Đánh giá chất lượng ký thuật vi thể trên tiêu bản nhuộm hema toxylin - Eosin ở một số cơ sở giải phẫu bệnh trên địa bàn Hà Nội

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Đại cương về xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể: 3 1.2. Vai trò của kỹ thuật trong chẩn đoán tế bào học 3 1.3. Tổng Quan về Hematoxylin – Eosin. 5 1.4. Kỹ thuật cố định, pha, vùi bệnh phẩm, đúc bloc, cắt và dán mảnh, nhuộm tiêu bản H&E: 7 1.4.1. Kỹ thuật cố định 7 1.4.2. Pha 8 1.4.3. Vùi bệnh phẩm 9 1.4.4. Quy trình chuyển tay: 10 1.4.5. Quy trình chuyển máy: 11 1.5. Đúc bloc 12 1.6. Kỹ thuật cắt và dán mảnh 12 1.7. Phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (H&E) 13 1.7.1. Thuốc nhuộm: 13 1.7.2. Nguyên tắc: 14 1.7.3. Phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (Hematoxylin Instant). 14 1.7.4. Kết quả: 15 Ch­¬ng 2: ®èi t­îng vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.1. Mẫu xét nghiệm: tiêu bản nhuộm H - E 16 2.2. Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1.Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang có phân tích kết hợp hồi cứu. 16 2.2.2. Nơi thực hiện đề tài 16 2.2.3. Phương tiện nghiên cứu: 17 2.2.4. Quy trình nghiên cứu 17 2.2.5. Nhận định kết quả 17 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18 3.1 Bảng kết quả 18 3.2 Đánh giá kết quảvà một số hình ảnh minh họa 19 3.2.1 Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện Lao phổi Trung Ương: 19 3.2.2 Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện K2 21 3.2.3 Labo Giải phẫu bệnh Trường Đại Học Y Hà Nội: 23 3.2.4 Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện 108: 25 Ch­¬ng 4: Bµn luËn 28 4.1. Sự liên quan mật thiết trong một chuỗi kỹ thuật liên hoàn từ việc lấy bệnh phẩm, pha bệnh phẩm, cố định, chuyển, đúc đến cắt mảnh và nhuộm HE để ra một tiêu bản mô bệnh học 28 4.1.1. Lấy bệnh phẩm 28 4.1.2. Cố định bênh phẩm: 29 4.1.3. Chuyển và đúc bệnh phẩm: 29 4.1.4. Cắt mảnh và dán bệnh phẩm: 30 4.1.5. Nhuộm tiêu bản 31 4.2. Một số yếu tố chính của Kỹ thuật vi thể liên quan ảnh hưởng đến tiêu bản nhuộm Hematoxylin và Eosin 31 KÕt luËn 34

doc41 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 03/06/2013 | Lượt xem: 5295 | Lượt tải: 6download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Đánh giá chất lượng ký thuật vi thể trên tiêu bản nhuộm hema toxylin - Eosin ở một số cơ sở giải phẫu bệnh trên địa bàn Hà Nội, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ĐẶT VẤN ĐỀ Cho tới nay chẩn đoán mô bệnh học vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc xác định bệnh. Trong khoảng hai thập niên trở lại đây, với sự phát triển nhanh của khoa học công nghệ trong lĩnh vực thăm dò chẩn đoán như nội soi, siêu âm, chụp cắt lớp vi tính, chụp cộng hưởng từ, nuôi cấy tế bào, bảo quản và ghép mô…đã tạo điều kiện cho sinh thiết chẩn đoán mô bệnh học phát triển cả về số lượng lẫn quy mô. Trong đó, bộ ba chẩn đoán gồm siêu âm – nội soi – sinh thiết đã trở thành mũi nhọn quan trọng. Sự phát triển này đã ngày càng khẳng định vị thế của lĩnh vực chẩn đoán mô bệnh học, góp phần chẩn đoán sớm nhiều tổn thương và nó rất hữu ích cho chẩn đoán và điều trị cũng như phòng bệnh. Một xét nghiệm mô bệnh học thường được tiến hành theo một chuỗi kỹ thuật liên hoàn bao gồm: 1).Lấy bệnh phẩm, cắt lọc; 2).Cố định bệnh phẩm; 3).Gửi xét nghiệm; 4).Vùi bệnh phẩm; 5).Cắt mảnh và dán; 6).Nhuộm; 7).Đọc kết quả. Mỗi khâu đều có những yêu cầu riêng và liên quan rất mật thiết với nhau, ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả chẩn đoán mô bệnh học. Trong các khâu kể trên thì khâu đầu và cuối được thực hiện bởi các bác sĩ chuyên khoa, các khâu còn lại đều được thực hiện bởi các kỹ thuật viên giải phẫu bệnh làm việc trong labo. Tùy theo mục đích và yêu cầu của xét nghiệm mà việc xử lý kỹ thuật ở từng khâu có những điểm khác nhau và có những quy trình riêng. Kỹ thuật nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE) là kỹ thuật phổ biến nhất trong các kỹ thuật mô học cũng như mô bệnh học, vì hầu hết các chẩn đoán mô bệnh học đều chỉ cần và (hoặc) phải dựa vào kỹ thuật này. Vì vậy nó được gọi là kỹ thuật thường quy cho mọi loại xét nghiệm mô bệnh học trong labo giải phẫu bệnh. Hiện nay, xét nghiệm mô bệnh học ở các cơ sở y tế trung ương trung bình có tới gần 50% trường hợp sai sót các loại trong các khâu kỹ thuật và làm giảm chất lượng chẩn đoán, trong đó khoảng 10% xét nghiệm âm tính hoặc chẩn đoán sai vì lý do kỹ thuật (3). Xuất phát từ tính thực tiễn của kỹ thuật nhuộm HE nhằm đảm bảo chất lượng trong chẩn đoán mô bệnh học, là một sinh viên sắp tốt nghiệp, một Cử nhân Kỹ thuật Y học tương lai nên qua bài khóa luận này em mong muốn rằng: Thực hiện thành thạo một chuỗi kỹ thuật liên hoàn từ bệnh phẩm ra những tiêu bản nhuộm H - E. Bước đầu đánh giá chất lượng vi thể và một số yếu tố ảnh hưởng đến tiêu bản nhuộm H - E. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể: Là một bộ phận quan trọng của khoa học tổn thương, xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể có mục đích phát hiện và nghiên cứu những tính chất, đặc điểm của tổn thương thuộc phạm vi tổ chức và tế bào. Ở một chừng mực nhất định, nó cho phép tìm hiểu những nguyên nhân gây ra những tổn thương ấy, góp phần giải thích cơ chế sinh bệnh cũng như những quy luật phát sinh và phát triển của tổn thương. Trong bệnh học, đây là một loại xét nghiệm có tính chính xác cao và độ tin cậy khá lớn nếu như kỹ thuật tiến hành đúng quy tắc và người đọc có những kinh nghiệm nhất định. Đã từ lâu, xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể đã trở thành người trợ thủ đắc lực cho nhà lâm sàng học và càng không thể thiếu được đối với nhà nghiên cứu y học. Trên thực tế, đối tượng xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể rất phong phú, phạm vi áp dụng ngày càng được mở rộng, ở các nước cũng như ở Việt Nam, đặc biệt trong lĩnh vực phát hiện bệnh. Ngày nay, hầu như mọi chuyên khoa lâm sàng và phần lớn những chuyên khoa cận lâm sàng đều có sử dụng những kết quả xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể vào công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học hoặc phục vụ bệnh nhân. 1.2. Tổng Quan về Hematoxylin – Eosin. Hematoxylin: là một phẩm nhuộm tự nhiên, chiết xuất bằng ete từ lõi cây Haematoxylon campechianum mọc trong vùng nhiệt đới Campeche ở Mexico. Bản thân Hematoxylin không có đặc tính nhuộm, mà nó phải trải qua quá trình oxy hóa để biến thành Hematein mới nhuộm được: đó là hiện tượng “Hematoxylin đã chín”. Sự oxy hóa này xảy ra do để dung dịch nhuộm từ 6 ngày đến 3 tuần để mở dưới ánh sáng mặt trời hoặc bằng các tác nhân gây oxy hóa như: iodat sodium, permanganat, potassium, oxytmereua. Trong quá trình chín Hematoxylin (C16H14O6) mất 2 nguyên tử H để trở thành Hematein (C16H12O6) có sự sắp xếp kiểu quinoit trong vòng dưới đây: H×nh 1.C«ng thøc cña Hematoxylin H×nh 2.C«ng thøc cña Hematin Sự oxy hóa liên tục của Hematein sẽ có hình thành một hợp chất không màu, chính vì vậy mà một số người cho rằng quá trình oxy hóa chậm một cách tự nhiên tốt hơn là sự oxy hóa bằng chất hóa học. Phản ứng do chất hóa học sẽ gây nên sự oxy hóa Hematein tức khắc và quá trình oxy hóa cứ tiếp tục nên hình thành một hợp chất không màu, làm cho dung dịch nhuộm không lâu bền. Hematein bản thân ít ưa các tổ chức, vì vậy nên phải dùng một chất gắn màu thường là aluminium dưới thể alun (alun ammoniac, potassium hay sắt): chất sơn được hình thành có tích điện dương mạnh và như vậy giống như những phẩm nhuộm bazơ mạnh nên cố định trên các acid nucleic, đặc biệt acid nucleic của nhân. Các sự khác nhau về đặc tính nhuộm phụ thuộc vào cách pha chế dung dịch Hematoxylin và thành phần gắn màu. Bảng dưới đây nêu lên ái tính của Hematoxylin tùy theo chất gắn màu: Thành phần Chất gắn màu (Kim loại) Nhân Vỏ myelin Sợi chun Dây keo Sợi thần kinh đệm, sợi biểu mô Trục thần kinh Mucin Tơ huyết Mitochondri Aluminium, sắt, tungsten Chromium, đồng, sắt Sắt, Iốt Molybden Tungsten Chì Aluminium Tungsten Sắt Eosin: Thuốc nhuộm hay dùng để nhuộm bào tương là Eosin. Nó có đặc tính dễ tan trong nước và có màu huỳnh quang vàng - xanh lá cây nhạt. [2], [3] Hình 3. Công thức của Eosin Với nguồn gốc và đặc tính đặc biệt như vậy nên kỹ thuật nhuộm Hematoxylin được tiến hành như sau: 1.3. Kỹ thuật cố định, pha, vùi bệnh phẩm, đúc bloc, cắt và dán mảnh, nhuộm tiêu bản H&E: 1.3.1. Kỹ thuật cố định Cố định là làm bất động những cấu trúc của tổ chức cũng như của tế bào nhưng vẫn tồn tại tới mức tối đa hình thái của chúng. Nói khác đi, cố định một tổ chức là giết chết những thành phần của tổ chức đó nhưng vẫn bảo quản chúng trong một tình trạng gần với lúc sống nhất. Trừ một số trường hợp cần nhuộm tươi hay cần nghiên cứu về men, nuôi cấy tế bào thì nói chung, mọi bệnh phẩm cần cố định ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể. Nếu như ta cố định bệnh phẩm không tốt thì sẽ làm giảm chất lượng xét nghiệm còn cố định hỏng thì không thể sửa chữa được. Bệnh phẩm sau khi lấy ra khỏi cơ thể sẽ gây ra thoái hóa, hoại tử giả tạo khi nhận định, các tế bào sẽ bị tiêu hủy bởi men nội bào, hình thái của chúng trở nên méo mó và sẽ sinh ra những hình ảnh giả tạo gây nhầm lẫn trong chuẩn đoán. Mặt khác, việc cố định chậm sẽ gây tiêu hủy các bào quan, không có lợi cho các nghiên cứu về men học đồng thời cũng không đảm bảo cho việc gắn màu tốt khi nhuộm. Một bệnh phẩm được cố định tốt phải đảm bảo những nguyên tắc sau: Mọi bệnh phẩm phải được cố định ngay sau khi lấy. Không được làm dập nát bệnh phẩm. Bệnh phẩm không cắt quá dày. Đủ lượng dung dịch cố định cần thiết. Thời gian cố định dung dịch thích hợp. Không để bệnh phẩm dính vào thành lọ. Chú ý những trường hợp cố định đặc biệt: Glycogen: cố định bằng dung dịch Grendre. Mỡ: cố định bằng dung dịch formol 10%, cắt lạnh và nhuộm Soudan. Một số dung dịch cố định thông dụng: Dung dịch formol đệm trung tính 10%: Formaldehyde 37% - 40% 100ml Nước cất 900ml Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) 4g Sodium phosphate dibasic anhydrous (NaH2PO4 khan) 6.5g Dung dịch formol 10%: Formandehyde 37% - 40% 100ml Nước cất hai lần 900ml Dung dịch cố định Bouin: Dung dịch nước bão hòa acid picic 75ml Formaldehyde 37% - 40% 20ml Acid acetic lạnh, nguyên chất 5ml Dung dịch Grende: Cồn 95% bão hòa acid