Xác định hàm lượng crystal violet và leuco crystal violet trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp miễn dịch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN TUẤN THÀNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CRYSTAL VIOLET & LEUCO CRYSTAL VIOLET TRONG SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths.Phạm Văn Hùng Ths.Huỳnh Thị Ngọc Liên Năm 2010 MỤC LỤC Phần 1: GIỚI THIỆU 1. Đặt vấn đề Đất nước Việt Nam có lợi thế là có bờ biển dài với nhiều cửa sông, đảo lớn nhỏ, nhiều eo biển, hồ, đầm lầy, kênh gạch ... Hơn nữa, Việt Nam nằm trong khu vực sinh thái nhiệt đới và có diện tích mặt nước lớn nên nguồn lợi thuỷ sản rất phong phú và đa dạng. Ngành thuỷ sản nước ta nói chung và xuất khẩu thuỷ sản nói riêng đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể, trở thành một trong những ngành xuất khẩu chủ lực của đất nước. Trong đó, mặt hàng cá tra, cá ba sa chiếm tỷ trọng khá lớn trong tổng lượng hàng thủy sản xuất khẩu . Tuy nhiên, việc tăng trưởng một cách nhanh chóng của các vùng nuôi trồng thủy sản nhưng không theo quy hoạch và các quy định về thực hành nuôi tốt (GAP) cũng như việc nuôi mật độ cao để gia tăng sản lượng dẫn đến môi trường nước bị ô nhiễm, dịch bệnh xảy ra. Khi đó, vấn đề thuốc và hoá chất để phòng và trị bệnh trở nên cần thiết và quan trọng. Bên cạnh những thuận lợi về trị và phòng chống dịch bệnh, dư lượng hóa chất, kháng sinh còn tồn lưu trong sản phẩm thuỷ sản rất có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng. Hiện nay xuất khẩu thuỷ sản nước ta đang gặp nhiều khó khăn do các rào cản kinh tế từ các thị trường nhập khẩu như Châu Âu (EU), Mỹ, Bắc Mỹ, Úc… đó là vấn đề dịch bệnh và tồn lưu dư luợng hóa chất - kháng sinh trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản…Sự kiện một số lớn container sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu từ Việt Nam bị từ chối ở thị trường Châu Âu, Mỹ, Canada,...trong thời gian qua do phát hiện có dư lượng hóa chất, kháng sinh đã gây ảnh hưởng không nhỏ cho ngành xuất khẩu thủy sản và đời sống người dân lao động nước ta. Crystial violet (CV) và Leuco crystal violet (LCV) là hai hóa chất trong nhiều loại hóa chất, kháng sinh đã bị các nước nhập khẩu như Liên minh Châu Âu và Canada phát hiện có trong sản phẩm cá tra/cá basa vượt mức giới hạn cho phép. Theo quy định của các thị trường EU, Mỹ và Bắc Mỹ đây là hai hoạt chất không được phép có trong sản phẩm thủy sản. Hai hoạt chất này cũng nằm trong Danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dung trong sản xuất kinh doanh thủy sản (Thông tư số 15/2009/TT-BNN , ngày 17 tháng 3 năm 2009 Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn). Tuy nhiên, Crystial violet & Leuco crystal violet vẫn còn lạm dụng tại các cơ sở sản xuất giống và nuôi thủy sản (đặc biệt tại các cơ sở sản xuất giống cá tra). Vấn đề đặt ra là phải xác định được hàm lượng Crystial violet & Leuco crystal violet trong sản phẩm thủy sản nuôi, đặc biệt là kiểm soát nguồn nguyên liệu tại nhà máy chế biến thủy sản một cách nhanh chóng và hiệu quả. Phương pháp thử hấp thu miễn dịch dùng enzym liên kết (ELISA) được sử dụng để Xác định hàm lượng Crystial violet & Leuco crystal violet trong sản phẩm thủy sản có ưu điểm độ nhạy cao, xử lý mẫu đơn giản, cho kết quả nhanh chóng và đặc biệt đầu tư thiết bị tương đối rẻ tiền. Trên cơ sở đó, đề tài “Xác định hàm lượng Crystial violet & Leuco crystal violet trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp miễn dịch” được thực hiện. 2. Mục tiêu của đề tài Xác định giá trị sử dụng của phương pháp “Xác định hàm lượng Crystal violet và Leuco Crystal violet trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp miễn dịch” trên nền mẫu cá tra theo các tiêu chí quy định trong Quyết định 657/2002/EC của Liên Minh Châu Âu. 3. Nội dung của đề tài Thực hiện tối ưu hóa các điều kiện ly trích CV/LCV trong mẫu cá tra. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp “Xác định hàm lượng Crystal violet và Leuco Crystal violet bằng phương pháp miễn dịch” trên nền mẫu cá Tra bằng kit thử của hãng Bioo Scientific. 