Xác định trình tự và phân tích gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm chủng NIBRG - 14 sử dụng trong sản xuất vacine cúm A/H5N1 tại Việt Nam

dịch cúm Châu Á năm 1957 - 1958. - Đại dịch cúm Hồng Kông năm 1968 – 1969 [12]. b. Ở Việt Nam, dịch cúm gia cầm xuất hiện lần đầu tiên vào 12/2003. Chia làm 3 đợt: - Đợt 1: 12/2003 đến 30/03/2004 ở 57 tỉnh. - Đợt 2: Từ tháng 4 đến tháng 11/2004, ở 17 tỉnh. - Đợt 3: 12/2004 đến 24/01/2005, ở 36 tỉnh [6]. 1.1.2. Nguồn lây nhiễm cúm A/H5N1 Bằng chứng sinh học và nguồn gốc phả hệ virus cúm A cho thấy thủy cầm chính là nguồn tàng trữ virus cúm A và từ đó truyền lây sang các vật chủ khác như: ngựa, lợn, gà, người… rồi gây bệnh và gây dịch ở các loài này. Gà bị nhiễm virus cúm thải virus qua đường mỏ hoặc qua phân sau đó người hoặc động vật ăn phải. Đây chính là nguy cơ lớn gây nhiễm nguồn nước và nguồn thức ăn, tạo điều kiện cho sự lây truyền virus trong các quần thể động vật và người [12]. Sự lây nhiễm virus cúm sang người có thể xảy ra theo hình ảnh sau: Hình 1.1: Con đường lây truyền virus cúm sang người [12]. Sự trộn kháng nguyên (Antigen shift) là những biễn đổi lớn, đột ngột và vật liệu di truyền thường là do sự tái tổ hợp di truyền giữa hai chủng virus. Lệch kháng nguyên (Antigen drift) là những biến đổi nhỏ, từ từ, thường do đột biến xảy ra liên tục theo thời gian trong cùng một chủng virus. Cả hai kiểu biến đổi di truyền này đều tạo ra những chủng virus mới mà không được nhận ra bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, kháng thể chống lại những virus cũ không còn nhận ra và đáp ứng miễn dịch được và kết quả là gây ra các trận dịch lớn, nguy hiểm [11]. 1.1.3. Triệu chứng lâm sàng. a. Triệu chứng. - Thời gian ủ bệnh rất ngắn 1 - 3 ngày - Gà nhiễm bệnh có những triệu chứng: + Viêm đường hô hấp cấp: Thở khó, khi thở phải há miệng, ho khẹc, chảy dịch mắt, dịch mũi và rớt dãi liên tục. Nhiệt độ cơ thể tăng đột ngột 40 - 450C. + Viêm đường tiêu hóa cấp: Tiêu chảy rất nặng, phân xám vàng, xám xanh, đôi khi có lẫn máu, mùi phân tanh. + Nhiễm trùng huyết: Mào và tích sưng, tích nước, xuất huyết điểm đỏ từng đám. Kết mạc mắt sưng chũng và xuất huyết, xuất huyết dưới da, đặc biệt xuất huyết ở cả da chân [1,7]. - Triệu chứng bệnh cúm gà ở người: Người nhiễm cúm gà có 3 hội chứng chính: + Hội chứng hô hấp: Hắt hơi, sổ mũi, mắt đỏ, chảy nước mắt, sợ ánh sáng, cảm giác rát họng, khô họng. Khó thở cấp tính, viêm thanh quản, khí quản, ho khan, khàn tiếng. + Hội chứng nhiễm trùng: Sốt cao liên tục, mặt đỏ, viêm kết mạc mắt. Chán ăn, lưỡi trắng. Mệt lả, đuối sức, chảy máu cam, hiếm nhưng quan trọng. + Hội chứng đau: Nhức đầu nhiều vùng trán, đôi khi lan khắp đầu. Đau bắp cơ: Thường gặp ở thắt lưng, chi dưới. Cảm giác nóng, đau vùng xương ức [1]. b. Bệnh tích Mổ khám gà bệnh thấy: - Mũi viêm xuất huyết và tịt lại. - Mào và tích xưng chũng, đỏ sẫm, tích nước. - Viêm hoại tử, xuất huyết tràn lan ở các phủ tạng: Phổi, tim, gan, lách, thận, buồng trứng… - Xuất huyết đỏ sẫm từng mảng ở các tổ chức dưới da và cơ. - Tuyến tụy xưng to có các vạch vàng và đỏ xen kẽ. - Viêm xuất huyết toàn bộ niêm mạc dạ dày, ruột non, ruột già, manh tràng, hậu môn, túi frabrieius [7]. 1.1.4. Tình hình dịch bệnh. 1.1.4.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới. - Đại dịch cúm Tây Ban Nha 1918: Dịch cúm diễn ra năm 1918 - 1919, còn được biết tới với tên cúm Tây Ban Nha, là đại dịch cúm lan rộng gần như ra toàn cầu. Đại dịch này hoành hành ở châu Âu, châu Mỹ và lan nhanh sang châu Phi, tới tận Bắc cực và các đảo Thái Bình Dương xa xôi. Khoảng 500 triệu người, tức 1/3 dân số thế giới khi đó nhiễm bệnh với số người chết ước tính ít nhất 50 triệu người, trong đó riêng ở Tây Ban Nha là 8 triệu người [10]. Hồi năm 2005, các nhà khoa học tại Trung tâm Kiểm soát và phòng chống dịch bệnh Mỹ đã khai quật thi thể của một người chết vì virus cúm Tây Ban Nha và qua nghiên cứu, họ phát hiện ra virus này hầu như chắc chắn có nguồn gốc từ gia cầm và có chung các đột biến gen với dòng virus cúm gia cầm H5N1 hoành hành tại các nước châu Á hồi đó. Cúm Tây Ban Nha cho tới nay vẫn được coi là đại dịch nghiêm trọng nhất lịch sử loài người, thậm chí còn được cho là đại dịch kinh hoàng nhất trong các loại bệnh dịch [12]. - Đại dịch cúm châu Á 1957: Sau đại dịch 1918, dịch cúm trở lại “hiền lành” cho tới tận đầu những năm 1950. Năm 1957, thế giới bắt đầu tiến hành theo dõi hoạt động của căn bệnh cúm. Dù các phương tiện phục vụ cho việc này chưa được hiện đại như ngày nay, người ta sớm phát hiện thấy một dấu hiệu bùng dịch xuất hiện ở khu vực châu Á [12]. Virus được xác định đã bắt nguồn từ Quý Châu, Trung Quốc, lan sang Singapore vào tháng 2/1957, chạm tới Hồng Kông vào tháng 4 và Mỹ vào tháng 6. Có 69.800 người Mỹ thiệt mạng trong khi con số người chết toàn cầu dao động từ 1 triệu – 4 triệu người. Người ta đã chế tạo thành công một loại vaccine để kiềm chế căn bệnh này. Dịch cúm châu Á lần đầu tiên cung cấp cơ hội cho giới khoa học nghiên cứu hoạt động lây nhiễm tiền dịch bệnh chuyển thành dịch ra sao. Cúm châu Á biến mất sau 11 năm xuất hiện và biến đổi thành cúm Hồng Kông vào năm 1968 [12]. - Đại dịch cúm Hồng Kong 1968: Dịch cúm Hồng Kông được xác nhận là dịch cấp độ 2, gây ra bởi mẫu virus cúm A/H3N2, chính là hậu duệ của cúm châu Á H2N2. Thông tin đầu tiên về trận dịch là một vụ bùng dịch nhỏ ở Hồng Kông xuất hiện vào ngày 13/7/1968, trong một khu vực có khoảng 500 người sống rất gần nhau. 2 tuần sau, dịch bệnh bùng nổ mạnh và kéo dài khoảng 6 tuần. Tháng 7/1968, dịch xuất hiện ở Việt Nam và Singapore. Tới tháng 9/1968, nó đã lan tới Ấn Độ, Philippines, bắc Australia và châu Âu. Cùng tháng đó, virus đã vươn tới California từ những người lính trở về sau chiến tranh Việt Nam. Virus vươn tới Nhật Bản, châu Phi và Nam Mỹ vào năm 1969. Tổng cộng trong hai năm 1968 – 1969, trận dịch đã giết hại khoảng 1 triệu người trên toàn cầu trước khi nó biến mất [12]. Hình 1.2. Bản đồ các quốc gia xảy ra dịch cúm A/H5N1 (WHO, tính đến 15/09/2008) [12]. Chú giải: Phần bôi đậm là vùng dịch cúm xảy ra trên gia cầm. Phần bôi nhạt là vùng dịch cúm chỉ xảy ra trên chim hoang dã. 1.1.3. Tình hình dịch cúm ở Việt Nam. Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn. Đây là lần đầu tiên dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nền tới nền kinh tế quốc dân. Tính đến tháng 10/2008, dịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát hàng năm tại nhiều địa phương trong cả nước, có thể phân chia thành các đợt dịch lớn như sau: - Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 và 30/03/2004, dịch cúm xảy ra ở các tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang. Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng hai tháng đã xuất hiện ở 57/64 tỉnh thành trong cả nước. Tổng số gà và thủy cầm mắc bệnh, chết và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 17% tổng đàn gia cầm. Trong đó, gà chiếm 30,4 triệu con, thuỷ cầm 13,5 triệu con. Ngoài ra, có ít nhất 14,8 triệu chim cút và các loại khác bị chết hoặc thiêu huỷ. Đặc biệt, có 3 người được xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 đã tử vong trong đợt dịch này [6]. - Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: Dịch bệnh tái phát tại 17 tỉnh, thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng 11/2004 chỉ còn một điểm phát dịch. Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống kê trong vụ dịch này là 84.078 con. Trong đó, có gần 56.000 gà; 8.132 vịt; và 19.950 con chim cút. Và đã có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1, trong đó có 9 ca tử vong [6]. - Đợt 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: Dịch cúm gà xảy ra trên 36 tỉnh thành trong cả nước. Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y thống kê là 1,846 triệu con (gồm 470.000 gà, 825.000 thủy cầm và 551.000 chim cút). Vào những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gà xảy ra trong tháng 10/2005 lan nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng 12/2005 [6]. - Sau một năm (2006), do áp dụng chương trình tiêm chủng rộng rãi cho các đàn gia cầm trong cả nước, cùng với các biện pháp phòng chống dịch quyết liệt, dịch cúm A/H5N1 không xảy ra ở Việt Nam. Mặc dù vậy, đến 06/12/2006 dịch cúm gia cầm A/H5N1 đã tái bùng phát ở Cà Mau, sau đó lan sang các tỉnh Bạc Liêu, Hậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ [6]. - Trong năm 2007, dịch bệnh tái phát tại Hải Dương vào ngày 17/02/2007 và được khống chế sau 1 tháng. Tuy nhiên, đến ngày 01/05/2007 dịch bệnh tiếp tục tái phát tại Nghệ An, sau đó lan sang nhiều tỉnh, thành phố trong cả nước. Theo Báo cáo của Cục Thú y (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn) đến ngày 10/06/2007 dịch đã xảy ra trên 16 tỉnh, thành phố (Nghệ An, Quảng Ninh, Cần Thơ, Sơn La, Nam Định, Đồng Tháp, Hải Phòng, Bắc Giang, Ninh Bình, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Quảng Nam, Hưng Yên, Thái Bình và Phú Thọ), và chỉ được khống chế hoàn toàn vào 8/2007 [6]. - Dịch bệnh tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc vào tháng 3/2008. Cho đến tháng 6/2008, dịch cúm gia cầm A/H5N1 về cơ bản đã được khống chế trên toàn quốc [6]. - Cúm gà 2010 và đầu năm 2011(chủ yếu là bệnh cúm thuộc chủng H5N1). Tại tỉnh Bắc Kạn từ ngày 19/3 đến ngày 6/4 năm 2010, dịch cúm gia cầm đã xảy ra tại 16 hộ chăn nuôi tại huyện Lương Phú. Tổng số gia cầm bị chết và tiêu hủy tại các hộ gia đình trên là 318 con [6]. Tại Quảng Ninh, ngày 29/3, dịch cúm gia cầm đã xảy ra tại 4 hộ gia đình thuộc xóm 4 xã Tiền Phong của huyện Yên Hưng. Tính đến ngày 6/4 tổng số gia cầm chết và tiêu huỷ của 4 hộ trên là 1.554 con (trong đó có 1.504 vịt và 50 gà). Ở huyện Yên Hưng, Quảng Ninh, có hơn 3.000 con gà có biểu hiện mắc bệnh, số gia cầm bị chết là 1420 con [6].  Cả nước còn 6 tỉnh là Nghệ An, Khánh Hòa, Tuyên Quang, Bắc Ninh, Bến Tre và Quảng Ninh có dịch cúm gia cầm chưa qua 21 ngày. Số ca mắc cúm A/H5N1 trong những tháng đầu năm 2010 có thể nói là “bất thường” so với những năm trước đó chỉ trong 2 tháng đầu năm đã bằng tổng số ca mắc cả năm 2009. Đầu năm 2011 bệnh cúm A/H5N1 đã xảy ra ở một số tỉnh nhưng với số lượng ít và hầu như chưa bùng phát thành dịch: Ngày 17/2, chi cục thú y tỉnh Kon Tum đã xác địnht trên 2.000 con chim cút và trên 1.000 con gà bị chiễm cúm A. Ngày 12/3, TS Lê Hữu Hải, Trưởng phòng NN&PTNT huyện Cai Lậy (Tiền Giang), cho biết bảy đàn gia cầm, thủy cầm hơn 4.700 con ở các xã Nhị Mỹ, Tân Phú, Nhị Quý, Hội Xuân và Mỹ Phước Tây của huyện Cai Lậy đã phải tiêu hủy vì có các triệu chứng của bệnh cúm A/H5N1 [6]. Bảng 1.1. Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo cáo cho WHO từ tháng 12/2003 đến 19/6/2008 [12]. 1.2. Virus cúm A 1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc. * Đặc điểm hình thái: Hình 1.3: (A): Hình thái virus cúm; (B): Cấu trúc virus cúm; (C): cấu trúc RNA của virus cúm. Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 – 120nm, đôi khi có dạng hình sợi. Khối lượng phân tử khoảng 250 Da. Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate [10]. * Đặc điểm về cấu trúc: Hạt virus: Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus. Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm [2,17]. + Gai H giúp virut gắn lên thể thụ cảm trên bề mặt tế bào. + Gai N có tác dụng thoái biến thể thụ cảm của tế bào và giúp virus phóng thích tế bào bị nhiễm. - Vỏ bọc ngoài (envelope) - Lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand. RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-) ssRNA) là vật chất di truyền (còn gọi là hệ gen) của virus cúm A, gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1-F2 [2]. 1.2.2. Cấu trúc hệ gen và chức năng Hình 1.4. cấu trúc virus cúm A Tất cả các virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae đều có hệ gen là RNA chứa 8 phân đoạn. Trên bề mặt virus có protein ngây ngưng kết hồng cầu là HA và một loại enzyme NA có chức năng phá hủy thụ thể của tế bào vật chu và giải phóng virus. Trên cơ sở trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, hệ gen virus cúm A có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotit [16]. Các gen mã hóa cho các protein và chức năng của chúng như sau: - Phân đoạn 1: Là các gen mã hóa cho protein PB2 với kích thước 2341bp có vai trò trong quá trình sao mã: gắn mũ. - Phân đoạn 2: Liên quan đến quá trình sao mã: kéo dài, kích thước 2341bp, mã hóa cho protein PB1. - Phân đoạn 3: Mã hóa cho protein PA, kích thước 2233 bp, có vai trò trong quá trình sao mã. - Phân đoạn 4: Liên kết với tế bào thụ thể trên tế bào chủ gây ngưng kết hồng cầu, kích thước đoạn gen là 1778 bp mã hóa cho protein HA (Hemagglutinin). - Phân đoạn 5: Mã hóa cho protein NP, kích thước 1565 bp, nucleotit bám vào RNA, là thành phần trong phức hợp sao mã, vận chuyển ra vào nhân của vRNA. - Phân đoạn 6: Đóng vai trò quan trọng trong quá trình giải phóng của virus, kích thước 1413 bp, mã hóa cho protein NA (Neuraminidase). - Phân đoạn 7: Kích thước 1027 bp, mã hóa cho protein M1 (Matrix protein), là protein nền, thành phần chính của virion và liên quan đến nhiều sự kiện quan trọng của virus. - Phân đoạn 8: Kích thước 890 bp, mã hóa NS1 với chức năng là protein không cấu trúc liên quan đến sự vận chuyển của RNA, ức chế interferon. Mã hóa prtein NS2 là protein không cấu trúc, chức năng chưa được biết rõ.  