Khảo sát một số bệnh thường gặp trên cá dĩa (symphysodon spp)

g lần thu mẫu đầu tiên xuất hiện 3 loại ký sinh trùng: Bothriocephalus, Myxobolus, Dactylogyrus. Trọng lượng và kích cỡ của mẫu này lớn hơn so với những mẫu còn lại. Điều này cho phép ta nhận định rằng cá có kích thước càng lớn, chủng loại ký sinh trùng xuất hiện càng nhiều. Cũng như nguyên nhân nhân làm cho cá dễ bị nhiễm các loại bệnh vi khuẩn, virus, nấm… không chỉ do một loại ký sinh trùng gây nên mà có thể do sự tác động tổng hợp của nhiều loài ký sinh trùng. Mẫu nào nhiễm nhiều loại ký sinh trùng, mẫu đó có dấu hiệu bệnh càng nặng. 4.2.2 Thành phần giống loài vi khuẩn xuất hiện Vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng, là trở lực chủ yếu kìm hãm sự phát triển và mở rộng sản xuất trong nuôi trồng thủy sản. Hầu hết các vi khuẩn gây bệnh là một phần của hệ sinh vật bình thường trong môi trường nước. Các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản đều có những triệu chứng gần giống nhau, đặc biệt là trên cá (Từ Thanh Dung, 2005). Một khi đã bộc phát bệnh thì khả năng điều trị thường không đem lại hiệu quả cao. Do đó, để có thể chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh thì việc nghiên cứu vi khuẩn ở cá là vấn đề không thể thiếu. Theo Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám cho rằng khi xem xét nguyên nhân gây bệnh cá tôm, không nên kiểm tra một yếu tố đơn độc mà phải xem xét đến 4 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 32 yếu tố chính: môi trường, mầm bệnh, ký chủ và vật nuôi (trích dẫn bởi Huỳnh Trúc Linh, 2006). Qua 6 đợt thu mẫu và phân tích, kết quả cho thấy vi khuẩn không chỉ xuất hiện trên cá bệnh mà còn xuất hiện trên cả cá khỏe. Điều này khẳng định nguyên nhân làm cho cá bệnh không phải một tác nhân duy nhất mà là sự tác động kết hợp giữa nhiều tác nhân. Nhưng thường vi khuẩn được xem là tác nhân gây bệnh thứ cấp hoặc tác nhân cơ hội (Từ Thanh Dung, 2005). Qua kết quả phân tích 35 mẫu, đã phân lập được 28 chủng vi khuẩn. Với thành phần giống, loài vi khuẩn xuất hiện trên cá dĩa được thể hiện trong bảng 4.2 Bảng 4.2 Thành phần giống loài vi khuẩn xuất hiện Các đợt thu mẫu STT Thành phần giống loài 1 2 3 4 5 6 A. hydrophila x x A. sobria x x E. tarda x x Acinetobacter baumannii x Plesiomonas shigelloides x Aeromonas sp x x x Vibrio sp x x x Pseudomonas sp x 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Edwardsiella sp x Ghi chú: x: Sự hiện diện của giống loài vi khuẩn. Hầu hết các chủng phân lập được đều là vi khuẩn Gram âm, hình que. Tất cả các chủng này đều được kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và định danh theo Bergey-Baumann và ctv (1984), API 20E (Fref, 1999) (Phụ lục 3). Với tỉ lệ xuất hiện của các chủng loài vi khuẩn được thể hiện trong bảng 4.3 Bảng 4.3 Tỉ lệ xuất hiện các chủng loài vi khuẩn phân lập được STT Thành phần chủng loài vi khuẩn xuất hiện Ti lệ xuất hiện (%) A. hydrophila 7.14 A. sobria 10.71 E. tarda 14.28 Acinetobacter baumannii 7.14 Plesiomonas shigelloides 3.57 Aeromonas sp 10.71 Vibrio sp 39.29 Pseudomonas sp 3.57 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Edwardsiella sp 3.57 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 33 Qua bảng 4.3 cho thấy trong 28 chủng vi khuẩn phân lập được trên cá dĩa thì chủng thuộc Vibrio sp chiếm tỉ lệ cao nhất (39.29%), kế đến là chủng thuộc giống Aeromonas (3 chủng Aeromonas sp, 2 chủng A. hydrophila, 3 chủng A. sobria), 3 chủng chiếm tỉ lệ thấp nhất (3.57%) là chủng Edwardsiella sp, chủng Pseudomonas sp và chủng Plesiomonas shigelloides. Vibrio sp Giải phẫu lấy mẫu bệnh phẩm từ gan, thận của cá cấy lên môi trường TSA, đặt vào tủ ấm. Sau 24 giờ phát triển các khuẩn lạc tròn, vừa, màu vàng hoặc cam nhạt. Vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm, hình que, di động, có phản ứng catalase, oxidase dương tính và mẫn cảm với O/129. Có khả năng sử dụng glucose, ornithin, thủy phân gelatin nhưng không cho phản ứng VP, không sử dụng lysine, không sinh gas và H2S. Trong 12 chủng thuộc giống Vibrio đã định danh được một loài, đó là Plesiomonas shigelloides. Mẫu phân lập được loài vi khuẩn này có trọng lượng 3.41g, chiều dài 5.5 cm, với dấu hiệu bệnh lý: vây lưng, vây hậu môn, vây đuôi bị tưa rách, đốm trắng gần cuống đuôi. Loài vi khuẩn này cho phản ứng citrate, manitol âm tính, inostitol dương tính… (Phụ lục 3) Mặc dù giống Vibrio thường được chú ý trên giáp xác nhiều hơn, nhưng trong 28 chủng định danh có đến 12 chủng thuộc giống Vibrio chiếm tỉ lệ cao nhất so với các nhóm khác. Tuy không gây ra những dịch bệnh to lớn nhưng vi khuẩn Vibrio vẫn có khả năng gây bệnh trên cá. Austin và ctv (1988) đã từng nghiên cứu và khẳng định có nhiều loài Vibrio gây bệnh trên cá (trích dẫn bởi Lê Thuần Nhân, 2006). Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) cho rằng V. samonicida, V. harveyi đều có thể gây bệnh trên cá. Bệnh vi khuẩn Vibrio trên cá có thể gây tỉ lệ hao hụt đáng kể, bệnh lây lan nhanh khi nuôi mật độ cao (Từ Thanh Dung, 2005). Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004), bệnh do vi khuẩn Vibrio trên cá thường có các dấu hiệu xuất hiện các đốm đỏ nhỏ, tại đó vẩy tróc và rụng đi, sau một thời gian tạo nên các vết loét nhỏ, sâu và bệnh cấp tính có thể gây chết hàng loạt. Vibrio cũng có khả năng làm vây cá tưa rách hoặc hoại tử. Điều này phù hợp với các mẫu phân tích vì đa số các mẫu có vi khuẩn Vibrio đều có dấu hiệu là vây tưa rách (Hình 4.6). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 34 Hình 4.6: Vây cá bị tưa rách và ăn mòn Aeromonas Giống vi khuẩn thứ 2 định danh được là Aeromonas với số lượng là 8 chủng (3 chủng Aeromonas sp, 2 chủng A. hydrophila, 3 chủng A. sobria). Hai mươi bốn giờ sau khi phân lập, quan sát khuẩn lạc dạng tròn, màu trắng đục, hơi lồi. Chọn khuẩn lạc điển hình nằm riêng lẻ cấy sang môi trường khác cho tới khi các khuẩn lạc trong môi trường TSA có hình dạng đồng nhất. Vi khuẩn thuộc giống Aeromonas là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động, phản ứng oxidase và catalase dương tính, oxi hóa và lên men trong môi trường O-F, kháng với O/129, có khả năng thủy phân gelatin, sử dụng citrate, glucose, không sinh gas và H2S… Trong 8 chủng thuộc giống Aeromonas đã định danh được 2 loài, đó là A. hydrophila và A. sobria. Mẫu phân lập được 2 loài vi khuẩn này có trọng lượng từ 3.11-53.64g, với dấu hiệu bệnh lý: bơi lội lờ đờ, vây tưa, lồi mắt (Hình 4.7). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 35 Hình 4.7: Cá bị lồi mắt Theo Từ Thanh Dung (2005) A. hydrophila là trực trùng hình que ngắn, chiều dài 2-3 µm, 2 đầu hơi tròn, đầu có 1 tiêm mao, không có nha bào. Nuôi cấy chúng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 28- 300C, sinh trưởng trong môi trường có độ pH thích hợp 7.1- 7.2. Vi khuẩn A. sobria không những gây nhiễm trùng máu mà nó còn gây bệnh đỏ mỏ, đỏ kỳ. Đa số các mẫu phân lập được giống Aeromonas đều có dấu hiệu đục và lồi mắt, vây tưa hoặc hoại tử. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và ctv (2004), một số loài vi khuẩn Aeromonas bao gồm A. hydrophila, A. caviae, và A. sobria gây nên bệnh nhiễm trùng máu ở động vật thủy sản. Cá bị sẫm từng vùng ở bụng, xuất hiện từng mảng đỏ trên cơ thể. Hoại tử vây, đuôi, xuất hiện các vết thương trên lưng, các khối u trên bề mặt cơ thể, vẫy dễ rơi rụng. Mắt lồi, mờ đục và phù ra, xoang bụng chứa dịch, nội tạng hoại tử. Bên cạnh những mẫu cá bệnh cũng có mẫu chưa có biểu hiện bệnh rõ ràng, thậm chí ở mẫu cá khỏe cũng phân lập được giống vi khuẩn Aeromonas. Điều này chứng tỏ vi khuẩn Aeromonas không chỉ hiện diện ở cá bệnh mà còn ở cá khỏe. Theo Từ Thanh Dung (2005) bệnh do giống vi khuẩn Aeromonas gây ra xuất hiện quanh năm nhưng thường tập trung vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, ở miền Nam bệnh thường xuất hiện nhiều vào đầu mùa mưa. Tỉ lệ hao hụt do bệnh này ở động vật thủy sản từ 30-70%. Nên có thể phòng bệnh do nhóm vi khuẩn này như sau: Không nuôi với mật độ quá dầy, cho cá ăn đầy đủ, hợp vệ sinh, tránh gây sốc cá cũng như tránh làm xây xát cá, cá giống mua về cần kiểm tra kỹ để loại bỏ Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 36 những con cá nhiễm bệnh sẵn hoặc bị xay xát nhiều, tốt nhất nên tắm muối 0.5% trong 5-10 phút trước khi thả nuôi. Edwardsiella sp Giống vi khuẩn thứ 3 định danh được là Edwardsiella. Theo Từ Thanh Dung (2005), Edwardsiella sp thuộc nhóm Enterobacteriaceae, đa số vi khuẩn thuộc nhóm này kỵ khí không bắt buộc, Gram âm, hình que, oxidase âm tính, lên men, phân bố rộng trong đất và trong môi trường nước. Edwardsiella sp có 2 loài thường gây bệnh trên cá là E. ictaluri và E. tarda. E.ictaluri xuất hiện trên cá nheo, gây bệnh mũ gan trên cá tra, cá basa. E. tarda gây bệnh trên nhiều loài cá. Trong 5 chủng thuộc giống Edwardsiella (1 chủng Edwardsiella sp và 4 chủng E. tarda). E. tarda phân lập từ 1 mẫu cá bệnh và 3 mẫu cá khỏe. Trọng lượng mẫu phân lập được loài vi khuẩn này 5.07- 6.05g. Với mẫu bệnh có dấu hiệu: màu sắc nhợt nhạt, gần vây bụng có vết loét rộng. Vi khuẩn này có khả năng sinh H2S, cho phản ứng Indol dương tính… Sự hiện diện của E.tarda trên cả cá khoẻ cho thấy E. tarda không chỉ xuất hiện trên cá bệnh mà còn trên cả cá khỏe. Chứng tỏ E. tarda không chỉ đơn độc gây bệnh cho cá mà còn có sự tác động của nhiều yếu tố khác như: vi khuẩn khác, ký sinh trùng, cá bị sốc, các yếu tố môi trường…Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Walter và Plumb (1980), Plumb (1995) (được trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005). Việc bộc phát bệnh của vi khuẩn E. tarda còn phụ thuộc vào yếu tố môi trường và mầm bệnh khác. Theo Từ Thanh Dung (2005), vi khuẩn E. tarda phân bố theo vùng địa lý, gây bệnh trên cả cá nước ngọt và nước mặn, có ít nhất 21 loài cá nuôi đã bị nhiễm bệnh do vi khuẩn này gây ra. Vi khuẩn này còn gây bệnh trên nhiều loài sinh vật khác như bò sát, chim, gia súc, các động vật hữu nhủ biển và trên người. Nhiệt độ thích hợp để bệnh phát triển khoảng 300C, tuy nhiên bệnh cũng có thể xuất hiện khi nhiệt độ nước thấp hơn và dao động bất thường. Khi cá (rô phi, bống tượng, cá chép, mè vinh) bị bệnh do E. tarda gây ra có các dấu hiệu bệnh lý như sau: Xuất hiện những vết thương nhỏ trên da (phía mặt lưng) đường kính 3-5 mm, những vết thương này sẽ phát triển thành khối u rỗng bên trong cơ, da cá bệnh bị mất sắc tố; Cá bị bệnh sẽ mất chức năng vận động do vây đuôi bị tưa rách; Có thể xuất hiện những vết thương bên dưới da, cơ khi ấn vào sẽ phát ra khí có mùi hôi, các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng cơ xung quanh. Bệnh xuất hiện khi chất lượng nước nuôi xấu và mật độ cao. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 37 Acinetobacter baumannii Giống vi khuẩn thứ 4 định danh đươc là Acinetobacter với số lượng 2 chủng, 2 chủng này được định danh bằng bộ test API 20 E và đã xác định được chúng thuộc loài Acinetobacter baumannii, với kết quả test được thể hiện trong phụ lục 3. Acinetobacter baumannii là vi khuẩn Gram âm, hình que, oxidase âm tính, catalase dương tính. Theo Nguyễn Thành Đạt (1999), giống Acinetobacter là vi khuẩn không sinh bào tử và phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Loài vi khuẩn này được phân lập ở thận mẫu 1 và gan của mẫu 2 trong lần thu mẫu đầu tiên. Những mẫu bệnh phân lập được vi khuẩn này có dấu hiệu mắt đỏ, bơi lội lờ đờ, vây ngực bị tưa, bơi nghiêng một bên, trọng lượng 36.32-53.64g. Trong mẫu bệnh này còn có sự hiện diện của ký sinh trùng: Bothriocephalus, Myxobolus và Dactylogyrus. Nên không thể khẳng định được Acinetobacter baumannii có khả năng gây bệnh trên cá dĩa hay không. Do đó, để khẳng định chính xác khả năng gây bệnh của vi khuẩn này cần phải tiến hành gây cảm nhiễm để xác định tác nhân gây bệnh. Nguyên nhân làm cho cá dĩa bị nhiễm vi khuẩn này có khả năng là do thức ăn không đảm bảo vệ sinh. Theo kết quả điều tra, hộ nuôi thường cho cá ăn thịt bò. Nên thịt bò rất có thể đã bị nhiễm loài vi khuẩn này và đã truyền sang cho cá dĩa trong quá trình cho ăn. Điều này phù hợp với ý kiến của Nguyễn Thành Đạt (1999), Acinetobacter có thể tạp nhiễm và làm biến chất rất nguy hiểm đối với sản phẩm sinh học được lưu giữ ở nhiệt độ thấp cũng như thức ăn ướp lạnh. Pseudomonas sp Giống vi khuẩn cuối cùng được phân lập trên cá dĩa là Pseudomonas, với tỉ lệ thấp nhất. Vi khuẩn có tính di động, hình que, gram âm, phản ứng catalase và oxidase dương tính, O-F âm tính. Khuẩn lạc dạng tròn trên TSA, hơi lồi, màu trắng xám. Mẫu phân lập được giống vi khuẩn này có trọng lượng 3.11g, chiều dài 5 cm, với dấu hiệu bệnh lý: Lồi mắt, vây lưng và vây hậu môn bị tưa. Theo Từ Thanh Dung (2005), đây là một trong những vi khuẩn được mô tả sớm nhất, không hình thành nha bào, kích thước 0.5-1.0 x 1.5-5.0 µm, chúng chuyển động bằng một hoặc nhiều tiêm mao. Vi khuẩn này có thể phát triển trong môi trường đơn giản và hiếu khí, chúng sinh sắc tố vàng-xanh, xanh hoặc xanh nhạt. Giống Pseudomonas là đặc thù trong các thủy vực tự nhiên, chúng phân bố khắp nơi trong môi trường đất, môi trường nước, có thể gây bệnh trên nhiều đối tượng Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 38 khác nhau. Bên cạnh những loài phân bố chủ yếu ở biển như: P. anguilliseptica, P. chlororaphus, cũng có những loài phân bố chủ yếu ở nước ngọt (P. flourescens). P. anguilliseptica và P. chlororaphus gây ra bệnh xuất huyết (đốm đỏ) trên cá. Bệnh do Pseudomonas sp thường có liên quan đến bị stress hoặc điều kiện quản lý không thích hợp. Vi khuẩn này xâm nhập vào cơ thể qua các thương tổn dưới da, mang. Khi cá bị nhiễm bệnh do vi khuẩn này gây ra có các dấu hiệu sau: Xuất huyết từng đốm nhỏ trên da, chung quanh miệng và nắp mang, vẩy rụng, rõ nhất hai bên thân và phía bụng; bề mặt cơ thể có thể chảy máu, tuột nhớt; khi xâm nhập vào cơ thể vi khuẩn này sẽ phá hủy các mô, các chức năng trong cơ thể, khi các cơ quan bị phá hủy có thể gây chết đến 70-80%; mắt mờ đục; bơi lội xoay tròn (lảo đảo), mất thăng bằng. Vì tỉ lệ hao hụt khá cao, nên để hạn chế bệnh này, cần phải có biện pháp phòng trị có hiệu quả là rất cần thiết (Từ Thanh Dung, 2005). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 39 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Qua 6 đợt thu mẫu và phân tích, có 6 giống ký sinh trùng xuất hiện trên cá dĩa. Đó là Trichodina, Chilodonella, Myxobolus, Capillaria, Bothriocephalus và Dactylogyrus. Trong đó tần suất xuất hiện của Dactylogyrus nhiều nhất. Định danh được 28 chủng vi khuẩn. Trong đó có 12 chủng thuộc giống Vibrio (11 chủng Vibrio sp, 1 loài Plesiomonas shigelloides), 8 chủng thuộc giống Aeromonas (3 chủng Aeromonas sp, 3 chủng A. sobria, 2 chủng A. hydrophila), 5 chủng thuộc giống Edwardsiella (1 chủng Edwardsiella sp, 4 chủng E. tarda), 2 chủng Acinetobacter baumannii và 1 chủng thuộc giống Pseudomonas. Những dấu hiệu bệnh thường gặp của cá dĩa trong quá trình điều tra là đốm trắng, đen thân, nấm, đường ruột, sưng mình, lồi mắt, rách vây. Đề xuất Thực hiện gây cảm nhiễm với các dòng vi khuẩn phân lập được. Cần thu mẫu bệnh phẩm kết hợp với các chỉ tiêu môi trường. Tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo để xác định tác nhân gây bệnh, lập kháng sinh đồ và thử nghiệm điều trị vi khuẩn trên cá dĩa. Để có kết quả xác đáng, rõ ràng hơn cần lặp lại nghiên cứu với số mẫu lớn hơn và tập trung vào những triệu chứng bệnh nhất định. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Austin, B and Austin, D. 1993. Bacteria Fish Pathogens. Disease in Farm and Wild Fish. Second Edition. Ellis Horwood Limited Pubications. 2. Bùi Minh Tâm. 2001. Giáo trình kỹ thuật nuôi cá cảnh. Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 3. Bùi Quang Tề, Vũ Thị Tám. 2000. Những bệnh thường gặp của tôm cá và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 78 trang. 4. Bùi Quang Tề. 2004. Bệnh thường gặp ở cá trắm cỏ và biện pháp phòng trị. NXB Nông Nghiệp. 5. Cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản. 1992. Chẩn đoán và phòng trị một số bệnh cá tôm. NXB Nông Nghiệp. 52 trang. 6. Đinh Thị Thu Thủy. 2006. Khảo sát mầm bệnh vi khuẩn và ký sinh trùng trên cá dĩa. Luận văn tốt nghiệp Đại Học, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 7. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội. 2004. Giáo trình bệnh học thủy sản, trường Đại Học Thủy Sản Nha Trang. 8. Đức Hiệp. 2000. Cá vàng cá cảnh. NXB Nông Nghiệp. 207 trang. 9. Francis- Floy, R. DVM, MS, Dipl ACZM, and Roy Yanong, VMD, 2002. Ichthyophthirius multifiis (White Spot) Infections in Fish; Cryptobia iubilans in Cichlids; Aeromonas Infections; Columnaris Disease; Mycobacteriosis in. 10. Fref 20190, 1999. API 20E. 11. Henderson, N, 2002. The Hole- In- The Head/ Lateral line erosion FAQ- by. 12. Huck, A, 2002. Headstand, Loss of Balance, Black area, Nerve Damage; Bloat, Dropsy, Popeye; Emaciated Discus and Capilaria Worm; Anchor Worms; Gill and Skin Flukes; Fin and Tail Rot; Cloudy Eye; Costia Parasite; Fish Tuberculosis. 13. Huỳnh Trúc Linh. 2006. Khảo sát các mầm bệnh trên cá sặc rằn. Luận văn tốt nghiệp Đại Học, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 14. Huỳnh Văn Lành. 2005. Điều tra hiện trạng kinh doanh và sản xuất cá cảnh ở Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp Đại Học, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 41 15. Lê Thuần Nhân. 2006. Khảo sát kỹ thuật nuôi và mầm bệnh trên cá kèo nuôi thương phẩm ở Bạc Liêu. Luận văn tốt nghiệp Đại Học, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 16. Mai Thanh Tuấn. 2005. Điều tra tình hình bệnh của cá rô phi nuôi lồng bè ở Cần Thơ, Vĩnh Long và Tiền Giang. Luận văn tốt nghiệp Đại Học, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 17. Nguyễn Minh. 1998. Kỹ thuật chăm sóc và lai tạo giống cá dĩa. NXB Mỹ Thuật. 143 trang. 18. Nguyễn Ngọc Linh. 2006. Nghiên cứu giải pháp nâng cao tỉ lệ sống của cá dĩa và kỹ thuật sinh sản nhân tạo cá chép Nhật. Luận văn tốt nghiệp Đại Học, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 19. Nguyễn Thành Đạt. 1999. Cơ sở sinh học vi sinh vật (tập1). Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội. NXB Giáo Dục. 206 trang. 20. Nguyễn Thành Tâm. 2006. Khảo sát các mầm bệnh trên cá rô đồng bị bệnh xù vẩy. Luận văn tốt nghiệp Đại Học, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 21. Nguyễn Thị Thanh Hiền. 1993. Theo dõi một số đặc điểm sinh học của cá dĩa. Tiểu luận tốt nghiệp, khoa Sinh Học, Đại Học Tổng Hợp thành phố Hồ Chí Minh. 22. Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Quốc Thịnh. 2004. Bài thực hành bệnh nấm và ký sinh trùng, khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 23. Nguyễn Thị Thu Hằng. 2000. Xác định tác nhân gây bệnh vi khuẩn trên cá bống tượng. Luận văn tốt nghiệp Đại Học, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 24. Nguyễn Thị Thu Hằng. 2004. Bài giảng bệnh nấm và ký sinh trùng. Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 25. Sabetta, A and Yanong, R.P.E, 2002. Tapeworm Experience; Hexamitiasis; Columnaris. 26. The Aquatic Animal Health Research institude Department of Fisheries. Kasetsart University Campus jatuak, Bangkod 10900. Thailand. 27. Trần Bá Hiền. 2003. Nghệ thuật nuôi cá cảnh. NXB Trẻ. 363 trang. 28. Trần Văn Bảo. 2000. Kỹ thuật nuôi cá kiểng. NXB Đồng Nai. 216 trang. 29. Trung Tâm Biên Soạn Và Dịch Thuật Sách Sài Gòn (Saigonbook). 2001. Cá cảnh- thưởng thức và nuôi dưỡng. NXB Đà Nẵng. 216 trang. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 42 30. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hòang Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa. 2005. Giáo trình bệnh học thủy sản, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 31. Từ Thanh Dung, Nguyễn Thị Như Ngọc. 2006. Bài giảng thực hành bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản. Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 32. Từ Thanh Dung. 2005. Bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 33. Undergasser, D. 1989. Handbook Fish Diease, TFH Publications. 34. Undergasser, D. 1991. Discus Health. TFH, Neptune, NJ, U.S.A. 35. Vĩnh Khang. 1993. Kỹ thuật nuôi cá kiểng. NXB Tp Hồ Chí Minh. 168 trang. 36. Võ Văn Chi. 1993. Cá Cảnh. NXB KHKT. 306 trang. 37. Võ Văn Chi. 1999. Kỹ thuật nuôi cá cảnh. NXB Văn Hóa Thông Tin. 270 trang. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 43 PHỤ LỤC Phụ lục1: Phiếu điều tra tình hình bệnh trên cá dĩa I. Thông tin chung Họ tên chủ hộ:............................................................................................................. Địa chỉ:........................................................................................................................ Điện thoại:................................................................................................................... Thời gian sản xuất (kinh doanh): ................................................................................ Các loài cá dĩa đang kinh doanh, giá thành: ............................................................... ..................................................................................................................................... ..................................................................................................................................... II. Kỹ thuật quản lý Kỹ thuật sản xuất, chăm sóc học hỏi từ kinh nghiệm nguời khác hay được cán bộ chuyên môn tập huấn: ................................................................................................. ..................................................................................................................................... Nguồn giống: .............................................................................................................. Mật độ ương. Kích cỡ: ................................................................................................ Nguồn nước sử dụng có qua xử lý không? ................................................................. ..................................................................................................................................... Chế độ thay nước: ....................................................................................................... Loại thức ăn: ............................................................................................................... Chế độ cho ăn: ............................................................................................................ Khẩu phần ăn: III.Thông tin về tình hình bệnh Một số bệnh thường xảy ra Bệnh do ký sinh trùng: Loài ký sinh trùng gây bệnh hoặc dấu hiệu bệnh: ...................................................... ..................................................................................................................................... ..................................................................................................................................... Giai đoạn cá nhiễm bệnh: ........................................................................................... Thời gian cá nhiễm bệnh: ........................................................................................... Tỉ lệ hao hụt do bệnh này gây ra: ............................................................................... Biện pháp xử lý:.......................................................................................................... ..................................................................................................................................... ..................................................................................................................................... Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 44 Loại thuốc sử dụng điều trị: Tên thuốc Liều lượng Thời gian trị Hiệu quả Bệnh do vi khuẩn: Loài vi khuẩn gây bệnh hoặc dấu hiệu bệnh: ............................................................. ..................................................................................................................................... ..................................................................................................................................... Giai đoạn cá nhiễm bệnh: ........................................................................................... Thời gian cá nhiễm bệnh: ........................................................................................... Tỉ lệ hao hụt do bệnh này gây ra: ............................................................................... Biện pháp xử lý:.......................................................................................................... ..................................................................................................................................... Loại thuốc sử dụng điều trị: Tên thuốc Liều lượng Thời gian trị Hiệu quả Bệnh khác Dấu hiệu bệnh lý:........................................................................................................ Giai đoạn cá nhiễm bệnh: ........................................................................................... Thời gian cá nhiễm bệnh: ........................................................................................... Tỉ lệ hao hụt do bệnh này gây ra: ............................................................................... Biện pháp xử lý:.......................................................................................................... ..................................................................................................................................... ..................................................................................................................................... Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 45 Phụ lục 2: Phương pháp xác định đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của vi khuẩn. Quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch TSA hoặc NA và ghi nhận các đặc điểm sau: • Hình dạng khuẩn lạc • Rìa khuẩn lạc • Bề mặt • Kích cỡ • Màu sắc • Tạo sắc tố (đổi màu môi trường) Nhuộm Gram Nhuộm Gram để quan sát hình dạng, kích cỡ và xác định vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm hay Gram dương. Các bước thực hiện • Sử dụng lame sạch, que cấy tiệt trùng, cho một ít nước muối sinh lý lên lame. • Cho một ít vi khuẩn lên lame có nước muối sinh lý và trãi đều. • Để lame khô tự nhiên. • Hơ lame qua đèn cồn để cố định vi khuẩn. • Để lame nguội và tiến hành nhuộm. • Nhuộm crystal violet khoảng 1 phút. • Rửa lame bằng nước. Nhuộm iodine khoảng 1 phút. • Rửa lame bằng dung dịch alcohol/acetone khoảng 10 giây. • Rửa lại bằng nước và để khô. • Nhuộm safranin khoảng 2 phút. • Rửa lại bắng nước sạch và để khô. • Quan sát trên kính hiển vi ở vật kính 40x và 100x có giọt dầu. Kết quả • Gram dương – Màu xanh/tím • Gram âm – màu đỏ/ hồng Tính di động Test này dùng để kiểm tra khả năng di chuyển độc lập của vi khuẩn. Nhiều loài vi khuẩn có khả năng di động nhờ vào tiêm mao. Sự di động này có thể quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp giọt treo ở vật kính 40x để xác định khả năng di động của vi khuẩn. Các bước thực hiện • Cho vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lamelle trên bàn. • Dùng que cấy tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle. • Tiệt trùng que cấy, lấy một ít vi khuẩn cho lên lamelle hoà vào nước muối sinh lý. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 46 • Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn. • Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước được treo ngược trên lamelle. • Đặt lame lên kính hiển vi quan sát ở vật kính 40x và kiểm tra tính di động của vi khuẩn. Phản ứng Oxydase Dùng que cấy phết một ít vi khuẩn lên giấy tẩm cytochrome oxidase. Vi khuẩn cho phản ứng dương sẽ làm giấy chuyển sang màu tím hoặc tím đen. Kết quả Que thử chuyển màu xanh đậm cho Phản ứng Oxydase dương tính (+) và không chuyển màu âm tính (-). Phản ứng Catalase Các bước thực hiện • Nhỏ một giọt dung dịch 3% H2O2 lên lame. • Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào dung dịch 3% H2O2. Kết quả Vi khuẩn cho phản ứng Catalase dương tính (+) sẽ gây hiện tượng sủi bọt trong dung dịch 3% H2O2 và ngược lại không sủi bọt, phản ứng Catalase âm tính (-). Khả năng lên men và oxy hoá đường glucose (O-F test) Các bước thực hiện • Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa môi trường O-F đã tiệt trùng. • Tiệt trùng que cấy thẳng và để nguội. • Dùng đầu que cấy lấy vi khuẩn trên đĩa agar và cấy thẳng vào 2 ống nghiệm. • Phủ lên một trong 2 ống nghiệm 0,5-1 ml dầu paraffin và để vào tủ ấm ở 28-300C. • Kiểm tra hằng ngày đến 7 ngày. So sánh màu của 2 ống nghiệm và ghi nhận kết quả theo bảng dưới đây. Kết quả Ống tiếp xúc không khí Ống phủ dầu paraffin Kết quả Xanh lá cây Xanh lơ ở phần trên Vàng Vàng Xanh lá cây Xanh lá cây Xanh lá cây Vàng Không phản ứng với glucose phản ứng kiềm tính phản ứng oxy hoá phản ứng lên men Phản ứng O/129 Test này dùng để phân biệt nhóm vi khuẩn Aeromonas và Vibrio. Vi khuẩn Aeromonas kháng âm tính (-), Vibrio nhạy cảm (dương tính) với hợp chất này. Các bước thực hiện • Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý tiệt trùng và lắc nhẹ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 47 • Dùng pipet tiệt trùng hút vi khuẩn trong ống nghiệm cho 5 giọt lên đĩa agar. • Tiệt trùng que trãi thuỷ tinh bằng cồn 950 và trãi đều vi khuẩn trên đĩa agar. • Đậy nắp đĩa để khoảng 1 phút. • Dán các đĩa giấy tẩm O/129 ở nồng độ 10 μg và 150 μg lên đĩa agar. • Ủ trong tủ ấm ở 28-300C và đọc kết quả sau 24 giờ. Kết quả Vi khuẩn mẫn cảm với O/129 tạo nên 1 vòng tròn vô trùng ≥ 15 mm quanh đĩa tẩm O/129. Môi trường dinh dưỡng để test O/129 phải có nồng độ muối thích hợp cho vi khuẩn vibrio phát triển, thông thường sử dụng môi trường TSA hoặc NA + 1,5% NaCl. Phản ứng Decarboxylase • Môi trường Decarboxylase + 0,5% yeast extract • Thêm 1% amino acid (Arginnine, Lysine, Ornithine) cho các phản ứng. Môi rường làm đối chứng không có amino acid. • Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. • Cấy một ít vi khuẩn vào trong 4 ống nghiệm. Sau đó phủ lên mỗi ống 0,5 ml paraffin tiệt trùng. Để trong tủ ấm ở 300C. Kết quả Đọc kết quả từ 1-4 ngày. Phản ứng (+) khi các ống nghiệm có amino acid chuyển màu khác với màu ống đối chứng và ngược lại. Khả năng sinh Indole • Môi trường Nutrient. • Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. • Để nguội. Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 300C. • Sau 48 giờ kiểm tra khả năng sinh Indole bằng cách nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm. Kết quả Vi khuẩn sinh Indole sẽ cho phản ứng (+) với một vòng màu hồng đến đỏ sậm trên bề mặt của môi trường và ngược lại. Phản ứng Voges-Proskauer (VP) • MR-VP broth. • Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội. • Thuốc thử: A: Hòa tan 5 g α-naphthol trong 100 ml ethyl alcohol. B: Hòa tan 40 g KOH trong 100 ml nước cất. • Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ 300C. • Sau 48 giờ nhỏ 0,6 ml thuốc thử A và 0,2 ml thuốc thử B vào ống nghiệm. • Lắc đều và để nghiêng ống nghiệm 30 phút. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 48 Kết quả Sự chuyển màu hồng của môi trường cho phản ứng (+) và ngược lại. Phản ứng tạo Nitrite từ Nitrate • Nitrate broth. • Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội. • Thuốc thử: A: Hòa tan 0,8% sulphanilic acid trong 5-N acid acetic. B: Hòa tan 0,5% α-naphthylmin trong 5-N acid acetic. • Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ 300C. • Sau 48 giờ nhỏ 1 ml thuốc thử A và 1 ml thuốc thử B vào ống nghiệm. Kết quả Sự chuyển màu đỏ trong vòng 1-2 phút cho phản ứng (+) và ngược lại. Khả năng sử dụng Citrate • Môi trường Simmon’s Citrate agar. • Đun sôi và khuấy cho tan. Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. • Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng trong ống nghiệm và để nguội. • Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng của ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ 300C. Kết quả Sau 2-7 ngày, vi khuẩn sử dụng Citrate tạo màu xanh lơ trong môi trường Simmon’s Citrate agar cho kết quả (+) và ngược lại. Starch hydrolysis (khả năng thủy phân Starch) • Nutrient agar + 0.5% Starch. • Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội khoảng 45 phút, đổ môi trường ra đĩa petri. • Cấy vi khuẩn lên đĩa petri và ủ ở nhiệt độ 300C. • Sau 48 giờ nhỏ thuốc thử Lugol’s Iodine (hòa tan KI và Iodine trong 10 ml nước cất rồi thêm tiếp cho đủ 100 ml) lên bề mặt môi trường có vi khuẩn. Kết quả Sự xuất hiện một vòng tròn lan rộng xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển trong vòng 30 phút cho phản ứng (+) và ngược lại. Gelatin hydrolysis (khả năng thủy phân Gelatin) • Nutrient agar + 1% Gelatin. • Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội khoảng 45 phút, đổ môi trường ra đĩa petri. • Cấy vi khuẩn lên đĩa petri và ủ ở nhiệt độ 300C. • Sau 48 giờ nhỏ thuốc thử HgCl2 lên bề mặt môi trường có vi khuẩn. Kết quả Sự xuất hiện một vòng tròn lan rộng xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển trong vòng 30 phút cho phản ứng (+) và ngược lại. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 49 Khả năng sử dụng các nguồn Carbohydrate • Nutrient broth. • 0.4% Bromothymol blue (1,6%) • 1% đường (glucose, sucrose, lactose, mannitol… ) • Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội. Dùng môi trường đường tương ứng. Cấy vi khuẩn vào trong các ống nghiệm. Ủ ở 300C. Đọc kết quả trong vòng 1-2 ngày. Nếu môi trường chuyển sang màu vàng cho phản ứng (+) và ngược lại. Khả năng sử dụng Urea • Môi trường 0,1% Pepton + 0,2% KH2PO4 + 0,0012% Phenol Red + 0,1% Glucose • Thêm 2% Urea cho phản ứng. Môi trường đối chứng không có Urea. Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. • Cấy một ít vi khuẩn vào trong 2 ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 300C. Đọc kết quả trong vòng 2 ngày. Phản ứng (+) khi các ống nghiệm có Urea chuyển màu hồng. Khả năng sinh gas và H2S • Môi trường TSI • Đun và khuấy cho tan hoàn toàn. Cho 5 ml môi trường vào ống nghiệm.Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. • Để nghiêng ống nghiệm tạo mặt phẳng nghiêng và chừa lại khoảng 1-2cm thạch đứng trong ống nghiệm và để nguội. • Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng và mặt đứng của ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ 300C. Đọc kết quả sau 14- 28 giờ. Kết quả Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen trong ống nghiệm, vi khuẩn sinh gas tạo bọt khí trong ống nghiệm. Môi trường Esculin • Cấy vi khuẩn thẳng xuống đáy và trên bề mặt môi trường. • Ủ ở nhiệt độ 300C. Đọc kết quả sau 7 ngày. Kết quả Môi trường có màu cho phản ứng (+) và ngược lại. Khả năng thủy phân Lipit (Tween 20) • Blood agar base • Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. • Để nguội khoảng 45oC, thêm 1% Tween 20, đổ môi trường ra đĩa Petri. • Cấy vi khuẩn lên đĩa Petri và ủ ở nhiệt độ 30oC. Đọc kết quả trong vòng 2 ngày. Vi khuẩn có khả năng thủy phân Tween 20 sẽ làm xuất hiện quầng mờ đục xung quanh khuẩn lạc cho kết quả (+) và ngược lại. Phản ứng Methyl red Cấy vi khuẩn vào dung dịch MR_VP đã tiệt trùng, ủ trong tủ ấm 5 ngày, sau đó nhỏ vào hai giọt dung dịch Methyl red, lắc nhẹ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 50 Phản ứng dương: đỏ; âm: vàng. Khả năng phát triển của vi khuẩn ở nồng độ muối 4% Môi trường 1% Tryptone. Thêm NaCl ứng với nồng độ 4%. Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121o C trong 15 phút. Cấy một ít vi khuẩn vào ống nghiệm, để trong tủ ấm 30oC. Sau 2-4 ngày, môi trường đục cho kết quả (+) và ngược lại. Phụ lục 3: Kết quả test Giống Edwardsiella Chỉ tiêu TèoK04(1) CHIẾNII L1105(23) TèoK406 (27) TèoK606 (28) TèoK706 (29) Nhuộm gram - - - - - Di động + + + + + Oxidase - - - - - Catalase + + + + + O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Urê - - - - - VP - - - - - Citrate + - - - - Gelatin + + - - - Metylred - - - - - TSI Đỏ/vàng Vàng/vàng + + + Indol + - + + + Arginine - + - - - Lysine + + + + + Ornithine + + + + + Glucose + + + + + Inostitol - - - - - Manitol + + - - - Saliciline - - - + - Sucrose - - - - - Rhamnose - - - - - Arabinose - + - - - Loài E. tarda Edwardsiella sp E. tarda E. tarda E. tarda Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 51 Phụ lục 3 (tt) Giống Vibrio Chỉ tiêu Chiến2K1 04(1) PhongK1 04(2) ChiếnK3 04(3) PhongL2 04(6) PhongL8 04(7) PhongK4 04(8) Nhuộm gram _ _ _ _ _ _ Di động + + + + + + Oxidase + + + + + + Catalase + + + + + + O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Urê - - - - - - VP - - - - - - Citrate - + + - - + Gelatin + + + + + + Metylred - - - - - - TSI Vàng/đỏ Vàng/vàng Vàng/vàng đỏ/vàng đỏ/vàng đỏ/vàng Indol + + + + + + Arginine + - + + + + Lysine + + + + + + Ornithine + + + + + + Glucose + + + + + + Inostitol + - - - - - Manitol - + + + + - Saliciline - - - + + + Sucrose - + - - - - Arabinose - - - - - - Loài Plesiomonas shigelloides Vibrio sp Vibrio sp Vibrio sp Vibrio sp Vibrio sp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 52 Phụ lục 3 (tt) Chỉ tiêu PhongL5 04(11) CHIẾNII L105(16) CHIẾNII K405(18) CHIẾNII K505(19) CHIẾNII K705(20) CHIẾNII K1205(24) Nhuộm gram - - - - - - Di động + + + + + + Oxidase + + + + + + Catalase + + + + + + O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Urê - - - - - - VP - - - - - - Citrate + - - - - - Gelatin + + + + + + Metylred - - - - - - TSI đỏ/vàng Vàng/vàng Vàng/vàng Vàng/vàng đỏ/vàng Vàng/vàng Indol + + + + + + Arginine + - - - - - Lysine + + + + + + Ornithine + + + + + + Glucose + + + + + + Inostitol - - - - - - Manitol + + + + + + Saliciline + - - - - - Sucrose - + - - - - Arabinose - - - - - - Loài Vibrio sp Vibrio sp Vibrio sp Vibrio sp Vibrio sp Vibrio sp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 53 Phụ lục 3 (tt) Giống Aeromonas Chỉ tiêu Chiến2K2 04(4) ChiếnK1 04(5) CHIẾNII L205(17) CHIẾNII K905(21) CHIẾNII L1005(22) TèoL50 6(25) TèoL80 6(26) Nhuộm gram _ _ _ _ _ _ _ Di động + + + + + + + Oxidase + + + + + + + Catalase + + + + + + + O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Urê - - - - - - - VP - - - - - - - Citrate + + - + + + + Gelatin + + + + + + + TSI V/V V/V V/V V/V V/V Đ/V V/V Esculin + - - - - + + Indol + + + + + + + Arginine + + + + - + + Lysine + + + + + + + Ornithine - - + + + - - Glucose + + + + + + + Inostitol - - - - - - - Saliciline + - - - - - - Sucrose + + + + + - - Arabinose + - - - - - - Loài A.. hydrophila A. sobria Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp A. sobria A. sobria Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 54 Phụ lục 3 (tt) Giống Pseudomonas Chỉ tiêu ChiếnL104(9) Nhuộm gram - Di động + Oxidase + Catalase + O/F - Urê - VP - Nitrate + Citrate - Gelatin + TSI + Esculin - Indol Arginine - Lysine - Ornithine + Glucose + Inostitol + Manitol + Saliciline - Sucrose + Tween 20 - 4%Nacl + Loài Pseudomonas sp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 55 Phụ lục 3 (tt) Giống Acinetobacter Chỉ tiêu HòaK104 (12) HòaL204 (14) ONPG - - ADH - - LDC - - ODC - - CIT - - H2S - - URE - - TDA - - IND - - VP - - GEL - + GLU + + MAN - - INO - - SOR - - RHA - - SAC - - MEL + + AMY - - ARA + + OX - - Loài Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 56 Phụ lục 4: Dấu hiệu bệnh lý của những mẫu cá phân lập được các giống, loài vi khuẩn Stt Tên hộ Dấu hiệu Mã vi khuẩn trữ Vi khuẩn Ghi chú Chiến 2K104 Vây lưng và vây hậu môn bị tưa, đốm trắng gần cuống đuôi. 1 Plesiomonas shigelloides Thận con 2 Chiến 2K204 nt 4 A. hydrophila Thận con 2 Chiến K304 Mắt lồi, màu sắc nhợt nhạt. Vây lưng và vây hậu môn có nhiều vết trắng 3 Vibrio sp Thận con 3 Chiến K104 Lồi mắt, vây lưng và vây hậu môn bị tưa. 5 A. sobria Thận con 1 1 Chiến Chiến L104 nt 9 Pseudomonas sp Gan con 1 Phong K104 Bơi lội lờ đờ, tập trung ở tầng mặt. 2 Vibrio sp Thận con1 Phong L204 Vây bình thường, phần thân bị lở loét gần sát vây lưng. 6 Vibrio sp Gan con 2 Phong L804 Bơi lội lờ đờ 7 Vibrio sp Gan con 8 Phong K404 Vây lưng bị tưa ở gần phía đầu 8 Vibrio sp Thận con 4 2 Phong Phong L504 Vây lưng bị tưa 11 Vibrio sp Gan con 5 3 Tèo Tèo K04 Màu sắc nhợt nhạt, gần vây bụng có vết loét rộng. 10 Edwardsiella tarda Thận Hòa K104 Vây bình thường, mắt đỏ, bơi lội lờ đờ. 12 Acinetobacter baumannii Thận con 1 Hoa S204 Mắt lồi, bơi lội lờ đờ, vây ngực bị tưa, bơi nghiêng một bên. 13 A. hydrophila Tỳ tạng con 2 4 Hoà Hòa L204 nt 14 Acinetobacter baumannii Gan con 2 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 57 CHIẾN L105 Vây tưa. Thân, vây có nhiều vết trắng.Thân gần như trắng hoàn toàn. 16 Vibrio sp Gan con 1 CHIẾN L205 Vây tưa, nhiều vết loét màu trắng, ăn mòn vây và thịt trên thân. 17 Aeromonas sp Gan con 2 CHIẾN K405 Vây tưa, có nhiều vết trắng.Vết trắng trên thân và vây. 18 Vibrio sp Thận con 4 CHIẾN K505 Vây tưa, có nhiều vết loét trên thân và vây. 19 Vibrio sp Thận con 5 CHIẾN K705 Toàn thân màu đen. Vây tưa. 20 Vibrio sp Thận con 7 CHIẾN K905 Màu sắc nhợt nhạt, vây tưa. 21 Aeromonas sp Thận con 9 CHIẾN L1005 Vây bị tưa, trên thân có nhiều vết trắng. 22 Aeromonas sp Gan con 10 CHIẾN L1105 Vây tưa, có nhiều vết loét trắng. Vết loét ăn mòn vây. 23 Edwardsiella sp Gan con 11 5 Chiến CHIẾN K1205 Vây tưa, có nhiều vết trắng trên vây, ăn mòn vây. 24 Vibrio sp Thận con 12 Tèo L506 Cá khỏe 25 A. sobria Gan con 5 Tèo L806 Cá khỏe 26 A. sobria Gan con 8 Tèo K406 Cá khỏe 27 Edwardsiella tarda Thận con 4 Tèo K606 Cá khỏe 28 Edwardsiella tarda Thận con 6 6 Tèo Tèo K706 Cá khỏe 29 Edwardsiella tarda Thận con 7 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 58 Phụ lục 5: Hóa chất và môi trường trong phân tích vi sinh 1. Môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Môi trường NA Môi trường TSA NA 23g TSA 40g Nước cất 1000ml Nước cất 1000ml Dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0.85g Nước cất 100ml 2. Môi trường trữ vi khuẩn NB 9g Nước cất 1000ml Glycerol 10% 3. Môi trường phản ứng sinh hóa Môi trường O/F Môi trường TSI (Tryptone Sugar Iron) OF basal medium 9.4g TSI 59,4g Glucose 1% Nước cất 1000ml Nước cất 1000ml Môi trường Sugar Fermentation NB 9g Sugar (Manitol, Salicin, Glucose, Sucrose…) 1% 1.6 % Bromothymol blue 0.4% Nước cất 1000ml Chỉnh pH 6.8 Môi trường Citrate Môi trường Nitrate Simmon ,s Citrate 24.5g Nitrate Broth 9g Nước cất 1000ml Nước cất 1000ml Môi trường Indol Môi trường MR-VP Nutrient Broth 8g MR-VP broth 17g Nước cất 1000ml Nước cất 1000ml Môi trường Decarboxylase Môi trường Esculin NB 9g Esculin 64g Yeast extract 0.5% Nước cất 1000ml Amino acid (Arginine, Lysine, Ornithine)1% Môi trường Starch hydrolyis Môi trường Gelatin hydrolyis NA 23g NA 23g Starch 0.5% Gelatin 1% Nứớc cất 1000ml Nứớc cất 1000ml 4. Hóa chất nhuộm Gram Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 59 Dung dịch Crytal Violet Crytal Violet 2g Ethanol (95%) 20ml Amonium Oxalate 0.8g Nước cất 80ml Hòa tan Crytal Violet trong Ethanol và Amonium trong nước cất. Hòa tan hai dung dịch này với nhau, để yên và dùng giấy lọc dung dịch sau 24h. Dung dịch Iodine Iodine 1g Potassium iodine 2g Nước cất 300ml Hòa tan Potassium trong 20ml nước, tiếp tục hòa tan Iodine, để yên qua đêm rồi cho vào hết phần nước cất còn lại. Dung dịch Decoloursing Ethanol/Acetone (95:5) Dung dịch Safranin Safranin 0.25g Ethanol 10ml Nước cất 90ml Hòa tan Safranin trong Ethanol, sau đó cho nước cất vào. 5. Hóa chất phản ứng sinh hóa Dung dịch H2O2 Dung dịch KOH 40% H2O2 3ml KOH 40g Nước cất 97ml Nước cất 100ml Thuốc thử Methyl red Dung dịch α- naphthol 5% Methyl red 0.04g α- naphthol 5g Ethanol 40ml Ethyl alchol 100ml Nước cất 100ml Dung dịch Kovac’s reagent P- dimethyl aminobenzaldehyde 5g Amyl alcohol 75ml HCl đậm đặc 25ml Thuốc thử môi trường Gelatin HgCl2 12g Nước cất 80ml HCl đậm đặc 16ml Hòa tan HgCl2 trong nước cất them từ từ acid vào lắc nhẹ dung dịch đến khi tan hoàn toàn. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 60 Thuốc thử Lugol’s Iodine Iodine 5g Potassium 10g Nước cất 100ml Hòa tan Potassium iodine vào iodine trong 10ml nước cất rồi thêm tiếp cho đủ 100ml. Thuốc thử phản ứng VP Thuốc thử A: Hòa tan 0.8% sulphanilic acid trong 5-N acid acetic. Thuốc thử B: Hòa tan 0.5% α- napthylamin trong 5-N acid acetic. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 61 Phụ lục 6: Các đia chỉ điều tra 1. Tiệm cá kiểng Tèo-53, Đường Cách Mạng Tháng Tám, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 2. Cơ sở cá kiểng Đồng Khởi – 2, Đường Đồng Khởi, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 3. Cửa hàng cá cảnh Ba Thôm- Đường 30/4, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 4. Cửa hàng cá cảnh Phú Vinh- Đường Lý Tự Trọng, Quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ. 5. Cá Kiểng Hoàng Vũ- Đường Trần Hưng Đạo, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 6. Tiệm Sinh Vật Cảnh-83, Đường Trần Hưng Đạo, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 7. Tiệm cá cảnh Hiếu Hòa, số 34, Đường Cách Mạng Tháng Tám, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 8. Tiệm cá cảnh Hoàng Ân, 91/15 A, Đường 30/4, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 9. Tiệm cá kiểng Thanh Phong, 146B-Đường Trần Văn Hoài, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 10. Tiệm cá kiểng Nghĩa, Đường Cách Mạng Tháng Tám, Quận Bình Thủy, Tp Cần Thơ. 11. Trại sản xuất giống cá dĩa của chú Hiền, 15A- Đường Mậu Thân, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 12. Tiệm cá cảnh của chú Hùng- Đường Trần Phú, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 13. Hộ cho cá dĩa đẻ của em Nguyễn Huỳnh Thành Công, hẻm 93, Đường Lý Tự Trọng, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 14. Tiệm cá cảnh Ba- Đường Nguyễn Văn Cừ- Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 15. Tiệm cá cảnh Thủy Cung-188 Đường Cách Mạng Tháng Tám, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 16. Hộ bán cá cảnh của chú Cường, hẻm 474- Đường Cách Mạng Tháng Tám, Quận Bình Thủy, Tp Cần Thơ. 17. Tiệm cá kiểng Thiên Hoa- Quận Cái Răng- Tp Cần Thơ. 18. Tiệm bán cá kiểng sỉ và lẻ- Đường Trần Hoàng Na- Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 19. Tiệm cá cảnh Năm Thọ- Đường Mậu Thân- Quận Ninh Kiều- Tp Cần Thơ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 62 20. Tiệm cá cảnh Long Thịnh- Đường Đường Cách Mạng Tháng Tám, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. 21. Tiệm cá cảnh Thủy Sinh- Đường 30/4, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 63 Phu lục 7: Các kỹ thuật sử dụng trong phân tích mẫu 1. Kỹ thuật tiệt trùng Do việc chẩn đoán bệnh chính xác và tin cậy phụ thuộc trực tiếp vào điều kiện tiệt trùng, khám mổ cá. Nên kỹ thuật vô trùng là khâu rất quan trọng trong suốt quá trình kiểm tra bệnh do vi khuẩn. Các dung dịch, môi trường, dụng cụ và chai lọ nuôi vi khuẩn phải được tiệt trùng. Các thao tác lấy mẫu vi sinh phải được thực hiện gần đèn cồn. Nơi làm việc trong phòng thí nghiệm phải sạch sẽ, vệ sinh bằng cồn 70o. Tránh để nắp chai lọ xuống bàn làm việc. Sau khi làm xong, bàn làm việc và các dụng cụ phải được tiệt trùng sạch sẽ và sắp xếp ngăn nắp. Khi làm việc tiếp xúc với vi khuẩn phải mang găng tay (Từ Thanh Dung, 2005) 2. Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm Trước khi giải phẫu, cá phải được giết chết bằng cách hủy não hoặc gây mê. Quan sát cá bằng mắt thường, ghi nhận tất cả các biểu hiện bệnh. Dùng cồn 700 sát trùng mặt ngoài của cá và dùng giấy lau sạch chất nhầy trên cơ thể cá để diệt các tạp khuẩn ký sinh ở phần da cá. Phân lập vi khuẩn từ vết thương Dùng cồn 700 sát trùng mặt ngoài của cá và dùng giấy lau sạch vùng vết thương. Dùng dao nhúng cồn và đốt trên ngọn lửa đèn cồn rạch 1 đường ở vết thương. Dùng que cấy đã đốt vô trùng chọc vào điểm vừa rạch, cấy trên NA hoặc TSA. Có thể lấy mẫu từ vết thương làm tiêu bản nhuộm Gram. Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng Khi mổ cá, tránh làm vở các cơ quan nội tạng. Cần nhấc mũi kéo lên tránh làm thủng ruột, vì đây là nguồn tạp nhiễm dễ gây khó khăn cho quá trình phân lập. Kiểm tra toàn bộ các cơ quan nội tạng. Ghi nhận các trạng thái không bình thường hoặc các dấu hiệu bệnh lý như quan sát màu sắc, hình dạng và các dấu hiệu khác thường trên gan, thận, tỳ tạng (màu sắc nhợt nhạt, sưng to, mềm nhũn, xuất huyết, đốm trắng). Phải quan sát các vị trí, các cơ quan, kiểm tra xoang có chất dịch không. Nếu có chất dịch, phải kiểm tra chất dịch nhiều hay ít, màu gì, độ đục ra sao. Lấy chất dịch làm tiêu bản (nhuộm Gram). Cho lên kính hiển vi kiểm tra. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ T i liệu học tập và nghiên cứu 64 Dùng dao mổ đã để nguội sau khi nhúng cồn và đốt trên đèn cồn, rạch 1 đường trên gan. Đặt que cấy tiệt trùng vào nơi vừa rạch, xoay nhẹ để lấy mẫu bệnh phẩm và cấy trên mặt NA hoặc TSA. Tương tự lấy mẫu bệnh phẩm trên thận và tỳ tạng (Từ Thanh Dung, 2005). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu