Xây dựng quy trình sản xuất men vi sinh và quy trình sản xuất chế phẩm hóa sinh xử lý môi trường cho sinh vật thủy sinh

1 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Gần đây việc tôm, cá chết hàng loạt trên các ao nuôi thủy sản đã gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người dân, các doanh nghiệp cũng như các cơ sở nuôi trồng và chế biến thủy sản. Nguyên nhân chính là do mất cân bằng sinh thái môi trường ao nuôi gây ra. Trong nuôi trồng thủy sản, thức ăn không ăn hết, chất thải và sự chuyển hóa dinh dưỡng là nguồn gốc chủ yếu của sự ô nhiễm nước nuôi thủy sản. Người ta đã quan sát, thấy rằng trong hệ thống thâm canh tôm thì chỉ có 15 - 20% thức ăn được dùng vào phát triển mô động vật, có tới 15% tổng lượng thức ăn hao hụt do không ăn hết và thất thoát, chỉ có 40 - 45% là được sử dụng trong quá trình chuyển hóa bình thường. Nitrit, sulphurit và photpho là những yếu tố chủ yếu bắt nguồn từ thức ăn. Việc cho thức ăn quá nhiều, thức ăn dễ tan, thức ăn khó hấp thu... sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng và phát triển của sinh vật đang nuôi đồng thời sẽ là những điều kiện thuận lợi cho hệ vi sinh phát triển nhất là hệ vi sinh không có lợi. Đây cũng chính là những yếu tố gây nên các bệnh về tôm, cá khiến tôm, cá chết hàng loạt trên diện rộng. Người ta ước tính rằng, có khoảng 63 - 78% nitơ và 76 - 80% photpho cho tôm, cá ăn bị thất thoát vào môi trường. Các nguồn khác của chất thải hữu cơ là mảnh vụn thực vật phù du hoặc tảo dạng sợi (lab-lab) và chất lắng đọng hoặc chất hữu cơ hoà tan, huyền phù... là do nước lấy vào mang theo. Khi hàm lượng nitơ, photpho và các chất dinh dưỡng khác trong ao nuôi gây nên sự phú dưỡng và dẫn tới tăng sức sản xuất ban đầu và nở rộ của vi khuẩn. Sự có mặt của các hợp chất hữu cơ sẽ làm giảm ôxy hoà tan và tăng BOD, COD, sulfit hydrogen, ammoniac và hàm lượng methan (CH4) trong môi trường ao nuôi. Đây cũng chính là những điều kiện bất lợi cho sinh trưởng và phát triển của vật nuôi. Việc sử dụng kháng sinh, các hóa chất bừa bãi đã gây nên sự kháng thuốc ở vi sinh vật đồng thời triệt tiêu những quần thể vi sinh vật có lợi cho môi trường ao nuôi và cũng là một trong những yếu tố gây mất cân bằng hệ sinh thái ao nuôi. Sự phát triển của các khu công nghiệp đã thải vào môi trường nước những yếu tố bất lợi gây nên sự ô nhiễm nguồn nước, làm ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng và phát triển của động vật nuôi đồng thời phá vỡ sinh thái môi trường. Từ những thực trạng trên nên việc đưa các chế phẩm sinh học – sinh hóa áp dụng trong nuôi thủy sản là một trong những giải pháp mang tính sinh thái, bền vững và cần thiết. Giống vi khuẩn lactobacillus đặc biệt là nhóm probiotic(nhóm vi khuẩn sinh acid lactic) sẽ kích thích việc hấp thu và sử dụng thức ăn của vật nuôi triệt để hơn. Nhóm vi khuẩn này còn giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa của vật nuôi, tăng miễn dịch cho co thể, chống chọi với các yếu tố môi trường khác tốt hơn. Kết hợp với vi khuẩn nhóm Bacillus, nitrobacter xử lý cải thiện chất lượng nước ao nuôi phía bên ngoài sẽ giúp hệ sinh thái ao nuôi trở nên cân bằng bền vững và có lợi cho vật nuôi. 2. Mục tiêu đề tài − Xây dựng quy trình sản xuất men vi sinh và quy trình sản xuất chế phẩm hóa sinh xử lý môi trường cho sinh vật thủy sinh. − Sản xuất thử nghiệm chế phẩm. − Đánh giá hiệu quả của sản phẩm trên thực địa. 3. Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu, phạm vi nghiên cứu Cách tiếp cận: Hệ thống ao nuôi thủy sản phải là một hệ sinh thái bền vững. Điều này có thể điều chỉnh tới trạng thái cân bằng nhờ hệ vi sinh vật có lợi cho môi trường ao nuôi. Nghiên cứu được tiến hành trực tiếp và đánh giá bằng thực nghiệm, từ đó chọn lọc và đưa ra những chủng vi khuẩn có lợi nhất cho việc sản xuất những chế phẩm thích hợp. 2 Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng các phương pháp lên men để thu sinh khối từ vi sinh vật. Từ đó kết hợp với các nhóm tác nhân gây bệnh ở môi trường ao nuôi nhằm tạo ra những dòng sản phẩm thích hợp ứng dụng trong môi trường nuôi trồng thủy hải sản. Phạm vi nghiên cứu: − Các loài thuộc giống Lactobacillus (L. acidophillus; L. sporogenes,…) − Các loài thuộc giống Bacillus (Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis,… ) − Saccharomyces cerevisiae − Nitrobacter, Nitrosomonas − Tá dược hấp phụ đường zeolite. − Thử nghiệm chế phẩm trên môi trường nuôi thủy sản tỉnh Bình Thuận. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Probiotic và một số ứng dụng Probiotic là thuật ngữ có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồm hai từ: pro- vì, biosis – sự sống. Probiotic là chế phẩm chứa các vi sinh vật sống đã được chọn lọc mà khi đưa vào cơ thể qua đường miệng với lượng lớn sẽ ảnh hưởng có lợi đến sức khoẻ vật chủ. Khái niệm này bắt nguồn từ giả thiết của nhà bác học Nga Metchinikoff (1845-1916) cho rằng người nông dân Bulgari luôn sống rất khoẻ mạnh là vì họ thường xuyên dùng sữa chua có chứa vi khuẩn lactic, chúng ảnh hưởng tới hệ vi sinh vật đường ruột và làm giảm tác động gây độc của vi sinh vật gây hại. Các vi sinh vật dùng làm probiotic thường có các đặc điểm sau:  Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa của vật chủ;  Dễ nuôi cấy;  Không sinh chất độc và không gây bệnh cho vật chủ;  Có khả năng tồn tại trong một thời gian dài;  Có khả năng sinh các enzyme, chất kháng sinh hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng được;  Chịu được pH thấp ở dạ dày và muối mật ở ruột non;  Biểu hiện hiệu quả có lợi đối với vật chủ. Ảnh hưởng của các chế phẩm probiotic có thể trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua khu hệ vi sinh vật đường ruột. Nhiều chế phẩm loại này rất có lợi cho sức khỏe con người. Chúng được sản xuất ở ba dạng: dạng viên, bột hoặc nước. Tác dụng có ích của probiotic có rất nhiều, có thể nêu một số như: [6,16]  Tăng cường tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzyme khác.  Chữa tiêu chảy do kháng sinh: sử dụng kháng sinh, đặc biệt là clindamycine, cephalosporine, penicilline dễ dẫn đến tiêu chảy do mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột.  Chữa viêm đường tiêu hóa do virus rota. Các virus này xâm nhập vào các tế bào ở đỉnh nhung mao ruột, phá hủy nhung mao, làm mất khả năng hấp thu chất dinh dưỡng và chất điện giải.  Ngăn ngừa việc viêm nhiễm âm đạo. Nhiều nghiên cứu cho thấy khi uống hàng ngày 109-1010 vi khuẩn Lactobacillus rhamnosa GR-1 và Lactobacillus fermentum RC-14 sẽ tránh viêm nhiễm âm đạo,... 3 1.2. Các chủng vi sinh vật sử dụng trong chế phẩm men tiêu hóa và chế phẩm xử lý môi trường ao nuôi thủy hải sản. 1.2.1. Chi Lactobacillus 1.2.1.1. Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus là những trực khuẩn G (+), không tạo bào tử không có khả năng di động. Lactobacillus acidophilus có nhiều trong sữa chua, pho mát và các sản phẩm lên men lactic khác. Ở cơ thể người Lactobacillus acidophilus có nhiều ở ruột, âm đạo, miệng. 1.2.1.2. Lactobacillus sporogenes Lactobacillus sporogenes lần đầu tiên được phân lập và mô tả vào năm 1993 bởi các nhà khoa học Nga LM Horowitz-Wlassowa và NW Nowotelnow (Zentbl. F. Bakt., 1933) . L. sporogenes là một trong các vi sinh sản xuất ra acid lactic, acid hoá đường ruột và ngăn ngừa được sự phát triển của các vi khuẩn gây thối rữa, có khả năng sinh bào tử được ứng dụng trong sản xuất men tiêu hóa và các sản phẩm khác. 1.2.2. Chi Bacillus Hầu hết các vi khuẩn thuộc chi Bacillus là vi khuẩn dinh dưỡng hóa hữu cơ, thu năng lượng dự trữ từ quá trình acid hóa các hợp chất hữu cơ và chúng có thể phát triển với carbondioxide hoặc carbonmonoxide nhưng nguồn cacbon là năng lượng duy nhất. Về mặt dinh dưỡng B. subtilis thuộc loại nguyên dưỡng, trong khi các loài khác như B.cereus và B.sphaericus