Xác định tác nhân gây bệnh và nghiên cứu thử nghiệm một số loại thảo dược trong phòng trị bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

lấy nước đó té đều xuống ao, hoặc ngâm xuống ao với liều lượng 3-5kg rễ tươi/1.000m2 ao ở mức nước 15-20cm. [2] ,[3], [6] 2.3.2. Cây xoan (Melia azedarach) Dùng lá xoan để diệt trùng mỏ neo và trùng bánh cho cá rất tốt: lấy cành lá xoan non bó thành bó ngâm trong lồng nuôi cá đang bị bệnh trùng mỏ neo, trùng bánh xe, hoặc ngâm trong cá nuôi ở phía đầu nguồn nước với lượng 150-200kg lá xoan/1.000m2 ao có mức nước 1,5 - 2m hoặc 20-25kg lá xoan/lồng cá 8m2. [2] ,[3], [6] 2.3.3. Cây thàn mát (Milletia ichthyochtona) Quả khi già hạt có chứa 30-40% dầu và chất gây độc (như rotenon, sapotoxin) đối với cá. Có thể dùng hạt thàn mát để diệt cá tạp trong ao nuôi tôm. Cách dùng: nghiền nát hạt rồi hoà vào nước, dùng nước đó tưới đều lên ao; hoặc đập nát cho vào bao tải ngâm ở ao, tác dụng chậm hơn. Liều lượng cứ 0,5-1 kg hạt dùng cho một ao 1.000 m2 ở mức nước 15 -20 cm. [2] ,[3], [6] 2.3.4. Cây sở (Cammellia sasanqua) Sở là cây ép lấy dầu, bã làm thành bánh (khô dầu sở) có chứa chất saponozit gây độc làm chết cá và có tác dụng diệt khuẩn. Khô dầu sở có tác dụng để cải tạo ao đầm nuôi tôm. Khi dùng, cần nghiền nát khô dầu sở rồi rải xuống ao, hay ngâm trong nước. [2] ,[3], [6] 2.3.5. Cây bồ hòn (Sapindus mukorossi) Quả bồ hòn có nhân, hạt rất độc. Người nuôi cá, tôm dùng hạt để diệt cá tạp khi cải tạo ao đầm. Khi dùng, giã hạt thật nhỏ, hoà tan với nước, dùng nước này té đều khắp ao với liều lượng 0,5-1kg hạt/1.000 m2 ao có mức nước 15-20cm. [2] ,[3], [6] 2.3.6. Cây thầu dầu tía (Ricinus communis L.) Lá thầu dầu có chất đắng, dùng để chữa bệnh loét mang, đốm đỏ cho cá rất hiệu quả: Lấy lá thầu dầu bó thành từng bó ngâm xuống ao với lượng 250-300kg lá thầu dầu/ha ao, với mức nước sâu 1,5 – 2 m. [2] ,[3], [6] 2.3.7. Cây nghể (Polygonum hydropipe L.) Nghể là cây có vị cay nóng, hắc. Dùng cây này chữa bệnh viêm ruột, loét mang cho cá trắm cỏ, rô phi, có hiệu quả nhất đối với cá giống: Lấy thân cây và lá băm nhỏ, nấu kỹ lấy nước, sau đó trộn với thức ăn cho cá ăn, với liều lượng 3 kg thân lá nghể tươi/100 kg cá giống, cho cá ăn liên tục từ 3 - 6 ngày. Cũng có thể dùng lá nghể khô xay thành bột trộn với thức ăn cho cá, 1 – 2 kg nghể khô/100 kg cá giống. [2] ,[3], [6] 2.3.8. Cây rau sam (Portulacaoler acea L.) Dùng rau sam để chữa bệnh viêm ruột do vi khuẩn đối với cá trắm cỏ. Khi dùng, rửa sạch rau rồi vô trùng bằng nước muối 3%, rải rau trong khung nổi ở ao hoặc trong lồng cá, mỗi ngày cho ăn một lần, liên tục trong 6 ngày với liều lượng 1,5-3kg rau sam/100kg cá. Đối với cá giống cần băm nhỏ rau, rắc đều trên mặt ao hoặc trong lồng cá. [2] ,[3], [6] 2.3.9. Cây tía đỏ ( Ricinus communis L.) Cây tía đỏ thường được dùng để chữa bệnh đường ruột cho động vật thuỷ sản. Khi dùng lấy thân và lá cây băm nhỏ, nấu kỹ, lấy nước trộn với thức ăn tinh rồi cho ăn lượng 0,2 - 0,5 kg lá/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong 3 - 5 ngày. [2] ,[3], [6] 2.3.10. Tỏi (Allium sativum L.) Tỏi được dùng chữa bệnh đường ruột cho cá nuôi. Khi dùng cần nghiền nát củ tỏi, trộn lẫn với thức ăn tinh cho cá ăn, liều lượng 0,5 - 1,5 kg tỏi, trộn với thức ăn/100 kg cá, cho cá ăn liên tục 6 ngày. [2] ,[3], [6] 2.3.11. Cây cau (Areca catechu) Chất arecolin trong hạt cau có tác dụng oxy hoá protein của tế bào kí sinh trùng làm tê liệt thần kinh của giun sán, làm tê liệt cả cơ trơn làm giun sán không bám vào thành ruột được nên dễ bị đẩy ra ngoài Dùng hạt cau với liều lượng 4g hạt cau/1kg cá/1 ngày, cho ăn trong 3 ngày để trị giun tròn kí sinh trong ruột cá trê (Spinitectus clariasi). [2] ,[3], [6] PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: 1/2008 – 5/2009 - Địa điểm: Phòng thí nghiệm khoa Thủy sản – Trường Đại học Nông Lâm Huế. - Địa điểm thu mẫu: Xã Quảng An, huyện Quảng Điền, tỉnh Thừa Thiên Huế. 3.2. Đối tượng nghiên cứu 3.2.1. Tôm Thẻ Chân Trắng Penaeus Vannamei Phân loại: Ngành: Arthropoda Lớp: Crustacea Bộ: Decapoda Họ chung: Penaeidea Họ: Penaeus Fabricius   Giống: Penaeus Hình 3.1. Tôm thẻ chân trắng Loài: Penaeus vannamei 3.2.2. Các loại thảo dược - Tỏi (Allium sativum L.). Hình 3.2. Tỏi Thành phần kháng thuốc chủ yếu là chất alicin (C6H10OS2) có khả năng diệt khuẩn mạnh, ở động vật thủy sản nó có tác dụng rất tốt với các vi khuẩn gam (-). Trong tỏi tươi không có chất alicin, nó chỉ được hình thành khi tỏi đã được phơi khô. Trong tỏi tươi có chứa aliin dưới tác dụng alinase có trong tỏi để tạo thành alicin.[6] Lá húng (Ocimum basilicum L). Rau húng là cây thân thảo, thân nhẵn hoặc có lông, thường phân cành ngay từ dưới gốc. Cây cao 50-60 cm. Lá mọc đối, có cuống, phiến lá hình thuôn dài. Có loại màu xám lục, có loại màu tím đen nhạt. Hình 3.3. Lá húng Hoa nhỏ màu trắng hay hơi tía, mọc thành chùm đơn hay phân nhánh, với những hoa mọc thành vòng, 5-6 hoa một vòng. Thành phần hoá học: Lá chứa nhiều hợp chất flavonoid (heterosid của flavon), triterpen, carotenoid. Tinh dầu chiếm đến 1-3% trọng lượng khô. Tinh dầu có thành phần chính: Eugenol (70%), methyleugenol (12%), beta-caryophyllen. Các thành phần chính: Menthol (30-50%), menthon (20-35%), acetat menthyl (4-10%). Thành phần tinh dầu thay đổi tuỳ theo nhiều yếu tố: Di truyền, thời vụ trồng, cách trồng, điều kiện khí hậu.[6] - Cây rau má (Centell asiatica). Rau má có tên khoa học là Centella asiatica (L.) thuộc họ hoa tán umbelliferae. Rau má còn có tên là tích tuyết thảo. Loại thực vật nầy mọc lan trên mặt đất có lá trông giống như những đồng tiền tròn được xếp nối tiếp nhau nên còn gọi là liên tiền thảo. Là một thứ rau dại ăn được thường mọc ở những nơi ẩm ướt như thung lủng, bờ mương thuộc những vùng nhiệt đới như Việt nam, Lào, Cambuchia, Indonesia, Malasia, Srilanka, Ấn độ, Pakistan, Madagascar . . . Cây rau má có thân nhẳn , mọc lan trên mặt đất, có rể ở các mấu. Lá có cuống dài mọc ra từ gốc hoặc từ các mấu. Lá hơi tròn, có mép khía tai bèo. Phiến lá có gân dạng lưới Hình 3.4. Cây rau má hình chân vịt. Hoa mọc ở kẻ lá. Cánh hoa màu đỏ hoặc tía. Tuỳ theo khu vực trồng hoặc mùa thu hoạch tỷ lệ các các hoạt chất có thể sai biệt. Thành phần của rau má bao gồm những chất sau: Beta caroten, sterols, saponins, alkaloids, flavonols, saccharids, calcium, iron, magnesium, manganese, phosphorus, potassium, zinc, các loại vitamins B1, B2, B3, C và K.[6] - Cây diếp cá (Houttuynia cordata). Cây diếp cá còn có tên là cây giấp cá, dấp cá. Tên khoa học là Houttuynia cordata. Họ lá giấp Saururaceae. Tên tiếng Anh của nó là heartleaf (lá hình tim) hay lizardtail (đuôi thằn lằn). Hình 3.5. Cây diếp cá Diếp cá có nguồn gốc ở Nhật Bản, miền nam Trung Quốc và Đông Nam Á, là một loại cỏ nhỏ, mọc lâu năm, ưa chỗ ẩm ướt, có thân rễ mọc ngầm dưới đất. Rễ nhỏ mọc ở các đốt, thân mọc đứng cao 40 cm, có lông hoặc ít lông. Lá mọc cách, hình tim, đầu lá hơi nhọn hay nhọn hẳn. Hoa nhỏ, không có bao hoa, mọc thành bông, có 4 lá bắc màu trắng; trông toàn bộ bề ngoài của cụm hoa và lá giống như một cây hoa đơn độc. Toàn cây vò có mùi tanh như mùi cá.[6] Theo Đỗ Tất Lợi, trong cây có chừng 0,0049% tinh dầu và một ít chất ancaloit gọi là cocdalin. Thành phần chủ yếu của tinh dầu là metylnonylxeton, chất myrcen, axit caprinic và laurinaldehyt. Hoa và quả chứa chất isoquexitrin và không chứa quexitrin. Độ tro trung bình là 11,4%, tro không tan trong HCl là 2,7%. 3.3. Nội dung nghiên cứu Phân lập, định danh vi khuẩn gây bệnh ở tôm thẻ chân trắng. Thử nghiệm tác dụng của các thảo dược lên chủng vi khuẩn phân lập được. So sánh khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược. 3.4. Dụng cụ - Hoá chất - Môi trường 3.4.1. Dụng cụ thí nghiệm Tủ ấm để nuôi cấy vi khuẩn. Kính hiển vi có vật kính: 10x, 20x, 40x, 100x. Que cấy, bộ giải phẫu: Kéo, dao, panh, kim tiêm. Hộp lồng, ống nghiệm, pipets, lam, lamen, đèn cồn. Bông lau, băng dính, bông không thấm nước. Dầu soi kính, nước muối sinh lí 0,9%, nước cất vô trùng. 3.4.2. Môi trường , hoá chất Môi trường phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm: môi trường chọn lọc TCBS (Thiosulphate Citrate Bilesalt sucrose). Môi trường nuôi cấy tăng sinh: Pepton Môi trường nuôi cấy chuyên biệt: TCBS Các môi trường dùng cho phản ứng sinh hoá: + Môi trường cơ bản O/F. + Môi trường KIA (Kligler Iron Agar) + Môi trường đường các loại (Glucose, sucrose, mantose, manitol) + Môi trường Simon Citrate Agar. + Môi trường khử Nitrate. + Môi trường MR-PV Broth. + Môi trường Tryptophan Broth Agar. + Môi trường Tryptone. Một số thuốc thử và thuốc nhuộm cần thiết: + Dung dịch Kovac’S dùng cho phản ứng Indol. + Thuốc thử Methyl Red, dùng cho phản ứng Methyl Red. + Thuốc thử dùng cho phản ứng V-P: Dung dịch KOH 20%. Dung dịch Alphanapthol 10%. + Thuốc thử cho dung dịch Nitrate: Dung dịch Naphthylamine. Dung dịch Acid Sunlfamilic. + Thuốc dùng cho nhuộm Gram: Dung dịch tím Gentian hay tím Crystal. Dung dịch Lugol. Dung dịch Cồn-Aceton hay cồn-Acid. Dung dịch Fuchsin hoặc Safranin. + Dung dịch rửa dụng cụ thủy tinh. Dung dịch Sulfua Cromic. Dung dịch KOH trong cồn. 3.5. Phương pháp nghiên cứu 3.5.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Mẫu bệnh phẩm Quan sát dấu hiệu bệnh lý Đo chiều dài, trọng lượng Cơ quan có dấu hiệu bệnh lý Nuôi cấy trong môi trường TCBS Chọn khuẩn lạc ưu thế Nuôi cấy thuần trên môi trường TCBS Nhuộm Gram Thử test sinh hóa Định danh vi khuẩn Nuôi cấy tăng sinh trong môi trường pepton lỏng Xác đinh nồng độ (106) Thử nghiệm dịch chiết các loại thảo dược ở nồng độ khác nhau Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 3.5.2. Phương pháp thu mẫu Tôm có biểu hiện bất thường, được thu nguyên con, còn sống hoặc mới chết. Tôm được đo chiều dài, cân trọng lượng khi lấy mẫu phân lập. Mẫu bệnh phẩm đem nuôi cấy lấy từ các cơ quan có dấu hiệu bị bệnh. Hình 3.6. Cân trọng lượng, đo chiều dài tôm bị bệnh 3.5.3. Phương pháp nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn Phương pháp phân lập xác định vi khuẩn gây bệnh dựa trên phương pháp nghiên cứu của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006). 3.5.3.1. Nuôi cấy phân lập Lấy mẫu bệnh phẩm: Cơ, mang, chân bơi, gan tụy của mẫu tôm được phân nhỏ, nghiền trong ống nghiệm chứa 2ml dung dịch nước muối sinh lý. Dùng que cấy vô trùng, lấy bệnh phẩm vạch trên đĩa thạch TCBS một số đường để được vùng 1. Hơ nóng đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội bằng cách ấn dần que cấy vào mép đĩa thạch. Đặt que cấy lên đĩa thạch tại vùng 1, vạch một số đường liên tiếp để được vùng 2. Tiếp tục như vậy ta được vùng 3. Lật ngược đĩa lồng, nuôi cấy ở nhiệt độ 30-370C, trong 24 giờ. Sau 24 giờ, kiểm tra sự phát triển của các khuẩn lạc. Dựa vào màu sắc, hình dạng, kích thướt khuẩn lạc để phân biệt các loại khuẩn lạc có trên đĩa lồng, từ đó chọn ra khuẩn lạc nghi ngờ. Khuẩn lạc nghi ngờ là khuẩn lạc chiếm ưu thế trên đĩa phân lập. 3.5.3.2. Nuôi cấy thuần chủng Mở đĩa các khuẩn lạc nghi ngờ (dưới ngọn đèn cồn). Dùng que cấy vô trùng, lấy bệnh phẩm từ một khuẩn lạc nghi ngờ riêng rẽ. Cấy lên đĩa thạch mới, để ở nhiệt độ 30-370C, trong 24h sẽ có một đĩa lồng chứa vi khuẩn thuần chủng. 3.5.3.3. Phương pháp nhuộm vi khuẩn Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc. Dùng que cấy phết, dàn một lớp mỏng trên tấm lam sạch. Để mẫu tự khô ở nhiệt độ phòng, sau đó hơ cao tấm lam trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm Gram theo các bước sau: + Nhỏ dung dịch tím Crystal lên mẫu để 30 - 60 giây. + Rửa nhanh bằng nước, rảy khô nước. + Nhỏ dung dịch Lugol lên mẫu để 1 phút. + Rửa nhanh rảy khô nước. + Nghiêng lam kính, nhỏ cồn 96% lên tẩy màu. + Rửa nhanh bằng nước, rảy khô nước. + Nhỏ dung dịch Fuchsin lên mẫu, để 1 - 2 phút. Rửa nước, rảy khô nước, có thể dùng khăn giấy thấm làm khô tiêu bản nhưng không để xước mẫu. Nhỏ dầu lên tiêu bản, đem soi dưới kính hiển vi (vật kính dầu). Nếu mẫu giữ nguyên màu xanh tím là vi khuẩn Gram dương, nếu mẫu chuyển màu hồng là vi khuẩn Gram. 3.5.3.4. Phương pháp thử các phản ứng sinh hóa - Thử phản ứng trên môi trường KIA. Dùng que cấy thẳng vô trùng lấy vi khuẩn nghiên cứu ria một đường thẳng ở phần thạch nghiêng. Sau đó cắm thẳng que cấy xuống phần thạch đứng (không chạm đáy). Nuôi cấy ở nhiệt độ 30 - 370C, trong 24 giờ rồi đọc kết quả. Đọc khả năng lên đường glucose: Nếu (+), phần thạch đứng chuyển sang màu vàng. Nếu âm tính (-), phần thạch đứng vẫn giữ màu vàng môi trường. Đọc khả năng lên men đường lactose: Nếu dương tính (+), phần thạch nghiêng chuyển màu vàng. Nếu âm tính (-), phần thạch nghiêng không chuyển màu. Nếu có khả năng lên men cả hai loại đường: Toàn bộ ống nghiệm chuyển sang màu vàng. Nếu không có khả năng len men cả 2 loại đường thì toàn bộ ống nghiệm vẫn giữ nguyên màu của môi trường ban đầu Đọc khả năng sinh hơi: (+) khi thạch bị nứt hay bị đẩy lên trên. Âm tính (-) khi không có hiện tượng nứt thạch. Đọc khả năng sinh H2S: (+) khi môi trường có màu đen. (-) khi môi trường không có màu đen. - Thử khả năng sinh Indol. Dùng môi trường Trypton lỏng cho phản ứng này. Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần nghiên cứu, cấy vào môi trường chứa Tryptone lỏng. Nuôi ở nhiệt độ 30-370C, trong 24 giờ. Dùng thuốc thử Kovac nhỏ 0,2-0,3 ml vào ống nghiệm đã nuôi cấy vi khuẩn, lắc đều, sau đó đọc kết quả: Dương tích (+): Có một vòng đỏ sẫm nổi lên trên bờ mặt môi trường. Âm tính (-): Có một vòng màu vàng sẫm nổi lên trên môi trường. Đó là màu của thuốc thử Kovac. - Thử khả năng di động. Dùng môi trường Manitol di động. Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần nghiên cứu, cấy một đường thẳng đứng chính giữ ống nghiệm. Nuôi ở nhiệt độ 30-370C, trong 24h, đọc kết quả: Khả năng lên men đường Manitol: (+) môi trường có màu vàng, (-) môi trường giữ nguyên màu ban đầu. Khả năng di động: (+) vi khuẩn mọc thành một đường thẳng, (-) vi khuẩn mọc lan ra ngoài đường cấy. - Thử phản ứng Nitrate. Cấy vi khuẩn cần nghiên cứu vào ống nghiệm chứa môi trường Nitrate. Nuôi ở nhiệt độ 30-370C trong 24h. Nhỏ thuốc thử: 1ml Acid Sulfalinic và 1ml Naphthyllamiue. Đọc kết quả: (+) xuất hiện màu đỏ 1-2 phút. (-) không xuất hiện màu đỏ. - Thử phản ứng Citrate. Dùng môi trường Simoms Citrate Agar đựng trong các ống nghiệm. Cấy vi khuẩn nghiên cứu vào ống nghiệm chứa môi trường Simoms Citrate Agar. Nuôi ở nhiệt độ 30 - 370C trong 24 – 48 giờ. Đọc kết quả: (+) Sẽ xuất hiện màu xanh blue. (-) Vẫn giữ nguyên màu xanh lá cây của môi trường. - Thử phản ứng Methyl Red. Dùng ống nghiệm chứa môi trường lỏng MR-VP để thử phản ứng này. Dùng que cấy vô trùng, lấy vi khuẩn cần nghiên cứu, cấy vào môi trường trên. Để ở nhiệt độ 30-370C trong 24 - 48 giờ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Methyl Red, lắc đều và đọc kết quả: (+) Xuất hiện màu đỏ, (-) Xuất hiện màu vàng, vừa âm vừa dương tính – xuất hiện màu vàng cam. - Thử phản ứng V-P (Voges – Proskaner test). Dùng một ống nghiệm chứa môi trường MR-VP lỏng. Cấy vi khuẩn lên môi trường cần nói trên. Nuôi ở nhiệt độ 30-370C trong 24 – 48 giờ. Nhỏ vào ống môi trường đã cấy vi khuẩn: 1ml Alpha – Naphthol 10% và 1ml KOH 20%. Lắc nhẹ sau ít phút rồi đọc kết quả. (+): Xuất hiện màu đỏ da cam ở bờ mặt môi trường trong ống nghiệm (-): Xuất hiện màu xanh đồng. - Kiểm tra khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn. Dùng các ống nghiệm có chứa môi trường đường khác nhau: Mantose, sucrose, glucose,... Cấy vi khuẩn cần nghiên cứu vào các môi trường đường nói trên. Nuôi ở nhiệt độ 30-370C trong 24h. Đọc kết quả: (+) Môi trường chuyển từ màu hồng sang màu vàng, (-) Môi trường không thay đổi màu sắc. 3.5.3.5. Phương pháp định danh vi khuẩn Dựa vào kết quả nuôi cấy phân lập, nhuộm vi khuẩn kết hợp với kết quả thực hiện các phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn theo khoá phân lập của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006) 3.5.4. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Chuẩn bị một số ống nghiệm vô trùng, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lý. Lấy 1ml mẫu nước cần nghiên cứu, đưa sang ống nghiêm thứ nhất làm đồng đều ta được độ pha loãng 10 lần (10-1). Lấy 1ml nước ở ống nghiệm 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 2, ta được độ pha loãng 100 lần (10-2). Cứ làm như vậy ta được độ pha loãng tiếp theo: 10-3, 10-4, …,10-n. Lấy 0,1ml nước nghiên cứu ở 2 – 3 độ pha loãng khác nhau, nuôi cấy trên đĩa thạch chứa môi trường cần thiết bằng que gạt. Mỗi độ pha loãng nuôi cấy từ 2 – 3 đĩa lồng. Nuôi cấy ở nhiệt độ 300C, sau 24 giờ, đem ra đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của các đĩa lồng có cùng nồng độ pha loãng. Mật độ vi khuẩn tính theo công thức: X = Trong đó: X: mật độ vi khuẩn A: Số lượng khuẩn lạc trung bình trong 1 độ pha loãng V: Thể nước đưa vào nuôi cấy K: Hệ số pha loãng Phương pháp so màu: Dùng dung dịch Macphalan để so màu xác định nồng độ vi khuẩn. 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Dd gốc 10-1 10-2 ... . 10-(n-1) 10-n Sơ đồ 3.2. Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn 3.5.5. Phương pháp chiết xuất thảo dược Thảo dược thí nghiệm được rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phòng, rồi cho vào máy xay thật nhuyễn, có thể thêm một ít nước cất làm dung môi nhằm thuận tiện cho việc vắt lấy dịch chiết qua lưới lọc. Các loại thảo dược thử nghiệm được chiết xuất với dung môi nước cất vô trùng. Dịch chiết được bảo quản ở nơi khô thoáng với nhiệt độ luôn bảo đảm dưới 500C tránh hiện tượng tác dụng dược lý của thảo dược bị mất đi bởi nhiệt độ. 3.5.6. Phương pháp thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của thảo dược Tiến hành thử nghiệm dịch chiết thảo dược trên vi khuẩn phân lập được theo phương pháp thạch lỗ của Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội, 1998. Các thao tác trong điều kiện vô trùng bằng đèn cồn. Hình 3.7. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược Phương pháp tiến hành: Lấy 0,1ml dung dịch ở ống nghiệm chứa vi khuẩn có mật độ 106CFU/ml dàn đều trên mặt thạch bằng que gạt, để khô tự nhiên. Sau 1 phút, mỗi đĩa thạch đục 5 lỗ trên mặt thạch với đường kính 3mm/lỗ (mỗi nồng độ thảo dược thử nghiệm được lặp lại 5 lần). Nhỏ vào mỗi lỗ 0.1ml dịch chiết dược liệu rồi giữ ở nhiệt độ 300C – 370C. Sau 24 giờ lấy ra xác định độ dài đường kính vòng tròn kháng khuẩn. Mỗi loại thảo dược được thử nghiệm với nồng độ gốc (100%) và các nồng độ pha loãng (75%, 50%, 25%). 3.6. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excell PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Trọng lượng, chiều dài tôm thẻ chân trắng bị bệnh Kiểm tra trọng lượng, chiều dài mẫu bệnh phẩm đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản do mỗi loại tác nhân thường cảm nhiễm ở một giai đoạn nhất định của đối tượng nuôi. Tôm thẻ chân trắng dễ mẫn cảm với nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau nên việc xác định giai đoạn phát triển của tôm sẽ giúp khoanh vùng được tác nhân gây bệnh để đưa ra kết quả chính xác hơn trong quá trình phân lập. Kết quả kiểm tra trọng lượng, chiều dài được thể hiện qua bảng 4.1. Bảng 4.1: Trọng lượng, chiều dài mẫu tôm bị bệnh Trọng lượng (g/con) MD ± SD Chiều dài (cm/con) MD ± SD 8,18 ± 1,81 11,04 ± 0,59 Kết quả bảng 4.1 cho thấy tôm có Ptb 8,18 g/con, Ltb 11,04 cm/con . Trong giai đoạn này tôm gần thu hoạch nếu bị các tác nhân gây bệnh xâm nhập sẽ gây thiệt hại nặng nề. Theo Đỗ Thị Hòa, 2004 giai đoạn này tôm rất dễ bị cảm nhiều bởi nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau do lượng thức ăn dư thừa trong ao nuôi tạo điều kiện cho các vi sinh vật gây bệnh phát triển đặc biệt đối với vi khuẩn gây bệnh. 4.2. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn gây bệnh. 4.2.1 Kết quả quan sát dấu hiệu bệnh lý Hình 4.1. Dấu hiệu bên ngoài của tôm bị bệnh Mẫu bệnh phẩm có hiện tượng bẩn mình, bẩn mang, xuất hiện màu hồng đỏ trên cơ thể. Một số khác xuất hiện các vùng mềm trên vỏ kitin, tạo nên các điểm nâu, đen hay trắng hoặc vỏ kitin bị ăn mòn, các phần phụ như chân bò, chân bơi, râu, đuôi tôm phòng lên, mòn cụt, gan tụy hoại tử từng phần. 4.2.2. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn Bảng 4.2. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng Đặc điểm sinh hoá Kết quả Chủng 1 Chủng 2 Màu sắc khuẩn lạc Vàng Xanh Hình dạng khuẩn lạc Tròn, bóng Tròn, bóng Nhiệt độ phát triển 370C 370C Nhuộm Gram - - Hình dạng vi khuẩn Que, ngắn Que, ngắn Đặc điểm khuyếch tán Làm biến đổi màu của môi trường nuôi cấy Không làm biến đổimôi trường nuôi cấy Lên men: Glucose Lactose Maltose Saccharose Manitol + - + + + + + + - + Khả năng di động + + Khả năng sinh hơi + - Khả năng sinh Indol + + Phản ứng trên môi trường KIA -/+ -/+ Phản ứng Methyl red - + Phản ứng Citrate ... - α – Naptol - - Phản ứng V-P + - Khả năng phát sáng - + Khả năng sinh H2S - - Tên vi khuẩn Vibrio alginolyticus Vibrio harvey Qua các đợt thu mẫu tôm thẻ chân trắng bị bệnh, đã tiến hành phân lập, thử phản ứng sinh hoá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.2. Dựa vào kết quả thu được trong quá trình nuôi cấy phân lập kết hợp khóa phân lập của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006) đã xác định được 2 chủng vi khuẩn Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus từ các mẫu tôm thẻ có dấu hiệu bệnh lý. Hai chủng vi khuẩn này thuộc vi khuẩn Gram (-) (hình 4.2 và 4.3), tế bào có dạng hình que ngắn, có khả năng di động, phát triển trên môi rường thạch chọn lọc TCBS, cho khuẩn lạc có màu đặc trưng rõ rệt: Màu vàng của V.alginolyticus (Hình 4.4), màu xanh của V.harveyi (Hình 4.5). Hình 4.2. Vibrio alginolyticus Hình 4.3. Vibrio harveyi Theo Bùi Quang Tề (năm 2002), các loài vi khuẩn Vibrio xuất hiện ở nhiều thủy vực mặn lợ đặc biệt trong các vùng nuôi tôm thâm canh, gây ra các bệnh chủ yếu trên tôm như: Bệnh đỏ dọc thân, bệnh ăn mòn vỏ giáp xác, bệnh mềm vỏ... Những vi khuẩn này thường đóng vai trò tác nhân cơ hội, khi tôm sốc do môi trường biến đổi, hoặc bị nhiễm các bệnh khác như virus, nấm, kí sinh trùng. Khi sức đề kháng của động vật thuỷ sản giảm, các loài vi khuẩn vibrio này có khả năng gây bệnh nặng, gây chết hàng loạt. Vi khuẩn Vibrio harveyi thường phân bố trong nước biển, ven bờ...gây bệnh cho giáp xác, đặc biệt ở tôm nước mặn, lợ. Theo Đỗ Thị Hòa (2004), sự khác nhau về sự khuếch tán màu sắc trên môi trường TCBS của hai chủng vi khuẩn này do khác nhau về khả năng lên men loại đường Saccarose. Vi khuẩn V.alginolyticus có khả năng lên men đường Saccarose làm thay đổi màu sắc của môi trường từ màu xanh sang màu vàng (Hình 4.4). Trong khi đó, vi khuẩn V.harveyi không có khả năng lên men loại đường này nên không làm thay đổi màu sắc của môi trường (Hình 4.5). Kết quả phân lập không thấy sự có mặt của các loài vi khuẩn khác, điều này cho thấy hai chủng vi khuẩn phân lập được là tác nhân chính gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của D. Lightner (1996) khi phân lập các tác nhân gây bệnh viêm ruột trên tôm sú nuôi ở Philippin, ông cũng bắt gặp các loài V.harveyi, V.alginolyticus, V. parahaemolyticus trên các mẫu bệnh phẩm. Hình 4.5. Khuẩn lạc của vi khuẩn V.harveyi trên môi trường TCBS Hình 4.4. Khuẩn lạc của vi khuẩn V.alginolyticus trên môi trường TCBS 4.3. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược Các thí nghiệm được tiến hành đối với vi khuẩn nuôi cấy ở mật độ 106 CFU/ml. Thảo dược thử nghiệm ở 4 nồng độ: 100%, 75%, 50%, 25%. Qua kết quả thử nghiệm thảo dược ở nồng độ 25%, tất cả thảo dược đều không có tác dụng kháng khuẩn (vi khuẩn mọc tràng đĩa). Đặc biệt đối với hai loại thảo dược diếp cá, rau má ở nồng độ 50% cũng không có tác dụng kháng khuẩn. 4.3.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Kết quả thử nghiệm tác dụng tỏi lên sự phát triển V.alginolyticus, V.harveyi được thể hiện ở đồ thị 4.1 và đồ thị 4.2. Đồ thị 4.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với V.alginolyticus (a, b, c: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Đồ thị 4.2. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với V.harvey (a, b, c, : Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Hình 4.6. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trên V.alginolyticus Đối với vi khuẩn V.alginolyticus, kết quả từ đồ thị 4.1 cho thấy tỏi ở 3 nồng độ: 100%, 75%, 50% đều có khả năng kháng khuẩn. Tỏi ở nồng độ 100% khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 20,4 ± 0.82 mm, tỏi ở nồng độ 50% kháng khuẩn kém nhất với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 12,8 ± 2,41 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p = 0,0060; 0,0006; 0,0031<0.05). Hình 4.7. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trên V.harveyi Đối với vi khuẩn Vibrio harvey, qua đồ thị 4.2 chỉ rõ, tỏi nguyên chất và tỏi pha loãng 75%, 50% đều có khả năng kháng khuẩn. Tỏi ở các nồng độ khác nhau cho khả năng kháng khuẩn khác nhau. Tỏi nguyên chất có khả năng kháng khuẩn tốt nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 22,1 ± 3,11mm, tỏi 75% kháng khuẩn kém hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 18,6 ± 1,95mm, thấp nhất ở tỏi nồng độ 50% với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 12,9 ± 1,52 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Mức độ kháng khuẩn của thảo dược được quyết định bởi thành phần, tính chất của các hợp chất được chiết xuất. Theo Đỗ Tất Lợi, 2004, trong tỏi có một ít iốt và tinh dầu. Thành phần chính của tỏi có chứa một hợp chất kháng sinh có tên alixin C6H10OS2, một hợp chất sunfua có tác dụng diệt vi khuẩn rất mạnh. Trong tỏi không có chất alixin ngay mà có chất aliin, một loại axit amin, chất aliin chịu tác dụng của men alinaza cũng có trong tỏi mới tạo thành alixin. Chất alixin tinh khiết không màu, hòa tan trong cồn, benzen, ete, không ổn định trong nước, dễ thủy phân. Độ thủy phân chừng 2,5%. Điều này giải thích vì sao tỏi nồng độ 75%, 50% có tác dụng kháng khuẩn kém hơn tỏi nguyên chất. Chất alixin bị nhiệt sẽ chóng mất tác dụng, gặp kiềm cũng bị mất tác dụng. Chất alixin rất dễ mất oxy do đó mất tác dụng kháng sinh, vì vậy nhiều tác giả đã cho rằng tác dụng kháng sinh của alixin chủ yếu do oxy trong phân tử. Chất alixin rất dễ kết hợp với một axit amin cystein có gốc SH để tạo thành một hợp chất khác. Gốc SH có tính chất kích thích sự sinh sản của vi sinh vật hay tế bào. Do đó tỏi có ức chế sự sinh sản của vi khuẩn bằng cách phá hoại khâu SH của chất cystein. 4.3.2. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Kết quả thử nghiệm tác dụng hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) lên sự phát triển của các chủng vi khuẩn phân lập được thể hiện qua đồ thị 4.3 và đồ thị 4.4. Đồ thị 4.3. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) đối với V.alginolyticus (a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Đồ thị 4.4. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) đối với V.harvey (a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Hình 4.8. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng khi thử nghiệm trên V.alginolyticus Kết quả từ đồ thị 4.3 chỉ rõ đối với vi khuẩn V.alginolyticus, hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) ở 3 nồng độ đều có khả năng kháng khuẩn. Hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 100% khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 16,3 ± 1,30 mm, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p 0,05). Hay nói cách khác khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 75% tương đương hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 50%. Đối với vi khuẩn V.harveyi, qua đồ thị 4.4 cho thấy hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) ở 3 nồng độ đều có khả năng kháng khuẩn. Hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 100% có khả năng kháng khuẩn cao nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 13,7 ± 1,09 mm, kém nhất hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 50% với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 11,7 ± 1,79 mm. Sự khác biệt giữa hai nồng độ này có ý nghĩa thống kê (p = 0,035 0,05). Thành phần hóa học của lá húng chứa ít tinh dầu (0,05 - 0,12%), trong tinh dầu có đến 65,2% các hợp chất phenolic trong đó có salicylat, thymol, carvacrol, eugenol và chavicol. Các thành phần này có tác dụng diệt khuẩn. Trong lá húng còn có một chất màu đỏ có tên colein. Colein trong lá có tác dụng kháng sinh mạnh đối với một số vi khuẩn. Theo Nguyễn Anh Tuấn, 2008 hợp chất tỏi, lá húng có tác dụng kháng khuẩn Aeromonas sp phân lập được từ mẫu cá trắm cỏ bị bệnh nhiễm khuẩn. Như vậy, tỏi và lá húng có tác dụng diệt khuẩn đối với cả vi khuẩn nước ngọt và nước lợ, mặn. 4.3.3. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được thể hiện qua bảng 4.3 và 4.4. Bảng 4.3. Khả năng kháng khuẩn của diếp đối với V.alginolyticus Nồng độ thảo dược Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS±SD 100% 7,2±0,57a 75% 5,1±1,02b (a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p<0,05) Bảng 4.4. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với Vibrio harvey Nồng độ thảo dược Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS ± SD 100% 7,4 ± 0.82a 75% 5,1 ± 0,74b (a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p<0,05) Đối với V.alginolyticus, kết quả bảng 4.3 thể hiện rõ diếp cá ở nồng độ 100% , 75% đều có khả năng kháng khuẩn. Ở nồng độ 100% hiệu quả kháng khuẩn của diếp cá cao hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 7,2±0,57 mm, ở nồng độ 75% khả năng kháng khuẩn của diếp cá thấp hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 5,1 ± 1,02 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê(p = 0,004 < 0,05). Đối với V.harveyi, qua bảng 4.4 thấy rõ diếp cá nồng độ 100% và 75% có khả năng kháng khuẩn. Diếp cá nồng độ 100% kháng khuẩn mạnh hơn diếp cá nồng độ 75%. Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình lần lượt ở hai nồng độ 7,4 ± 0.82; 5,1 ± 0,74. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0,001< 0,05. Theo Đỗ Tất Lợi, 2004, trong cây diếp cá có chừng 0,0049 % tinh dầu, một ít chất ancaloit có tên cocdalin. Thành phần chủ yếu của tinh dầu có chứa mertylnonylxeton CH3CO(CH2)8CH3 (có mùi rất khó chịu), chất miêcxen C10H46, axit caprinic C9H19COOH và laurinaldehyt. Hoa quả chứa chất isoquexitrin và không chứa quexitrin. Những hợp chất này có tính kháng khuẩn mạnh, đặc biệt đối với nhũng vi khuẩn gây bệnh trên người. 4.3.4. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Kết quả thử nghiệm tác dụng rau má lên sự phát triển V.alginolyticus, V.harveyi được thể hiện bảng 4.5 và 4.6. Bảng 4.5. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với Vibrio alginolyticus Nồng độ thảo dược Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS ± SD 100% 6,6 ± 0,96a 75% 4,9 ± 0,89b (a,b: Thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê với p < 0,05) Bảng 4.6. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với Vibrio harvey Nồng độ thảo dược Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS±SD 100% 6,9 ± 1,14a 75% 5,4 ± 0,96b (a,b: Thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê với p < 0,05) Đối với vi khuẩn V.alginolyticus, kết quả từ bảng 4.5 thể hiện rõ khả năng kháng khuẩn của rau má ở nồng độ 100% và nồng độ 75%. Rau má nồng độ 100% tiêu diệt vi khuẩn mạnh hơn rau má nồng độ 75%. Với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình lần lượt 6,6 ± 0,96 mm, 4,9 ± 0,89 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê với p = 0,01< 0,05. Đối với vi khuẩn V.harveyi, qua bảng 4.6 thấy rõ, rau má nồng độ 100% và 75% đều có khả năng kháng khuẩn. Hiệu quả kháng khuẩn khi thử nghiệm nồng độ 100% tốt hơn 75%. Với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình lần lượt 6,9 ± 1,14 mm, 5,4 ± 0,96 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê với p = 0,027 < 0,05. Rau má được nhiều người nghiên cứu nhưng kết quả chưa thống nhất. Theo Basu và Lamsal (1947), trong rau má có một ancaloit hydrocotylin C22H33O8N, có độ nhạy 210 - 2120C. Ancaloit này cho các muối oxalat với độ chảy 2950C, muối picrat với độ chảy 110 - 1120C, muối cloroplatinat với độ chảy 134 - 1360C. Theo Bửu Hội, Rakoto Ratsimamaga và Boiteau, trong cây rau má có chứa một glucozit có tên asiaticozit sẽ cho axit aisiatic và glucoza. Chất glucozit này có tinh thể, tan trong rượu, độ chảy 230-2330C, có thể cho một dẫn xuất tan trong nước gọi là oxyasiaticozit. Chất này có khả năng kháng khuẩn. Một số tác giả khác (Lythoe và Trippet) nghiên cứu rau má đã chiết xuất được một glucozit khác đặt tên là xentelozit có tính chất gần giống như aisiaticozit. Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình. Có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát trùng. Từ những năm 1940, y học hiện đại bắt đầu nghiên cứu những tác dụng của rau má. Rau má có những hoạt chất thuộc nhóm saponins (còn được gọi là tripernoids) bao gồm asiaticoside, madecassoside, madecassic acid và asiatic acid. Hoạt chất asiaticoside đã được ứng dụng trong điều trị bệnh phong, bệnh lao ở trên người. Đối với những bệnh này, vi khuẩn dược bao phủ bởi một màng ngoài giống như sáp khiến cho hệ kháng nhiểm của cơ thể không thể tiếp cận. Chất asiaticoside trong dịch chiết rau má có thể làm tan lớp màng bao này để hệ thống miễn dịch của cơ thể tiêu diệt chúng. 4.4. Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn của mỗi loại thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất của mỗi loại thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được sử dụng để so sánh hiệu quả giữa chúng. Kết quả được thể hiện qua bảng 4.7 Bảng 4.7. So sánh khả năng kháng khuẩn của thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được. Chủng vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MD ± SD Tỏi Tỏi + húng Diếp cá Rau má V.alginolyticus 20,4 ±0,82a 16,3 ± 1,30a 7,2 ± 0,57a 6,6 ± 0,96a V.harveyi 21,1±3,11a 13,7 ± 1,09b 7,4 ± 0.82a 6,9 ± 1,14a (a,b trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0,05) Kết quả từ bảng 4.7 cho thấy, tất cả thảo dược khi thử nghiệm trên V.alginolyticus và V.harveyi đều có sự chênh lệch đường kính vòng kháng khuẩn. Tỏi, diếp cá, rau má khi thử nghiệm trên vi khuẩn V.harvey cho hiệu quả kháng khuẩn cao hơn so với thử nghiệm trên vi khuẩn V.alginolyticus. Tuy nhiên, không có sự khác biệt thống kê khi so sánh khả năng kháng khuẩn của tỏi, diếp cá, rau má khi thử nghiệm trên vi khuẩn V.alginolyticus và V.harveyi (p > 0,05). Ngược lại, đối với hợp chất tỏi, húng (tỷ lệ 1:1), khi thử nghiệm trên vi khuẩn V.alginolyticus cho hiệu quả kháng khuẩn cao hơn khi thử nghiệm trên V.harveyi với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt 16,3 ± 1,30 mm, 13,7 ± 1,09 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0,005 < 0,05. Trong cùng một loài vi khuẩn khả năng kháng khuẩn của thảo dược không giống nhau đối với các chủng vi khuẩn khác nhau. Thảo dược có tác dụng tiêu diệt chủng vi khuẩn này, nhưng lại không có khả năng tiêu diệt chủng vi khuẩn khác. Điều này có thể giải thích do cấu tạo tế bào của các chủng vi khuẩn có sự sai khác dẫn đến tác dụng của các hợp chất trong thảo dược lên màng tế bào vi khuẩn không có sự đồng nhất giữa các chủng vi khuẩn. Vì vậy, khả năng tiêu diệt vi khuẩn của thảo dược cũng khác nhau ở mỗi chủng vi khuẩn trong cùng một loài 4.5. Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn giữ các loại thảo dược khác nhau đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất của mỗi loại thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được sử dụng để so sánh hiệu quả giữa chúng. Kết quả được thể hiện ở đồ thị 4.5 và 4.6. Đồ thị 4.5. Khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược khác nhau đối với Vibrio alginolyticus (a, b, c: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Đồ thị 4.6. Khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược đối với Vibrio harvey (a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Kết quả từ đồ thị 4.5 cho thấy, đối với vi khuẩn V.alginolyticus, trong 4 loại thảo dược được thử nghiệm, tỏi có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 20,4 ± 0,82 mm. Hợp chất tỏi, lá húng (tỷ lệ 1:1) nồng độ 75% khả năng kháng khuẩn tương đối mạnh với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 16,3 ± 1,3 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p = 0,05. Đối với vi khuẩn V.harvey, kết quả từ đồ thị 4.6 chỉ rõ trong các loại thảo dược thử nghiệm, tỏi có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 22,1 ± 3,11mm, hợp chất tỏi, lá húng (tỷ lệ 1:1) khả năng kháng khuẩn kém hơn tỏi nhưng hiệu quả hơn diếp cá, rau má với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 13,7 ± 1,10 mm. Sự sai khác này có ý nghĩa thống kê (p 0.05. Hình 4.9. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của các thảo dược Qua kết quả so sánh, có thể thấy tỏi nguyên chất khả năng kháng khuẩn mạnh hơn hợp chất tỏi, lá húng. Kết quả này trái ngược với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Anh Tuấn (2008) khi thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các thảo dược trên vi khuẩn gây bệnh cá trắm cỏ, cho kết quả khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng mạnh hơn tỏi nguyên chất. Như vậy, khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá hung đối với các vi khuẩn gây bệnh trên đối tượng nuôi nước ngọt có thể cao hơn các vi khuẩn gây bệnh trên nước mặn. Thành phần các chất trong thảo dược và thành phần cấu tạo trong vi khuẩn quyết định khả năng kháng khuẩn của thảo dược. Tùy thuộc vào cấu tạo của các loài vi khuẩn mà tác dụng của thảo dược lên nó khác nhau, do đó khả năng kháng khuẩn khác nhau. PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận - Kết quả phân lập cho thấy 2 chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi đã được phát hiện trong mẫu tôm bị bệnh. - Trong 4 loại thảo dược được thử nghiệm cho thấy 4 loại đều có khả năng tiêu diệt chủng vi khuẩn phân lập được. - Trong 4 loại thảo dược có khả năng kháng khuẩn, tỏi có khả năng kháng khuẩn cao nhất với đường kính vòng kháng khuẩn 23,6 ± 0,89 mm, diếp cá và rau má có đường kính vòng kháng khuẩn nhỏ nhất. - Nồng độ thảo dược có tác dụng kháng khuẩn cao nhất là 100%. Các nồng độ tỏi 25%, hợp chất tỏi, lá húng (tỷ lệ 1:1) nồng độ 25%, diếp cá nồng độ 50%, 25%, rau má nồng độ 50%, 25% không có khả năng kháng khuẩn. 5.2. Kiến nghị - Phân tích thành phần hóa học của các loại thảo dược để hiểu rõ hơn về cơ chế kháng khuẩn. - Tiến hành cảm nhiễm ngược trở lại trên tôm, dùng chiết xuất thảo dược để thử nghiệm khả năng trị bệnh. - Nhân rộng kết quả nghiên cứu, áp dụng vào thực tiễn. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Tôn Thất Chất, 2006. Giáo trình Kỹ thuật nuôi giáp xác, trường Đại Học Nông Lâm Huế. [2]. Võ Văn Chi, 2000. Cây thuốc trị bệnh thông dụng, NXB Thanh Hóa. [3]. Võ Văn Chi, 1997. Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội. [4]. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội, 2004. Bệnh học thủy sản, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. [5]. Hà Ký và ctv, 1995. Phòng và trị bệnh cho tôm cá, Báo cáo tổng kết cấp Nhà nước mã số KN - 04 - 12, Hà Nội. [6]. Đỗ Tất Lợi, 1968. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội [7]. Chu Viết Luân, 2003. Thủy sản Việt nam phát triển và hội nhập, NXB Chính trị quốc gia Hà Nội [8]. Nguyễn Ngọc Phước, 2002. Bài giảng bệnh học thủy sản, Trường Đại học Nông Lâm Huế. [9]. Nguyễn Ngọc Phước, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Quang Linh, Ngô Thị Hương Giang, Nguyễn Nam Quang, 2007. Sử dụng thảo dược và chế phẩm từ thảo dược trong điều trị bệnh vi khuẩn cho động vật thủy sản. Kỷ yếu Khoa học Công nghệ, 2007. Liên hiệp khoa học Kỹ thuật Việt Nam. Hà nội. [10]. Mai Văn Tài, 2004. Điều tra đánh giá hiện trạng các loại thuốc và hoá chất dùng trong nuôi trồng thuỷ sản nhằm đề xuất các giải pháp quản lý. [11]. Bùi Quang Tề, 2002. Bệnh của tôm nuôi và biên pháp phòng trị, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. [12]. Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám, 1999. Những bệnh thường gặp của tôm cá và biện pháp phòng trị, NXB Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh. [13]. Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành và cộng tác viên, 2006. Kết quả nghiên cứu chế phẩm ( VTS1-C) ( VTS1 – T) tách chiết từ thảo dược phòng trị bệnh cho tôm sú và cá tra. [14]. Nguyễn Thị Vân Thái, 2004. Xây dựng bài thuốc y học cổ truyền ứng dụng trong phòng và chữa bệnh cho tôm cá. Bệnh viện Y học cổ truyền TW, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc về nghiên cứu và ứng dụng khoa học công nghệ trong NTTS (22 - 23/12/2004 tại Vũng Tàu), NXB Nông Nghiệp. [15]. Nguyễn Thị Vân Thái và cộng tác viên, 2006. Bàn về tiềm năng phòng và chữa bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh thảo mộc trong nuôi trồng thuỷ sản. [16]. Khuê Lập Trung, 1985. Kỹ thuật phòng trị bệnh tôm, cá và nhuyễn thể. NXB Nông Thôn Trung Quốc. [17]. Trần Linh Thước, 2002. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục. [18]. Tổng kêt tình hình nuôi trồng thuỷ sản năm 2002. Báo cáo của Bộ Thuỷ Sản. Các website: [19]. Website chuyên về Nông nghiệp và Thuỷ sản: www.vietlinh.com.vn [20]. Website của Bộ Thuỷ Sản www.fishtenet.gov.vn [21]. Bách khoa toàn thư mở www.en.wikipedia.org [22]. Website của Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I www.ria1.mofi.gov.vn. PHỤ LỤC T 100% T 75% Mean 20,4 17,7 Variance 0,675 2,2 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 6 t Stat 3,560654556 P(T<=t) one-tail 0,005958871 t Critical one-tail 1,943180274 P(T<=t) two-tail 0,011917741 t Critical two-tail 2,446911846 T 100% T 50% Mean 20,4 12,8 Variance 0,675 5,825 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 5 t Stat 6,665640947 P(T<=t) one-tail 0,000573656 t Critical one-tail 2,015048372 P(T<=t) two-tail 0,001147313 t Critical two-tail 2,570581835 T 75% T 50% Mean 17,7 12,8 Variance 2,2 5,825 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 7 t Stat 3,86775149 P(T<=t) one-tail 0,00307477 t Critical one-tail 1,8945786 P(T<=t) two-tail 0,00614953 t Critical two-tail 2,36462425 TH 100% TH 75% Mean 16,3 13,9 Variance 1,7 1,3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 3,098386677 P(T<=t) one-tail 0,007350815 t Critical one-tail 1,859548033 P(T<=t) two-tail 0,014701629 t Critical two-tail 2,306004133 TH 100% TH 50% Mean 16,3 13,1 Variance 1,7 1,05 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 8 t Stat 4,31487912 P(T<=t) one-tail 0,001281859 t Critical one-tail 1,859548033 P(T<=t) two-tail 0,002563719 t Critical two-tail 2,306004133 TH 75% TH 50% Mean 13,9 13,1 Variance 1,3 1,05 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 1,16691993 P(T<=t) one-tail 0,13842313 t Critical one-tail 1,85954803 P(T<=t) two-tail 0,27684626 t Critical two-tail 2,30600413 DC 100% DC 75% Mean 7,2 5,1 Variance 0,325 1,05 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 6 t Stat 4,004542875 P(T<=t) one-tail 0,003541123 t Critical one-tail 1,943180274 P(T<=t) two-tail 0,007082245 t Critical two-tail 2,446911846 RM 100% RM 75% Mean 6,6 4,9 Variance 0,925 0,8 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 2,894272205 P(T<=t) one-tail 0,010033604 t Critical one-tail 1,859548033 P(T<=t) two-tail 0,020067207 t Critical two-tail 2,306004133 T 100% TH 100% Mean 20,4 14,12 Variance 0,675 34,4001 Observations 5 7 Hypothesized Mean Difference 0 Df 6 t Stat 2,794755706 P(T<=t) one-tail 0,015690055 t Critical one-tail 1,943180274 P(T<=t) two-tail 0,03138011 t Critical two-tail 2,446911846 T 100% DC 100% Mean 20,4 7,2 Variance 0,675 0,325 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 7 t Stat 29,5160973 P(T<=t) one-tail 6,59962E-09 t Critical one-tail 1,894578604 P(T<=t) two-tail 1,31992E-08 t Critical two-tail 2,364624251 T 100% RM 100% Mean 20,4 6,6 Variance 0,675 0,925 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 8 t Stat 24,395184 P(T<=t) one-tail 4,2548E-09 t Critical one-tail 1,85954803 P(T<=t) two-tail 8,5095E-09 t Critical two-tail 2,30600413 TH 100% DC 100% Mean 16,3 7,2 Variance 1,7 0,325 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 5 t Stat 14,29927046 P(T<=t) one-tail 1,50734E-05 t Critical one-tail 2,015048372 P(T<=t) two-tail 3,01469E-05 t Critical two-tail 2,570581835 TH 100% RM 100% Mean 16,3 6,6 Variance 1,7 0,925 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 7 t Stat 13,38727185 P(T<=t) one-tail 1,52094E-06 t Critical one-tail 1,894578604 P(T<=t) two-tail 3,04188E-06 t Critical two-tail 2,364624251 DC 100% RM 100% Mean 7,2 6,6 Variance 0,325 0,925 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 7 t Stat 1,2 P(T<=t) one-tail 0,13458597 t Critical one-tail 1,8945786 P(T<=t) two-tail 0,26917194 t Critical two-tail 2,36462425 T 100% T 75% Mean 22,1 18,6 Variance 9,675 3,8 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 7 t Stat 2,132007164 P(T<=t) one-tail 0,035230525 t Critical one-tail 1,894578604 P(T<=t) two-tail 0,070461049 t Critical two-tail 2,364624251 T 100% T 50% Mean 22,1 12,9 Variance 9,675 2,3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 6 t Stat 5,944770162 P(T<=t) one-tail 0,000506217 t Critical one-tail 1,943180274 P(T<=t) two-tail 0,001012435 t Critical two-tail 2,446911846 T 75% T 50% Mean 18,6 12,9 Variance 3,8 2,3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 8 t Stat 5,16053752 P(T<=t) one-tail 0,00043154 t Critical one-tail 1,85954803 P(T<=t) two-tail 0,00086309 t Critical two-tail 2,30600413 TH 100% TH 75% Mean 13,7 12,4 Variance 1,2 3,175 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 7 t Stat 1,389758458 P(T<=t) one-tail 0,103598793 t Critical one-tail 1,894578604 P(T<=t) two-tail 0,207197586 t Critical two-tail 2,364624251 TH 100% TH 50% Mean 13,7 11,7 Variance 1,2 3,2 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 7 t Stat 2,132007164 P(T<=t) one-tail 0,035230525 t Critical one-tail 1,894578604 P(T<=t) two-tail 0,070461049 t Critical two-tail 2,364624251 TH 75% TH 50% Mean 12,4 11,7 Variance 3,175 3,2 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 0,61993042 P(T<=t) one-tail 0,27627379 t Critical one-tail 1,85954803 P(T<=t) two-tail 0,55254757 t Critical two-tail 2,30600413 DC 100% DC 75% Mean 7,4 5,1 Variance 0,675 0,55 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 8 t Stat 4,646701705 P(T<=t) one-tail 0,000825874 t Critical one-tail 1,859548033 P(T<=t) two-tail 0,001651748 t Critical two-tail 2,306004133 RM100% RM 75% Mean 6,9 5,4 Variance 1,3 0,925 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 2,248595067 P(T<=t) one-tail 0,027343534 t Critical one-tail 1,859548033 P(T<=t) two-tail 0,054687067 t Critical two-tail 2,306004133 T 100% TH 100% Mean 22.1 13.7 Variance 9.675 1.2 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 5 t Stat 5.69573343 P(T<=t) one-tail 0.001163646 t Critical one-tail 2.015048372 P(T<=t) two-tail 0.002327293 t Critical two-tail 2.570581835 T 100% DC 100% Mean 22.1 7.4 Variance 9.675 0.675 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 5 t Stat 10.21720629 P(T<=t) one-tail 7.70976E-05 t Critical one-tail 2.015048372 P(T<=t) two-tail 0.000154195 t Critical two-tail 2.570581835 T 100% RM100% Mean 22.1 6.9 Variance 9.675 1.3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 5 t Stat 10.2595031 P(T<=t) one-tail 7.5582E-05 t Critical one-tail 2.01504837 P(T<=t) two-tail 0.00015116 t Critical two-tail 2.57058183 TH 100% DC 100% Mean 13.7 7.4 Variance 1.2 0.675 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 7 t Stat 10.28785692 P(T<=t) one-tail 8.8692E-06 t Critical one-tail 1.894578604 P(T<=t) two-tail 1.77384E-05 t Critical two-tail 2.364624251 TH 100% RM 100% Mean 13.7 6.9 Variance 1.2 1.3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 9.616652224 P(T<=t) one-tail 5.67795E-06 t Critical one-tail 1.859548033 P(T<=t) two-tail 1.13559E-05 t Critical two-tail 2.306004133 DC 100% RM 100% Mean 7.4 6.9 Variance 0.675 1.3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 7 t Stat 0.79555728 P(T<=t) one-tail 0.22620896 t Critical one-tail 1.8945786 P(T<=t) two-tail 0.45241791 t Critical two-tail 2.36462425 T1 100% T2 100% Mean 20.4 22.1 Variance 0.675 9.675 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 5 t Stat -1.18158168 P(T<=t) one-tail 0.145251527 t Critical one-tail 2.015048372 P(T<=t) two-tail 0.290503054 t Critical two-tail 2.570581835 TH1 100% TH2 100% Mean 16.3 13.7 Variance 1.7 1.2 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 3.413967254 P(T<=t) one-tail 0.004584626 t Critical one-tail 1.859548033 P(T<=t) two-tail 0.009169252 t Critical two-tail 2.306004133 DC1 100% DC2 100% Mean 7.2 7.4 Variance 0.325 0.675 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 7 t Stat -0.4472136 P(T<=t) one-tail 0.33411552 t Critical one-tail 1.8945786 P(T<=t) two-tail 0.66823104 t Critical two-tail 2.36462425 RM1 100% RM2 100% Mean 6.6 6.9 Variance 0.925 1.3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat -0.44971901 P(T<=t) one-tail 0.332424134 t Critical one-tail 1.859548033 P(T<=t) two-tail 0.664848268 t Critical two-tail 2.306004133 Ghi chú: T : tỏi TH: hợp chất tỏi, lá húng (tỷ lệ 1:1) RM: rau má DC: diếp cá T1: tỏi thử nghiệm trên vi khuẩn Vibrio alginolyticus T2: tỏi thử nghiệm trên vi khuẩn Vibrio harveyi