Hình 1.5. Các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 [3]. * Độc lực gây bệnh của virus cúm A: Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độc lực thấp (LPAI - low pathogenic avian influenza), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên. - HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 h sau nhiễm. Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin. - LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế sức đề kháng của virus và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [4]. 1.2.3. Đặc tính kháng nguyên của virus cúm A. HA và NA là hai kháng nguyên bề mặt đặc biệt quan trọng nó quyết định độc lực cũng như khả năng nhân lên của virus. Hai kháng nguyên này cũng là mục tiêu tấn công đầu tiên của hệ thống miễn dịch vật chủ khi có sự xâm nhiễm của virus. * Kháng nguyên HA. HA là một glycoprotein có khối lượng khoảng 76.000 Dalton chứa 2 – 3 vị trí glycosyl hóa. Trên phân tử HA có ít nhất 5 domain kháng nguyên (A,B,C,D, và E) phân bố ở phần đầu của phân tử này. HA được cấu tạo bởi 2 tiểu phần là HA1 và HA2. Hai tiểu phần này được nối với nhau bởi một trình tự amino acid ngắn, đặc trưng cho từng bến thể H. Trình tự của đoạn peptit nối trong phân tử HA cũng chính là trình tự nhận biết và phân cắt của enzyme protease tế bào chủ đối với phân tử protein này. Sự phân cắt phân tử HA là bước đầu tiên trong quá trình thâm nhập vào tế bào chủ của virus cúm. Thông thường sự phân cắt này có tính giới hạn đối với các mô với sự có mặt của các protease thích hợp. Tuy nhiên đối với virus cúm độc lực cao (H5 và H7) đã tìm thấy sự có mặt của nhiều amino acid kiềm tính tại vị trí nhận biết của protease. Đặc tính này cho phép HA được nhận biết và phân cắt bởi nhiều loại protease có mặt ở nhiều loại tế bào khác nhau, dẫn đến sự mở rộng giới hạn các mô có thể bị xâm nhiễm bởi virus [14,15]. * Kháng nguyên NA. Cùng với HA, NA cũng là một kháng nguyên bề mặt vô cùng quan trọng, có tính chất quyết định đến khả năng nhân lên của virus. Chức năng chính của NA là phân cắt phân tử sialic acid (N-Acetyl neuramic acid), giải phóng virus khỏi tế bào nhiễm [8,5]. NA phân giải thụ thể tế bào màng nhày đường hô hấp bằng cách cắt đứt các liên kết glucosid giải phóng ra Neuramininic acid. Quá trình này cho phép virus đi qua màng nhày và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu của cơ thể vật chủ. NA cũng phá hủy các thụ thể dành cho HA trên bề mặt của tế bào hồng cầu, mặc dù các tế bào không phải là đối tượng gây nhiễm. Cùng với protease của tế bào chủ, NA tham gia tích cực vào quá trình phân cắt phân tử HA và phân cắt mối liên kết giữa thụ thể tế bào với HA. Nếu không có NA thì virus sẽ bị bất hoạt do gắn chặt vào thụ thể sialic acid của tế bào chủ, không được giải phóng ra khỏi tế bào và dẫn tới mất khả năng gây nhiễm tế bào. Vùng hoạt động của phân tử NA hoạt động ở đầu 5’ của phân tử này. Đối với các chủng H5N1 độc lực cao, NA đã biến đổi rất nhiều qua quá trình tiến hóa. Các đột biến đó đã giúp cho virus trở nên thích nghi và gây bệnh cho nhiều loại vất chủ khác nhau [9]. Ở dạng NA-N1 của các chủng độc lực cao, trên phân tử protein này có đoạn nhỏ gọi là vùng “đảo ngược” tạo ra một lỗ hổng (hollow pocket), cấu trúc này không có ở N2 và N9. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chính cấu trúc này đóng vai trò như một nhân tố ức chế tác dụng của một số thuốc kháng virus [13]. 1.3. Một số phương pháp phòng, chống bệnh cúm A/H5N1.: 1.3.1. Phòng bệnh bằng vaccine Hiện nay vaccine được coi là biện pháp chiến lược nhằm ngăn chặn dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng cúm trên người, tuy vaccine không ngăn ngừa hoàn toàn virus nhưng làm giảm được bệnh ở gia cầm qua đó làm giảm được sự phân hóa của virus từ gia cầm bị bệnh. Kháng thể đặc hiệu có thể sinh ra, đó chính là kháng thể kháng HA của virus đang nhiễm, nhưng thông thường động vật và người chết rất nhanh trước khi miễn dịch sinh kháng thể kháng HA. Có nhiều loại kháng thể nhưng chỉ có kháng thể kháng HA mới có vai trò trung hòa virus cho bảo hộ miễn dịch. Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở 2 loại chính là vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới [1]. - Vaccine truyền thống bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng. Vaccine vô hoạt đồng chủng (homonogus) là loại vaccine được sản xuất chứa cùng những virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa. Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologous) là vaccine sử dụng virus có kháng nguyên NA dị chủng [1]. - Vaccine thế hệ mới: Vaccine được sản xuất có sử dụng kỹ thuật di truyền bao gồm: + Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên HA, NA tái tổ hợp và tách chiết làm vaccine. + Vaccine tái tổ hợp có chứa vecto đậu gia cầm dẫn truyền: Sử dụng virus đậu gia cầm làm vecto tái tổ hơp mang gen H5 và N1 chống virus type H5N1 và H7N1. + Vaccine tái tổ hợp có vecto adenovirus dẫn truyền: Sử dụng plasmit adenovirus dẫn truyền, lắp ghép virus adeno có chứa gen kháng nguyên H5 từ đó làm vecto tái tổ hợp H5 phòng chống virus type H5N1. + Vaccine từ sản phẩm plasmit tái tổ hợp có chứa gen HA, NA, NP, M2 đơn lẻ hoặc đa gen. + Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: Được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen trong đó gen kháng nguyên H5 có vùng “độc” đã được biến đổi bằng kỹ thuất di truyền. 1.3.2. Phòng bệnh bằng sử dụng hoá dược liệu. Một số dạng hóa dược đang được dùng trong các thuốc ức chế virus không đặc hiệu tác dụng ngăn cản quá trình giải phóng virus ra khỏi tế bào nhiễm (ức chế NA), hoặc ức chế quá trình thoát vỏ (cởi áo) và bao gói của virus do ức chế vận chuyển protein NP vào nhân tế bào trong quá trình nhân lên của virus trong tế bào nhiễm [7]. Các chế phẩm chủ yếu là Rimantadine, Amantadine A/H5N1 đã xuất hiện sự kháng thuốc với hai thuốc này và Oseltamivir (Tamiflu) hoặc phác đồ hỗn hợp cả hai loại . Trong đó, Oseltamivir ức chế NA của mọi type virus cúm, được sử dụng uống dự phòng trong vòng 48 h sau tiếp xúc với mầm bệnh, và được sử dụng là thuốc dự trữ chiến lược phòng dịch cúm A/H5N1, tuy nhiên thuốc cũng có một vài tác dụng phụ trên người được ghi nhận như gây rối loạn tâm thần và có thể gây độc sau điều trị liều cao, cần chú ý khi sử dụng [1,7]. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu: 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu. Chủng virus cúm NIBRG-14 do viện Công Nghệ Sinh Học tiếp nhận từ Viện Quốc Gia về tiêu chuẩn và kiểm định sinh học (NIBSC, vương quốc Anh) là chủng được tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược. 2.1.2. Các hoá chất dùng trong nghiên cứu. Agarose, agar, EDTA, ethanol 70%, ethanol 100%, NaCl, cao nấm men, trypton, Amp, X-gal, MgCl2, SDS10%, chlorofrom, trizol, acetat natri, TAE, Sol I, Sol II, Sol III. 2.1.3. Các trang thiết bị: Bộ nguồn điện di, bộ điện di DNA, máy khuấy trộn Vortex, máy soi chụp ảnh gel, máy lắc ổn nhiệt 370C, máy khuấy từ, máy li tâm lạnh, tủ lạnh sâu - 250C, - 750C,máy li tâm, lò vi sóng, máy hút chân không, cân phân tích 10-4g, cân điện 10-2g, phòng thí nghiệm cấp độ 3, box cấy an toàn. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết RNA tổng số - Virus bị bất hoạt bằng trizol với tỷ lệ 1:1, trộn đều bằng xi lanh (khoảng 20 lần). - Bổ sung dịch chloroform vào dịch huyền phù virus đã được bất hoạt trong trizol (1:1), đảo đều trong 15 giây. - Để trong nhiệt độ phòng trong 5 phút sau đó li tâm 10.000 vòng/phút trong vòng 10 phút ở nhiệt độ thường. - Đưa dịch đã li tâm vào ống eppendorf mới. - Bổ sung 0,5 isopropanol,đảo đều trong nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút. - Ly tâm 12.000 v/p trong vòng 30 phút ở 40C để thu tủa RNA. - Rửa tủa bằng 1ml ethanol 70%, ly tâm 12.000 v/p trong vòng 15 phút ở 40C. - Làm khô RNA trong box, hòa lại trong 20µl nước vô trùng đã loại RNase. 2.2.2. Kiểm tra RNA trên quang phổ kế Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự hấp phụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các bazơ purin và pirimidin. Nồng độ RNA sợi đơn (µg/ml) sẽ được tính theo công thức: CRNA = A260 x 40 x d, với d là độ pha loãng mẫu cần đo. Cách tiến hành như sau: - Pha loãng dung dịch RNA pha loãng 20 lần trong nước vô trùng (5µl dung dịch RNA trong 95µl nước). - Dùng pipet chuyển dung dịch RNA đã pha loãng sang ống thạch anh của máy quang phổ Shimadzu và đo ở bước sóng 260nm. - Nồng độ RNA của mẫu đo sẽ được tính theo công thức trên với độ pha loãng là 20 lần. 2.2.3 Phương pháp tạo cDNA Tổng hợp sợi cDNA từ RNA của virus giai đoạn này cần có enzyme Reverse Transcriptase và mồi ngẫu nhiên. Phương pháp thực hiện như sau: Chuẩn bị hỗn hợp RNA và mồi trong ống 0,5ml vô trùng với các thành phần: Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp RNA và mồi. RNA tổng số (30-50mg)5µlMồi ngẫu nhiên (50ng /µl )3µdNTP(10mM) 1µlH20 không có Rnase 1µlTổng thể tích10µlChuẩn bị xong hỗn hợp ủ ở 650C trong 5 phút và đặt trên đá khoảng 1 phút. Tiếp tục chuẩn bị các thành phần khác bổ sung cho phản ứng: Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR. 10X RT Buffer2 µl25mM MgCl24 µl0.1M DDT2 µlChất ức chế Rnase1 µlTổng thể tích9 µl - Bổ sung 9 µl hỗn hợp thành phần trên vào mỗi ống chứa RNA và mồi đã sử lý ở 650C trong 5 phút, đảo nhẹ sau đó ly tâm 3000 v/p trong 30 giây. - Ủ phản ứng ở 250C trong 2 phút. - Sau đó bổ sung enzyme phiên mã ngược và mỗi phản ứng, đảo đều sau đó ủ tiếp chu trình nhiệt trong máy PCR như sau: 250C trong 10 phút 420C trong 50 phút 700C trong 15 phút Bảo quản ở 40C - Bổ sung 1 µl Rnase H vào mỗi ống và ủ ở 370C trong 20 phút để loại bỏ toàn bộ RNA. Mẫu chứa các sợi cDNA có kích thước khác nhau và cDNA sẽ được dùng làm khuôn để tổng hợp nên những đoạn DNA đặc hiệu bằng phương pháp PCR. 2.2.4. Nhân bản gen mã hoá kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 chủng NIBRG-14 bằng phương pháp PCR Phản ứng giai đoạn này cần có đoạn mồi đặc hiệu cho gen mã hoá kháng nguyên HA của virus cúm và sự có mặt của Taq polymerase. Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR. H2O 16,1µlBuffer 10X2,5µldNTP 2µlMồi 11µlMồi 2 1µlcDNA2µlTaq- polymerase0.4µlTổng thể tích25µl Chu trình nhiệt: Bước 1: 940C/3 phút Bước 2: 940C/1 phút Bước 3: 500C/50 giây Bước 4: 720C/1 phút 30 giây Bước 5: Lặp lại 3 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4. Bước 6: 720C/8 phút Bước 7: 40C/ vô cùng 2.2.5. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di - Chuẩn bị gel agarose 1%: Cho 1g agarose vào 100 ml dung dịch đệm TAE 1X. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 500C rồi đổ dung dịch vào khay agarose điện di có cài sẵn răng lược. Sau khoảng 30 phút khi gel đã đông, gỡ lược ra đổ gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X vào để dung dịch ngập cách mặt gel từ 1 – 2 mm. - Tra mẫu: Lấy khoảng 5 µl sản phẩm trộn với 3 µl màu loadingdye 10X tra vào các giếng nhỏ trong gel. Chỉ thị phân tử là DNA đã được cắt phối bằng Hind III và EcoR I cũng được tra vào gel làm marker. - Chạy điện di ở hiệu điện thế 100 V, 400 mA, trong khoảng 2 – 30 phút. DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương. Quan sát sự di chuyển của màu bromophenol blue để biết khi nào cần ngừng điện di. - Nhuộm DNA bằng Ethidium bromide: Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch nhuộm này với nồng độ 2µl trong thời gian khoảng 10 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng của tia tử ngoại của máy soi chụp gel. 2.2.6. Phương pháp tách dòng. - Tách dòng đoạn DNA mã hoá cho kháng nguyên HA của virus cúm H5N1 được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng. Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR. H204µlBuffer for T4 ligase1 µlSản phẩm PCR2 µlVectơ PCR 2.12 µlT4 ligase1 µlTổng thể tích10µl Ủ mẫu ở 140C trong khoảng 16 giờ. Sau khi sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào E.coli chủng INV α F`. Cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp và X-gal, sau đó đem mẫu đi ủ ở 370C qua đêm. Các khuẩn lạc E.coli chứa vecto PCR 2.1 tái tổ hợp mang sản phẩm PCR có màu trắng. 2.2.7. Biến nạp DNA plasmit vào tế bào E.coli chủng INV αF`. Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmit trực tiếp vào tế bào thể nhận. Cơ chế biến nạp gồm việc làm thay đổi thành phần cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn để DNA plasmit dễ dàng chui vào tế bào thể nhận. Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA plasmit ngoại lai được gọi là tế bào khả biến. Quá trình biến nạp DNA vào tế bào E.coli được tiến hành như sau: - Lấy ống tế bào khả biến đặt trên đá 30 phút. - Trộn sản phẩm lai vào ống tế bào khả biến, cắm trên đá 30 phút. - Sốc nhiệt ở 420C, thời gian 45 giây, sau đó chuyển ống té bào đó trên đá và để 3 phút. - Bổ sung 250 µl môi trường lỏng LB, nuôi trên máy lắc trong máy lắc với tốc độ 200v/p, ở 370C trong 1 giờ. - Cấy trải 150 µl trên môi trường LB đặc có Amp và X-gal. - Ủ trong tủ ấm 370C qua đêm. 2.2.8. Tách chiết DNA plasmit Nhặt các khuẩn lạc trắng với 1 khuẩn lạc xanh, cấy vào mỗi khuẩn lạc 2 µl môi trường LB lỏng có chứa Amp, nuôi lắc qua đêm 370C trong 200v/p. - Lấy 1 µl dịch nuôi cho vào ống eppendorf đem ly tâm 6000v/p trong 5 phút để thu xác tế bào. - Bổ sung lần lượt 150 µl Sol I, trộn đều bằng máy vortex. - Bổ sung 150 µl Sol II, đảo nhẹ bằng tay 3 lần. - Bổ sung 150 µl Sol III, đảo nhẹ bằng tay 3 lần. - Bổ sung 450 µl chlorofrom, đảo nhẹ. - Ly tâm 10.000v/p trong 15 giây. - Dùng pipet hút khoảng 400 µl dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới. - Bổ sung 40 µl NaOAC 3M, pH 5,2 và 1 µl ethanol 100%. Để DNA plasmit tủa ở 13.000 v/p trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi thu cặn DNA. - Rửa cặn DNA bằng 500 µl cồn 70. - Ly tâm 13.000 v/p trong 15 phút, thu tủa. - Làm khô cặn DNA plasmit bằng máy Speed Vac trong 5 phút. - Hoà cặn DNA trong 40 µl TE có Rnase, búng đều sau đó ly tâm 3000 v.p trong 30 giây. - Ủ ở bể ổn nhiệt 370C trong 1 giờ để loại RNA. 2.2.9. Tinh sạch plasmit Để tinh sạch vecto plasmit tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tự. Được tiến hành như sau: - Ly tâm 1,5 µl dịch nuôi cấy qua đêm để thu cặn tế bào. - Xác định tế bào được hoà tan lại trong 150 µl Resuspension Buffer nhờ Vortex. - Bổ sung 150 µl Lisisbuffer và đảo nhẹ 5-6 lần, ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 phút. - Thêm 150 µl Precipitation Salt, đảo nhẹ 6-8 lần. - Ly tâm 13000 v/p trong vòng 5 phút. Trong lúc đợi ly tâm đặt cột S.N.A.P miniprep (A) vào trong ống (B). - Thu dịch nổi vào ống eppendorf vô trùng. - Thêm 600 µl Binding Buffer, đảo nhẹ 5-6 lần, cho toàn bộ dịch qua hệ thống cột A/B. - Ly tâm hệ thống A/B tại nhiệt độ phòng 2000 v/p trong 30 giây. - Loại dịch chảy qua. - Bổ sung vào cột 500 µl Wash Buffer. - Ly tâm cột A/B trong nhiệt độ phòng từ 2000 v/p trong 30 giây. - Thêm 900 µl Final Wash 1X và ly tâm 2000 v/p trong 30 giây. - Ly tâm hệ thống tại nhiệt độ phòng với tốc độ tối đa trong vòng 1 phút. - Chuyển cột A vào một ống eppendorf vô trùng, thêm 30 µl nước và ủ 3 phút ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm cột ở nhiệt độ phòng tốc độ tối đa trong 1 phút. 2.2.10. Xác định trình tự gen bằng máy tự động Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc của Sanger có sử dụng các dideoxynucleotit. Trong kỹ thuật xác định trình tự bằng máy tự động, người ta không đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ mà bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau. Như vậy tất cả các oligonucleotit cùng chấm dứt tại một dideoxynucleotit sẽ có cùng một màu. - Cho chạy phản ứng với các thành phần tham gia sau đó tinh sạch sản phẩm để xác định trình tự. Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR. Big dye3µlMồi1,275µlBuffer 2,5X 3µlDNA plasmit3µlH2O khử ion vô trùng4,725µlTổng thể tích15µl Chu trình nhiệt: Bước 1: 960C /1 phút Bước 2 : 960C/ 10 phút Bước 3: 500C/5 giây Bước 4: 600C/4 phút Bước 5: Lặp lại 25 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4. Bước 6: 40C trong vô cùng. Tinh sạch sản phẩm để xác định trình tự: - Bổ sung 5 µl EDTA 125mM pH 8 vào mỗi ống sản phẩm. - Thêm vào 60 µl ethanol 100%. - Ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút. - Ly tâm tốc độ 12.000 v/p trong 30 phút. - Thu tủa, rửa tủa bằng 60 µl ethanol 70%. - Ly tâm tốc độ 10.000 v/p trong 10 phút. - Loại dịch thu cặn. - Làm khô DNA. - Thêm vào 15 µl hidiformamide. - Biến tính 3 phút ở 950C. - Đưa mẫu vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số. Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme có bản chất là các ribonuclease (RNase). Hơn nữa các Rnase lại có mặt khắp nơi (có mặt rất nhiều trên mồ hôi, trên tay của người làm thao tác). Vì vậy việc tách chiết RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh bị nhiễm các RNase từ môi trường ngoài vào mẫu. Thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ hóa chất đều được sử lý bằng DEPC sau đó khử trùng bằng nhiệt với áp suất cao, khi thao tác phải đeo găng tay. Quá trình tách chiết RNA được tiến hành theo phương pháp sử dụng dung dịch Trizol. RNA dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử đòi hỏi phải có độ tinh sạch cao, không lẫn protein và DNA. Để đo nồng độ RNA cần dùng cho việc tạo cDNA, chúng tôi dã dùng phương pháp quang phổ kế để xác định độ hấp phụ ở bước sóng 260nm (A260). Hình 3.1. Kết quả tách RNA tổng số. Kết quả điện di ở hình 3.1 cho thấy RNA plasmit có băng đặc trưng sắc nét, không bị đứt gãy trong quá trình thao tác. RNA plasmit thu được đem pha loãng để làm khuôn cho các phản ứng RT- PCR. 3.2. Kết quả khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm H5N1. Sau khi tách chiết, 10ng RNA tổng số đã tách chiết được dùng làm sợi khuôn để nhân bản đoạn DNA đích bằng kỹ thuật RT-PCR, sử dụng bộ sinh phẩm SuperScripTM One step RT-PCR của hãng Invitrogen. Vì vùng gen mã hóa cho các gen HA khá dài, để đảm bảo việc nhân bản gen thành công chúng tôi đã thiết kế hai cặp mồi khuếch đại gen theo hai đoạn riêng biệt nằm ở đầu 3’ và đầu 5’ của gen. Cặp mồi dùng để khuếch đại đoạn gen ở đầu 5’ của gen HA có trình tự: H55PI: ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTG; H55M14: GCATACTAGAGTTTATCGCCC. Sản phẩm RT-PCR với cặp mồi này có chiều dài theo lý thuyết là 917 bp. Cặp mồi dùng để khuếch đại đoạn gen ở đầu 3’ của gen HA có trình tự: H53P5: CATCAACACTGAACCAGAGATTGG; H53MS: TTAAATGCAAATTCTGCATTGTAAG. Sản phẩm PCR với cặp mồi này có chiều dài theo lý thuyết là 1055 bp. Phản ứng phiên mã ngược được thực hiện theo chu trình nhiệt 500C - 30 phút, 940C – 2 phút; 30 chu kỳ (940C – 15 giây, X0C* - 50 giây, 720C- 1 phút 30 giây); 720C – 8 phút, 40C – ∞. Sau đó chuyển sang giữ ở 40C. Sản phẩm PCR (8µ) được kiểm ta điện di trên gel agarose 1%. (hình 3.2) 1055 bp 917 bp 247 bp 147 bp M47 bp 947 bp Hình 3.2. kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của gen HA trên gel agarose 1% M: Thang DNA chuẩn. 