4. Thời gian thực hiện: Từ tháng 1/2010 đến tháng 5/2010. Phần 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về đối tượng thủy sản làm nghiên cứu (cá tra) 2.1.1 Phân loại Theo hệ thống phân loại của G.V. Lindberg (1974), cá tra thuộc:lớp cá Pisces, Bộ cá Nheo Siluriforms, Họ cá Tra Pangasidae, Giống cá Tra Pangasius, Loài cá Tra Pangasisus hypophthalmus (Sauvage 1878). Tên tiếng Anh của cá tra: Shutchi Catfish. Tên khoa học: Pangasius hypophthalmus. 2.1.2 Đặc điểm Cá Tra là loại cá thuộc loại cá da trơn, sống vùng nước ngọt, phần đầu và phần thân chiếm phần lớn tỉ trọng cá Tra, trong đó phần thân có giá trị thương phẩm và kinh tế nhất. Cá có thể thích nghi trong điều kiện rất khắc nghiệt như: mật độ thả nuôi cao, chất lượng nước không đảm bảo. Là loài cá bản địa nên thích hợp với điều kiện tự nhiên ở ĐBSCL, vì thế quy mô diện tích nuôi rộng lớn. Cá Tra là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, dễ nuôi và đánh bắt nên có khả năng đưa vào chế biến với khối lượng và quy mô lớn. 2.1.3 Tình hình nuôi cá Tra ở ĐBSCL Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp-Phát triển nông thôn, tính đến ngày 14/8/2009, diện tích thả nuôi cá tra của 9 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long là 5.154ha, tăng 2,7 lần so với đầu năm 2009. Cũng đến giữa tháng 8, sản lượng cá tra thu hoạch toàn vùng là 457.000 tấn, gấp 8,2 lần so với đầu năm. Sản lượng cá thu hoạch trong 8 tháng đầu năm tăng liên tục với mức tăng bình quân là 13,5%/tháng. Cá tra hiện được nuôi nhiều nhất ở 3 tỉnh, thành Đồng Tháp, Cần Thơ và An Giang. Theo thống kê của Cục Hải Quan, hiện nay thị trường nhập khẩu cá tra lớn nhất của Việt Nam là Nga, Hoa Kỳ, Chi Lê, Pê-ru và các nước Đông Âu. Tổng sản lượng cá tra xuất khẩu 7 tháng qua là 326.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt hơn 737,1 triệu USD. Tuy sản lượng và giá trị xuất khẩu đều giảm so với cùng kỳ 2008 nhưng trong 3 tháng, từ tháng 5 đến tháng 7, sản lượng và giá trị xuất khẩu cá tra của Việt Nam đều tăng. Theo dự báo của Hiệp Hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam, tình hình xuất khẩu cá tra những tháng cuối năm 2009 sẽ có triển vọng tốt hơn do xu hướng lên giá của đồng euro so với đồng USD, trong khi EU là thị trường xuất khẩu chính, chiếm gần một nửa kim ngạch xuất khẩu của cá tra. Diễn biến diện tích và sản lượng cá tra ở vùng ĐBSCL giai đoạn 1997-7T/2008 và quy hoạch đến năm 2020 (nguồn Dương Công Chinh, Đồng An Thụy,2009-TT. Nghiên cứu Môi trường & XLN-Viện Khoa học Thủy lợi miền Nam). 2.1.4 Tình hình sử dụng hóa chất và kháng sinh trong ao nuôi cá Tra Con cá Tra đang là mặt hàng xuất khẩu tiềm năng đối với ĐBSCL hiện nay, vì thế việc người dân mở rộng diện tích nuôi và thả cá với qui mô lớn là điều tất yếu. Mật độ thả cá cao, cho ăn, xử lý nước…không phù hợp dẫn đến việc sử dụng thuốc và kháng sinh trong quá trình xử lý nước và trị bệnh cho cá là điều không thể tránh khỏi. Mặc dù, ngày 17/3/2009 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ban hành DANH MỤC HOÁ CHẤT, KHÁNG SINH CẤM SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT, KINH DOANH THỦY SẢN (Thông tư số 15/2009/TT-BNN) nhưng ở một số vùng nuôi vẫn còn tồn tại tình trạng người nuôi lạm dụng hóa chất – kháng sinh cấm trong quá trình nuôi. Việc lạm dụng hóa chất – kháng sinh dẫn tới tồn lưu dư lượng trong sản phẩm thủy sản nói chung và cá Tra nói riêng, từ đó ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng các mặt hàng thủy sản cũng như cá Tra xuất khẩu, mặt khác cũng ảnh hưởng không nhỏ đến sức khỏe người tiêu dùng. Do đó, vấn đề đặt ra là kiểm soát được dư lượng hóa chất, kháng sinh sử dụng nhằm đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng và nâng cao chất lượng và uy tín của hàng thủy sản cũng như cá Tra trên thị trường Thế giới. 2.2 Giới thiệu về Crystial violet 2.2.1 Sơ lược về Crystial violet Crystal Violet (CV) (còn gọi là tím crystal) là chất thuộc họ Triphenylmethane có khả năng gây ung thư nên đã bị cấm sử dụng trong chăn nuôi ở một số quốc gia như Hoa Kỳ, New Zealand, EU… Tại Việt Nam, Crystal Violet là chất không có trong Danh mục thuốc thú y thủy sản, sản phẩm xử lý cải tạo môi trường trong nuôi trồng thủy sản được phép lưu hành tại Việt Nam. CV thường ở dạng bột mịn, có màu tím, hay dùng để nhuộm các nguyên vật liệu như da, sợi và giấy trong ngành sản xuất công nghiệp. Ngoài ra CV cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi khuẩn và bào tử của nó. Từ lâu, CV đươc