picric 80ml Formandehyde 37% - 40% 15ml Acid acetic lạnh, nguyên chất 5ml 1.3.2. Pha Không được làm giập nát bệnh phẩm: khi pha không được dùng kẹp có mấu, lưỡi dao pha phải sắc, mỏng và dài, cắt một chiều không được ray đi ray lại trên một vị trí của bệnh phẩm và bệnh phẩm khi pha phải được đặt trên một miếng lie, gỗ hoặc plastic. Các mẫu bệnh phẩm dùng trong kỹ thuật mô học thường được cắt dày từ 3 - 5 mm. Với bệnh phẩm mềm (não,…) có thể cố định vài giờ cho cứng sau đó mới pha lại. Trong trường hợp chuyển đúc bằng máy, bệnh phẩm không được cắt dày hơn chiều cao của lòng khuôn nhựa. 1.3.3. Vùi bệnh phẩm Cấu trúc tế bào hoặc mô chỉ nhìn thấy được dưới kính hiển vi khi chúng được cắt thành những lát mỏng cỡ micromet để cho ánh sáng đi qua. Khi đó ta mới quan sát được chi tiết của tế bào, hình dạng hay cách sắp xếp của chúng. Cố định mới chỉ giết chết tế bào và giữ cho các thành phần của chúng được bất động ở trạng thái tĩnh. Nếu đem cắt ngay thành các lát cắt mỏng, mối liên quan giữa các tế bào cũng như cấu trúc mô bị biến đổi, thậm chí bị đảo lộn do tác động cơ học. Muốn vậy người ta phải tạo khuôn cho bệnh phẩm, nghĩa là phải làm cho một chất nào đó ngấm sâu vào tế bào hoặc mô mà khi cắt không làm biến dạng cấu trúc của chúng. Có nhiều chất được dùng cho phương pháp này nhưng chất hay được dùng hơn cả là parafin. Hiện có nhiều loại parafin với các điểm nóng chảy khác nhau nhưng loại thích hợp nhất dùng trong kỹ thuật mô học là parafin có nhiệt độ nóng chảy từ 56 - 58oC. Nếu dùng nhiệt độ nóng chảy của parafin cao hơn bắt buộc người ta phải chỉnh nhiệt độ của tủ parafin lên nữa, hậu quả làm cho bệnh phẩm chín, khó cắt và bắt mầu tồi. Ngoài ra, parafin còn được pha thêm một số chất phụ gia để làm tăng chất lượng của nó như: histoplas, paraplas… Song parafin không tan trong nước (bệnh phẩm lại có nhiều nước) và cồn nên bệnh phẩm phải được khử nước bằng cồn có nồng độ thấp (80o) đến cao (cồn tuyệt đối) rồi khử cồn bằng xylen. Tuy nhiên, với những máy chuyển bệnh phẩm vừa lắc, vừa ly tâm thì việc loại hết nước, cồn và xylen trong bệnh phẩm thường đạt kết quả tốt khi bệnh phẩm được chuyển qua từ 2 - 3 lần parafin. Việc tẩm parafin cho bệnh phẩm còn được đặt trong các bình hút chân không (có trong máy chuyển) càng làm cho parafin ngấm vào bệnh phẩm nhanh và tốt hơn. Do các cơ sở giải phẫu bệnh chưa có đủ máy chuyển nên chúng tôi giới thiệu cả hai quy trình vùi bệnh phẩm bằng tay và bằng máy chuyển: 1.3.4. Quy trình chuyển tay: Áp dụng cho các bệnh phẩm có chiều dày dưới 2 mm Cồn 90o - 15 phút Cồn 95o - 15 phút Cồn 100o I - 15 phút Cồn 100o II - 15 phút Cồn 100o III - 15 phút Xylen I - 15 phút Xylen II - 30 phút Xylen III - 30 phút Parafin I - 30 phút Parafin II - 1 giờ Parafin III - 1 giờ Áp dụng cho bệnh phẩm có chiều dày từ 5 mm đến dưới 8 mm Cồn 80o - 2 giờ Cồn 90o - 6 giờ Cồn 95o - 8 giờ Cồn 100o I - 4 giờ Cồn 100o II - 6 giờ Cồn 100o III - 8 giờ Xylen I - 4 giờ Xylen II - 8 giờ Xylen III - 10 giờ Parafin I - 4 giờ Parafin II - 6 giờ Parafin III - 10 giờ 1.3.5. Quy trình chuyển máy: Áp dụng cho các mảnh sinh thiết và các mảnh mô nhỏ Thời gian cố định tối thiểu là 3 giờ. Rửa nhẹ trong nước chảy. Cồn 80o - 10 phút. Cồn 95o x 3 lần x 15 - 20 phút Cồn 100o x 3 lần x 15 phút/ lần Cồn 100o/ xylen tỉ lệ 1:1 - 15 phút Xylen x 2 lần x 15 phút/ lần Parafin x 3 lần x 15 lần/ phút Parafin hút chân không từ 15 - 20 phút. Nếu không có hút chân không thì ở (7) tăng thêm mỗi lần 5 phút. Đúc bloc Áp dụng cho các mô thông thường Cồn 80o - 1 giờ Cồn 95o x 3 lần x 1 giờ/ lần Cồn 100o x 3 lần x 1 giờ/ lần Xylen x 3 lần x 1 giờ/ lần Parafin x 3 lần x 1 giờ/ lần Parafin hút chân không 1 giờ Đúc bloc 1.3.6. Đúc bloc Bệnh phẩm sau khi qua quá trình đúc bloc đạt yêu cầu thì có thể giữ vô thời hạn. Muốn đúc bloc phải làm cho parafin ở xung quanh cũng như ở bên trong bệnh phẩm đặc lại một cách thuần nhất. Để đạt được điều này, người ta dùng những khuôn bằng kim loại để trao đổi nhiệt diễn ra nhanh chóng và nước lạnh có đá. Đúc bệnh phẩm phải thao tác sao cho nhiệt độ của parafin và bệnh phẩm không chênh lệch nhiều. Nếu parafin hay bệnh phẩm nguội quá sẽ tạo ra một viền trắng xung quanh bệnh phẩm, khi bloc nguội hay cắt bệnh phẩm có thể bật bloc. Trên thực tế người ta đổ vào khuôn hay thanh chắn kim loại parafin lỏng đã lọc từ trước, nhúng ngay bệnh phẩm vào parafin đang lỏng này. Dùng kẹp hơ nóng để định hướng bệnh phẩm theo ý muốn (rất cần phải lưu ý khâu này, nếu đặt bệnh phẩm không đúng mặt thì sẽ không chuẩn đoán được). Người ta chọn mặt phẳng cắt là mặt đáy. Với các bệnh phẩm quá nhỏ, có thể dùng kính lúp để nhặt và đặt bệnh phẩm hoặc nhuộm bệnh phẩm với Eosin 1% cho dễ nhận. 1.3.7. Kỹ thuật cắt và dán mảnh Nếu bệnh phẩm đã được xử lý tốt ở các khâu: cố định, pha và vùi thì sẽ tạo điều kiện cho việc cắt mảnh được dễ dàng hơn. Trước khi cắt thì máy cắt cần được kiểm tra cả ốc vít và tra dầu bôi trơn. Nhiệt độ trong phòng cắt không quá 25oC và tốt hơn là cắt trong phòng có điều hòa. Nếu không có điều kiện thì bloc phải được ngâm và nước đá để đảm bảo đủ độ cứng mới cắt mảnh được. Độ nghiêng của lưỡi dao đặt và máy cắt thích hợp là 45o. Chất lượng của mảnh cắt còn phụ thuộc vào nhiệt độ dàn tiêu bản (nóng không quá 50oC). Như vậy một tiêu bản cắt được coi là đạt yêu cầu nếu: Mỏng đều. Không xước, gấp hoặc rách. Còn nguyên khuôn parafin quanh bệnh phẩm. Vị trí của mảnh cắt đặt ở 2/3 của lam từ dưới lên (1/3 của lam từ trên xuống để ghi mã số bệnh nhân, phía 2/3 dùng để dán nhãn sau khi nhuộm) lúc này bệnh phẩm nằm ở chính giữa lam kính. Sau khi cắt có nhiều chất dùng để dán mảnh cắt lên lam kính: albumin, silan, keo casein… trong đó dung dịch albumin 1 - 2% được dùng cho phương pháp nhuộm thông thường là phổ biến nhất. 1.3.8 Phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (H&E) 1.3.8.1 Thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm nhân hematoxylin: Hematoxylin là một loại thuốc nhuộm tự nhiên, nó được biết đến từ năm 1863. Bản thân Hematoxylin không có đặc tính nhuộm mà phải trải qua quá trình oxy hóa mất 2 nguyên tử hydro để trở thành Hematein. Pha dung dịch Hematoxylin nhanh: Cho phần A và phần B vào một bình chứa hơn 1 lít. Thêm 1 lít nước cất 2 lần hoặc nước đã được ion hóa. Không dùng nước máy. Lắc hoặc khuấy dung dịch vài phút cho đến khi tan hoàn toàn. Để yên ít nhất 1 giờ. Kết quả nhuộm tốt nhất sau 12 giờ. Lọc trước khi dùng. Có kết tủa và váng trên bề mặt là bình thường đối với thuốc nhuộm này. Thời gian nhuộm có thể thay đổi từ 4 - 8 phút. Nếu dùng để nhuộm tế bào có thể pha thành 1.5 - 2 lít. Thuốc nhuộm bào tương: Eosin Với Eosin bán cùng Hematoxylin được pha như sau: Một lọ Eosin hòa tan trong 1 lít nước cất 2 lần. Lắc cho tan hết. Lọc trước khi nhuộm. 1.3.8.2 Nguyên tắc: Đây là phương pháp nhuộm phối hợp thông dụng nhất bằng cách nhuộm kế tiếp một phẩm nhuộm nhân “bazơ” - hematin và một phẩm nhuộm bào tương “acid” - eosin. Việc nhuộm nhân được nhuộm “tăng dần”người ta dùng lại khi những cấu trúc của nhân rõ nét nhất. Ngược lại việc nhuộm bào tương“giảm dần” bằng cách nhuộm sẫm lên rồi loại phẩm thừa bằng cồn có nồng độ thấp. 1.3.8.3. Phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (Hematoxylin Instant). Tiêu bản tẩy nến 3 lần Xylen x 2 lần/ phút. Chuyển vào cồn 100o, cồn 90o, cồn 80o x 2 phút mỗi bể. Rửa nước chảy 5 phút. Nhuộm nhân trong dung dịch Hematoxylin nhanh từ 5 - 7 phút. Rửa nước chảy 5 phút. Biệt hóa trong cồn acid (acid HCL 0.5% trong cồn 70o) vài giây. Rửa nước chảy ít nhất 5 phút (kiểm tra dưới kính hiển vi xem nhân nhuộm đã được chưa. Nếu nhạt quá thì nhuộm thêm, ngược lại nếu sẫm quá thì tẩy tiếp trong cồn acid và rửa nước chảy tiếp 5 phút). Làm xanh bằng dung dịch lithi carbonat hoặc natri carbonat bão hòa. Rửa nước chảy 5 phút. Nhuộm bào tương trong Eosin từ 3 - 5 phút. Rửa qua nước. Loại phẩm thừa trong cồn 95o vài giây. Tẩy nước bằng cồn tuyệt đối. Làm trong bằng Xylen. Gắn lamelle bằng Baume Canada. 1.3.8.4. Kết quả: Nhân tế bào từ xanh - xanh đen Bào tương từ hồng đến đỏ. Hồng cầu màu đỏ. Ch­¬ng 2 ®èi t­îng vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu Đối tượng nghiên cứu Mẫu xét nghiệm: tiêu bản nhuộm H - E Mỗi cơ sở 200 – 500 tiêu bản. Xử lý các mẫu xét nghiệm Tất cả các tiêu bản đều đã được xử lý theo quy trình chung bao gồm: pha bệnh phẩm, cố định, chuyển, đúc, cắt mảnh, nhuộm H - E. Pha bệnh phẩm: được thực hiện tại phòng pha do Bác sĩ chuyên khoa thực hiện. Các mẫu được cố định lại, chuyển và đúc thành khối nến trên máy chuyển đúc Microm Khối nến được đúc trong cassette PVC tiêu chuẩn Cắt mảnh độ dày 3mm, nhuộm và dán lamell để tạo thành tiêu bản hoàn thiện. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang có phân tích kết hợp hồi cứu. Nơi thực hiện đề tài Labo Bộ môn giải phẫu bệnh, 13 Lê Thánh Tông, Hoàn Kiếm, Hà Nội: Là nơi phát triển các kỹ năng và thành thạo một chuỗi quy trình chuyển, đúc, cắt, nhuộm từ bệnh phẩm ra những tiêu bản nhuộm HE Labo Giải phẫu bệnh viện Lao Phổi Trung Ương, 463 Hoàng Hoa Thám, Ba Đình, Hà Nội. Labo Giải phẫu bệnh Bệnh viện K2, Làng Tựu, xã Tam Hiệp, Thanh trì, Hà Nội. Labo Giải phẫu bệnh Bệnh viện 108, Số 1 Trần Hưng Đạo, Hai Bà Trưng, Hà Nội. Phương tiện nghiên cứu: Kính hiển vi quang học Quy trình nghiên cứu Làm thuần thục kỹ thuật tại bộ môn. Đến các cơ sở Quan sát, ghi chép Theo dõi quy trình kỹ thuật vi thể nhuộm H – E do kỹ thuật viên tại cơ sở tiến hành. Phát hiện các lỗi hay gặp ở các cơ sở Đối chiếu lỗi với quy trình làm để phát hiện ra lỗi xảy ra ở khâu nào. Đối chiếu tiêu bản có lỗi với tiêu bản cùng lô thực hiện để phát hiện nguyên nhân gây ra lỗi. Nhận định kết quả Các tiêu bản được nhận định trên kính hiển vi quang học ở các độ phóng đại khác nhau: X10; X40 Chất lượng tiêu bản được đánh giá theo ba mức độ: Không đạt yêu cầu: không chẩn đoán được hoặc tiêu bản quá xấu do các lỗi như: mảnh cắt quá dày, rách nát hoặc nhăn nhúm, nhuộm quá đậm hoặc quá nhạt màu, nhân tế bào bị chợt, tế bào nát… Đạt yêu cầu: Có thể nhận định được kết quả mặc dù còn có một số lỗi kỹ thuật như: bị xước, nhăn, bẩn, có phần bị bong… nhưng vẫn còn nguyên vẹn cấu trúc và màu sắc rõ ràng tương phản. Tốt: Tiêu bản cắt mỏng đều, không gấp, không rách xước, màu của nhân và bào tương rõ nét, tương phản… CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Bảng kết quả STT Cơ sở nghiên cứu Chất lượng tiêu bản Tổng Ghi chú Không đạt Đạt Tốt 1 Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện Lao phổi Trung Ương 9 146 57 212 Tỷ lệ % 4,2% 68,9% 26,9% 2 Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện K2 83 371 14 468 Tỷ lệ % 17,7% 79,3% 3% 3 Labo Giải phẫu bệnh của Bộ môn Giải phẫu bệnh. 3 164 81 248 Tỷ lệ % 1,2% 66,1% 32,7% 4 Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện 108 7 236 85 328 Tỷ lệ % 2,1% 72% 25,9% 3.2 Đánh giá kết quảvà một số hình ảnh minh họa Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện Lao phổi Trung Ương: - Các tiêu bản không đạt: 9/212, chiếm 4,2%; tiêu bản đạt: 146/212, chiếm 68,9%; tiêu bản tốt: 57/212, chiếm 26,9%. Đa số các tiêu bản không đạt có hiện tượng “Chợt nhân” (chiếm 3,3% tổng số tiêu bản) ngoài ra một số tiêu bản rách, nhăn nhúm, mất mô. - Đối chiếu với các mẫu tương tự, cùng lô xét nghiệm cho thấy lý do chính thuộc về lỗi cố định bệnh phẩm: Các phòng khoa đều được nhận hóa chất cố định. Tuy nhiên, do không chú ý hoặc(và) không để ý đến những ảnh hưởng của việc cố định bệnh phẩm đến chất lượng xét nghiệm giải phẫu bệnh nên để hóa chất quá lâu, bảo quản không tốt làm chất lượng hóa chất cố định bị giảm. Đối với bệnh phẩm lớn thường không cố định vẫn chuyển đến Labo xét nghiệm. Đối với bệnh phẩm sinh thiết, có trường hợp không dùng hóa chất cố định mà dùng nước muối sinh lý hoặc nước cất. Điều đó đã ảnh hưởng rất nhiều đến cấu trúc mô, tế bào bị nát, nhân bắt màu rất kém. - Các tiêu bản đạt: 146/212, chiếm 68,9 %. Phần lớn cắt tương đối mỏng, nhuộm màu đẹp, sự tương phản giữa nhân và bào tương rõ ràng. Tuy nhiên tiêu bản vẫn chưa thật đều và đôi chỗ bị xước, nhăn nhúm. Một số hình ảnh Hình 3.2.1.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; chợt nhân Hình 3.2.2.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; chợt nhân Hình 3.2.3.Tiêu bản nhuôm H – E X 40; có nấm trên tiêu bản Hình 3.2.4.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị bong Hình 3.2.5.Tiêu bản nhiệm H – E X 40; tiêu bản bị cặn bẩn, đen Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện K2 - Tổng số tiêu bản không đạt là: 83/468, chiếm 17,7%; tiêu bản đạt: 371/468, chiếm 79,3%; tiêu bản tốt: 14/468, chiếm 3%. Đa số các tiêu bản không đạt đều do cắt dầy, không đều, xước rách nhiều, bắt màu đậm, tế bào có hiện tượng nát nhiều (chiếm 72% tổng số tiêu bản). - Đối chiếu với các mẫu tương tự, cùng lô xét nghiệm cho thấy lý do chính thuộc về lỗi tuân thủ các tiêu chuẩn trong xét nghiệm nhuôn tiêu bản H – E: Thời gian cố định bệnh phẩm không đảm bảo, phần lớn tại cơ sở là bệnh phẩm mổ, kích thước lớn, sau khi mổ xong không cố định ngay mà để rất lâu sau đó mới pha và cố định dẫn đến bệnh phẩm bị hoại tử, dùng bếp điện đun Parafin, đun đi đun lại nhiều lần làm parafin trở lên rất cứng dẫn đến khi cắt mảnh tế bào sẽ bị nát, thao tác đúc dùng thìa múc parafin, không chú ý áp sát mặt phẳng bệnh phẩm vào khuôn đúc làm bệnh phẩm sâu, lệch trong parafin dẫn đến khi cắt không lấy được mặt phẳng cần thiết, nhiều khi phá làm mất mô, cắt tiết kiệm dao nên nhiều khi dao bị mẻ gây xước mảnh cắt. - Các tiêu bản đạt yêu cầu: 371/468, chiếm 79,3%. Tuy nhiên, nhiều tiêu bản ở một số vùng nhỏ vẫn có hiện tượng xước, rách hoặc mất mô. Một số hình ảnh Hình 3.2.6.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tế bào bị nát Hình 3.2.7.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tế bào nát, chợt nhân Hình 3.2.8.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; có nếp gấp Hình 3.2.9.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị xước và bong Labo Giải phẫu bệnh Trường Đại Học Y Hà Nội: - Các tiêu bản không đạt là: 3/248, chiếm 1,2%; tiêu bản đạt: 164/248, chiếm 66,1%; tiêu bản tốt: 81/248, chiếm 32,7%. Đa số các tiêu bản không đạt thuộc về các lỗi như: mảnh cắt dày, xước, mảnh cắt bị bong, mất mô, tiêu bản còn cặn bẩn, cấu trúc mô bị giãn, không có sự tương phản rõ nhân bào tương nhưng vẫn nhận được cấu trúc mô và một số các tổn thương. - Đối chiếu với các mẫu cùng lô xét nghiệm cho thấy lý do chính thuộc về lỗi thao tác kỹ thuật: cắt dày, cắt vào những vùng dao bị mẻ gây xước, đặt bàn hơ lâu gây giãn. Có những mẫu do khâu cố định kém từ tại cơ sở làm thủ thuật, mổ dẫn đến ở Labo dù kỹ thuật rất tốt nhưng tiêu bản vẫn bắt màu kém và cấu trúc mô không rõ ràng. - Các tiêu bản đạt là: 164/248; chiếm 66,1%. Đại đa số các tiêu bản đạt yêu cầu đều thấy rõ nhân màu xanh – đen, tương phản khá rõ nét trên nền bào tương màu hồng đỏ, cấu trúc mô cũng như các tổn thương đều nhận rõ. Tuy nhiên, vẫn có những tiêu bản có một số vị trí bị nhăn, xước. Một số hình ảnh Hình 3.2.10.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị nhăn Hình 3.2.11.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị gấp, bong Hình 3.2.12.Tiêu bản H – E X 40; tiêu bản cắt thiếu mô Hình 3.2.13.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị xước Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện 108: - Các tiêu bản không đạt: 7/328, chiếm 2,1%; tiêu bản đạt: 236/328, chiếm 72%; tiêu bản tốt: 85/328, chiếm 25,9%. Phần lớn các tiêu bản không đạt thuộc về các lỗi như: mảnh cắt dày, xước, không có sự tương phản rõ nhân bào tương nhưng vẫn nhận được cấu trúc mô và một số các tổn thương. - Đối chiếu với các tiêu bản cùng lô xét nghiệm cho thấy lý do chính thuộc về lỗi thao tác kỹ thuật, cắt tiết kiệm dao. Một số trường hợp có hiện tượng bong do dán không dùng Albumin. - Các tiêu bản đạt: 236/328, chiếm 72%. Phần lớn cắt tương đối mỏng, nhuộm màu đẹp, sự tương phản giữa nhân và bào tương rõ ràng, tuy vẫn chưa thật đều và vẫn có đôi chỗ bị xước, nhăn nhúm. Một số hình ảnh Hình 3.2.14.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị xước Hình 3.2.15.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị bong, gấp Hình 3.2.16.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị xước, rách, gấp, bong Ch­¬ng 4 Bµn luËn Sự liên quan mật thiết trong một chuỗi kỹ thuật liên hoàn từ việc lấy bệnh phẩm, pha bệnh phẩm, cố định, chuyển, đúc đến cắt mảnh và nhuộm HE để ra một tiêu bản mô bệnh học Lấy bệnh phẩm Các bệnh phẩm làm xét nghiệm mô bệnh học bao gồm nhiều loại, từ các bệnh phẩm lớn như bệnh phẩm sau mổ, bệnh phẩm tử thiết, bệnh phẩm sinh thiết bằng phẫu thuật hay tiểu phẫu đến các bệnh phẩm nhỏ hơn như sinh thiết bằng kim sinh thiết, các sinh thiết bấm qua nội soi…Các bệnh phẩm lớn thường được pha bởi các bác sĩ giải phẫu bệnh học, số còn lại đều được lấy bởi các bác sĩ thuộc nhiều chuyên khoa như tiêu hóa (sinh thiết dạ dày, đại trực tràng, sinh thiết gan…); hô hấp (sinh thiết phổi chọc kim xuyên thành ngực); sản – phụ (chất nạo tử cung)… Hai yêu cầu cơ bản của việc lấy bệnh phẩm là lấy trúng và lấy đủ thật không đơn giản. + Lấy trúng là lấy trúng vùng tổn thương. Điều đó có nghĩa là trước tiên phải xác định rõ được vùng tổn thương hoặc ít nhất cũng là những vùng có biến đổi khác thường so với vùng lành. + Lấy đủ là lấy được bệnh phẩm sao cho đủ cơ sở (hay tiêu chuẩn) để chẩn đoán mô bệnh học. So với việc lấy trúng thì yêu cầu này đòi hỏi người lấy bệnh phẩm phải có sự hiểu biết rất rõ về mô bệnh học. Cùng một loại bệnh nhưng ở từng vùng mô, từng giai đoạn bệnh sẽ có những hình ảnh khác nhau về mô bệnh học. Hơn nữa, mặc dù một u ác tính có biểu hiện rõ trên lâm sàng nhưng nếu lại sinh thiết vào cùng hoại tử thì mô bệnh học không thể kết luận được. + Từ hai yêu cầu của việc lấy bệnh phẩm là lấy trúng và lấy đủ, người ta đã quy định rất rõ cho từng loại bệnh phẩm phải lấy ở những vùng nào, tối thiểu là bao nhiêu mảnh. Nếu lấy bệnh phẩm không đạt yêu cầu thì các khâu còn lại của xét nghiệm mô bệnh học trở nên vô ích, lãng phí và những sai sót trong khâu lấy bệnh phẩm đôi khi là những sai sót không thể sửa chữa được. Cố định bênh phẩm: Formol 10% là dung dịch cố định được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất, dùng cho mọi lại xét nghiệm mô bệnh học thông thường bởi vì chúng có đặc điểm cơ bản sau: + Là một chất khử oxy + Không kết tủa Protein, nhưng cố định hoàn toàn các gel gelatin bằng cách làm cho chúng không hòa tan. + Cố định các lipid phức tạp, trong đó có cả ty lạp thể và bộ Golgi + Không tác dụng trực tiếp lên trên Glucid nhưng vẫn bảo quản được chúng do không làm tan các thành phần cấu tạo có Protid của tế bào. + Là chất cố định có vận tốc xuyên thấm khá nhanh. + Không làm co (nhưng làm co mạnh khi chuẩn bị vùi nến) nhưng làm cứng mạnh. + Cấu trúc tế bào được bảo quản tốt. + Làm tăng sự kiềm tính của các cấu trúc khi nhuộm qua mảnh cắt vùi nến. Chuyển và đúc bệnh phẩm: + Máy chuyển bệnh phẩm tự động được cài đặt chạy theo chương trình, từ cố định, tẩy nước bằng cồn rồi tẩy cồn bằng xylen và cuối cùng là thay xylen bằng parafin. Ở mỗi trạm, máy đều tự động đảo đều tại chỗ và trước khi chuyển sang trạm kế tiếp sau đều được ly tâm để loại bớt hóa chất. Do vậy đã tránh được hiện tượng bệnh phẩm bị “sống”. + Máy đúc nến hoạt động theo nguyên tắc luôn giữ được nhiệt độ của khuôn đúc, bệnh phẩm và parafin nóng chảy trong suốt quá trình đúc bệnh phẩm (500C – 600C). Khi chuyển khuôn đã đúc sang modun làm lạnh là việc đúc nến hoàn tất. Sử dụng máy này tránh được một sai sót rất hay gặp trong cách đúc nến thông thường là mất sự liên kết đồng nhất giữa bệnh phẩm và parafin đồng thời rất thuận lợi cho việc sắp đặt bệnh phẩm trong khuôn đúc, đặc biệt là các bệnh phẩm nhỏ. Mặt khác, việc sử dụng caseette thay cho khuôn đúc kim loại không những dễ thao tác, bảo quản mà còn giúp cho việc cắt mảnh rất thuận lợi, đặc biệt là việc cắt “phá” tạo mặt cắt mảnh – mộ Cắt mảnh và dán bệnh phẩm: Trong quá trình để làm ra một tiêu bản mô bệnh học thì đây là một khâu rất quan trọng và khó, đòi hỏi người kỹ thuật viên không những phải nắm vững, làm đúng các quy trình thao tác trên máy, hiểu rõ nguyên lý hoạt động của máy mà còn phải rèn cho được tính cẩn thận, kiên trì và nhẫn nại mới có thể có được những mảnh cắt đẹp, đúng yêu cầu kỹ thuật. Trong nhiều trường hợp, mặc dù các thao tác đều làm đúng theo quy trình và yêu cầu kỹ thuật nhưng vẫn không có được mảnh cắt đạt yêu cầu như đã làm ở giai đoạn một. Loại trừ các sai sót kỹ thuật ở các khâu khác như cố định, chuyển đúc…thì lý do chính là do thao tác vận hành máy. Các máy cắt mảnh đều sử dụng một vô lăng tạo đà để đưa khối nến chuyển động theo chiều thẳng đứng từ trên xuống dưới và mỗi một chu kỳ quay lại tịnh tiến một “bước” tương đương với mức dày – mỏng đã đặt trước và có thể thay đổi được. Theo thiết kế, hầu hết các máy cắt đều có độ chính xác cao, chống rung và phần cải tiến chủ yếu là tăng độ linh động cho các hệ điều chỉnh như dao cắt, bệ gá dao, hệ thống điều chỉnh ba chiều cho độ nghiêng của dao, mâm cố định khối nến…Như vậy mặc dù đặt ở mức cắt mỏng nhất nhưng chỉ cần vận hành tay quay thiếu đồng bộ (nhanh quá hoặc chậm quá hoặc thiếu dứt khoát) sẽ tạo ra một mảnh cắt dầy và không đều. Mặt khác, độ nghiêng của lưỡi dao cũng ảnh hưởng rất nhiều đến kết quả cắt mảnh và độ nghiêng này lại không hằng định mà thay đổi tùy theo loại mô cắt “mềm hay cứng”. Do vậy, việc vận hành máy cắt đòi hỏi tính kinh nghiệm rất cao. Qua mỗi một lần cắt đều phải rút kinh nghiệm và tìm cách khắc phục. Sự tiến bộ trong từng giai đoạn (từ giai đoạn 1 đến giai đoạn 3) trong nghiên cứu của chúng tôi đã phần nào minh chứng cho điều đó. Dán mảnh cắt lên tiêu bản, tuy đơn giản nhưng cũng là một khâu quan trọng. Dung dịch dán tiêu bản thường dùng hiện nay là dung dịch Albumin. Nếu để tiêu bản trên bàn hơ quá lâu, quá nóng, thiếu đồng bộ khi tãi mảnh cắt hoặc chất lượng dung dịch dán không tốt (không lọc kỹ hoặc bảo quản không tốt)… sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến chất lượng tiêu bản. Dán mảnh không đạt yêu cầu kỹ thuật sẽ dẫn tới bong mảnh cắt hoặc tạo ra những tổn thương giả, làm bẩn tiêu bản...vv. Nhuộm tiêu bản Trong cả ba giai đoạn cắt mảnh đều tiến hành ở một mức cắt giống nhau nhưng độ dày mỏng của các mảnh cắt rất khác nhau. Với cùng một quy trình nhuộm như nhau, các tiêu bản dày thường rất đậm cả Hematoxylin (ở nhân) và Eosin (bào tương). Có lẽ ở các mảnh cắt dày thì các yếu tố gắn màu được gắn vào mô trên mảnh cắt nhiều hơn và “chồng chéo” lên nhau do đó chúng có màu đậm hơn và không thể có sự tương phản giữa nhân và bào tương được. Mặt khác, sự bắt màu cũng rất khác nhau ở các mô khác nhau cũng như các tổn thương khác nhau. Mô ung thư thường cho màu nhân đậm hơn các mô khác. Một số yếu tố chính của Kỹ thuật vi thể liên quan ảnh hưởng đến tiêu bản nhuộm Hematoxylin và Eosin Cố định bệnh phẩm không tốt làm giảm hẳn chất lượng xét nghiệm và cố định hỏng là không thể sửa chữa được. Lỗi về cố định bệnh phẩm rất hay xảy ra đối với các trường hợp Labo xét nghiệm giải phẫu bệnh không trực tiếp thực hiện. Chủ yếu là phát hóa chất cho các khoa/phòng Đúc bloc: các lỗi có thể xảy ra như: nhiệt độ parafin không đảm bảo (Thay thế bếp điện đun parafin thay thế trường hợp không có máy đúc) làm parafin rất cứng gây ảnh hưởng rất nhiều đến cấu trúc mô và khó khăn rất lớn trong quá trình cắt và dán mảnh gây ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng tiêu bản. Quá trình đúc có thể gây lỗi bệnh phẩm không đúng mặt phẳng, nằm sâu trong bloc…sẽ gây cắt thiếu mô, mất mô. Một số tiêu bản có mảnh cắt dày, phẩm nhuộm bắt màu rất đậm và không có sự tương phản rõ giữa nhân và bào tương. Kết quả này lại một lần nữa khẳng định rằng kỹ thuật cắt mảnh ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình nhuộm. Mảnh cắt hay bị xước cũng gây ảnh hưởng rất nhiều, điều này rất hay xảy ra do các vấn đề về dao cắt và kỹ thuật cắt. Dán mảnh: một số tiêu bản ở một số cơ sở do tỷ lệ pha albumin quá cao, nhiều khi tẩy không hết, gây bắt màu làm xấu tiêu bản nhuộm. Dung dịch dán mảnh cũng như thao tác dán mảnh là một nguyên nhân gây bong mảnh cắt cũng như tạo tổn thương giả. Một số yếu tố làm bẩn tiêu bản như: vi khuẩn, nấm (do dung dịch dán mảnh bảo quản không tốt, không ngâm lam kính) Hơ quá lâu trên bàn hơ hoặc ở một số cơ sở bàn hơ quá nóng có thể gây giãn cấu trúc mô. Sự gấp nếp mảnh cắt (mảnh cắt bị nhăn nhúm) hoặc bị rách là do thao tác tãi mảnh cắt trên bàn hơ không đạt yêu cầu (Viện Quân đội trung ương 108 tãi trên thiết bị chuyên dụng đựng dung dịch dán: nhanh & hiệu quả hơn so với tãi trực tiếp trên lam kính) Quá trình nhuộm tiêu bản là bước có vai trò quyết định rất lớn đến chất lượng tiêu bản, việc cắt bớt một số khâu trong quy trình nhuộm sẽ gây ảnh hưởng nhiều. Một số cơ sở bỏ qua bước tẩy nước cuối cùng và dùng máy sấy để sấy khô sẽ làm cho tiêu bản bị ám. Tóm lại: Để có được một tiêu bản mô bệnh học là một chuỗi các khâu kỹ thuật liên hoàn mà các khâu đó đều có sự liên quan mật thiết với nhau, ảnh hưởng tới chất lượng tiêu bản. Trong các khâu đó, bên cạnh việc tiến hành theo đúng quy trình kỹ thuật thì yếu tố con người đóng vai trò hết sức quan trọng và quyết định đến việc tạo ra một tiêu bản đẹp, hạn chế tối đa các sai sót chủ quan trong chẩn đoán mô bệnh học. KÕt luËn Đối với em- một sinh viên chuyên ngành Kỹ thuật Y học sắp ra trường khi đã nắm vững về lý thuyết các quy trình kỹ thuật cơ bản - để thực hiện thành thạo một chuỗi kỹ thuật chuyển, cắt, nhuộm từ bệnh phẩm ra những tiêu bản nhuộm H – E thì em nhận thấy rằng kỹ thuật khó nhất là cắt mảnh. Và để thực hiện được kỹ thuật vi thể nhuộm H – E đạt yêu cầu kỹ thuật thì thời gian tối thiểu phải làm việc liên tục trong labo ba tháng, dưới sự hướng dẫn của các anh chị kỹ thuật viên có kinh nghiệm. Một số yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm H – E: Sự thành thạo thao tác, đặc biệt là trên máy cắt mảnh và để làm được việc này, yếu tố “con người” là rất quan trọng. Cố định bệnh phẩm không tốt làm giảm hẳn chất lượng xét nghiệm và cố định hỏng là không thể sửa chữa được. Lỗi về cố định bệnh phẩm rất hay xảy ra vì với các Labo xét nghiệm phát hóa chất cho các khoa/phòng, các khoa/phòng không chú ý hoặc coi nhẹ vai trò của việc cố định và dùng thay bằng nước muối sinh lý, nước cất gây hoại tử bệnh phẩm. Đúc bloc: các lỗi có thể xảy ra như: nhiệt độ parafin không đảm bảo (Thay thế bếp điện đun parafin thay thế trường hợp không có máy đúc) làm parafin rất cứng gây ảnh hưởng rất nhiều đến cấu trúc mô và khó khăn rất lớn trong quá trình cắt và dán mảnh gây ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng tiêu bản. Quá trình đúc có thể gây lỗi bệnh phẩm không đúng mặt phẳng, nằm sâu trong bloc…sẽ gây cắt thiếu mô, mất mô. Một số tiêu bản có mảnh cắt dày, phẩm nhuộm bắt màu rất đậm và không có sự tương phản rõ giữa nhân và bào tương. Kết quả này lại một lần nữa khẳng định rằng kỹ thuật cắt mảnh ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình nhuộm. Mảnh cắt hay bị xước cũng gây ảnh hưởng rất nhiều, điều này rất hay xảy ra do các vấn đề về dao cắt và kỹ thuật cắt. Dán mảnh: một số tiêu bản ở một số cơ sở do tỷ lệ pha Albumin quá cao, nhiều khi tẩy không hết, gây bắt màu làm xấu tiêu bản nhuộm. Dung dịch dán mảnh cũng như thao tác dán mảnh là một nguyên nhân gây bong mảnh cắt cũng như tạo tổn thương giả. Dán mảnh cắt không đạt yêu cầu kỹ thuật dẫn đến bong mảnh cắt, làm mảnh cắt nhăn nhúm, rách cũng như có thể tạo ra các tổn thương giả, ảnh hưởng rất nhiều đến chất lượng tiêu bản Một số yếu tố làm bẩn tiêu bản như: vi khuẩn, nấm (do dung dịch dán mảnh bảo quản không tốt, không ngâm lam kính) Hơ quá lâu trên bàn hơ hoặc ở một số cơ sở bàn hơ quá nóng có thể gây giãn cấu trúc mô. Sự gấp nếp mảnh cắt (mảnh cắt bị nhăn nhúm) hoặc bị rách là do thao tác tãi mảnh cắt trên bàn hơ không đạt yêu cầu (Viện Quân đội trung ương 108 tãi trên thiết bị chuyên dụng đựng dung dịch dán: nhanh & hiệu quả hơn so với tãi trực tiếp trên lam kính) Quá trình nhuộm tiêu bản là bước có vai trò quyết định rất lớn đến chất lượng tiêu bản, việc cắt bớt một số khâu trong quy trình nhuộm sẽ gây ảnh hưởng nhiều. Một số cơ sở bỏ qua bước tẩy nước cuối cùng và dùng máy sấy để sấy khô sẽ làm cho tiêu bản bị ám nước. KIẾN NGHỊ Khi tiÕn hµnh thực hiện kỹ thuật vi thể cÇn ph¶i thường xuyên chú ý kiểm tra chất lượng hóa chất sinh phẩm, trang thiết bị tốt, thao tác kỹ thuật đúng ®Ó chÊt l­îng cña chÈn ®o¸n Gi¶i phÉu bÖnh ngµy cµng n©ng cao. §Ò nghÞ cÇn nghiªn cøu thªm nh÷ng ¶nh h­ëng kh¸c và nghiên cứu sâu hơn về các yếu tố ảnh hưởng ®Õn kÕt qu¶ chÈn ®o¸n m« bÖnh häc. Lêi cam ®oan T«i xin cam ®oan ®©y lµ ®Ò tµi do chÝnh t«i nghiªn cøu. C¸c sè liÖu, kÕt qu¶ trong ®Ò tµi lµ trung thùc vµ ch­a ®­îc c«ng bè trªn mét c«ng tr×nh nghiªn cøu nµo. NÕu cã g× sai sãt t«i xin hoµn toµn chÞu tr¸ch nhiÖm. Hµ Néi, th¸ng 06 n¨m 2011 T¸c gi¶ khãa luËn NguyÔn V¨n Minh Tµi liÖu tham kh¶o TiÕng viÖt 1. Tr­êng §¹i häc Y khoa, Bé m«n Gi¶i phÉu bÖnh(1976): Kü thuËt hiÓn vi th«ng th­êng. Nhµ xuÊt b¶n Y häc Hµ Néi, 2. Tr­êng §¹i häc Y Hµ N«i , Bé m«n Gi¶i phÉu bÖnh (2004): Tµi liÖu tËp huÊn dµnh cho c¸n bé gi¶i phÉu bÖnh, 3. Lê Hoàng Anh (2009): Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng của dung dịch cố định tới chất lượng nhuộm H – E và PAS. 4. NguyÔn §øc Th¸i (2008): Kü thuËt chuyÓn ®óc c¾t nhuém vµ c¸c yÕu tè ¶nh h­ëng, 5. Vũ Thị Thu Hảo (2005): Kỹ thuật nhuộm Hematoxylin – Eosin trong chẩn đoán Mô bệnh học. 6. Nguyễn Thị Hải (2007): Kỹ thuật và một số yếu tố ảnh hưởng tới kết quả nhuộm ba màu Masson trên mảnh cắt. English 7. Enda B.Prophet, Bob Mills, Jacquelyn B.Arrington, Leslie H.Sobin, M.D: Laboratory Methods in Histotechnology. LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Đại học - Trường Đại học Y Hà Nội. Bộ môn Giải phẫu bệnh - Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em được học tập, rèn luyện và tu dưỡng tại trường. Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn CN. Nguyễn Hữu Quốc - người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị trong Bộ môn Giải phẫu bệnh - Trường Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị trong các Labo xét nghiệm Giải Phẫu Bệnh Các bệnh viện: Viện K2; Viện Lao Phổi Trung Ương; Viện Quân Đội Trung Ương 108 đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt quá trình tìm hiểu và nghiên cứu để thực hiện khóa luận. Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, những người thân trong gia đình đã tạo mọi điều kiện về tinh thần và vật chất cho con. Cảm ơn những người bạn đã luôn ủng hộ và động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Hà Nội, ngày tháng 06 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Văn Minh MỤC LỤC

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docĐánh giá chất lượng ký thuật vi thể trên tiêu bản nhuộm HEMA TOXYLIN - EOSIN ở một số cơ sở giải phẫu bệnh trên địa bàn Hà Nội.doc