thẩm định phương pháp xác định hàm lượng crinamidin trong chế phẩm với các kết quả như sau: - Phương pháp có tính chọn lọc đáp ứng yêu cầu; sau khi bắn phá crinamidin qua MS/MS lựa chọn ba ion con, một ion được sử dụng để định lượng và hai ion dùng để khẳng định sự có mặt của crinamidin trong mẫu. Bên cạnh đó lựa chọn hai ion của cafein, một ion con được sử dụng để định lượng và một ion con được dùng để xác nhận. - Khoảng tuyến tính với R2 = 0,9970 trong khoảng nồng độ từ 5 đến 50 µg/mL (tương ứng với 50 – 500 µg/g). - Giới hạn định lượng của crinamidin là 1 µg/mL (tương ứng 10 µg/g). - Độ lặp lại của phương pháp có độ lệch chuẩn tương đối từ 4,5% đến 4,9 % trên các nền nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng. 65 - Độ thu hồi trên nền nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng thuộc khoảng 90,0% đến 107,0% đáp ứng yêu cầu AOAC. 5. So sánh phương pháp đã xây dựng với phương pháp tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV, phương pháp đã xây dựng có các ưu điểm sau: - Quy trình chiết đã xây dựng cho hiệu suất chiết cao hơn so với quy trình chiết của tiêu chuẩn DĐVN IV. Phương pháp đã xây dựng sử dụng chuẩn nội là cafein, độ lặp tốt, giảm thiểu được các sai số trong phân tích. - Phương pháp đã xây dựng có giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng thấp hơn so với phương pháp tiêu chuẩn DĐVN IV, có thể định lượng những mẫu có hàm lượng nhỏ hơn. - Thời gian phân tích bằng GC-MS/MS không quá dài, chỉ khoảng một nửa thời gian phân tích so với HPLC, đồng thời tiết kiệm thời gian hoạt hóa, rửa cột mà HPLC cần cho mỗi lần phân tích. Bên cạnh đó, thời gian lưu của pic chính và chuẩn nội khi phân tích bằng GC-MS/MS ổn định, RSD thời gian lưu tR (các lần phân tích, các ngày phân tích khác nhau) < 2%, ít chịu ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài. 6. Đánh giá xác định hàm lượng crinamidin trên 48 mẫu thuốc và TPBVSK. Trong đó có 10 mẫu không phát hiện crinamidin. Hàm lượng crinamidin trong 38 mẫu còn lại thay đổi trong khoảng rộng giữa các chế phẩm có cùng dạng bào chế. Kiến nghị 1. Áp dụng phương pháp xây dựng tại các phòng thí nghiệm có thiết bị GC-MS/MS để xác định hàm lượng crinamidin đại trà. 2. Tiếp tục nghiên cứu liên phòng thí nghiệm nhằm bổ sung phương pháp đã xây dựng vào hệ thống tiêu chuẩn kiểm nghiệm quốc gia phục vụ cho việc quản lý thuốc và TPBVSK. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2012), Hóa phân tích tập II, NXB Y học. 2. Nguyễn Tuấn Anh, Phạm Thị Giảng, Trịnh Văn Quỳ (2006), "Nghiên cứu định tính, định lượng Crinamidin trong dược liệu và viên nang Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao", Tạp chí KIỂM NGHIỆM THUỐC, 4(4), pp. 10 - 14. 3. Bộ Y Tế (2015), Dược điển Việt Nam IV Bản bổ sung, NXB Y học, Hà Nội, pp. 1182 - 1184. 4. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y Học, pp. PL 125 - 127. 5. Bộ Y Tế, Thông tư ban hành Danh mục thuốc thiết yếu lần VII Bản dự thảo. p. 51 - 52. 6. Chính phủ Nghị định 65/2017/NĐ-CP, Chính sách đặc thù về giống, vốn và công nghệ trong phát triển nuôi trồng, khai thác dược liệu. 2017. 7. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, Hà Nội, pp. 500. 8. Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Ngô Vân Thu, Delome Frederic, Daniel F. Michel Bechi (1999), "Khảo sát alcaloid chiết từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) bằng kỹ thuật GC-MS", Tạp chí Dược học, 4, pp. 9-11. 9. Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học Tập II, NXB Y học. 10. Đỗ Tất Lợi (2015), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, pp. 510 - 512; 915-918; 924-926. 11. Phạm Luận (2014), Phương pháp phân tích sắc ký và chiết tách, Nhà xuất bản Bách khoa Hà Nội. 12. Trần Cao Sơn - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật, NXB khoa học và kỹ thuật. 13. Nguyễn Viết Thân (2004), Những cây thuốc, vị thuốc thường dùng. 14. Nguyễn Nhật Thành, Phạm Thị Ninh, Trần Thị Phương Thảo, Hoàng Minh Châu, Trần Văn Sung (2011), "Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) trồng ở Đồng Nai, Việt Nam", Tạp chí Hóa học, (49), pp. 355 -361. 15. Thủ tướng chính phủ 1976/QĐ-TTg, Quyết định phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030. 2013. 16. Nguyễn Hữu Lạc Thủy (2014), Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alkaloid và flavonoid cho cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae), Luận án tiến sĩ Dược học, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh. 17. Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Nguyễn Hồng Thiên Thanh, Võ Thị Bạch Huệ (2013), "Phân lập và xây dựng chất chuẩn crinamidin từ lá trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L.", Tạp chí Dược học, 441, pp. 38 - 41. 18. Tuệ Tĩnh 3033 cây thuốc đông y y học cổ truyển Tuệ Tĩnh. 19. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Dương Thị Thúy Nga, Nguyễn Thị Tường Vy, Phạm Quỳnh Khoa, Hà Diệu Ly, Hà Hồi, Nguyễn Minh Đức (2016), "Điều chế và thiết lập chất chuẩn crinamidin", Tạp chí Dược học, 477, pp. 52-57. 20. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Phan Thị Phi Phi, Phan Thị Thu Anh (2008), "Tác dụng phục hồi thương tổn tế bào Lympho T và dòng tủy của viên nang Crila trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)", Tạp chí Dược học, 5, pp. 10 - 14. Tiếng Anh 21. Association of Official Analytical Chemists (2002), AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals. 22. Daniel C. Harris (2006), Quantitative Chemical Analysis, seventh edition Craig Bleyer, W.H Freeman and Company, New York, pp. 474-555. 23. David M. Bliesner (2006), Validating chromatographic methods - A pratical guide, Wiley - interscience. 24. Edmond de Hoffmann, Vincent Stroobant (2007), Mass Spectrometry Principles and Applications, Third edition, Wiley, pp. 217-221. 25. Elena Stashenko and Jairo René Martínez (2014), Gas Chromatography - Mass Spectroscopy, Advances in Gas Chromatography, Xinghua Guo (Ed.), Intech. 26. Francesc Viladomat, Giovanna R. Almanza, Carles Codina, Jaume Bastida, William E. Campbell, Shaheed Mathee (1996), "Alkaloid from Brunsvigia orientalis", Phytochemistry, 43(6), pp. 1379-1384. 27. Shibnath Ghosal, Kulwant S. Saini, August Wilhelm Frahm (1983), "Alkaloids of Crinum latifolium", Phytochemistry, 22, pp. 2305 - 2309. 28. Jasvinder Chawla, Amer Suleman (2017), "Neurologic Effects of Caffeine", Medscape. 29. John Refaat, Mohamed S. Kamel, Mahmoud A. Ramadan and Ahmed A. Ali (2013), "Crinum; an endless source of bioactive principles: A review. Part V. Biological profile", International journal of pharmaceutaical sciences and research, 4(4), pp. 1239 - 1252. 30. Jonathan MELVILLE (2014), "GC/MS Analysis of Caffeine", UC Berkeley College of Chemistry. 31. Levin S "Traditional Vietnamese herb Crinum latifolium shows promise for prostate and ovarian health", International Journal of Immunopharmacology, 1(12), pp. 2143-2150. 32. Marcel Jenny, Angela Wondrak , Elissaveta Zvetkova, Nguyen Thi Ngoc Tram, Phan Thi Phi Phi, Harald Schennach, Zoran Culig, Florian Ueberall, Dietmar Fuchs (2011), "Crinum latifolium leave extracts suppress immune activation cascades in peripheral blood mononuclear cells and proliferation of prostate tumor cells", Scientia Pharmaceutica, 79(2), pp. 323 - 336. 33. Nguyen Hai Nam, Kim Yong, et al. (2004), "New constituents from Crinum latifolium with inhibitory effects against tube-like formation of human umbilical venous endothelial cells", Natural Product Research 18(6), pp. 485 - 491. 34. Quincy A. Edwards Sherry-Anne S. Hinkson, Leah D. Garner-O’neale And Sergei M. Kulikov (2015), "Quantification of caffeine in selected beverages via gas chromatography mass spectroscopy", Sadguru Publications. 35. Shigeru Kobayashi, Tokumoto Toshihiro, Kihara Masaru, Imakura Yasuhiro, Shingu Tetsuro, Taira Zenei (1984), "Alkaloidal constituents of Crinum latifolium and Crinum bulbispermum (Amaryllidaceae)", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 32, pp. 3015 - 3022. 36. Tadelech Atomssa and A.V. Gholap (2011), "Characterization of caffeine and determination of caffeine in tea leaves using uv-visible spectrometer", African Journal of Pure and Applied Chemistry, 5(1), pp. 1-8. 37. The Commission of The European Communities (2012), "Comission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results (2002/657/EC)", Official Journal of the European Communities. 38. Nguyen Thi Ngoc Tram, Maya Mitova, Vassya Bankova, Nedyalka Handjieva, Simeon S. Popov (2002), "GC-MS of Crinum latifolium L. Alkaloids", Z. Naturforsch C., 57 (3-4), pp. 239 - 242. 39. Nguyen Thi Ngoc Tram, Zornitza G. Kamenarska, Nedyalka V. Handjieva, Vassya S. Bankova, Simeon S. Popov (2003), "Volatiles from Crinum latifolium", Journal of Essential Oil Research, 15(3), pp. 195-197. 40. Zvetkova E, Wirleitner B, Tram N, Schennach H and Fuchs D (2001), "Aqueous extracts of Crinum latifolium (L.) and Camellia sinensis show immunomodulatory properties in human peripheral blood mononuclear cells", Journal of International Immunopharmacology, 1(12), pp. 2143-2150.