xem là chất diệt nấm (loại saprolegnia ssp) và diệt kí sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa). Leuco Crystal violet được sinh ra từ sự khử Crystal violet bởi các enzyme trong cá, một hợp chất chuyển hoá rất bền của CV. LCV được tích luỹ bên trong, tồn trữ lâu dài trong cơ thịt của cá. Tính chất vật lý và hóa học của CV/LCV: Hòa tan trong rượu, cloroform-tan, tan trong nước, không tan trong ête. Độ hòa tan trong nước: 16 g/L (25 ºC) Công thức cấu tạo của Crystal violet Công thức cấu tạo của Leuco Gentian Violet 2.2.2 Các ứng dụng của Crystal violet 2.2.2.1 Trong công nghiệp Trong ngành công nghiệp CV hay dùng để nhuộm các nguyên vật liệu như da, tơ, sợi và giấy. Ngoài ra CV cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để làm dung dịch nhuộm vi khuẩn, và bào tử của nó, Crystal violet còn là chất được sử dụng như một loại thuốc thử trong ngành hóa phân tích. 2.2.2.2 Trong thủy sản Bản thân Crystal violet có khả năng sát trùng cho nên được sử dụng trong ngành thủy sản để xử lý nước và để sát nấm cũng như để sát kí sinh trùng ngoài da. Đó là một loại thuốc trừ nấm rất công hiệu và thường được dùng để tẩy trùng trong các hồ gây cá giống và trong các mô hình nuôi trồng thủy sản. 2.2.3 Tác hại của Crystal violet Khi vào cơ thể cá, CV sẽ bị phân hủy thành chất chuyển hóa (metabolite) là Leuco Crystal violet. Thời gian đào thải của CV nhanh, ngược lại chất LCV có thể tồn tại trong thời gian rất lâu trong thịt và nhất là trong mỡ của cá đã bị nhiễm CV. 2.2.3.1 Tác hại đối với con người Gần đây đã cho thấy rằng Crystal Violet là rất độc đối với các tế bào động vật có vú và có liên quan trong vấn đề làm biến đổi tuyến giáp và ung thư gan. Điều này dẫn tới việc cấm sử dụng Crystal Violet để điều trị cho cá và tôm. 2.2.3.2 Thiệt hại về kinh tế Nếu sản phẩm thủy sản xuất khẩu có chứa các lượng tồn dư chất độc hại và bị cấm sử dụng như CV thì toàn bộ lô hàng sẽ bị trả về và có thể bị nước sở tại kiện, dẫn đến những thiệt hại về kinh tế là không nhỏ. 2.2.4 Tình hình sử dụng Crystal violet 2.2.4.1 Tình hình sử dụng CV trên thế giới Trong các thập niên qua ngành nuôi trồng thủy sản trên thế giới có những bước tiến vượt bậc. Do việc áp dụng kĩ thuật nuôi mới, nuôi thâm canh mật độ cao để gia tăng năng suất, sản lượng, nạn dịch bùng phát, ô nhiễm môi trường làm cho thủy sản chết hàng loạt, vì thế người nuôi luôn tìm biện pháp khắc phục và việc sử dụng thuốc, hóa chất trong công việc phòng và trị bệnh là rất hữu hiệu. Crystral violet đã được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới trong ngành công nghiệp nuôi cá như một thuốc trừ nấm, thuốc trị ký sinh ngoài da và thuốc tẩy uế. 2.2.4.2 Tình hình sử dụng CV ở Việt Nam Sau khi hàng loạt lô hàng thủy sản của Việt Nam bị các nước nhập khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh cấm đã gây thiệt hại lớn về tài chính cũng như uy tín hàng thủy sản Việt Nam. Nhà nước và cơ quan chức năng ngành thủy sản Việt Nam đã đưa ra các qui định tương đối chặt chẽ về việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng cũng như chế biến thủy sản, nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng, ổn định và phát triển xuất khẩu. Tuy nhiên, việc chấp hành các qui định của nhà nước là chưa triệt để vì thỉnh thoảng vẫn còn một số lô hàng thủy sản Việt Nam xuất khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh cấm hoặc vượt quá giới hạn đối với những kháng sinh cho phép sử dụng có giới hạn, trong chương trình kiểm soát dư lượng các chất độc hại trong thủy sản nuôi do Nafiqaved thực hiện năm 2003 và 2008 thỉnh thoảng vẫn phát hiện mẫu thủy sản nhiễm thuốc hoặc hoá chất bị cấm sử dụng, MG và CV là một điển hình. 2.2.5 Chất thay thế Crystal violet Để giải quyết tạm thời vấn đề cần phải có những chất khác thay thế CV- LCV trong công tác phòng trị bệnh trên các loài thủy sản. BRONOPOL là chất có tác dụng diệt kí sinh trùng trên cá thay thế CV. Đây là chất được EU cho phép sử dụng trị bệnh cho cá từ năm 2001 và không qui định giới hạn về dư lượng. Theo đánh giá của cơ quan bảo vệ Môi Trường Hoa Kì (EFA) thì Bronopol không là chất gây ung thư, có thể làm chất tẩy trùng, diệt khuẩn. Chất bronopol có công thức hóa học: C3H6BrNO4. Tên hóa học của chất này là 2-Bromo-2-Nitropropane-1,3-Diol. Bronopol được cung cấp ra thị trường với các tên thương mại như: Pyceze, Onyxide 500…. Nhằm mục tiêu phát triển xuất khẩu thủy sản ổn định trong thời gian tới, thiết nghĩ các hộ nuôi thủy sản cần tuân thủ nghiêm các qui định của nhà nước và các cơ quan chuyên môn trong việc sử dụng hóa chất và kháng sinh trong thủy sản để đảm bảo uy tín, chất lượng và giữ vững thương hiệu, đồng thời tránh ra các thiệt hại lớn về kinh tế do bị phát hiện có dư lượng cá hóa chất và kháng sinh có hại trong các lô hàng thủy sản xuất khẩu. (Sở Nông Nghiệp An Giang, 2/2/2005). 