1: Sản phẩm PCR đầu 3’. 2: Sản phẩm PCR đầu 5’. Đoạn gen mã hóa protein kháng nguyên HA của virus cúm đã được nhân lên một cách đặc hiệu, chỉ tạo ra một băng DNA duy nhất, không có sản phẩm phụ. Sản phẩm PCR được đối chiếu với thang DNA chuẩn, kích thước của sản phẩm PCR này đúng theo dự đoán lý thuyết: sản phẩm PCR đầu 3’ có chiều dài khoảng 1055bp, sản phẩm PCR đầu 5’ có chiều dài khoảng 917bp. Kết quả này chứng tỏ chương trình thiết kế hoàn toàn hợp lý cả về mặt lý thuyết và kỹ thuật. 3.3. Kết quả tách dòng sản phẩm PCR Việc tách dòng được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vecto tách dòng PCRR 2.1 của hãng invitrogen sau đó biến nạp vào E.coli rồi tách chiết lại plasmid để chọn loại vecto tái tổ hợp. 3.3.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vecto pCRR 2.1. Quy trình gắn được thực hiện với mục đích tạo vecto tái tổ hợp mang đoạn gen cần tách dòng. Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vecto pCRR 2.1 trong bộ TA cloning Kit của hãng invitrogen. Phản ứng dựa vào đặc tính xúc tác hình thành liên kết nối hai đoạn DNA của enzyme T4 ligase. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng enzyme T4 ligase trong bộ TA cloning Kit của hãng invitrogen, enzyme này có khả năng nối hai trình tự DNA cả đầu so le và đầu bằng. Phản ứng gắn được tiến hành ở 140C, thời gian lai là 16 giờ, đây là thời gian và nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme T4 ligase hoạt động. Bảng 3.1. Thành phần phản ứng gắn. H20 3µlDung dịch đệm của T4 DNA ligase 1µlVector pCR® 2.1 2µlT4 DNA ligase 1µlT4 DNA ligase 3µlTổng thể tích 10µl  Hình 3.3. Sơ đồ vectơ pCR®2.1 (Invitrogen) 3.3.2. Biến nạp vecto tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng INV αF’. Sản phẩm PCR sau khi gắn vào vecto pCRR 2.1 được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng INV αF’. Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn, plasmit tái tổ hợp được tạo ra với số lượng lớn các bản sao. Quá trình biến nạp được thực hiện bằng phương pháp sốc nhiệt. Sau khi biến nạp, dịch tế bào đem cấy trải trên dĩa petri đã có sẵn môi trường LB đặc có bổ sung Amp, X-gal. Với môi trường chọn lọc này, các khuẩn lạc mang vecto pCRR 2.1 sẽ có màu xanh do gen lac-Z hoạt động bình thường nên tổng hợp được enzyme beta-galactosidase, chất này thủy phân cơ chất X-gal thành một sản phẩm có khả năng kết hợp với oxi để tạo thành chất (5.5 dibrom – 4,4 dichloro indigo) có màu xanh da trời, trong khi đó khuẩn lạc chứa vecto tái tổ hợp sẽ có màu trắng do chứa đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên HA chèn vào giữa Lac-promotor và gen cấu trúc Lac-Z nên gen Lac-Z bị hỏng và không tổng hợp được beta-galactosidase Hình 3.4. Kết quả biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli . Vì vây, có thể kết luận rằng: khuẩn lạc màu xanh là khuẩn lạc chắc chắn không mang gen mong muốn, còn khuẩn lạc màu trắng là khuẩn lạc có khả năng mang gen mong muốn. Để khẳng định dòng mang gen chúng tôi tiến hành tách chiết DNA plasmit và kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn. 3.3.3. Tách chiết plasmit. Chúng tôi tiến hành nuôi và tách chiết DNA từ 16 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh. Mỗi khuẩn lạc được nuôi trong 2ml môi trường LB lỏng có bổ sung Amp, lắc ở 370C với tốc độ 200 v/p, qua đêm. Sau đó chuyển dịch nuôi sang các ống eppendorf rồi ly tâm với tốc độ 12000 v/p trong 5 phút, thu dịch nổi. Bổ sung lần lượt các dung dịch Sol I, Sol II, Sol III, sau đó chiết lại bằng chloroform : isoamyl alcohol (24:1). Dung dịch Sol I có tác dụng hòa lại cặn tế bào thành hỗn dịch thuần nhất. SDS có trong dung dịch Sol II kết hợp với NaOH sẽ phá vỡ màng tế bào và giải phóng ra DNA. Trong môi trường có dung dịch Sol II, độ pH cao lên trên 10. Dung dịch Sol III là đệm KOAc 3M, pH 5,5 có tác dụng trung hòa môi trường sau khi đã phá vỡ tế bào làm cho các phần tử plasmit trở về trạng thái bình thường sau khi bị tháo xoắn trong điều kiện kiềm. Chiết dung dịch chlorofom, sau đó ly tâm sẽ làm cho DNA plasmit nằm ở pha nước ở phía trên, protein tủa cùng với xác tế bào sẽ nằm ở pha giữa, chloroform sẽ nằm ở pha cuối. Hút dịch nổi rồi tủa bằng muối NaOAc 3M pH 5,2 và cồn tuyệt đối ở -250C trong 2 giờ. Sau đó ly tâm thu cặn. Làm khô cặn DNA rồi hòa lại trong 40µ TE chứa Rnase ủ ở 370C trong 1 giờ để loại bỏ RNA. Các plasmit sau khi tách được kiển tra bằng điện di trên gel agarose 1% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 X 10 11 12 13 14 15 16 Hình 3.5. Kết quả tách DNA plasmit 1 - 9: DNA plasmit được tách chiết từ sản phẩm biến nạp của đầu 5’ X: DNA plasmit được tách chiết từ khuẩn lạc xanh. 10 – 16: DNA plasmit được tách chiết từ sản phẩm biến nạp của đầu 3’. Theo lý thuyết điện di thì phân tử DNA nào có kích thước càng lớn thì di chuyển càng chậm, nghĩa là trên ảnh quan sát được nó sẽ tạo thành một vạch sáng cao hơn so với các phân tử DNA có kích thước nhỏ hơn. Trong vecto tái tổ hợp, ngoài phần gốc là vecto PCRR 2.1 còn gắn thêm sản phẩm PCR nên khi di chuyển sẽ chậm hơn vecto gốc PCRR 2.1 là plasmit tách từ khuẩn lạc xanh. Quan sát kết quả điện di trên cho thấy có sự chênh lệch rõ rệt giữa các khuẩn lạc xanh và trắng. Các plasmit từ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 16 được tách từ khuẩn lạc trắng đều có đường chạy cao hơn so với plasmit được tách từ khuẩn lạc xanh. Điều này chứng tỏ các dòng pasmit này có khả năng mang gen mã hóa kháng nguyên HA. Để có thể khẳng định các DNA plasmit được tách từ khuẩn lạc trắng có mang gen mã hóa kháng nguyên HA hay không chúng tôi tiến hành kiểm tra phản ứng cắt với enzyme giới hạn EcoR I. 3.3.4. Kiểm tra vecto tái tổ hợp bằng cắt với enzyme giới hạn EcoR I. Enzyme EcoR I được sử dụng để cắt kiểm tra các dòng plasmit có khả năng mang sản phẩm PCR, vị trí cắt của enzyme này theo thiết kế của nhà sản xuất được đưa vào trước hoặc sau 2 đầu đoạn gen cần được nhân dòng. Từ kết quả tách chiết plasmit, chúng tôi đã chọn plasmit số 1, 3, 4 và 8 ở đầu 5’ và 10, 11, 12, 13 và 16 ở đầu 3’ để kiểm tra sự mang gen bằng enzyme hạn chế EcoRI. Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR. H2O7,6µEcoRI0,4µĐệm cho enzyme EcoRI(bufer 2)1µplasmit1µTổng thể tích10µ Hỗn hợp phản ứng trên được tiến hành ở 370C trong 4 giờ và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thể hiện ở hình dưới đây: 947 148 M48 248 348 448 5 648 M 548 448 348 248 148 A B Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmit bằng enzyme hạn chế EcoRI A: Sản phẩm cắt ở đầu 5’; B: Sản phẩm cắt ở đầu 3’ M: thang DNA chuẩn 1, 6: Sản phẩm PCR 2A-5A: plasmit tái tổ hợp đầu 5’ được cắt bằng EcoRI. 2B-5B: plasmit tái tổ hợp đầu 3’ được cắt bằng EcoRI. Trên ảnh điện di cho thấy đường chạy số 2A, 4A, 5A xuất hiện băng vạch có kích thước bằng kích thước của sản phẩm đầu 5’ khoảng 917 bp so với băng DNA chuẩn. Đường chạy số 1B, 2B, 4B, và 5B có kích thước khoảng 1055 bp đúng bằng kích thước của sản phẩm PCR đầu 3’. Như vậy có khả năng chúng tôi đẫ thu được plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa kháng nguyên HA. Để khẳng định chính xác chúng tôi tiến hành giải trình tự gen. 3.4. Kết quả tinh sạch các plasmit tái tổ hợp Dòng plasmit tái tổ hợp cần được tinh sạch trước khi làm phản ứng xác định trình tự. Để tinh sạch dòng plasmit tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tự, chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm Miniprep Kit do hãng invitrogen cung cấp. 148 248 3 448 Hình 3.7. Kết quả tinh sạch các plasmit tái tổ hợp 1-2: Plasmit tái tổ hợp đầu 5’; 3-4: Plasmit tái tổ hợp đầu 3’. Kết quả tinh sạch DNA plasmit cho thấy dòng plasmit tái tổ hợp hoàn toàn đủ tiêu chuẩn cho mục đích đọc trình tự. 3.5. Kết quả xác định trình tự. Sử dụng DNA plasmit cho phản ứng PCR giải trình tự với việc sử dụng bộ sinh phẩm BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit của Applied Biosystems, quy trình của phản ứng PCR cho giải trình tự được trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu. Quá trình giải trình tự được thực hiện trên máy giải trình tự tự động ABI 3100. Sau khi giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên HA của virus H5N1, trình tự phân tích gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm H5N1 được phân tích bằng phần mềm PC-Gen. Giải trình tự gene H5 và so sánh với chủng gốc VN1194 NIBRG-14 - AATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCG -900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| VN_1194 - AATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCG -900 NIBRG-14 - ATAAACTCTAGCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATCGGGGA -950 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| VN_1194 - ATAAACTCTAGCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATCGGGGA -950 NIBRG-14 - ATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCA -1000 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| VN_1194 - ATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCA -1000 SerGlnArgGlu---deleted--ThrArgGlyLeu NIBRG-14 - GAAATAGCCCTCAACGAGAG------------ACGCGAGGATTATTTGGA -1050 |||||||||||||| ||||| | | |||||||||||||| VN_1194 - GAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGATTATTTGGA -1050 SerGlnArgGluArgArgArgLysLysArgGlyLeu NIBRG-14 - GCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTG -1100 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| VN_1194 - GCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTG -1100 NIBRG-14 - GTATGGGTACCACCATAGCAACGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACA -1150 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| VN_1194 - GTATGGGTACCACCATAGCAACGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACA Chúng tôi sử dụng chương trình phần mềm PC/Gene để phân tích trình tự gen HA của chủng đó tách dòng. kết quả cho thấy trình tự gen hoàn toàn không thay đổi so với chủng gốc. Bên cạnh đó khi so sánh trình tự gen HA này với chủng A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), 12 base thuộc đoạn nối HA1- HA2 đã bị cắt bỏ, đây chính là vùng gây độc.  KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. KẾT LUẬN - Đã tạo dòng xác định trình tự đoạn gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm từ gà bị nhiễm bệnh ở Việt Nam. - Đã phân tích trình tự đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên HA cúm chủng NIBRG-14 sử dụng trong sản xuất vaccine cúm A/H5N1 tại Việt Nam. ĐỀ NGHỊ: Tiếp tục nghiên cứu sử dụng kháng nguyên và kháng thể để đánh giá chất lượng vaccine cũng như phục vụ cho việc sản xuất vaccine tại Việt Nam và trên thế giới. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Ban chỉ đạo quốc gia phòng chống đại dịch cúm ở người (2006), thông báo về nội dung họp Ban chỉ đạo Quốc gia phòng chống đại dịch cúm ở người ngày 24/06/2006, số: 354/TB-BYT, Hà Nội. Kiều Hữu Ảnh (2005), Vi sinh vật học, Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội, Hà Nội. Nguyễn Thị Chính và Trương Thị Hòa (2004), Vi sinh vật y học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội. Nguyễn Thị Bích Nga (2006), Phân lập, lưu giữ và nghiên cứu đặc tính phân tử gen HA (H5) và NA (N1) của một số chủng virus cúm A/H5N1 trên gia cầm ở Việt Nam, luận văn thạc sĩ Sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Hà Nội. Phạm Văn Ty (2005), Virus học, Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội, Hà Nội. Http://  HYPERLINK "" www.cucthuy.gov.vn. Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Hà Nội (2009), sổ tay phòng chống bệnh cúm gia cầm H5N1, Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh Bernd sebastian Kamps, Christian Hoffmann, Wolfgang Preiser (2006), influenza Report 2006, Flying Publishser, WHO. Diane Hulse, Robert G. Webster, Rupert J. Russell, and DiDaniel R. Perez (2004), “Molecular Determinants Within the Surface ptoteins Involved in the Pathogenicity of H5N1 Influenza viruses in chickens”, Journal of virology, 78, pp. 9954-9964. Gary R. Whittaker (2001), “Intracellular traficking of influenza virus: clinical implications for molecular medicine”. Exp. Rev. Mol. Med. 8 February. K. Martin, A Helenius (1991), “Nuclear transport of influenza virus ribonucleproteins: the viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import”, Bioinfobank Library, cell. 67:117-301993813. Lutz Gurtler (2006), “Virology of Human Influenza”. In: Influenza Report. Kamps BS, Hoffmann C, Presier W. Flying Publisher, Wuppertal- Full text at  HYPERLINK "" . Scidev.net (2006), New article Birdflu Ptotein’s pocket’s could inspire better drugs published. Steinhauer D.A (1999), “Role of Hemagglutinin cleavege for the: Pathogenicity of Influenza Virus” Virology, 258(1), pp.1 – 20. SQ Li, M.Orlich and R.Rott (1990), “Generation of Seal influenza virus variants pathogenic for chickens, because of hemagglutinin cleavage site changes”, Journal of Virology,64(7), pp. 3297 – 3303. Timothy Paustian (2007), “Influenza virus”, Microbiology and Bacteriology The world microbes. Zhoo NN, Shortrdge KF, Class ECJ, Krauss SL and Webster RG (1999), “Rapid evolution of H5N1 influenza virus in chickens in Hong Kong”, Jviol, 73, pp. 3366 – 3374. MỤC LỤC  TOC \t "`.1.2.1.3.1.4.1" LỜI CẢM ƠN! MỞ ĐẦU: CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU  PAGEREF _Toc60826274 \h 3 1.1 Giới thiệu chung về dịch cúm gia cầm.  PAGEREF _Toc60826275 \h 3 1.1.1. Lịch sử cúm gia cầm.  PAGEREF _Toc60826276 \h 3 1.1.2. Nguồn lây nhiễm cúm A/H5N1  PAGEREF _Toc60826277 \h 3 1.1.3. Triệu chứng lâm sàng.  PAGEREF _Toc60826278 \h 5 1.1.4. Tình hình dịch bệnh.  PAGEREF _Toc60826279 \h 6 1.1.4.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới.  PAGEREF _Toc60826280 \h 6 1.1.3. Tình hình dịch cúm ở Việt Nam.  PAGEREF _Toc60826281 \h 8 1.2. Virus cúm A  PAGEREF _Toc60826282 \h 12 1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc.  PAGEREF _Toc60826283 \h 12 1.2.2. Cấu trúc hệ gen và chức năng  PAGEREF _Toc60826284 \h 13 1.2.3. Đặc tính kháng nguyên của virus cúm A.  PAGEREF _Toc60826285 \h 16 1.3. Một số phương pháp phòng, chống bệnh cúm A/H5N1.:  PAGEREF _Toc60826286 \h 17 1.3.1. Phòng bệnh bằng vaccine  PAGEREF _Toc60826287 \h 17 G 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  PAGEREF _Toc60826288 \h 20 2.1. Đối tượng nghiên cứu:  PAGEREF _Toc60826289 \h 20 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.  PAGEREF _Toc60826290 \h 20 2.1.2. Các hoá chất dùng trong nghiên cứu.  PAGEREF _Toc60826291 \h 20 2.1.3. Các trang thiết bị:  PAGEREF _Toc60826292 \h 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu  PAGEREF _Toc60826293 \h 20 2.2.1. Tách chiết RNA tổng số  PAGEREF _Toc60826294 \h 20 2.2.2. Kiểm tra RNA trên quang phổ kế  PAGEREF _Toc60826295 \h 21 2.2.4. Nhân bản gen mã hoá kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 chủng NIBRG-14 bằng phương pháp PCR  PAGEREF _Toc60826296 \h 22 2.2.5. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di  PAGEREF _Toc60826297 \h 23 2.2.6. Phương pháp tách dòng.  PAGEREF _Toc60826298 \h 24 2.2.7. Biến nạp DNA plasmit vào tế bào E.coli chủng INV αF`.  PAGEREF _Toc60826299 \h 24 2.2.8. Tách chiết DNA plasmit  PAGEREF _Toc60826300 \h 25 2.2.9. Tinh sạch plasmit  PAGEREF _Toc60826301 \h 26 2.2.10. Xác định trình tự gen bằng máy tự động  PAGEREF _Toc60826302 \h 27 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  PAGEREF _Toc60826303 \h 29 3.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số.  PAGEREF _Toc60826304 \h 29 3.2. Kết quả khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm H5N1.  PAGEREF _Toc60826305 \h 30 3.3. Kết quả tách dòng sản phẩm PCR  PAGEREF _Toc60826306 \h 31 3.3.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vecto pCRR 2.1.  PAGEREF _Toc60826307 \h 32 3.3.2. Biến nạp vecto tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng INV αF’.  PAGEREF _Toc60826308 \h 33 3.3.3. Tách chiết plasmit.  PAGEREF _Toc60826309 \h 34 3.3.4. Kiểm tra vecto tái tổ hợp bằng cắt với enzyme giới hạn EcoR I.  PAGEREF _Toc60826310 \h 35 3.5. Kết quả xác định trình tự.  PAGEREF _Toc60826311 \h 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.  PAGEREF _Toc60826312 \h 40 KẾT LUẬN  PAGEREF _Toc60826313 \h 40 ĐỀ NGHỊ:  PAGEREF _Toc60826314 \h 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO  PAGEREF _Toc60826315 \h 41   DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU  TOC \t "8.1" Bảng 1.1. Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo cáo cho WHO từ tháng 12/2003 đến 19/6/2008 [12].  PAGEREF _Toc60826466 \h 11 Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp RNA và mồi.  PAGEREF _Toc60826467 \h 21 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR.  PAGEREF _Toc60826468 \h 22 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR.  PAGEREF _Toc60826469 \h 23 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR.  PAGEREF _Toc60826470 \h 24 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR.  PAGEREF _Toc60826471 \h 27 Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR.  PAGEREF _Toc60826472 \h 36   DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH  TOC \t "7.1" Hình 1.1: Con đường lây truyền virus cúm sang người [12].  PAGEREF _Toc60826395 \h 4 Hình 1.2. Bản đồ các quốc gia xảy ra dịch cúm A/H5N1 (WHO, tính đến 15/09/2008) [12].  PAGEREF _Toc60826396 \h 8 Hình 1.3: (A): Hình thái virus cúm; (B): Cấu trúc virus cúm; (C): cấu trúc RNA của virus cúm.  PAGEREF _Toc60826397 \h 12 Hình 1.4. cấu trúc virus cúm A  PAGEREF _Toc60826398 \h 13 Hình 1.5. Các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 [3].  PAGEREF _Toc60826399 \h 15 Hình 3.1. Kết quả tách RNA tổng số.  PAGEREF _Toc60826400 \h 29 Hình 3.2. kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của gen HA trên gel agarose 1%  PAGEREF _Toc60826401 \h 31 Hình 3.3. Sơ đồ vectơ pCR®2.1 (Invitrogen)  PAGEREF _Toc60826402 \h 32 Hình 3.4. Kết quả biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli .  PAGEREF _Toc60826403 \h 33 Hình 3.5. Kết quả tách DNA plasmit  PAGEREF _Toc60826404 \h 34 Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmit bằng enzyme hạn chế EcoRI  PAGEREF _Toc60826406 \h 36 Hình 3.7. Kết quả tinh sạch các plasmit tái tổ hợp  PAGEREF _Toc60826407 \h 37   DANH MỤC VIẾT TẮT Amp: Ampiciline. Bp: Base pair. EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid. h : Giờ. HA: Hemagglutinin. HPAI: Highly pathogenic avian influenza. LPAI: Low pathogenic avian influenza. MA: Matrix. NA: Neuraminidase. NP: Nucleocapside. Nxb: Nhà xuất bản. RNA: Ribonucleotide acid. RT-PCR: Retime PCR. Ts: Tiến sĩ. Taq polymerase: Thermus aquaticus polymerase. v/p : Vòng trên phút. X- gal: 5 - Bromo – Chlorua – 3 – indolyl – β – D – glactosidase