đòi hỏi về chất hữu cơ tối thiểu như amino acid hay vitamin dư thừa. Khi có mặt của không khí phần lớn các vi khuẩn Bacillus đều có thể phát triển và sinh bào tử. Phần lớn trong chúng có enzyme catalase. Các thành viên của nhóm Bacillus ít phát triển kị khí khi không có các chất nhận điện tử ngoại sinh. B. subtilis được xem là một vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn nhưng chúng có thể phát triển trong điều kiện không có oxygene và sản sinh acetoin, acetate, các acid và 2,3- butadiendiol từ pyrovate thông qua acetolactate. B. subtilis có thể phát sinh NAD+ từ sự biến đổi acetoin thành butanectiol, do đó nó có thể phát triển kị khí mạnh hơn và cạnh tranh với B.cereus và B.licheniformis 1.2.3. Nitrosomonas Nitrosomonas có dạng hình cầu hoặc hình bầu dục ngắn, kích thước từ 1-2 x 3 µm, G (-), có màng nhầy, không sinh bào tử, có tiêm mao dài nên có thể chuyển động được. Phát triển mạnh nhất ở pH= 7,0 - 8,6. Vi khuẩn này thuộc nhóm hóa tự dưỡng, chúng sử dụng năng lượng tạo ra để khử CO2 tạo ra các hợp chất hữu cơ. Trong quá trình nitrat hóa Nitrosomonas đóng vai trò oxy hóa amonium thành nitrit [3]. Nitrosomonas Nitrobacter NH3 NO2- NO3- 1.2.4. Nitrobacter Nitrobacter là vi khuẩn G (-), sống tự dưỡng bắt buộc không sinh bào tử, khuẩn lạc trong suốt, bé (khoảng 0.2 µm). Nitrobacter có hình que, hình lê hoặc đa hình, di động hoặc không di động. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 370C, pH=7.3 - 7.5, chết ở nhiệt độ lớn hơn 490C hoặc bé hơn 00C. Một số loài Nitrobacter: Nitrobacter winogradskyi, Nitrobacter hamburgensis, Nitrobacter vulgaris. 4 Nitrobacter đóng vai trò quan trọng trong chu trình nitơ bởi vì chúng oxy hóa nitrit, nitrat sử dụng năng lượng cho hoạt động sống thay vì phải sử dụng nguồn năng lượng cacbon [3,24]. 1.2.5. Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae thường được dùng trong công nghiệp cồn etylic, men bánh mì, sinh khối Protein và sản xuất rượu, bia. Chúng có cả hai hình thức sinh sản: vô tính và hữu Hình thái tế bào Saccharomyces cerevisiae có dạng hình ovan, đôi khi hình tròn (phụ thuộc điều kiện nuôi cấy). Kích thước trung bình 4-6 µm. Không bào thay đổi rõ rệt trong quá trình nuôi cấy. Kích thước không bào có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào. Trong tế bào trẻ các không bào hầu như không thấy, ở các tế bào già không bào đôi khi chiếm tới 80% [11,13]. CHƯƠNG II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Các chủng vi sinh vật - Vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (L. acidophillus, L. sporogenes,…) - Vi khuẩn chi Bacillus (B. megaterium, B. licheniformis, B. subtilis,… ) - Vi khuẩn phân giải nitơ (Nitrobacter sp., Nitrosomonas sp.) - Nấm men Saccharomyces cerevisiae. Các chủng giống sử dụng trong sản xuất chế phẩm được bảo quản dưới dạng đông khô. Chủng được lưu giữ tại phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh thuộc khoa Sinh học trường Đại học Đà Lạt. 2.1.2. Đối tượng thử nghiệm Các hồ nuôi Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) tại Công ty TNHH Anh Việt, xã Phước Thể, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận. 2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian từ tháng 3/2010 đến tháng 12/2011. - Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh – Khoa Sinh học Trường Đại học Đà Lạt. - Công ty TNHH Anh Việt, xã Phước Thể, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận. 2.3. Môi trường và hóa chất 2.3.1. Môi trường nuôi cấy và kiểm tra độ sống của sản phẩm Môi trường MRS lỏng, môi trường MRS đặc (phụ lục 1, 2), môi trường Hansen (phụ lục 3), Môi trường Vinogratxkii (Phụ lục 4). 2.3.2 Môi trường kiểm tra độ tạp nhiễm Môi trường MRS đặc, pH = 6,8-7,2 sau hấp (Phụ lục 2). Môi trường Hansen đặc, pH=6,2 sau hấp (phụ lục 3). Môi trường Sabouraud, pH = 5,6 sau hấp (Phụ lục 5). Môi trường tổng hợp pha sẵn TCBS (Merck, Đức): Kiểm tra vi khuẩn Vibrio. 2.3.3. Nước muối sinh lý 0,9% (Phụ lục 6) 2.3.4. Thuốc nhuộm Gram (Phụ lục 7) 2.4. Phương pháp nghiên cứu. 2.4.1. Phương pháp sản xuất chế phẩm men vi sinh và chế phẩm sinh hóa xử lý môi trường nước Mô tả quy trình: Phục hồi chủng: Khui riêng rẽ từng giống đông khô và cấy vào môi trừơng MRS lỏng, Hansen lỏng, Vinogratxkii lỏng, ủ ấm 37oC/4 – 6h đối với vi khuẩn, 290C đối với nấm men. 5 Chế phẩm Elacmen, Elacvit sử dụng các chủng: B.subtilis, L.acidophilus, L.sporogenes, S.cerevisiae Chế phẩm Biozeo sử dụng các chủng: B.subtilis, B.megaterium, B.licheniformis, Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp. Nhân giống: Nhân giống riêng từng chủng trên môi trường lỏng, ủ ấm 37o C đối với vi khuẩn, 290C đối với nấm men sau 48h. Kiểm tra độ thuần khiết của từng loại trước khi cấy. Cấy chủng: Cấy riêng từng chủng trên các Roux chứa môi trường đặc đã hấp vô trùng. Mỗi Roux cấy 5ml canh chủng giống. Ủ ấm 37oC đối với vi khuẩn Bacillus, Lactobacilus, 290C đối với nấm men, tiến hành lên men 48h. Gặt sinh khối: Dùng nước muối sinh lí để gặt sinh khối, ly tâm 4000 vòng/phút, thời gian 30 phút Làm khô sinh khối: Làm khô sinh khối trong tủ ấm ở 40oC, có quạt hút. Thu bột gốc: Xay bột gốc khi đã khô, kiểm tra độ sống của bột gốc theo phương pháp Koch. Trộn bán thành phẩm: Sử dụng tá chất phối trộn: chế phẩm Elacmen (sử dụng đường lactose, bột mì), chế phẩm Elacvit (sử dụng tá chất gồm đường lactose, bột mì và bổ sung thêm viatmin PP, B2, B6), Chế phẩm Biozeo (Zeolite, đường lactose), sau đó trộn với bột gốc tương ứng (sinh khối vi sinh vật). Chế phẩm sau khi trộn phải đảm bảo các thành phần được trộn đều, đúng nồng độ vi sinh vật theo tiêu chuẩn cơ sở (TCCS). Kiểm tra độ sống, độ thuần khiết của bán thành phẩm: Trước khi đưa ra đóng gói thì lô bán thành phẩm đó phải được lấy mẫu theo nguyên tắc trên, dưới, trái, phải để kiểm tra độ đồng đều, độ sống, độ thuần khiết. Nếu kết quả kiển tra đạt thì lô bán thành phẩm đó mới được đưa qua đóng gói. Đóng gói: Việc đóng gói được thực hiện trong phòng sạch, đảm bảo độ ẩm nhỏ hơn 60% và thực hiện ở nhiệt độ phòng. 2.4.2. Phương pháp phục hồi chủng và nhân giống cấp I 2.4.3. Phương pháp lên men - Sử dụng phương pháp lên men bề mặt trên môi trường đặc. - Dùng micropipette hút 4 ml giống cấp 1 bơm vào mỗi hộp Roux (có sẵn môi trường tương ứng cho các chủng sản xuất đã được hấp khử trùng), trải đều. Đem ủ ấm 37o C đối với vi khuẩn, 290C đối với nấm men trong 48-72 giờ. 2.4.4 Phương pháp phối chế sản phẩm 2.4.5. Phương pháp nhuộm Gram 2.4.6. Phương pháp định tính và định lượng mẫu sản phẩm 2.4.6.1. Định tính vi sinh vật trong sản phẩm 2.4.6.2. Định lượng vi sinh vật trong sản phẩm 2.4.7. Kiểm tra tạp nhiễm của sản phẩm 2.4.7.1. Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn 2.4.7.2. Kiểm tra tạp nhiễm vi nấm 2.4.8. Phương pháp kiểm tra độ ẩm sản phẩm 2.4.9. Phương pháp lấy mẫu chế phẩm và lấy mẫu nước ấu trùng tôm 6 2.4.10. Phương pháp bố trí thí nghiệm ao nuôi và thả tôm giống 2.4.10.1. Xử lý nước nuôi tôm giống bằng chế phẩm xử lý môi trường (Biozeo) 2.4.10.2. Nuôi tôm giống có bổ sung chế phẩm men vi sinh Dùng 3 bể thử nghiệm, dung tích mỗi bể bố trí thí nghiệm là ≥ 9m3, diện tích bề mặt 9m2, cao 1.2m. Lượng nước cấp vào cho mỗi bể là 7m3/bể. Mật độ bố trí của các bể 1 và bể 2 là 250 Nauplius/lít. Bể 1: Cho ăn chế phẩm Elacmen Bể 2: Cho ăn chế phẩm Biofish Bể 3: Bể đối chứng không sử dụng men vi sinh Mỗi ngày cho ăn một lần vào 6 giờ sáng Liều lượng sử dụng chế phẩm: Trong suốt quá trình nuôi từ giai đoạn Zoea 1 đến khi Post xuất cân chế phẩm sục vào nước 15-30 phút rồi trộn thức ăn vào, để yên 15 phút rồi cho tôm ăn. 2.4.11. Phương pháp đo pH 2.4.12. Phương pháp xác định nitrate, nitric (NO3 , NO2) 2.4.13. Phương pháp xác định amonium (NH4+) 2.4.14. Phương pháp kiểm tra vi khuẩn Vibrio haveyi 2.4.15. Phương pháp theo dõi sự sinh trưởng của tôm giống 2.4.16. Phương pháp xử lý số liệu - Sử dụng phần mềm Excel 2010 để xử lý kết quả. - Cách tính số lượng ấu trùng: Dùng một cốc thủy tinh có dung tích 1 lít đưa vào bể múc 5 điểm khác nhau trong bể nhằm đảm bảo độ chính xác mật độ phân bố của ấu trùng. Đếm hết số ấu trùng 5 lần đã múc, ta tính được trung bình số ấu trùng trong 1 lít. Tiếp theo đưa số liệu đã có vào công thức sau ta sẽ tính được tỉ lệ sống của ấu trùng còn lại trong bể. a: tỉ lệ sống của ấu trùng b: trung bình số ấu trùng đếm được trong 5 lần đếm c: số ấu trùng bố trí ban đầu. Nước đầu vào Xử lý thô Cấp vào trại (các bể nuôi) Thả Naupli Zoea 1-3 Mysis 1-3 Post1 – Post xuất Chăm sóc T.ăn + men vi sinh Chế phẩm xử lý môi trường Chăm sóc T.ăn + men vi sinh 7 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 3.1. Đặc điểm sinh học các chủng vi sinh vật sản xuất chế phẩm. Sau khi hoàn nguyên chủng giống trong môi trường canh thang dinh dưỡng và ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC (đối với các chủng vi khuẩn), trên môi trường Hansen lỏng ở nhiệt độ 29oC (đối với nấm Saccharomyses) trong 4 - 6 giờ tất cả các ống giống gây đục môi trường. Cấy ria trên các hộp petri chứa môi trường thạch MRS đối với các chủng (L. acidophillus, L. sporogenes,B. megaterium, B. licheniformis, B. subtilis ), môi trường Winogratskii cho các chủng (Nitrosomonas, Nitrobacter) ủ ở 370C, nuôi cấy nấm men trên môi trường thạch Hansen ở 29oC trong 18 - 24 giờ, tiến hành khảo sát đặc điểm khuẩn lạc, làm tiêu bản quan sát hình thái tế bào. Kết quả khảo sát đặc điểm của chủng giống được thể hiện qua bảng sau: Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng giống STT Chủng vi sinh vật Đặc điểm khuẩn lạc Hình thái tế bào 1 L. acidophillus Khuẩn lạc dạng R, sần sùi, nhầy, bờ riềm không đều và nhăn nheo, có màu trắng sữa, núm to và nhô cao. Trực khuẩn Gram dương, nối nhau thành chuỗi hoặc nằm riêng rẽ. Kích thước ngắn, tương đối đồng đều về hình thể, hai đầu hơi tròn. 2 L. sporogenes Khuẩn lạc dạng R, đường kính sau 24h nuôi cấy 4- 4,5 mm, hơi xám nâu, mướt, núm lồi ở giữa. Dạng trực khuẩn, xếp riêng rẽ, ít khi xếp thành chuỗi ngắn, Gram dương, hai đầu tù và hai đầu bắt màu đậm. 3 B. subtilis Khuẩn lạc dạng R, tròn, bờ riềm không đều, có màu vàng nhạt chuyển dần sang xám, xù xì, khô, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn và có núm lồi ở giữa Trực khuẩn Gram dương. Tế bào xếp thành từng đôi hay từng chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài, một số phân tán riêng lẻ hoặc tập trung thành đám. 4 B. megaterium Khuẩn lạc dạng R, hình tròn đều, hơi lượn sóng, nhẵn, thường có các vòng tròn đồng tâm trên bề mặt, có màu trắng sữa và chuyển sang màu kem, có khi màu nâu nhạt có ánh mờ, đục. Trực khuẩn G (+), hình que ngắn, các tế bào dạng đơn, đôi, hai đầu hơi tròn kích thước 2 x1,2 -5 x 1,5 µm. Tế bào còn non đứng riêng lẻ, tế bào già tròn và nhẵn hơn, đôi khi có hình thoi, tù hai đầu. 5 B. licheniformis Khuẩn lạc dạng R, tròn, to, ở giữa có núm lồi lên có màu vàng nhạt. Vi khuẩn Gram dương, hình que dài tương đối đồng đều ở hai đầu vuông tạo thành chuỗi từ 2 - 4 vi khuẩn, kích thước 2 x 0,5 – 5 x 1,5 µm. 6 Nitrobacter sp. Khuẩn lạc khô, hình tròn, có nhiều nếp nhăn màu trắng trên bề mặt. Hình que, Gram (-), sinh trưởng riêng rẽ, trong những cặp tế bào hoặc tạo thành những chuỗi ngắn. 7 Nitrosomonas sp. Khuẩn lạc khô, hình tròn, Dạng hình que ngắn hoặc hình 8 màu trắng, xuất hiện vòng tròn có màu trắng trên bề mặt khuẩn lạc, không có nếp nhăn. bầu dục, kích thước từ 1-2 x 3 µm, Gram âm, có màng nhầy, có tiêm mao dài. 8 S. cerevisiae Khuẩn lạc tròn, dạng giọt, đồng nhất, có màu trắng đục, bề mặt khuẩn lạc trơn bóng. Dạng hình ovan, đôi khi hình trứng, nảy chồi. Kích thước trung bình 4-6 µm. 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống (%) đến quá trình lên men - Các nhóm vi khuẩn có thể sinh trưởng và phát triển mạnh ở pH = 7, nấm men thích hợp ở giá trị pH = 6. - Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tăng trưởng của vi sinh vật. Qua khảo sát chúng tôi nhận thấy các nhóm vi khuẩn phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 35- 370C, nấm men tăng trưởng mạnh ở 290C. - Lượng giống bổ sung vào quá trình lên men khoảng 5% là thích hợp để thu sinh khối tế bào. 3.3. Khảo sát khả năng tăng trưởng của các chủng giống Qua quá trình khảo sát, hầu hết các giống sản xuất tăng trưởng mạnh trong thời gian từ 30 giờ đến 48 giờ. Sau thời gian 50 giờ pha suy tàn biểu hiện rõ rệt. Do vậy, chúng ta cần phải tiến hành thu sinh khối các giống với các khoảng thời gian cụ thể như sau: • L. acidophilus từ 30 giờ đến 36giờ • L. sporogenes từ 36 giờ đến 42 giờ • B. subtilis và B. megaterium từ 30 giờ đến 36 giờ • B. licheniformis từ 42 giờ đến 48 giờ • Nitrosomonas và Nitrobacter từ 30 giờ đến 36giờ • Sacharomyces cerevisiae từ 30 giờ đến 36giờ 3.6. Quy trình sản xuất chế phẩm Sau khi đã kiểm tra một số đặc tính của chủng giống. Chúng tôi tiến hành cấy chuyền, nhân giống sản xuất và tiến hành lên men thu sinh khối hai sản phẩm men tiêu hóa (Elacmen), chế phẩm xử lý môi trường ao nuôi thủy sản (Biozeo), với các thông số lên men cụ thể như sau: - Môi trường lên men: Sử dụng môi trường MRS cho các chủng thuộc chi (Lactobacillus, Bacillus), môi trường Vinogratxkii đối với các chủng nitrate hóa, Môi trường Hansen cho nấm men. - pH môi trường: vi khuẩn (pH = 7.0), nấm men (pH = 6.0) - Nhiệt độ lên men: vi khuẩn (t0C = 370C), nấm men (t0C = 290C), - Thời gian lên men: • L. acidophilus: 36giờ • L. sporogenes: 42 giờ • B. subtilis và B. megaterium: 36 giờ • B. licheniformis: 48 giờ • Nitrosomonas và Nitrobacter: 36giờ • Sacharomyces cerevisiae: 36giờ. 9 3.6.1. Quy trình sản xuất chế phẩm men vi sinh Elacmen, Elacvit M. trường lỏng, t0, thời gian Phối trộn Tá chất + 4 chủng VSV Vitamin PP, B2, B6 Bán thành phẩm Chủng đông khô Phục hồi M.trường lỏng, t0, thời gian Cấy phân vùng Nhân giống cấp 1 M. trường rắn, t0, thời gian Lên men chính Gặt thu sinh khối tế bào Cố định tế bào Bột gốc Ly tâm M. trường rắn, t0, thời gian Chất mang Xay mịn Kiểm nghiệm Thành phẩm Elacmen, Elacvit Kiểm nghiệm cuối Bao bì, nhãn mác, đóng gói 10 3.6.2. Quy trình sản xuất chế phẩm xử lý môi trường Biozeo Phối trộn Tá chất + 5 chủng VSV Biozeo Bán thành phẩm Chủng đông khô Phục hồi M.trường lỏng, t0, thời gian Cấy phân vùng Nhân giống cấp 1 M. trường rắn, t0, thời gian Lên men chính Gặt thu sinh khối tế bào Cố định tế bào Bột gốc Ly tâm M. trường rắn, t0, thời gian Chất mang Xay mịn Kiểm nghiệm Thành phẩm Biozeo Kiểm nghiệm cuối Bao bì, nhãn mác, đóng gói 11 3.7. Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm Elacmen, Elacvit, Biozeo Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra chất lượng chế phẩm men vi sinh Elacmen Sản phẩm kiểm tra Lô sản xuất Tiêu chuẩn cơ sở Tên chế phẩm Thành phần 070710 080710 090810 Elacmen B.subtilis 5.108 5.108 4.108 ≥ 106 CFU/g L.acidophilus 5.10 8 6.108 3.108 L.sporogenes 4.109 5.109 5.109 S.cerevisiae 5.107 6.107 8.107 Tạp nhiễm vi sinh vật Âm tính Âm tính Âm tính Không có vi sinh vật tạp nhiễm Độ ẩm 3 4,5 4 Độ ẩm ≤ 6% Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra chất lượng chế phẩm men vi sinh Elacvit Kiểm tra Lô sản xuất Tiêu chuẩn cơ sở 070810 120910 091010 CFU/g B.subtilis 5.108 4.108 4.108 ≥ 106 CFU/g L.acidophilus 5.108 6.108 4.108 L.sporogenes 5.109 4.109 5.109 S.cerevisiae 6.106 6.106 7.106 mg/g Vitamine B2 1,4 1,2 1,5 1,0-1,5 mg/g Vitamine B6 1,3 1,0 1,2 1,0-1,5 mg/g Vitamine PP 5,0 4,8 4,6 4,5-5,0 mg/g Tạp nhiễm ( ≥ 10-3) Âm tính Âm tính Âm tính Không có vi s inh tạp nhiễm Độ ẩm (%) 5 4 4 Độ ẩm ≤ 6% Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra chất lượng chế phẩm Biozeo. Sản phẩm kiểm tra Lô sản xuất Tiêu chuẩn cơ sở Tên chế phẩm Thành phần 050610 060610 070810 Biozeo B.subtilis 4.106 6.106 7.106 ≥ 106 CFU/g B.megaterium 9.106 8.106 6.106 B.licheniformis 3.106 2.106 5.106 Nitrosomonas sp. 4.106 2.106 3.106 Nitrobacter sp. 3.106 5.106 3.106 Tạp nhiễm vi sinh vật Âm tính Âm tính Âm tính Không có vi sinh tạp nhiễm Độ ẩm (%) 4 5 4 Độ ẩm ≤ 6% Nhận xét: Kết quả kiểm tra độ sống ở 3 lô sản xuất: 070710; 080710; 090810 của chế phẩm Elacmen như sau: Độ sống trung bình của B. subtilis qua 3 lần kiểm tra là 4.67108 CFU/g, L. acidophilus 4.6 x 108 CFU/g, L. sporogenes 4.67108 CFU/g, S. cerevisiae 6.3107 CFU/g. 12 Biểu đồ 2. Kết quả khảo sát giá trị NO2- theo thời gian xử lýbằngchế phẩmBiozeo. Từ kết quả định lượng vi sinh vật sống cho thấy chế phẩm Elacvit có kết quả cao hơn theo tiêu chuẩn cơ sở, cụ thể: - L.sporogenes là cao nhất 4.109-5.109 CFU/g. - B.subtilis và L.acidophilus trung bình đạt từ 4.108- 6.108 CFU/g. - S.cerevisiae là thấp nhất nhưng nằm trong khoảng yêu cầu của chế phẩm trung bình đạt từ 6.106 - 7.106 CFU/g. Thành phần vitamine B2, B6, PP và các tiêu chuẩn khác đều nằm trong ngưỡng tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) của nhà sản xuất. Trong chế phẩm Biozeo độ sống của các chủng vi sinh lô 050610; 060610; 070810 đều đạt ngưỡng trên so với tiêu chuẩn cơ sở (≥106 CFU/g). Tất cả các lô sản xuất đều không bị tạp nhiễm vi sinh vật lạ (âm tính), độ ẩm luôn dưới ngưỡng cho phép. Qua kết quả kiểm tra cho thấy tất cả các chỉ tiêu kiểm tra đều đạt tiêu chuẩn cơ sở. Điều này chứng tỏ các công đoạn sản xuất chế phẩm phù hợp và ít tác động đến độ sống của các vi sinh vật trong chế phẩm. Hạn sử dụng sản phẩm: 24 tháng kể từ ngày sản xuất Bảo quản sản phẩm nơi khô ráo, tránh ánh sáng trực tiếp. 3.8. Kết quả thử nghiệm chế phẩm trên thực địa 3.8.1. Kết quả xử lý môi trường nước nuôi tôm thẻ chân trắng Biểu đồ 3. Kết quả khảo sát giá trị NO3- theo thời gian xử lý bằng chế phẩm Biozeo. Biểu đồ 1. Kết quả khảo sát giá trị NH4+ theo thời gian xử lý bằng chế phẩm Biozeo. 13 Nước sau khi xử lý bằng chế phẩm đã đạt các chỉ tiêu về sinh hóa để đưa vào nuôi tôm, trong quá trình nuôi vẫn tiếp tục xử lý để các chỉ tiêu sinh hóa luôn giữ trong khoảng tốt nhất cho sự phát triển của ấu trùng tôm (theo tiêu chuẩn chất lượng nước nuôi thủy sản - TCVN 5943-1995) 3.8.2. Kết quả kiểm tra vi khuẩn Vibrio. Bảng 3.11. Kết quả kiểm tra Vibrio harveyitheo thời gian xử lý chế phẩm BIOZEO. Kết luận: Sau khi xử lý chế phẩm BIOZEO từ 24 – 96 giờ lượng vi khuẩn Vibrio giảm mạnh. Có thể nói việc bổ sung các chủng vi sinh vật trong chế phẩm đã làm ức chế đượcmột số vi sinh vật gây bệnh, nhất là Vibrio harveyi. Như vậy Biozeo là một trong những tác nhân làm giảm các nguy cơ gây phát sinh bệnh do vi khuẩn Vibrio. 3.8.3. Ảnh hưởng của chế phẩm Elacmen đến sự phát triển và vấn đề phòng bệnh ở tôm thẻ chân trắng Bảng 3.12. Dấu hiệu bệnh lý và khả năng phòng bệnh trong chu kì nuôi Giai đoạn Sử dụng chế phẩm Elacmen Sử dụng chế phẩm Biofish Không sử dụng chế phẩm Bể 1 Bể 2 Bể 3 Đường ruột Bám bẩn Bệnh Pr Đường ruột Bám bẩn Bệnh Pr Đường ruột Bám bẩn Bệnh Pr N - - - - - - Z1 Khá - - Khá - - Khá - - Z2 Khá + + Khá - - Bt + + Z3 Bt - + Bt - - Bt + + M1 Bt - - Bt - - Bt + + M2 Bt - - Bt - - Bt + + M3 Bt - - Bt - - Bt - + P1 Bt - - Bt - - Bt - + P2 Bt - - Bt - - Bt - - P12 Bt - - Bt - - Bt - - Ghi chú: - : Âm tính , +: Dương tính, Bt: Bình thường, Pr: Bệnh Protozoae; Z (giai đoạn Zoae); N (Nauplli); M (Mysis); P (Postlarvae); Bt: bình thường. Ao Khuẩn lạc xanh CFU/ml Khuẩn lạc vàng CFU/ml Trước xử lý Sau xử lý Trước xử lý Sau xử lý Ao 1 140 60 290 20 Ao 2 110 50 60 40 14 Dùng chế phẩm Elacmen để đối chứng với việc xử dụng các loại men vi sinh khác, nhận thấy ấu trùng tôm thẻ chân trắng từ giai đoạn Zoae1- Postlarvae12 sinh trưởng tốt ở tất cả các bể. Điều đó được phản ánh qua hệ đường ruột, khả năng tiêu hóa thức ăn, kháng bệnh, lột xác và gia tăng khích thước của tôm. Riêng bể sử dụng chế phẩm Elacmen ở các giai đoạn Zoae1- Postlarvae12 đường ruột của ấu trùng sau khi sử dụng chế phẩm là khá tốt: đường ruột không bị đứt quãng, to đồng đều, nhu động ruột tốt, chứa nhiều thức ăn, đường phân vàng đều, dài chứng tỏ ấu trùng ăn và tiêu thụ hiệu quả thức ăn. Hiện tượng ấu trùng tôm bám bẩn và mắc bệnh protozoa ở giai đoạn Zoea là do chất lượng tảo cung cấp vào bể chưa tốt, lượng thức ăn cung cấp vào bể dư làm hàm lượng chất hữu cơ tăng là tiền đề cho protozoa phát triển. Mức độ bám bẩn của ấu trùng tôm xuất hiện ở giai đoạn Z2 và Z3 , tuy nhiên khi sử dụng chế phẩm Elacmen và xử lý Formaline 25 - 30 ppm trong các bể giảm bớt và dần hết, chỉ có bể 4 không sử dụng chế phẩm thì dấu hiệu bệnh không giảm. Trong quá trình nuôi ấu trùng tôm bị bệnh Protozoa đây là một trong số bệnh khiến tôm bị chết nhiều nếu sức đề kháng không tốt. Ở giai đoạn Z2 và Z3, bệnh này xuất hiện ở bể sử dụng chế phẩm Elacmen và các bể đối chứng khác. Bệnh đã giảm và hết sau đó, nhưng ở bể 3 (đối chứng không sử dụng chế phẩm) bệnh này vẫn tiếp tục đến giai đoạn Post1 và đây cũng là nguyên nhân khiến bể 3 đạt năng suất nuôi thấp nhất. 0 50 100 150 N Z M P Tỉ lệ s ốn g( % ) giai đoạn sử dụng chế phẩm đối chứng 1 đối chứng 2 ĐC3 không sử dụng Biểu đồ 4. Biểu đồ so sánh tỉ lệ sống ở các bể giống theo từng giai đoạn Nhận xét: Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm có sự khác nhau ở các giai đoạn và ở các bể nuôi. Bể sử dụng chế phẩm men tiêu hóa Elacmen và bể đối chứng sử dụng chế phẩm men tiêu hóa Biofish đều cho tỷ lệ sống ở giai đoạn post xuất là khá cao (lớn hơn 50%). Riêng bể đối chứng 3 không sử dụng chế phẩm cho năng suất thấp nhất (35%). Kết quả trên cho thấy việc sử dụng chế phẩm men vi sinh có ảnh hưởng lớn tới năng suất nuôi tôm. 15 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận. 1. Xây dựng quy trình sản xuất cho các chế phẩm là men vi sinh Elacmen, Elacvit sử dụng các chủng giống: B.subtilis, L.acidophilus, L.sporogenes, S.cerevisiae và chế phẩm sinh hóa xử lý môi trường nuôi tôm (Biozeo) sử dụng các chủng: B.subtilis, B.megaterium, B.licheniformis, Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp. 2. Thiết lập được các thông số thích hợp cho quá trình lên men: - Yếu tố pH: Đối với vi khuẩn thích hợp là 7.0, nấm men là 6.0 - Yếu tố nhiệt độ: Đối với vi khuẩn là 370C, Nấm men là 290C - Tỷ lệ giống bổ sung cho quá trình lên men thu sinh khối: 5% - Thời gian lên men thu sinh khối: đối với các chủng L. acidophilus, B. subtilis, B. megaterium, Nitrosomonas, Nitrobacter, Sacharomyces cerevisiae khoảng 30 -36 giờ, L. sporogenes từ 36-42 giờ, B. licheniformis từ 42 đến 48 giờ 3. Triển khai sản xuất và kiểm tra tiêu chuẩn chất lượng 03 chế phẩm (Elacmen, Elacvit, Biozeo) gồm 9 lô sản phẩm, tất cả các lô sản xuất trên đều đạt tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) với số lượng tế bào sống >106 CFU/g. 4. Sử dụng chế phẩm sinh hóa Biozeo có chứa 5 chủng vi sinh vật và tá chất Zeolite để bổ sung vào ao nuôi đã có tác dụng làm giảm các tác nhân gây ô nhiễm môi trường ao nuôi như giảm NH3+, NO2-, NO3-, vi khuẩn phát sáng. Đồng thời đã làm tăng khả năng cạnh tranh sinh học giúp môi trường ao nuôi bền vững và hiệu quả hơn. 5. Sản phẩm men vi sinh Elacmen khi đưa vào sử dụng cho các ao nuôi tôm tại công ty TNHH Anh Việt đã cho kết quả: Giai đoạn tôm post xuất đạt tỉ lệ sống > 50% ở mức trung bình so với các bể sử dụng các chế phẩm khác và cao hơn so với bể không sử dụng chế phẩm (35%). Tỉ lệ sống này được đánh giá ở mức độ khá trong mục tiêu nuôi tôm giống của Cty TNHH Anh Việt, xã Phước thể, huyện Tuy Phong, Bình Thuận. 4.2. Kiến nghị. 1. Tiếp tục nghiên cứu và cải tiến quy trình để nâng cao chất lượng sản phẩm và sản xuất ở quy mô lớn. 2. Cần đánh giá chất lượng, hiệu quả của sản phẩm trên các đối tượng thủy sản khác và trên quy mô rộng hơn.