2.3 Giới thiệu về phương pháp thử hấp thu miễn dịch dùng enzym liên kết (ELISA) 2.3.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển 2.3.2 ELISA là gì? ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau: Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt. Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme. Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa KN-KT. Sự hiện diện của phức hợp KN-KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu. Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một KT đặc hiệu cho KN chưa biết. Thông thường KN được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate). Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa. Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): KN được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra KT đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp KT-KN có thể sảy ra. Nếu KT được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện KN cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng KT thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), KN cần xác định sẽ được nhận biết qua KT thứ cấp này. Giữa các bước của ELISA, các protein và các KT không đặc hiệu, KT không gắn với KN sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn KT liên kết với KN được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với KT trong phức hợp KT-KN. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra. Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. 2.3.3 Phân loại 2.3.3.1 Dạng cạnh tranh Nguyên tắc chung: Kit phân tích dựa vào phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Nó dựa trên sự cạnh tranh giữa enzyme conjugate và dư lượng chất phân tích trong mẫu để gắn kết với kháng thể cố định trong well. Trong tiến trình phản ứng, mẫu và enzyme conjugate được tiêm vào well chứa kháng thể cố định. Nếu chất phân tích tồn tại trong mẫu nó sẽ cạnh tranh với enzyme conjugate để kết hợp với lượng kháng thể cố định trong well. Khi lượng chất phân tích đủ nó sẽ kết hợp hết với kháng thể. Vì thế, enzyme conjugate không kết hợp được với kháng thể và không phản ứng được với chất tạo màu. Đo cường độ màu để cho ra kết quả chính xác. 2.3.3.2 Dạng không cạnh tranh Nguyên tắc chung Chất phân tích được gắn cố định trong well. Khi cho mẫu và Antibody 1 vào well, chất phân tích có trong mẫu và chất phân tích cố định trong well sẽ cạnh tranh vị trí gắn với Antibody 1. Chất phân tích có trong mẫu được ưu tiên gắn với Antibody 1. Antibody 1 khi còn dư sẽ gắn với chất phân tích cố định trong well. Sau khi rửa, Antibody 1 gắn với chất phân tích có trong mẫu sẽ bị loại bỏ. Sau đó, cho Antibody 2 (enzyme conjugate) vào nó sẽ gắn kết với Antibody 1 còn lại trong well. Sau thao tác rửa, Antibody 2 nào không gắn kết được sẽ bị loại bỏ. Khi cho cơ chất tạo màu vào, Antibody 2 sẽ phản ứng với cơ chất tạo màu. Sau khi cho chất dừng phản ứng, đo cường độ màu để cho kết quả chính xác. 2.3.4. Ứng dụng - Xác định nồng độ của KT trong huyết thanh; - Kiểm tra sự có mặt của KN; - Phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm; - Xác định sự có mặt của dược phẩm; - Xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học 2.3.5. Ưu khuyết điểm 2.3.5.1 Ưu điểm - Phương pháp xử lý mẫu nhanh. Có tính chọn lọc cao. - Chi phí thiết bị khá rẻ so với các phương pháp khác. 2.3.5.2 Khuyết điểm - Chi phí mua kit thử đắt. - Là phương pháp định lượng sàng lọc, khi mẫu dương thì phải khẳng định lại bằng phương pháp sắc ký. 2.4 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích (định lượng, có tính sàng lọc cho hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng) 2.4.1 Giải thích thuật ngữ Sai số Alpha (a) Là khả năng mẫu thật sự âm (compliant), cho dù kết quả thu được là dương (non-compliant). Trường hợp này gọi là mẫu dương tính giả (Fasle positive result). Sai số beta (b) Là khả năng mẫu thật sự dương (non-compliant), cho dù kết quả thu được là âm (compliant). Trường hợp này gọi là mẫu âm tính giả (Fasle negative result). Độ lặp lại (repeatability) Là giá trị đạt được khi tiến hành các thí nghiệm khác nhau trong cùng điều kiện. Độ tái lặp (within-lab reproducibility) Là giá trị đạt được khi tiến hành các thí nghiệm khác nhau trong các điều kiện khác nhau trong cùng 1 phòng thí nghiệm. Độ thu hồi (recovery) Là tỷ lệ phần trăm của giá trị nồng độ chất phân tích đo được trên giá trị thực của chất phân tích. Độ ổn định (stability) Là giá trị đạt được khi tiến hành phân tích kiểm tra điều kiện bảo quản và thời gian bảo quản của thuốc thử, dung dịch chuẩn vv… Độ đặc hiệu (specificity) Là khả năng phân biệt của phương pháp giữa chất cần phân tích và các tạp chất (các chất gây nhiễu). Ruggedness Sự biến thiên của kết quả khi thay đổi các điều kiện thực nghiệm của phương pháp (The susceptibility of a method to minor changes in experimental conditions). Giới hạn quyết định (CCα) Là giới hạn nồng độ mà trên nồng độ đó sẽ quyết định mẫu không đạt với sai số α (=5%). Giới hạn phát hiện (CCβ) Là nồng độ nhỏ nhất của chất cần phân tích có trong mẫu mà phương pháp có thể phát hiện được với sai số β (=5%). Khoảng tuyến tính Là khoảng nồng độ mà cường độ của tín hiệu thu được tỉ lệ tuyến tính với nồng độ của chất phân tích. Mẫu trắng Là mẫu không chứa dư lượng của chất phân tích. Mẫu thêm chuẩn Là mẫu trắng được thêm chuẩn của chất phân tích vào. 2.4.2 Các thông số đánh giá Các thông số đánh giá trong quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp được thực hiện theo Quyết định 2002/657/EC ngày 12 tháng 08 năm 2002 của Liên Minh Châu Âu. Đối với phương pháp định lượng, có tính sàng lọc các thông số cần đánh giá là: Độ lặp lại Giá trị cần xác định là độ lệch chuẩn, SD Độ tái lặp Giá trị cần xác định là độ lệch chuẩn nội bộ phòng, SEW/L Giới hạn phát hiện Giá trị cần xác định là CCβ Độ đặc hiệu Tỉ lệ phản ứng chéo (do nhà sản xuất kit thử cung cấp) Ruggedness Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích Độ ổn định Khảo sát sự ổn định của dung dịch chuẩn sử dụng và sự ổn định của chất phân tích trên nần mẫu thử. Độ tuyến tính, khoảng làm việc Giá trị cần xác định là hệ số hồi quy tuyến tính trong khoảng nồng độ phân tích. Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm thực hiện để tài Đề tài được thực hiện tại phòng Kiểm nghiệm Hóa - Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 6 (NAFIQAD 6), địa chỉ 386C CMT8, P. Bùi Hữu Nghĩa, Q. Bình Thủy, Tp. Cần Thơ 3.2 Vật liệu 3.2.1 Mẫu thí nghiệm Cá Tra được lấy từ vùng nuôi của công ty thủy sản Vĩnh Hoàn (Đồng Tháp), đây là vùng nuôi nằm trong chương trình kiểm soát dư lượng của NAFIQAD 6 quản lý và cũng là vùng nuôi đạt tiêu chuẩn về thực hành nuôi tốt (GAP). Tất cả quá trình nuôi đều được kiểm soát chặt chẽ và tuyệt đối không sử dụng hóa chất – kháng sinh cấm. Vì vậy, các mẫu dùng để thực nghiệm hoàn toàn là mẫu không chứa CV/LCV 3.2.2 Hóa chất sử dụng Chuẩn Crystal violet oxalate có độ tinh khiết ³ 90%, Dr.Ehrenstorfer GmbH hoặc tương đương. Chuẩn Leuco Crystal violet (LCV) 10ng/ml, Dr Ehrenstofer GmbH hoặc chuẩn Leuco Crystal violet 97.0%, Dr Ehrenstofer GmbH (LCV). Acetonitril, loại dùng cho phân tích sắc ký. n-hexane, loại tinh khiết phân tích. Nước cất, loại dùng cho sắc ký. Dichloromethane, loại dùng cho sắc ký. Kit thử CV/LCV của hãng Bioo Scientific với thành phần kit thử: 1 khay vi đĩa 96 giếng (12 hàng, mỗi hàng 8 giếng) được bảo quản chống ẩm trong túi kín, mỗi giếng được phủ các kháng thể CV. Không được rửa các giếng này. 6 lọ chứa dung dịch chuẩn CV pha sẵn ở các nồng độ tương ứng cho đường chuẩn (1.8ml). Mỗi lọ được đậy kín bằng mỗi nắp có màu khác nhau. 1 lọ chuẩn LCV được pha sẵn ở nồng độ 50 ng/ml (1.8ml). Lọ này được dùng để thêm vào mẫu kiểm soát (trường hợp không có chuẩn tinh khiết riêng). 1 lọ CV-HRP (8ml). 1 lọ dung dịch đệm rửa có độ đậm đặc 20 lần (20x Wash Solution) (28ml). 1 lọ chứa dung dịch cơ chất/tạo màu, đã pha sẵn (TMB Substrate) (12ml). 1 gói dùng để pha dung dịch đệm trích A (Concentrate of Buffer A) chứa hai gói thuốc thử I và thuốc thử II. 1lọ chứa dung dịch đệm trích B có độ đậm đặc 10 lần (10x Extration Buffer B), (20ml). 1 lọ chứa dung dịch đệm trích C có độ đậm đặc 10 lần (10x Sample Extraction Buffer C), (25ml). 1 lọ chứa dung dịch ngừng phản ứng, đã pha sẵn (Stop Buffer), (20ml). 1 lọ chứa dung dịch oxy hoá, có độ đậm đặc 10 lần (10x Oxidant Solution), (1.8ml). 3.2.3 Thiết bị - dụng cụ -Máy đọc Benchmark Plus reader, Biorad. (kèm hình chụp hệ thống TB) -Phần mềm Microplate Manager Version 5.2., Biorad. -Hệ thống thổi khí nitơ. -Bể điều nhiệt, Brant hoặc tương đương. -Tủ ấm có khả năng điều chỉnh đến 250C, Memmert hoặc tương đương. -Micro pipet 100 µl; 1000 µl; 5000 µl, Brand hoặc tương đương. -Bể siêu âm, Elma hoặc tương đương. -Máy ly tâm, Hettich hoặc tương đương. -Máy xay mẫu, Gali hoặc tương đương. -Cân, d=0.01g Satorious hoặc tương đương. -Cân, d= 0.1mg Satorious hoặc tương đương. -Máy rửa, Washer PW40. -Máy lắc, Hwashin. -Máy lắc nhiều ống nghiệm, Glascol hoặc tương đương. -Tủ lạnh, Toshiba hoặc tương đương. -Pipette Pasteur, Brand hoặc tương đương. -Ống ly tâm nhựa, 50ml, Greiner hoặc tương đương. -Ống ly tâm 1.5ml. -Ống ly tâm thủy tinh 12ml. -Cốc, bình tam giác, bình định mức các loại. -Giấy parafilm. -Giấy nhôm. -Túi PE 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phạm vi nghiên cứu Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp “Xác định hàm lượng Crystal violet và Leuco Crystal violet bằng phương pháp miễn dịch” trên nền mẫu cá Tra bằng kit thử của hãng Bioo Scientific. Đây là phương pháp phân tích sàng lọc, định lượng nên các thông số được đánh giá gồm: Độ đặc hiệu: tỉ lệ phản ứng chéo (do nhà sản xuất kit thử cung cấp). Độ tuyến tính, khoảng làm việc: giá trị cần xác định là hệ số hồi quy tuyến tính trong khoảng nồng độ phân tích. Ruggedness: khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích: khảo sát sự thay đổi pH của đệm trích dùng pha loãng mẫu đến độ nhiễu nền và độ thu hồi của phương pháp. Giới hạn phát hiện: giá trị cần xác định là CCβ. Độ lặp lại: giá trị cần xác định là độ lệch chuẩn, SD. Độ tái lặp: giá trị cần xác định là độ lệch chuẩn nội bộ phòng, SEW/L 3.3.2 Nguyên tắc của phương pháp Nguyên tắc ly trích mẫu Crystal violet và Leuco Crystal violet được trích từ mô của cá tra bằng dung dịch đệm và acetonitril , dịch trích được tách nước bằng dichloromethane, sau khi oxi hóa, dịch trích này được loại bỏ dung môi dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ 50 -600C. Phần cặn được hòa tan với n-hexane và đệm trích. Phần dung dịch ở lớp dưới được dùng để xác định CV và LCV bằng phương pháp thử miễn dịch dùng enzyme liên kết. 3.3.3 Tính đặc hiệu của kit thử sử dụng Phản ứng chéo với: Crystal violet : 100% Leuco Crystal violet (sau khi oxy hoá) : 100% Malachit Green : 82% Leuco Malachit Green : <0.01% Diethylstilbestrol : <0.01% Sulfumethazine : <0.01% Chloramphenicol : <0.01% Furazolidone : <0.01% 3.3.4 Phương pháp phân tích mẫu Cân 2.00g (±0.1g) mẫu vào ống Falcon 50ml Thêm 0.6 ml Buffer A và 0.4 ml Buffer B, 6,5ml ACN vào mỗi ống Falcon chứa mẫu Lắc khoảng 30 giây, sau đó siêu âm trong bể siêu âm khoảng 10 phút Ly tâm 4000 v/p trong 10 phút ( to=20-250C) Hút 5ml dung dịch trong cho vào ống Falcon 50ml khác Thêm 3ml H2O và 2 ml DCM vào mỗi ống nghiệm Lắc trên máy lắc (shaker) 15 phút Li tâm 4000v/p ở nhiệt độ phòng trong 10 phút (250C) Hút 3ml dung dịch lớp trên cho vào ống li tâm thủy tinh 12 ml Thêm 0.1 ml dung dịch oxy hóa (oxidation) lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng 25 phút Bay hơi dung dịch trong ống nghiệm dưới dòng khí Nitơ ở nhiệt độ 50-600C Hòa tan cặn còn lại với 1ml n-Hexan, 1,6ml đệm trích mẫu (Buffer C : ACN= 4 : 1) Vortex 30 giây, li tâm 4000v/p trong 10 phút. Hútt khoảng 0,3ml dung dịch lớp dưới đem phân tích Đo mẫu ở bước sóng 450 nm trên máy đọc. 3.3.5 Chuẩn bị hóa chất của kit thử 3.3.5.1 Đệm rửa Trộn 1 thể tích của dung dịch đệm rửa có độ đậm đặc 20 lần (20x Wash Solution) với 19 thể tích nước cất. Dung dịch pha mới trước mỗi lần sử dụng. 3.3.5.2 Dung dịch cơ chất/ tạo màu Dung dịch cơ chất /tạo màu đã được pha sẵn để sử dụng, nhưng kết tủa ở nhiệt độ -40C. Vì vậy cẩn thận đưa lọ này về nhiệt độ phòng sau đó lắc đều trước khi cho vào giếng. 