Xác định ID50 của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn edwardsiella ictaluri

falcol 50ml tiệt trùng, đem ly tâm 4000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lý tiệt trùng để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần). 10 Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên và cho vào khoảng 25ml dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn đều mẫu bằng máy vortex. Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 610nm và điều chỉnh OD tương ứng để xác định mật độ vi khuẩn. OD=1±0.1 tương ướng mật độ vi khuẩn là 109 cfu/ml. Hình 3.1: Sơ đồ chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm 11 3.3.4 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri ở cá tra. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức và nghiệm thức đối chứng không tiêm và tiêm nước muối sinh lý, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 10 con/bể. 1. Nghiệm thức không tiêm. 2. Nghiệm thức đối chứng: Tiêm nước muối sinh lý. 3. Nghiệm thức 1: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 107 CFU/ml). 4. Nghiệm thức 2: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 106 CFU/ml). 5. Nghiệm thức 3: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 105 CFU/ml). 6. Nghiệm thức 4: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 104 CFU/ml). 7. Nghiệm thức 5: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 103 CFU/ml). 8. Nghiệm thức 6: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 102 CFU/ml). Thí nghiệm xác định LD50 được tiêm với 6 mật độ từ 103 - 108 CFU/ml đối với chủng A1. 3 chủng còn lại tiêm từ 102 - 107 CFU/ml (Bảng 3.2). Bảng 3.2: Mật độ vi khuẩn E. ictaluri (CFU/ml) gây cảm nhiễm Chủng NT 6 NT 5 NT 4 NT 3 NT 2 NT 1 A1 2,7x103 2,7x104 2,7x105 2,7x106 2,7x107 2,7x108 T8 0,4x102 0,4x103 0,4x104 0,4x105 0,4x106 0,4x107 CAF258 0,8x102 0,8x103 0,8x104 0,8x105 0,8x106 0,8x107 KSL103 0,5x102 0,5x103 0,5x104 0,5x105 0,5x106 0,5x107 Ghi chú: NT: nghiệm thức - Cá mua về được thuần hóa 1 tuần thì tiến hành tiêm vi khuẩn cho cá ở các mật độ vi khuẩn và tiêm ở gốc vi ngực của cá. - Cá được kiểm tra kí sinh trùng và vi sinh trước khi tiến hành thí nghiệm. - Tiêm 0,1ml cho mỗi con và không cho ăn trong suốt quá trình thí nghiệm. - Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 12 ngày. 12 3.3.4.1 Xác định LD50 theo phương pháp của Reed và Muench (1938) Xác định LD50 để biết được khả năng gây bệnh của vi khuẩn và so sánh độc lực giữa các chủng vi khuẩn. Log LD50 = Log A + x Log 10 Trong đó: Log A: nồng độ nhỏ và cận 50% Log 10: độ pha loãng %d: % số cá chết nhỏ và cận 50% %t: % số cá chết lớn và cận 50% 3.3.4.2 Tái phân lập và tái định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp truyền thống. - Tiến hành thu mẫu cá lờ đờ hay vừa mới chết, ghi lại thời gian dấu hiệu bên ngoài và bên trong cơ thể. - Phân lập vi khuẩn ở 3 cơ quan: gan, thận và tỳ tạng - Sau 24-48 giờ ủ ở 28-300C quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường TSA/NA, nhuộm gram, xác định hình dạng vi khuẩn, khả năng di động của vi khuẩn. Các chỉ tiêu sinh lý Kiểm tra phản ứng oxidase, catalase Các chỉ tiêu sinh hóa Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O/F), khả năng tạo acid từ các loại đường: mannose, glucose, sucrose, galactose, mannitol, maltose, sorbitol, xylose, glycerol, rhamnose, Inositol, khả năng sinh H2S, indole, khả năng sử dụng citrate, sử dụng urea, khả năng thủy phân gelatine, thủy phân starch, thủy phân Tween 80. Phản ứng tạo nitrite từ nitrate, phản ứng VP, MR, khả năng kết hợp crystal violet và khả năng phát triển ở các nồng độ muối khác nhau. 50% - %d %t - %d 13 3.3.5 Mô học Cố định mẫu: Mẫu gan và thận được cố định trong dung dịch formol trung tính 10% trong 24h, tiến hành rửa dưới vòi nước 2h. Sau đó chuyển sang cồn 70% để bảo quản và xử lý mẫu. Cắt tỉa và định hướng: Mẫu trước khi đưa vào qui trình xử lý mẫu phải cắt tỉa và định hướng cho mẫu đạt kích cỡ phù hợp, cắt mẫu với độ dày từ 5-7mm. Đưa mẫu vào catsset và tiến hành xử lý. Qui trình xử lý mẫu: Qui trình xử lý mẫu được thực hiện trên máy Tisue processing (phụ lục 4) Loại nước: Mục đích của lọai nước nhằm đảm bảo loại hết nước trong mẫu mô mà không làm tế bào bị biến dạng hoặc không làm vị trí thành phần cấu tạo tế bào trong mẫu mô không bị thay đổi. Qúa trình loại nước được thực hiện bằng cách cho mẫu qua nhiều dung dịch cồn với nồng độ gia tăng từ 70% đến 100%. Thời gian khử nước phụ thuộc vào độ dày của mẫu mô. Làm trong mẫu: Vì cồn không thể hòa lẫn với paraffin nên sau khi khử nước thì cồn cũng được loại ra khỏi mẫu. Nếu không loại bỏ hết cồn, phần mô đó sẽ bị co rút lại, khối mẫu đúc trong paraffin sẽ không đồng nhất, tạo nên những lổ hỗng trên lát cắt. Do đó làm ngấm vào trong mẫu mô dung môi trung gian (xylen) có thể hòa tan được cồn và paraffin. Tẩm paraffin: Paraffin là chất nền để bảo đảm cho tế bào giữ nguyên được hình dạng khi cắt. Sau khi làm trong, mẫu mô sẽ được ngấm paraffin nóng chảy (57- 600C). Đúc khối: Mục đích của việc đúc khuôn là làm cho mẫu mô nằm trong khối rắn để cắt lát mỏng. Chất nền để đúc khuôn là paraffin: sáp ong nóng chảy với tỉ lệ 7:3. Sau khi mẫu mô đã vùi vững chắc vào paraffin làm rắn paraffin lại bằng cách đặt khuôn trong tủ lạnh, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn. Cắt mẫu: Sử dụng máy microtome để cắt mẫu, lát cắt có độ dày là 2 µm. Mẫu được cắt thành băng dài và cho vào chậu nước nóng 45-500C để paraffin căng ra, dùng kim mũi giáo nhẹ nhàng tách riêng từng đoạn mẫu đạt yêu cầu. Dán mẫu lên lame: Dung dịch keo để dán mẫu là Mayer's albumin. Thoa dung dịch keo lên lame, đặt một đầu lame vào chậu nước ấm nghiêng một góc 450 và nâng từ từ lên, lát cắt sẽ được dán chặt vào phiến kính. Sau khi dán, làm khô phiến kính bằng cách sấy khô ở nhiệt độ 450C-500C. 14 Nhuộm mẫu (Harris's Haematoxylin & Eosin): mẫu được nhuộm theo qui trình trình bày trong phụ lục 4. Dán lamelle vào lame: Để đảm bảo mẫu được giữ lâu và tăng tính chiết quang của mẫu, dùng keo Enterlan phủ lên mẫu và dán lamelle lên mẫu. Nhỏ một giọt keo lên mẫu, đặt lamelle nghiêng 45o và tiếp xúc với giọt keo, hạ lame xuống từ từ để tránh bọt khí. Đọc kết quả: Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10x để quan sát tổng quát tiêu bản nếu tiêu bản đẹp đạt yêu cầu có nhân bắt màu tím xanh của Hematoxylin, phần còn lại bắt màu hồng Eosin. Các tiêu bản đẹp sẽ được quan sát lần lượt ở độ phóng đại 40x,100x (nhỏ giọt dầu) và chụp hình tiêu bản đặc trưng. 3.3.6 Xử lý số liệu Các số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel. 15 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau khi thực hiện thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên những chủng khác nhau thì thời gian xuất hiện bệnh khác nhau. Ở những nồng độ khác nhau thì tỉ lệ chết cũng khác nhau. 4.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. 4.1.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng A1 Sau khi gây cảm nhiễm, ở tất cả các nghiệm thức đều có cá chết với tỉ lệ rất cao và đều có dấu hiệu bệnh lý rất rõ. Ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau thì thời điểm xuất hiện bệnh cũng khác nhau (Đồ thị 4.1.1). Đồ thị 4.1.1: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng A1 Qua đồ thị 4.1.1 cho thấy vào ngày thứ 2 ở tất cả các nghiệm thức đều có cá chết ngoại trừ bể đối chứng tiêm nước muối sinh lý. Sau 12 ngày thí nghiệm tất cả các nghiệm thức đều chết (100%), bể đối chứng tiêm nước muối sinh lý chết (39%) riêng bể đối chứng không tiêm thì không có cá chết. Do chủng A1 tỉ lệ chết cao nồng độ thấp 2,7x103 CFU/ml tỉ lệ chết đã là 100%. Vì vậy chủng A1 không xác định được giá trị LD50. 16 4.1.2 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng T8 Do chủng A1 không xác đinh được LD50 lý do ở nồng độ thấp tỉ lệ chết đã trên 50%. Vì vậy từ chủng T8 trở về sau được bố trí với nồng độ thấp hơn từ 102 đến 107 CFU/ml. Đồ thị 4.1.2: Biểu hiện tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng T8 Kết quả Đồ thị 4.1.2 cho thấy cá bắt đầu chết vào ngày thứ 3 ở nghiệm thức 0,4x107 CFU/ml với tỉ lệ 13% và 0,4x102 CFU/ml là 3%. Vào ngày thứ 4 tất cả các nghiệm thức đều có cá chết ngoại trừ bể đối chứng. Sau 12 ngày thí nghiệm ở nghiệm thức 0,4x107 CFU/ml cá chết với tỉ lệ cao nhất 83%. Tỉ lệ thấp nhất 23% ở mật độ 0,4x102 CFU/ml. Trong khi đó, ở các nghiệm thức còn lại 0,4x103 CFU/ml; 0,4x104 CFU/ml; 0,4x105 CFU/ml và 0,4x106 CFU/ml cá chết với tỉ lệ lần lượt là 67%; 57%; 43% và 37%. Riêng bể tiêm nước muối sinh lý cũng có cá chết nhưng tỉ lệ không cao 17%, bể không tiêm thì không có cá chết. Từ kết quả thí nghiệm, LD50 của chủng T8 thu được trong thí nghiệm gây cảm nhiễm có giá trị LD50 = 1,3x104 CFU/ml. 4.1.3 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng CAF258 Sau khi gây cảm nhiễm chủng CAF258 cho kết quả rất tốt giữa các nghiệm thức khác nhau thì tỉ lệ chết khác nhau (Đồ thị 4.1.3). 17 Đồ thị 4.1.3: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng CAF258 Ở nghiệm thức 0,8x107; 0,8x106; 0,8x105 CFU/ml cá tập trung chết vào ngày thứ 4 còn 0,8x104 CFU/ml chết vào ngày thứ 5. Trong khi đó ở nghiệm thức 0,8x103 và 0,8x102 CFU/ml cá chết lần lượt vào ngày 5 và ngày 6. Sau 12 ngày thí nghiệm nghiệm thức 0,8x107 CFU/ml chết với tỉ lệ cao nhất 100% và thấp nhất là 0,8x102 CFU/ml với tỉ lệ 7%, còn ở nghiệm thức 0,8x105 và 0,8x106 CFU/ml chết với tỉ lệ 93% hai nghiệm thức còn lại 0,8x102 và 0,8x103 CFU/ml tỉ lệ chết lần lượt là 63% và 73%. Bể đối chứng tiêm nước muối và bể không tiêm đều không có cá chết trong suốt qua trình thí nghiệm. Cũng như chủng T8 sau khi gây cảm nhiễm chủng CAF258 cho kết quả xác định được giá trị LD50 = 4,7x102 CFU/ml. Kết quả này cho thấy chủng CAF258 có động lực khá mạnh. 4.1.4 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng KSL103 Cũng giống như chủng CAF258 chủng KSL103 sau khi gây cảm nhiễm ở các nghiệm thức khác nhau tỉ lệ chết khác nhau (Đồ thị 4.1.4). Đồ thị trên cho thấy sau 12 ngày gây cảm nhiễm nghiệm thức 0,5x107 CFU/ml chết với tỉ lệ 93% ở 0,5x106CFU/ml là 80% và 0,5x105 CFU/ml là 60%, còn 0,5x104 CFU/ml là 33%. Trong khi đó nghiệm thức 0,5x103 CFU/ml chết với tỉ lệ 7% và 0,5x102 CFU/ml là 20%, tuy nghiệm thức 0,5x102 CFU/ml có tỉ lệ chết cao hơn 0,5x103 CFU/ml nhưng sự chênh lệch cũng không lớn có thể chấp nhận được. Sau khi 18 gây cảm nhiễm cá chết tập trung vào ngày 3 và 4 riêng bể đối chúng tiêm nước muối và không tiêm thì không có cá chết. Kết quả cũng cho ta xác định được LD50 với giá trị LD50 = 2,1x104 CFU/ml. Độc lực của chủng này cũng tương đối mạnh. Đồ thị 4.1.4: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng KSL103 4.2 Thảo luận chung Sau khi gây cảm nhiễm các chủng vi khuẩn E. ictaluri kết quả thu được ở những chủng vi khuẩn E. ictaluri khác nhau thì thời gian xuất hiện bệnh khác nhau và ở các nồng độ khác nhau tỉ lệ chết cũng khác nhau. E. ictaluri chủng A1 vào ngày thứ 2 ở tất cả các nồng độ vi khuẩn đều có cá chết. Trong khi đó chủng T8 cá bắt chết vào ngày thứ 3 ở nồng độ 0,4x107 CFU/ml và ngày thứ 4 ở các nồng độ 0,4x106, 0,4x105, 0,4x104 và 0,4x103 CFU/ml, còn chủng CAF258 cá bắt đầu chết vào ngày thứ 3 ở nồng độ 0,8x106 và 0,8x107 CFU/ml, chủng KSL103 thì cá chết vào ngày thứ 3 và thứ 4. Trong thí nghiệm gây cảm nhiễm tiêm vi khuẩn này trên cá tra giống của Lương Trần Thục Đoan (2006) ở mật độ 106 CFU/ml cá bắt đầu chết vào ngày thứ 2 và 105 CFU/ml là ngày thứ 3. Trong khi đó Ngô Minh Dung (2007) cũng sử dụng E. ictaluri tiêm cho cá tra thì cho kết quả cá bắt đầu chết vào ngày thứ 2 ở 108 CFU/ml và vào ngày thứ 3 ở mật độ 107 và 106 CFU/ml. Bên cạnh đó, 19 Lawrence et al. (1997) gây cảm nhiễm E. ictaluri lên cá nheo và ở nghiệm thức 1,3x106 CFU/ml cá chết đã được ghi nhận ở thời điểm 24 giờ sau khi gây cảm nhiễm. Kết quả cho thấy, thời điểm cá bắt đầu biểu hiện bệnh khác nhau ở những chủng khác nhau và ở những nồng độ khác nhau thì thời gian biểu hiện bệnh cũng không giống nhau. Ngoài thời điểm biểu hiện bệnh lý thì tỉ lệ cá chết ở cũng phản ánh khả năng gây bệnh của chủng vi khuẩn lên vật chủ. Sau khi theo dõi 12 ngày chủng A1 chết 100% ở tất cả các nồng độ, chủng T8 cá chết với tỉ lệ cao nhất 83% ở mật độ 0,4x107 CFU/ml và thấp nhất 23% ở mật độ 0,4x102 CFU/ml. Trong khi đó chủng CAF258 ở nồng độ 0,8x107 CFU/ml chết với tỉ lệ cao nhất 100% và thấp nhất là 0,8x102 CFU/ml với tỉ lệ 7%, còn chủng KSL103 ở 0,5x107 CFU/ml chết với tỉ lệ 93% và thấp nhất ở 0,5x103 CFU/ml chết với tỉ lệ 7% và 0,5x102 CFU/ml là 20%. Trong thí nghiệm của Williams và Lawrence (2005) khi tiến hành tiêm vi khuẩn E.ictaluri so sánh với phương pháp ngâm trên cá nheo Mỹ cho kết quả chủng R4383 WT ở mật độ 5,2x103 cfu/ml, 5,2x104 cfu/ml, 5,2x105 cfu/ml thì tỉ lệ chết lần lượt là 67.2%, 100%, 100%. Trong khi đó chủng R4383 HM là 63.5%, 98,7% và 100%. Bên cạnh đó, Newton et al. (1989), tiến hành ngâm cá nheo trong dung dịch có mật độ vi khuẩn E. ictaluri là 5x108 CFU/ml nhận thấy có 93% cá nheo bị nhiễm và biểu hiện bệnh ESC (trích dẫn bởi Plumb, 1999). Ngoài ra, Lương Trần Thục Đoan (2006) khi sử dụng mật độ vi khuẩn 106 CFU/ml và 105 CFU/ml tiêm trên cá tra giống đã thu được tỉ lệ chết 100% và 66,7% trong khoảng thời gian theo dõi là 10 ngày. Ở thí nghiệm xác định khả năng bộc phát bệnh của vi khuẩn này lên cá tra sau khi tiêm, sử dụng mật độ vi khuẩn 1,5x105 CFU/ml và 1,5x106 CFU/ml tiêm cho cá tra giống thì cũng thu được tỉ lệ chết là 100% thời gian theo dõi là 6 ngày (Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004). Từ kết quả thí nghiệm xác định được LD50 của 3 chủng T8, CAF258, KSL103 và chủng A1 không xác định được LD50 do ở nồng độ thấp nhất tỉ lệ chết đã trên 50%. Cũng từ kết quả thí nghiệm cho thấy ở những chủng vi khuẩn E. ictaluri khác nhau thì khả năng gây bệnh khác nhau và giá trị LD50 cũng khác nhau. Trong 3 chủng xác định được LD50 thì chủng CAF258 có LD50 thấp nhất với giá trị LD50 = 4,7x102 CFU/ml và lớn nhất là chủng KSL103 với LD50 = 2,1x104 CFU/ml, trong khi đó chủng T8 có giá trị LD50 = 1,3x104 CFU/ml. Còn Ngô Minh Dung (2007) khi nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn này cũng xác định được giá trị LD50 = 106,5 CFU/ml. Bên cạnh đó, Lawrence et al. (1997) cũng sử dụng vi khuẩn này tiêm cho cá nheo với hai dòng vi khuẩn E. ictaluri một dòng được phân lập từ tự nhiên và một dòng LSU-E2 đã được 20 làm giảm độc lực, kết quả ở dòng LSU-2 thu được giá trị LD50 = 5,1x107 CFU/ml, còn ở dòng tự nhiên không xác định được LD50 do ở nồng độ thấp nhất 1,3x102 CFU/ml đã có tỉ lệ chết trên 50%. Ngoài ra, Baxa et al. (1990) cũng ngâm vi khuẩn này trên cá hồi trắng, theo dõi 14 ngày đã ghi nhận được giá trị LD50 = 3,4x107 CFU/ml. Qua kết quả nghiên cứu này cho thấy không chỉ vi khuẩn xâm nhập và gây bệnh trên những loài cá khác nhau thì khác nhau (Baxa et al. 1990) ngâm vi khuẩn E. ictaluri với cùng một mật độ 1x108 CFU/ml thì cá nheo chết là 32%, 75% đối với cá hồi trắng và 5% đối với cá vược sọc, theo dõi trong 14 ngày. Mà là vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể của ký chủ tạo bệnh hay không, ở mức nào còn tùy thuộc vào khả năng gây bệnh của vi khuẩn đối với ký chủ và điều kiện tác động. Trong 4 chủng vi khuẩn đem gây cảm nhiễm thì có 3 chủng T8, CAF258, KSL103 là xác định được độc lực LD50 và Chủng A1 tuy không xác định được giá trị LD50 nhưng với kết quả đó biết được độc lực của chủng này là rất mạnh. Trong quá trình gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri ở chủng A1, T8 thì bể đối chứng tiêm nước muối sinh lý có xuất hiện cá chết chủng A1 (39%) và chủng T8 (17%) và chủng KSL103 nồng độ thấp chết cao hơn nồng độ cao với 0,5x102 CFU/ml tỉ lệ chết là 20% và 0,5x103 CFU/ml chết với tỉ lệ 7%. Điều này có thể do tiêm cá gây sốc cho cá (bể đối chứng không tiêm hoàn toàn không có cá chết) và môi trường không ổn định cũng ảnh hưởng đến quá trình gây cảm nhiễm. Theo Wise et al. (1993) cho rằng khi cá nheo Mỹ bị sốc do nuôi trong bể trước khi tiếp xúc E. ictaluri, chết 97% ở cá bị sốc và 77% ở cá không bị sốc. Bên cạnh đó, Francis – Floyed (1996) có kết luận khi gây cảm nhiễm trên loài cá này gây chết cao nhất ở 250C, thấp nhất ở 230C và 280C, không gây chết ở 170C, 210C và 320C. Kết quả gây cảm nhiễm có 2 chủng có độc lực tương đối mạnh đó là chủng A1 không xác đinh được LD50 (bố trí từ 2,7x103 đến 2,7x108 CFU/ml) và chủng CAF258 (bố trí từ 0,8x102 đến 0,8x107 CFU/ml) với giá trị LD50 = 4,7102 CFU/ml. Gần đây, Cao Ái Hữu (2009) khi thực hiện đề tài tìm hiểu kiểu protein, lipopolyssachride (LPS) và protein màng ngoài (OMP) của một số chủng vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá tra kết quả khi điện di 9 chủng vi khuẩn E. ictaluri gồm: A1, C1, C2, 3B3, CAF255, CAF258, B1, T9 và S1 cho kết quả 6 chủng 3B3, C1, C2, B1, T9 và S1 có biểu hiện vạch protein giống nhau đều có 7 vạch ở các vi trí 150, 81, 70, 60, 43 và 36 kDa, trong khi đó 3 chủng còn lại CAF255, CAF258, A1 ngoài 7 vạch protein trên còn có thêm 21 vạch ở vị trí 50 kDa và có kết luận rằng đối với những vùng địa lý và điều kiện môi trường khác nhau dẫn tới protein của tế bào vi khuẩn có thể khác nhau. Thật vậy, qua kết quả thí nghiệm cho ta thấy 2 chủng A1, CAF258 có độc lực mạnh hơn những chủng còn lại. Điều này chứng tỏ khả năng gây bệnh của vi khuẩn E. ictaluri có liên quan đến protein của vi khuẩn. Theo Từ Thanh Dung, 2005 khả năng gây bệnh của vi khuẩn phụ thuộc vào khả năng xâm nhập và độc chất, độc chất bao gồm màng ngoài tế bào (LPS) và độc chất từ protein. 4.3. Dấu hiệu bệnh lý của cá sau khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. Cá tra gây cảm nhiễm có trọng lượng từ 15-30g chiều dài từ 10-15cm, cá mua về được dưỡng trong bể composite lớn sau đó được bố trí vào bể nhỏ. Cá được kiểm tra ký sinh trùng và vi sinh trước khi bố trí thí nghiệm. Nhìn chung cá sau khi gây cảm nhiễm có hiện tượng nổi đầu bơi lờ đờ sau đó chết và chìm xuống đáy. Bên ngoài da cá nhợt nhạt, gầy yếu đôi khi vây bị xuất huyết. Giải phẩu bên trong một số cơ quan nội tạng như gan, thận, tỳ tạng có đốm trắng tròn, nhỏ, đường kính từ 1-2mm và một vài con có hiện tượng nhũng ở thận, nội quan tái nhạt có dịch màu trắng. Trong thí nghiệm gây cảm nhiễm E. ictaluri lên cá tra giống của Lương Trần Thục Đoan (2006); Ngô Minh Dung (2007) cũng ghi nhận được những dấu hiệu bệnh lý như trên. Hình 4.3: Nội tạng cá tra bị nhiễm E. ictaluri 4.4. Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn E. ictaluri Sau khi gây cảm nhiễm, vi khuẩn được phân lập từ gan, thận và tỳ tạng của cá bệnh, sau đó vi khuẩn đã tái phân lập được tiến hành tái định danh vi khuẩn trở lại (Bảng 4.4). Việc tái phân lập và định danh vi khuẩn là hết sức cần thiết đối với lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng. Nó giúp xác định chính xác tác nhân gây bệnh để chắc chấn rằng chủng vi khuẩn phân lập được là chủng vi khuẩn ban 22 đầu đem gây cảm nhiễm. Bởi vì tỉ lệ chết chưa hẳn là dấu hiêu tốt của vấn đề bệnh, mà nó còn có thể là kết quả của vấn đề môi trường xấu hoặc do vi khuẩn khác gây ra. Hơn nữa tác nhân gây bệnh phải luôn tìm thấy trên sinh vật nhiễm bệnh và tác nhân gây bệnh phải được xác định từ kết quả tái phân lập (định đề R. Koch). Bảng 4.4: Kết quả tái định danh vi khuẩn sau khi gây cảm nhiễm STT Chỉ tiêu C1 A1 T8 KSL 103 CAF258 1 Gram - - - - - 2 Hình dạng que que que que que 3 Di động + + + + + 4 Oxidase - - - - - 5 Catalase + + + + + 6 OF +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 7 Citrate - - - - - 8 H2S - - - - - 9 Ure - - - - - 10 Nồng độ muối 0% + + + + + 0,5% + + + + + 1% + + + + + 1,5% + - + - - 2% - - - - - 11 Nitrate - - - - - 12 Indole - - - - - 13 VP - - - - - 14 MR - - - - - 15 Thủy phân gelatine - - - - - 16 Thủy phân starch - - - - - 17 Tween 80 - - - - - 18 Các loại đường Manose + + + + + Sucrose - - - - - Xylose - - - - - Glucose + + + + + Mannitol - - - - - Glycerol + + + + - Maltose - - - - - Rhamnose - - - - - Inositol - - - - - Galactose + + + + + Sorbitol - - - - - 19 Kết hợp crystal violet - - - - - 23 Kết quả sau khi gây cảm nhiễm vi khuẩn thu được phát triển chậm, sau 24-48 giờ ở 28-300C tạo thành những khuẩn lạc có kích thước rất nhỏ, tròn có màu trắng, không có nhân, rìa có dạng không đồng nhất. Đặc điểm này giống với đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri do (Crumlish và ctv, 2002; Từ Thanh Dung và ctv, 2004) mô tả. Hình 4.4.1: Gram vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Hình 4.4.2: Kết quả test sinh hóa vi khuẩn E. Ictaluri. (A) O/F; (B) Các lọai đường 1: Manose, 2: Sucrose, 3: Xylose, 4: Glucose, 5: Mannit, 6: glycerol, 7: Maltose, 8: Rhamnose, 9: Inositol, 10: Galactose. Sau đó kiểm tra các đặc điểm sinh hóa bằng phương pháp truyền thống, mỗi chỉ tiêu lặp lại 2 lần. Kết quả 4 chủng vi khuẩn nghiên cứu giống với chủng tham khảo C1 (có nguồn gốc từ tủ -800C của Khoa Thủy Sản) ở hầu hết các chỉ tiêu, ngoài trừ chủng CAF258 ở chỉ tiêu oxi hóa đường glycerol. Tất cả các chủng điều có dạng hình que, gram âm (Hình 4.4.1), di động yếu, cho phản ứng oxidase âm tính, catalase dương tính, có khả năng lên men và oxi hóa đường 24 manose, glucose, galactose và glycerol (trừ chủng CAF258 không có khả năng oxi hóa đường glycerol), không có khả năng oxi hóa đường sucrose, xytose, mannitol, manltose, rhamnose, inositol, sorbitol (Hình 4.4.2), không có khả năng sinh khí H2S và không tạo sản phẩm indole, có khả năng kết hợp muối nhưng không có khả năng kết hợp crystal violet, cho phản ứng âm tính với citrate, urease, indole, VP và MR, tween 80, không có khả năng thủy phân gelatin và starch. Theo Hawke và ctv (1981) mô tả vi khuẩn E. ictaluri là vi khuẩn gram âm, hình que, di động yếu, có khả năng oxi hóa và lên men đường glucose, phản ứng catalase dương tính và oxidase âm tính, không sinh khí H2S trên môi trường TSI và phản ứng indole âm tính. Bên cạnh đó, Keskin và ctv, (2004) cho rằng vi khuẩn E. ictaluri cho phản ứng galactose, manose dương tính khi sử dụng phương pháp test truyền thống. 4.5 Biến đổi mô học ở cá tra bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Gan là cơ quan tiết ra dịch mật đổ vào túi mật và ruột non qua ống dẫn mật, gan còn là nơi giải độc cho cơ thể, là nơi thực hiện việc chuyển hoá glucid, lypid, protid trong cơ thể và sản xuất ra kháng thể. A B D C a b Hình 4.5: Gan và thận cá tra bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (H&E, 200x) A. Xung huyết tĩnh mạch trung tâm, xuất huyết nhiều vùng trên gan ( ) B. Vùng tế bào gan bị biến đổi cấu trúc ( ) C. a. Quản cầu thận bị xung huyết, b. Ống thận bị họai tử, mất cấu trúc D. Thận bị xung huyết và xuất huyết ( ) 25 Quan sát mô gan của cá gây cảm nhiễm có sự biến đổi, liên kết cấu trúc tế bào gan bị phá hủy, đảo tụy và tĩnh mạch gan xung huyết. Nhiều vùng tế bào có hiện tượng xuất huyết, bị biến đổi cấu trúc và họai tử hạt. Những tổn thương diễn ra toàn bộ tổ chức gan làm cho gan không còn chức năng khử độc, lọc máu, chuyển hoá protein, lipid, glucid, tiết mật, làm cho chất độc không được loại bỏ sẽ tích lũy trong cơ thể kết hợp với những yếu tố khác làm chết cá. Thận là cơ quan bài tiết và tạo máu, là con đường xâm nhập chủ yếu của vi khuẩn. Quan sát mô thận cá tra cho thấy cấu trúc ống thận bị vỡ, nhiều vùng bị hoại tử, quản cầu thận mất cấu trúc. Thận bị mất cấu trúc nên không thực hiện được chức năng bài tiết các chất thải trong quá trình trao đổi chất sẽ gây ra hiện tượng tích tụ các sản phẩm thải của quá trình biến dưỡng gây độc cho cơ thể. Theo Nguyễn Quốc Thịnh (2002) hiện tượng sung huyết kéo dài sẽ làm vỡ mạch máu, giải thoát nhiều emzim tiêu hoá (tiêu hoá protein, lipid,..) từ các bạch cầu làm cho tổ chức viêm bị hủy hoại dẫn đến hoại tử. Hiện tượng xuất huyết do ở những vùng sung huyết với ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn, các mao mạch máu bị vỡ hoặc tính thẩm thấu của mạch máu tăng lên, làm cho các tế bào máu trong vùng sung huyết thoát ra xen lẫn với các tế bào cơ quan (Đỗ Thị Hoà & ctv, 2004). 26 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận - Sau khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra với 4 chủng A1, T8, CAF258 và KSL103. Kết quả xác định được LD50 của 3 chủng CAF258, T8, KSL103 với giá trị LD50 lần lượt là 4,7x102 CFU/ml; 1,3x104 CFU/ml và 2,1x104 CFU/ml. Chủng A1 không xác định được LD50 do ở nồng độ thấp tỉ lệ chết đã là 100% . - Kết quả tái phân lập và tái định danh bằng phương pháp truyền thống của 4 chủng này phù hợp với kết quả trước và sau khi gây cảm nhiễm và cũng không có gì khác so với chủng tham khảo C1 và những kết quả định danh trước đây. - Quan sát mô gan của cá gây cảm nhiễm có sự biến đổi, liên kết cấu trúc tế bào gan bị phá hủy, đảo tụy và tĩnh mạch gan xung huyết. Nhiều vùng tế bào có hiện tượng xuất huyết, bị biến đổi cấu trúc và hoại tử hạt. 5.2 Đề xuất - Đối với chủng A1 bố trí lại với nồng độ thấp hơn để xác định được giá trị LD50. - Cần bố trí thêm những chủng E. ictaluri khác để hiểu rõ hơn về độc lực của vi khuẩn này ở cá tra. 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Baxa, D.V., J.M. Groff, A. Wishkovsky and R.P. Hedrick, 1990. Susceptibility of nonictalurid fishes to experimental infected with Edwardsiella ictaluri. Diseases of Aquatic Organisms 8: 113-117. 2. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004. Giáo trình bệnh học thủy sản. Khoa Nuôi trồng thủy sản, Đại Học Thủy Sản Nha Trang. 237 trang. 3. Cao Ái Hữu, 2009. Tìm hiểu kiểu protein, lipopolyssacharide (LPS) và protein màng ngoài (OMP) của một số chủng Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). 4. Crumlish, M., T.T. Dung, J.F. Turnbull, N.T.N Ngọc and H.W. Ferguson, 2002. Indentification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hupophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam. Journal of fish dieaes 25: 733-736. 5. Dương Nhật Long, 2003. Giáo trình kỹ thuật nuôi thủy sản nước ngọt. 6. Ferguson.W, J.F. Turnbull, A. Shinn, K. Thompson, T.T. Dung and M. Crumlish, 2001. Bacillary nercrosis in farmed Pangasius hypophthalamus (Sauvage) from the Mekong Delta, Viet Nam. Journal of Fish Diseases 24: 509-514. 7. Francis-Floyd, R. 1996. Enteric septicemia of catfish. University of Florida. Fact sheet FA-10. 8. Hawke J.P., A.C. McWhorter, A.G. Steigerwalt and D.J. Brenner, 1981. Edwardsiella ictaluri sp. Nov., the causative agent of enteric septicemia of catfish. International Journal of Systematic Bacteriology 31: 396-400. 9. new detail.php?id=19. Tác nhân gây bệnh đốm trắng trên gan, thận (bệnh mủ gan) và hướng ngăn ngừa bệnh (Nguyễn Trọng Bình, 2008). Đăng ngày (10/05/2008), truy cập ngày 09/11/2008. 10. d=003003&id=954. Bệnh mủ gan trên cá tra. Truy cập ngày 21/11/2008. 28 11. Huỳnh Chí Thanh, 2007. Xác định đặc điểm sinh hóa và bước đầu thử nghiệm điều trị bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthamus) bằng kháng sinh. Luận văn tốt nghiệp đại học. 12. Keskin, O., S. Secer, M. Izgur, S. Turlyilmaz và R.S. Mkakosya, 2004. Edwardsiella ictaluri infection in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Turk. J. Vet. Anim. Sci. 28:649-653. 13. Lawrence M.L., R.K. Cooper and R.L. Thune, 1997. Attenuation, pesistence and vaccine potential of an Edwardsiella ictaluri purA Mutant. Infection and Immunity 65 (11): 4642-4652. 14. Lê Minh Đương, 2007. So sánh khả năng xâm nhập của hai dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasianodon hypophthamus). Luận văn tốt nghiệp đại học. 15. Lê Phú Khởi, 2006. Đánh giá thông tin liên quan đến quản lý sức khỏe cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở tỉnh An Giang. Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại học Cần thơ. 16. Lê Thị Bé Năm, 2002. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng ở nội tạng cá tra Pangasianodon hypophthamus. Luận văn tốt nghiệp đại học. 17. Lương Trần Thục Đoan, 2006. Khảo sát sự xuất hiện của vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) trên các cơ quan khác nhau của cá tra (Pangasianodon hypophthamus). Luận văn tốt nghiệp đại học. 18. Ngô Minh Dung, 2007. Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và A. hydrophila trên cá tra. Luận văn tốt nghiệp đại học. 19. Nguyễn Quốc Thịnh, 2002. Nghiên cứu mô bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn tốt nghiệp. 20. Nguyễn Quốc Thịnh, T.T. Dung, H.W. Ferguson, 2003. Nghiên cứu mô bệnh học cá tra (Pangasianodon hypophthamus) bệnh trắng gan. Tạp chí khoa học Đại Học Cần Thơ, chuyên ngành thủy sản. Trang 120-125. 21. Nguyễn Thanh Phương, Phạm Minh Đức, Vũ Nam Sơn và Trần Văn Bùi. 2004. Báo cáo tổng quan ứng dụng công nghệ nhằm năng cao chất lượng hạ giá thành sản phẩm thủy sản (tôm càng xanh, cá tra, basa và cá rô phi ở tỉnh An Giang). Sở Khoa học và Công nghệ An Giang và Khoa Thủy sản, Đại học Cần thơ. 29 22. Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri do trên cá tra Pangasianodon hypophthamus ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận văn tốt nghiệp đại học. 23. Plumb J.A., 1999. Edwardsiella ictaluri Septicaemias. Fish diseases and disorders, Volume 3: Viral, Bacterrial and Fungal infections. 24. Shotts E.B., V.S. Blazer and W.D. Walyman, 1986. Pathogenesis of experimental Edwardsiella ictaluri infection in Channel Catfish (Ictalurus punctatus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciencesn 43:36-42. 25. Tiết Ngọc Trân, 2007. So sánh khả năng gây bệnh của hai dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra Pangasianodon hypophthamus và nheo Mỹ (Ictalury furcatus). Luận văn tốt nghiệp đại học. 26. Trần Lê Triệu Tú, 2007. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự nhiễm khuẩn của vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra (Pangasianodon hypophthamus). Luận văn tốt nghiệp đại học. 27. Từ Thanh Dung, 2005. Bài giảng bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản. Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 28. Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng thụy Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ. 137-142. 29. William, M.L and M.L. Lawrence, 2005. Identification and characerization of a two compoent hemolysin from E. Ictaluri. Veterinary Microbiology 108:281- 189. 30. Wise, D.J., T.E. Schwedler and D.L. Otis, 1993. Effects of stress on susceptibility of naive channel catfish in immersion chllenge with Edwardsiell ictaluri. Journal of Aquatic animal Health 5: 92-97. 30 PHỤ LỤC 1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn: 1. Nhuộm Gram Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ một giọt nước cất lên lam kính, dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn trải đều lên giọt nước cất. Để khô ở nhiệt độ phòng sau đó hơ lướt lam trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn trên lam. Các bước thực hiện: 1. Nhỏ dung dịch Crystal violet (dung dịch I ) lên lam. Để 1 phút. 2. Rửa bằng nước cho hết màu tím trên lam (khoảng 2 giây), để khô. 3. Nhỏ dung dich Iodine (dung dịch II) lên lam, để khoảng 1 phút. 4. Lật nghiêng lam kính cho hết dung dịch Iodine trên lam. 5. Dùng dung dịch cồn: aceton (dung dịch III) để tẩy màu bằng cách nghiêng lam kính rồi nhỏ từ từ dung dịch III cho đến khi giọt nước cuối trên lam không còn màu tím. Rửa và để khô. 6. Nhỏ dung dịch Safranin (dung dich IV) lên lam, để khoảng 2 phút. Rửa và để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát ở vật kính 100X. Đọc kết quả Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh. Vi khuẩn Gram âm (G-) có màu hồng đỏ. 2. Quan sát tính di động Sự di động của vi khuẩn có thể quan sát bằng phương pháp giọt treo ở vật kính 40X. Các bước thực hiện như sau: 1. Cho vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lamelle trên bàn. 2. Cho một giọt nước lên lame. 3. Tiệt trùng que cấy, lấy một ít vi khuẩn cho lên lame hòa vào nước. 4. Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước chứa vi khuẩn. 5. Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước được treo ngược trên lamelle 6. Đặt lam lên kính hiển vi quan sát tính di động của vi khuẩn ở vật kính 40X. 3. Phản ứng oxidase: dùng dung dịch oxidase Dùng que cấy phết một ít vi khuẩn lên giấy lọc đã tẩm dung dịch oxidase. Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Oxidase (+) sẽ làm giấy lọc chuyển sang màu xanh trong vòng 10 giây và ngược lại. 31 4. Phản ứng catalase Sử dụng dung dịch 3% H2O2 (3ml H2O2 trong 100ml nước cất). 1.Dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn để lên lame. 2. Nhỏ lên vi khuẩn một giọt 3% H2O2 Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Catalase (+) sẽ gây hiện tượng sủi bọt trong dung dịch 3% H2O2 và ngược lại. 5. Khả năng lên men và oxy hoá đường glucose (O/F) Các bước thực hiện: 1. Đun và khấy cho tan hoàn toàn môi trường O/F. 2. Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội 450C. 3. Thêm 1% glucose tiệt trùng. Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm. 4. Cấy vi khuẩn vào 2 ống nghiệm có chứa môi trường OF. Sau đó phủ 0.5-1ml dầu parafin tiệt trùng vào 1 ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C. Theo dõi và đọc kết quả sau từ một đến bảy ngày. Lên men (F) khi ống có phủ parafin chuyển sang màu vàng. Oxidation (O) khi ống không có phủ parafin chuyển sang màu vàng. Không đổi (N) cả hai ống đều có màu xanh lá cây hoặc xanh lơ. 6. Khả năng sinh H2S Các bước thực hiện: 1. Môi trường TSI (60g/1000ml nước cất). 2. Đun và khuấy cho tan hoàn toàn. 3. Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội ở 450C. 4. Cho khoảng 3ml môi trường vào ống nghiệm. 5. Để nghiêng ống nghiệm tạo một mặt phẳng nghiêng. 6. Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng và mặt đứng của ống nghiệm. Ủ ở 280C. Đọc kết quả sau 14-28 giờ - Vi khuẩn chỉ lên men đường Glucose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng (K (alkaline)/A (acid)) - Vi khuẩn lên men đường Glucose và Lactose hoặc Sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng (A(acid)/A (acid)). - Vi khuẩn chỉ lên men đường Lactose hoặc Sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (A (acid)/K (alkaline)). - Vi khuẩn không lên men đường Glucose, không lên men đường Lactose hoặc Sucrose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (K (alkaline)/K (alkaline)). - Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen trong ống nghiệm. 32 7. Khả năng sinh indole Các bước thực hiện: 1. Cho khoảng 3ml môi trường Nutrient broth vào ống nghiệm. 2. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội. 3. Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C. 4. Sau 48 giờ nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm. Kết quả: Vi khuẩn sinh Indole sẽ cho phản ứng (+) với một vòng màu hồng đến đỏ sậm trên bề mặt của môi trường và ngược lại. 8. Khả năng phát triển của vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau 1. Chuẩn bị môi trường 1% tryptone. Thêm NaCl ứng với các nồng độ muối 0; 0.5; 1; 1,5; 2% NaCl. 2. Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm, thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 3. Cấy một ít vi khuẩn vào 2 ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C. 4. Đọc kết quả từ 2 ngày. Phản ứng dương tính khi ống nghiệm đục và ngược lại. 9. Phản ứng Voges-Proskauer (VP): 1. Môi trường MR-VP broth 2. Cho 3ml môi trường vào trong ôngd nghiệm. 3. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội. 4. Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ 280C. 5. Sau 48 giờ nhỏ 0.6 ml dung dịch thuốc thử A và 0.2 ml dung dịch thuốc thử B vào ống nghiệm. 6. Lắc đều và để ống nghiệm 30 phút. 7. Đọc kết quả: phản ứng dương tính khi có màu hồng của môi trường xuất hiện, và ngược lại. Thuốc thử: A: Hòa tan 5g alpha naphthol trong 100 ml ethyl alcohol. B: Hòa tan 40g KOH trong 100 ml nước cất. 9. Khả năng sử dụng Citrate: 1. Môi trường Simmon’s Citrate agar. 2. Đun sôi và khuấy cho tan. 3. Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm và thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 4. Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng trong ống nghiệm và để nguội. 5. Cấy vi khuẩn trên mặt nghiêng của ống nghiệm, ủ trong tủ ấm 280C. 6. Đọc kết quả sau 2-7 ngày. Vi khuẩn sử dụng citrate tạo màu xanh lơ trong môi trường Cimmon citrate agar và ngược lại. 10. Khả năng thủy phân Gelatine: 33 1. Môi trường Nutrient agar-1% Gelatine. 2. Thanh trùng ở 1210C trông 15 phút. Để nguội khoảng 450C, đổ môi trường ra đĩa Petri. 3. Cấy vi khuẩn lên đĩa Petri và ủ ở 280C. 4. Sau 48 giờ nhỏ thuốc thử HgCl2 lên bề mặt agar. 5. Đọc kết quả trong vòng 30 phút. Nếu xuất hiện một vòng tròn lan rộng xung quanh chổ có vi khuẩn phát triển cho phản ứng dương tính và ngược lại. 11. Khả năng sử dụng Ure: 1. Môi trường 0.1% Pepton + 0.2% KH2PO4 + 0.0012% Phenol red + 0.1% Glucose, thêm 2% Ur echo phản ứng. Môi trường đối chứng không có ure. 2. Cho 3 ml môi trường vào trong ống nghiệm. 3. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 4. Cấy một ít vi khuẩn vào trong hai ống nghiệm. Để trong tủ ấm 280C. 5. Đọc kết quả trong vòng 2 ngày. Phản ứng dương tính khi các ống nghiệm có ure chuyển sang màu hồng. 12. Khả năng sử dụng các loại đường: 1. Môi trường: Các dung dịch đường glucose, sucrose, galactose, mannitol, maltose, sorbitol, xylose, glycerol, rhamnose, Inositol. 2. Cấy vi khuẩn vào các ống nghiệm. Ủ trong tủ ấm ở 280C. 3. Sau 48 giờ đọc kết quả. Phản ứng dương tính khi ống nghiệm chuyển sang màu vàng và ngược lại. 34 PHỤ LỤC 2 Bảng số lượng cá chết hằng ngày trong thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. Chủng A1: Mật độ tiêm từ 2,7x103 CFU/ml đến 2,7x103 CFU/ml. 10^8 10^8 10^8 10^7 10^7 10^7 10^6 10^6 10^6 10^5 10^5 10^5 10^4 10^4 10^4 10^3 10^3 10^3 0.85% NaCl 0.85% NaCl 0.85% NaCl Không tiêm Bể T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T20 T22 Số cá 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Ngày 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ngày 2 3 5 5 2 1 3 1 0 0 2 0 0 0 0 4 2 0 5 0 0 0 0 Ngày 3 6 6 6 6 5 6 5 0 0 3 0 0 0 2 4 2 1 6 0 0 0 0 Ngày 4 6 6 6 6 5 6 6 3 6 6 3 4 0 6 4 3 1 6 0 0 0 0 Ngày5 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 5 6 0 6 4 4 4 6 0 0 0 0 Ngày 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 1 6 6 5 6 6 0 0 0 0 Ngày 7 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 2 6 6 6 6 6 0 0 0 0 Ngày 8 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 6 6 0 0 0 0 Ngày9 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 0 0 0 0 Ngày 10 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 1 0 0 0 Ngày 11 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 2 0 0 Ngày 12 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 2 0 0 35 Chủng T8: Mật độ tiêm từ 0,4x102 CFU/ml đến 0,4x107 CFU/ml 10^7 10^7 10^7 10^6 10^6 10^6 10^5 10^5 10^5 10^4 10^4 10^4 10^3 10^3 10^3 10^2 10^2 10^2 0.85% NaCl 0.85% NaCl 0.85% NaCl Không tiêm Bể T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21 Số cá 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Ngày 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ngày 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ngày 3 2 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Ngày 4 4 2 2 2 2 1 1 3 6 2 3 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 Ngày5 6 6 3 2 5 2 2 6 8 4 3 0 2 0 1 0 2 1 0 0 0 0 Ngày 6 8 8 5 3 6 3 3 6 8 4 3 4 2 0 1 0 2 1 0 0 0 0 Ngày 7 8 10 6 9 8 3 3 6 8 4 3 5 5 5 1 0 2 1 0 0 0 0 Ngày 8 8 10 6 9 8 3 3 6 8 4 3 6 5 5 1 0 2 4 0 0 3 0 Ngày9 8 10 7 9 8 3 3 6 8 4 3 6 5 5 1 0 3 4 0 0 5 0 Ngày 10 8 10 7 9 8 3 3 6 8 4 3 6 5 5 1 0 3 4 0 0 5 0 Ngày 11 8 10 7 9 8 3 3 6 8 4 3 6 5 5 1 0 3 4 0 0 5 0 Ngày 12 8 10 7 9 8 3 3 6 8 4 3 6 5 5 1 0 3 4 0 0 5 0 36 Chủng CAF258: Mật độ tiêm vi khuẩn từ 0,8x102 CFU/ml đến 0,8x107 CFU/ml. 10^7 10^7 10^7 10^6 10^6 10^6 10^5 10^5 10^5 10^4 10^4 10^4 10^3 10^3 10^3 10^2 10^2 10^2 0.85% NaCl 0.85% NaCl 0.85% NaCl Không tiêm Bể T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21 Số cá 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Ngày 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ngày 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ngày 3 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ngày 4 9 10 10 8 9 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ngày5 10 10 10 10 9 9 8 5 8 4 5 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ngày 6 10 10 10 10 9 9 8 8 10 7 6 2 0 2 2 0 0 0 0 0 0 0 Ngày 7 10 10 10 10 9 9 9 8 10 8 6 6 4 4 4 1 0 1 0 0 0 0 Ngày 8 10 10 10 10 9 9 9 8 10 8 6 7 6 5 5 1 0 1 0 0 0 0 Ngày9 10 10 10 10 9 9 9 8 10 8 6 8 6 7 5 1 0 1 0 0 0 0 Ngày 10 10 10 10 10 9 9 9 8 10 8 6 8 6 8 5 1 0 1 0 0 0 0 Ngày 11 10 10 10 10 9 9 9 9 10 8 6 8 6 8 5 1 0 1 0 0 0 0 Ngày 12 10 10 10 10 9 9 9 9 10 8 6 8 6 8 5 1 0 1 0 0 0 0 37 Chủng KSL103: Mật độ tiêm vi khuẩn từ 0,5x102 CFU/ml đến 0,5x107 CFU/ml. 10^7 10^7 10^7 10^6 10^6 10^6 10^5 10^5 10^5 10^4 10^4 10^4 10^3 10^3 10^3 10^2 10^2 10^2 0.85% NaCl 0.85% NaCl 0.85% NaCl Không tiêm Bể T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21 Số cá 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Ngày 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ngày 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 Ngày 3 8 7 8 3 2 3 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 Ngày 4 8 10 10 7 6 8 0 4 2 1 0 1 0 0 1 0 2 1 0 0 0 0 Ngày5 8 10 10 7 6 10 4 7 4 1 1 2 0 1 1 0 4 1 0 0 0 0 Ngày 6 8 10 10 7 7 10 4 7 6 4 1 3 0 1 1 0 4 1 0 0 0 0 Ngày 7 8 10 10 7 7 10 4 7 6 5 1 3 0 1 1 0 4 1 0 0 0 0 Ngày 8 8 10 10 7 7 10 4 7 6 5 2 3 0 1 1 1 4 1 0 0 0 0 Ngày9 8 10 10 7 7 10 4 7 7 5 2 3 0 1 1 1 4 1 0 0 0 0 Ngày 10 8 10 10 7 7 10 4 7 7 5 2 3 0 1 1 1 4 1 0 0 0 0 Ngày 11 8 10 10 7 7 10 4 7 7 5 2 3 0 1 1 1 4 1 0 0 0 0 Ngày 12 8 10 10 7 7 10 4 7 7 5 2 3 0 1 1 1 4 1 0 0 0 0 38 PHỤ LỤC 3 Kết quả tái định danh của vi khuẩn E. ictaluri sau khi gây cảm nhiễm: STT Chỉ tiêu C1 A1 T8 CAF258 KSL103 1 Gram - - - - - 2 Hình dạng que que que que que 3 Di động + + + + + 4 Catalase + + + + + 5 Oxidase - - - - - 6 O-F glucose +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 7 Simmons' citrate - - - - - 8 H2S - - - - - 9 Urea - - - - - 10 Nồng độ muối 11 0% + + + + + 12 0,5% + + + + + 13 1% + + + + + 14 1,5% - - + - - 15 2% - - - - - 16 Nitrite - - - - - 17 Indole - - - - - 18 VP - - - - - 19 MR - - - - - 20 Gelatin - - - - - 21 Thủy phân starch - - - - - 21 Tween 80 - - - - - 21 Các loại đường Manose + + + + + Sucrose - - - - - Xylose - - - - - Glucose + + + + + Mannit - - - - - Glycerol + + + - + Maltose - - - - - Rhamnoso - - - - - Inositol - - - - - Galactose + + + + + Sorbitol - - - - - 19 Crystal violet - - - - - 39 PHỤ LỤC 4 Mô học 1. Formol trung tính (Neutral buffered formalin: NBF) Formalin 100 ml NaH2PO4 4 g Na2HPO4 6,5 g Nước cất 900 ml 2. Dung dịch cố định Buoin’s Acid picric quá bão hòa 750 ml Formol 125 ml Glacial acetic acid 50 ml 3. Harris’s haematoxyline Haematoxyline 5 g 100% alcohol 50 ml Potassium alum 50 g Nước cất 1 lít Mercuric oxide 2,5 g Glacial acetic acid 40 ml Hòa tan Potassium alum trong nước ấm. Hòa tan Haematoxyline trong cồn, sau đó cho vào dung dịch Potassium alum vừa pha ở trên, rồi thêm Mercuric oxide và khuấy đều. Để nguội, thêm Glacial acid và lọc lại. 4. Eosin/Phloxine Stock Eosin (1% Eosin Y trong nước) 100 ml Stock Phloxine (1% Phloxine B trong nước) 10 ml 95% Ethanol 780 ml Glacial acetic acid 4 ml 5. Acid/ Alcohol Alcohol 70% 990 ml Hydrochloric acid 10 ml 6. 2% Potassium acetate Potassium acetate 20 g Nước cất 1lít 40 Qui trình xử lí mẫu Hóa chất Thời gian Cồn 800 1 h Cồn 900 1 h Cồn 950 1 h Cồn 1000 1 h Cồn 1000 1 h Cồn 1000 1 h Xylen 1 h Xylen 2 h Xylen 2 h Paraffin : Xylene 2 h Paraffin : Sáp ong 2 h Paraffin : Sáp ong 2 h Qui trình nhuộm mẫu (Harris's Haematoxylin & Eosin) Hóa chất Thời gian Xylen 10 phút Xylen 10 phút Xylen 1 phút Cồn 1000 1 phút Cồn 1000 1 phút Cồn 1000 1 phút Cồn 900 1 phút Cồn 800 1 phút Cồn 650 1 phút Haematoxylin 10 phút 1% acid alcohol Nhúng 3 lần Eosine 3 phút 2% Potassium acetate 5 phút Cồn 650 1 phút Cồn 800 1 phút Cồn 900 1 phút Cồn 1000 1 phút Cồn 1000 1 phút Cồn 1000 1 phút Xylen 5 phút Xylen 5 phút Xylen 5 phút 41 MỤC LỤC Lời cảm tạ………………………………………………………………………i Tóm tắt…………………………………………………………………………ii Mục lục………………………………………………………………………...iii Danh sách bảng…………………………………………………………………v Danh sách đồ thị………………………………………………………………..v Danh sách hình………………………………………………………………...vi PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ ...............................................................................................1 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................3 2.1 Tình hình bệnh trên cá tra ....................................................................................3 2.2 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ở cá tra. ................................................3 2.1.1 Nguyên nhân gây bệnh.................................................................................3 2.1.2 Đường lây lan................................................................................................4 2.1.3 Dấu hiêu bệnh lý ...........................................................................................4 2.3 Lịch sử bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus).....................5 2.4 Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm Edwardsiella ictaluri....................................5 2.5 Biến đổi mô học ở cá bệnh do vi khuẩn E. ictaluri .............................................7 PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................8 3.1 Thời gian và địa điểm ..........................................................................................8 3.2 Vật liệu nghiên cứu..............................................................................................8 3.3 Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................8 3.3.1 Chuẩn bị hệ thống bể ....................................................................................8 3.3.2 Cá thí nghiệm................................................................................................9 3.3.3 Vi khuẩn........................................................................................................9 3.3.4 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri ở cá tra. .................................11 3.3.4.1 Xác định LD50 theo phương pháp của Reed và Muench (1938)..........12 3.3.4.2 Tái phân lập và tái định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp truyền thống. ..............................................................................12 3.3.5 Mô học ........................................................................................................13 3.3.6 Xử lý số liệu................................................................................................14 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................15 4.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. .....................................................15 4.1.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng A1...............................15 4.1.2 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng T8 ...............................16 iii 42 4.1.3 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng CAF258......................16 4.1.4 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng KSL103......................17 4.2 Thảo luận chung.................................................................................................18 4.3. Dấu hiệu bệnh lý của cá sau khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. .............21 4.4. Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn E. ictaluri.....................................21 4.5 Biến đổi mô học ở cá tra bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ....................24 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.................................................................26 5.1 Kết luận..............................................................................................................26 5.2 Đề xuất ...............................................................................................................26 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................27 PHỤ LỤC 1 .................................................................................................................30 PHỤ LỤC 2 .................................................................................................................34 PHỤ LỤC 3 .................................................................................................................38 PHỤ LỤC 4 .................................................................................................................39 iv 43 DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm ..................................... 9 Bảng 3.2: Mật độ vi khuẩn E. ictaluri (CFU/ml) gây cảm nhiễm .................... 11 Bảng 4.4: Kết quả tái định danh vi khuẩn sau khi gây cảm nhiễm................... 22 DANH SÁCH ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1.1: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng A1 ................ 15 Đồ thị 4.1.2: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng T8.................16 Đồ thị 4.1.3: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng CAF258........17 Đồ thị 4.1.4: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng KSL103........ 18 v 44 DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Sơ đồ chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm.................................................. 10 Hình 4.3: Nội tạng cá tra bị nhiễm E. ictaluri................................................... 21 Hình 4.4.1: Gram vi khuẩn Edwardsiella ictaluri............................................. 23 Hình 4.4.2: Kết quả test sinh hóa vi khuẩn E. ictaluri. ..................................... 23 Hình 4.5: Gan và thận cá tra bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ……….24 vi