3.3.5.3 Dung dịch đệm trích A Dung dịch này được pha từ 2 gói thuốc thử I và II trong gói đệm trích A (Concentrate of Buffer A). Hoà tan 2 gói thuốc thử I và thuốc thử II với 100ml nước cất, bảo quản ở nhiệt độ phòng. 3.3.5.4 Dung dịch đệm trích B Trộn 1 thể tích của dung dịch đệm trích B có độ đậm đặc 10 lần (10x Extration Buffer B ) với 19 thể tích nước cất. Dung dịch pha mới trước mỗi lần sử dụng. 3.3.5.5 Dung dịch đệm trích C Trộn 1 thể tích của dung dịch đệm trích C có độ đậm đặc 10 lần (10x Sample Extraction Buffer C) với 9 thể tích nước cất. Dung dịch pha mới trước mỗi lần sử dụng. 3.3.5.6 Dung dịch đệm pha loãng mẫu (Đệm trích C: acetonitril = 4:1, v/v) Trộn 4 thể tích dung dịch đệm trích C với 1 thể tích acetonitril. 3.3.5.7 Dung dịch oxy hoá Trộn 1 thể tích của dung dịch oxy hóa có độ đậm đặc 10 lần (10x Oxidant Solution) với 9 thể tích acetonitril. 3.3.6 Chuẩn bị mẫu Đồng hóa mẫu Lấy phần mô cơ từ những vị trí khác nhau của mẫu. Tránh những mô mỡ. Cắt phần mô vừa lấy thành từng miếng nhỏ từ 3-5 cm. Cho phần mô vừa cắt (khoảng 100 gam) vào máy xay mẫu, xay đến khi mẫu đồng nhất. Giữ mẫu trong túi PE hàn kín miệng ở -180C hoặc thấp hơn cho đến khi phân tích. Khi tiến hành phân tích, mẫu phải đưa về nhiệt độ phòng. Chuẩn bị mẫu thí nghiệm Dùng cân có d=0.01g cân 2.00 gam mẫu đã được đồng hóa vào ống ly tâm nhựa 50ml. Lượng cân chỉ được phép sai lệch ± 0.1 gam. 3.3.7 Tiến hành 3.3.7.1 Phương pháp chiết tách CV và LCV từ mẫu vật liệu sử dụng - Cho vào các ống ly tâm chứa mẫu thí nghiệm 0,6ml đệm trích A, 0,4ml đệm trích B và 6,5ml acetonitril. Trộn hỗn hợp bằng máy lắc nhiều ống nghiệm khoảng 20 phút. - Ly tâm 6 phút, 4500 vòng/phút. - Hút 5ml dịch trong cho vào ống ly tâm nhựa khác. - Tiếp tục thêm vào mỗi ống ly tâm ở bước 3ml nước cất, 2ml dichloromethane. Lắc trên máy lắc 15 phút. Ly tâm 6 phút, 4500 vòng/phút. - Hút 3ml dịch trích ở lớp trên cho vào ống ly tâm thủy tinh 12 ml. Cho vào mỗi ống 0.1ml dung dịch oxy hoá, để ở nhiệt độ phòng 20 phút (giai đoạn này dùng để oxy hóa LCV thành CV). - Bay hơi đến khô phần dung môi này dưới dòng khí nitơ đặt trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 50 – 600C. - Hòa tan phần cặn sau thổi khô bằng 1ml n-hexan. - Thêm vào 1,6ml dung dịch đệm pha loãng mẫu. Trộn bằng máy lắc khoảng 1 phút rồi ly tâm 10 phút tốc độ 4000 v/p. - Hút phần dung dịch phía dưới cho vào ống ly tâm 1.5ml. 3.3.7.2.Phát hiện tổng CV/LCV bằng kĩ thuật miễn dịch dùng enzyme liên kết - Lấy đủ số giếng cần thiết cho mỗi lần phân tích. - Hút 100µl các chuẩn cho vào khay vi đĩa, mỗi chuẩn lặp lại hai lần. - Hút 100µl dịch trích mẫu cho vào các giếng còn lại, mỗi mẫu lặp lại hai lần. - Thêm 50µl dung dịch thể tiếp hợp (CV-HRPO) vào tất cả các giếng. - Gói kín toàn bộ khay vi đĩa, sau đó lắc nhẹ trong 1 phút. - Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ (20-250C ) trong 1 giờ. - Sau khi ủ xong rửa khay vi đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm rửa. - Hút 100µl dung dịch cơ chất tạo màu cho vào tất cả các giếng. Đem ủ trong 20 phút ở nhiệt độ 20-250C. - Cho vào 100 µl dung dịch ngừng phản ứng ở tất cả các giếng. - Đo độ hấp thụ tại bước sóng 450 nm bằng máy đọc. 3.3.8 Đọc kết quả Giá trị mật độ quang trung bình (OD) của hai giếng A1 and A2 là giá trị nền của các giá trị mật độ quang (OD) của mẫu và chuẩn. 3.4 Bố trí thí nghiệm Trong quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp, đề tài không xác định thông số độ ổn định vì để đánh giá được thông số này cần nhiều thời gian khảo sát, theo dõi. Với thời gian thực hiện của đề tài, không đủ để đánh giá thông số này. Bước Thời gian Nội dung Phân bố thí nghiệm Kết quả thu được 1 Tuần 1, 2,3 1. Xác định độ tuyến tính, khoảng làm việc. Xác định độ tuyến tính của đường chuẩn trong khoảng nồng độ chuẩn do nhà sản xuất kit thử cung cấp. Hệ số hồi quy tuyến tính R2 ≥ 0.99. Xác định khoảng làm việc (nồng độ phân tích) từ khoảng tuyến tính của đường chuẩn. 2 2. Ruggedness: Khảo sát pH của dung dịch đệm trích C dùng để pha loãng. Phân tích mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn CV/LCV ở mức nồng độ CV/LCV trong mẫu là 4.0 µg/kg. Dùng dung dịch đệm trích C với pH thay đổi từ 4.5 đến 6.5. Bước thay đổi pH cho mỗi lần khảo sát là 0.5. Giá trị nhiễu nền nhỏ. Độ thu hồi đạt từ 70 đến 130% 3. Xác định giới hạn phát hiện CCβ 3.1 Tuần 4 Khảo sát độ nhiễu của của nền mẫu cá tra Xác định CCα và CCβ Phân tích tối thiểu 20 mẫu cá tra không chứa CV/LCV. Tính toán được giá trị nhiễu nền trung bình, CCα và CCβ. 3.2 Tuần 5 Thẩm tra sai số β. Phân tích 20 mẫu trắng thêm chuẩn ở mức CCβ tính toán. Sai số β £ 5% (không quá 1 mẫu không phát hiện CV/LCV) 3.3 Nếu sai số β ≥ 5%, khảo sát lại giá trị thực tế của CCβ. Lần lượt thực hiện phân tích mẫu trắng thêm chuẩn ở mức nồng độ 1.5 lần, 2.00 lần giá trị CCβ đã xác định ở bước 3. Việc phân tích được lặp lại đến khi sai số β £ 5%. sai số β £ 5% (không quá 1 mẫu không phát hiện CV/LCV) 3.4 Tuần 6,7,8 Xác định độ lặp lại và độ tái lặp Thực hiện 3 lần phân tích, mỗi lần thực hiện như sau: thêm chuẩn vào mẫu trắng ở các mức nồng độ, 1.00, 1.5 và 2.00 lần giá trị CCβ thực tế. Mỗi mức nồng độ thực hiện 07 mẫu. Tổng số mẫu phân tích cho ba đợt là 63 mẫu. Tính được giá trị độ lệch chuẩn (SD) của từng nồng độ , độ lệch chuẩn nội bộ phòng (SDW/L), độ tuyến tính trong khoảng nồng độ phân tích. 3.5. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu Xác định nồng độ CVvà LCV trong mẫu: Nồng độ CV/LCV trong mẫu được xác định theo phương pháp nội suy. Đường chuẩn được xây dựng từ giá trị mật độ quang trung bình (OD) của các dung dịch chuẩn. Giá trị mật độ quang trung bình (OD) của hai giếng A1 and A2 là giá trị nền của các giá trị mật độ quang (OD) của mẫu và chuẩn. Các giá trị (OD) trung bình của các chuẩn và mẫu (trung bình của hai giếng lặp lại) chia cho giá trị (OD) của chuẩn zero nhân 100. Chuẩn zero có giá trị là 100% (độ hấp thụ cực đại) và các giá trị OD còn lại là ước số phần trăm của giá trị hấp thụ cực đại. O.D. chuẩn (hoặc mẫu) x 100= % độ hấp thụ cực đại O.D.chuẩn zero Đường chuẩn: Các giá trị độ hấp thụ được gắn tương ứng với trục Y và logarithmic nồng độ các chuẩn ứng với trục X biểu diễn trên đồ thị. Đường chuẩn phải tuyến tính trong khoảng 0.05 Đường chuẩn: Các giá trị độ hấp thụ được gắn tương ứng với trục Y và logarithmic nồng độ các chuẩn ứng với trục X biểu diễn trên đồ thị. Đường chuẩn phải tuyến tính trong khoảng 0.05 ¸ 4.5 ng/ml. Nồng độ tổng CV/LCV tính được từ đồ thị nhân cho hệ số pha loãng mẫu và chuyển đổi sang đơn vị ng/g trong mẫu mô. Xác định giá trị CCa Phân tích ít nhất 20 mẫu trắng/matrix, và tính độ nhiễu nền của mẫu trắng (S/N). Ba lần giá trị S/N là CCα. . Giá trị CCα được xác định theo công thức: CCα = 3 x SD + Xtb (..) Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn Xtb: Nồng độ trung bình Xác định giá trị CCb Giá trị CCb được xác định theo công thức: CCβ = CCα + 1.64*SDW/L (..) Trong đó: SDW/L là độ lệch chuẩn nội bộ phòng xác định theo công thức: Trong đó: ni: số lần phân tích lặp lại ở nồng độ thứ i SDri: độ lệch chuẩn ở nồng độ thứ i, Độ lệch chuẩn (SD): (..) Trong đó: xi: nồng độ mẫu phân tích được ở lần thứ i : nồng độ trung bình của các lần phân tích. n: số lần phân tích Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): (..) Trong đó: SD: độ lệch chuẩn : nồng độ trung bình của các lần phân tích Độ thu hồi của phương pháp (..) Trong đó: y là nồng độ mẫu phân tích được x là nồng độ mẫu ban đầu TÀI LIỆU THAM KHẢO Hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất kit thử CV/LCV, Bioo Scientific. Phát hiện tổng MG/LMG bằng phương pháp thử miễn dịch dung enzyme liên kết (NAFI6/H-5.6). Trần Phương Ngọc Hân, 2008 Tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản tại phòng kiểm nghiệm NAFIQAD 6- Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp chuyên nghành Chế biến thủy sản, trường Đại học Cần Thơ. 15/2009/TT-BNN,Thông tư-Ban hành Danh mục thuốc, hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng. Thứ Tư, 16/12/2009, 07:55 (GMT+7).Thời báo kinh tế Sài Gòn. Dương Công Chinh, Đồng An Thụy, 2009 Phát triển nuôi cá Tra ở ĐBSCL và các vấn đề môi trường cần giải quyết. hppt:// www.vietnamnet.vn . hppt://www.khoahoc.net Commission Decision of 12 August 2002 (2002/657/EC), implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. SANCO/2004/2726-rev 4 – December 2008, Guidelines for the implementation of Decision 2002/657/EC. CSL Nafiqaved training course 2005, Method validation experiments. Chương 5, Sổ tay phương pháp Hóa, Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 6 Jame N.Miller & Jane C.Miller, Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry