Luận án Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học các steroid phân cực từ loài sao biển archaster typicus Việt Nam

tỏ, hợp chất A7 không có liên kết 92 đôi C-24/C-25 ở phần mạch nhánh. Do đó, hợp chất A7 được xác định là 3-O- sulfothornasterol A. Hình 4.46: Cấu trúc hóa học của hợp chất A7 Bảng 4.10: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất A7 và A8 A7 A8 C δC ac δH mult bc (J = Hz) δC ac δH mult bc (J = Hz) 1 36,9 36,9 2 29,6 29,6 3 79,7 4,21 (1H, m, H-3) 79,7 4,20 (1H, m, H-3) 4 31,1 31,1 2,45 (dm, J = 12,5 Hz) 5 51,2 51,1 6 69,8 3,50 (1H, td, J = 10,5; 4,3 Hz, H-6) 69,8 3,50 (1H, td, J = 10,8; 4,4 Hz) 7 43,4 43,4 8 36,7 36,7 9 146,7 146,7 10 39,2 39,2 11 117,7 5,33 (1H, m, H-11) 117,7 5,33 (1H, d, J = 5,9 Hz) 12 43,1 43,2 13 42,5 42,5 14 55,1 55,1 15 25,9 23,9 16 23,8 25,9 17 55,3 56,3 18 13,6 0,78(3H, s, H3-18) 13,6 0,78 (3H, s, H3-18) 19 19,5 0,98 (3H, s, H3-19) 19,5 0,96 (3H, s, H3-19) 20 60,3 60,5 21 26,6 1,34 (3H, s, H3-21) 27,7 1,33 (3H, s, H3-21) 22 75,1 75,6 2,53 (Ha-22) 93 2,61 (Hb-22) 23 213,8 203,5 24 54,8 2,37 (2H, d, J=7,0 Hz) 126,4 6,19 (1H, s) 25 25,4,8 157,4 26 22,8 0,89 (d, J = 12,5) 20,9 1,90 (3H, s) 27 22,9 0,91 (d, J = 12,5 Hz) 26,9 2,11 (3H, s) c Đo trong MeOD, a 125 MHz, b 500 MHz 4.1.10. Hợp chất A9: Muối natri (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,4β,5,6α, 7β,8,14,15α,26-nonaol 6-O-sulfate Hợp chất A9 được phân lập dưới dạng chất rắn, vô định hình. Hình 4.47: Phổ 1H-NMR của hợp chất A9 Phổ 1H-NMR (hình 4.47) xuất hiện 3 nhóm methyl bậc 3 với các tín hiệu singlet tại δH 1,14 (3H, s, H-18), 1.37 (3H, s, H-19), 1,64 (brs, H-27) và một tín hiệu doublet tại δH 0,87 (3H, d, J = 6,3 Hz, H-21) của một nhóm methyl bậc 2. Cũng trên phổ này, ở vùng trường yếu còn xuất hiện các tín hiệu của các proton oximetin tại δH 4,00 (1H, m), 4,05 (1H, d, J = 4,1Hz), 4,82 (1H, d, J = 8,2 Hz), 4,37 (1H, d, J =9,1 Hz), 4,39 (1H, dd, J = 4,9; 9,5 Hz), 3,9 (1H, s) và tín hiệu của một proton olefinic tại δH 5,38 (1H, t, J = 6,5 Hz) chứng tỏ sự có mặt của một liên kết đôi dạng >C=CH-CH2-. Phổ 13C-NMR của hợp chất A9 (hình 4.48) cũng chỉ ra sự có mặt của các nguyên tử cacbon liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy tại δC 67,4; 67,9; 68,5; 72,2; 72,7; 79,4; 79,5; 83,0 và một liên kết đôi tại δC 125,1/135,5 ppm. 94 Hình 4.48: Phổ 13C-NMR của hợp chất A9 Từ các thông tin thu được, kết hợp với tham khảo, chúng tôi nhận thấy các dữ liệu phổ NMR của hợp chất A9 hoàn toàn phù hợp với kết quả phổ của hợp chất muối natri (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,4β,5,6α,7β,8,14,15α,26-nonaol 6-O-sulfate (bảng 4.11). Hợp chất này cũng đã được nhóm nghiên cứu Ricco và các cs phân lập từ loài sao biển Archaster typicus vào năm 1986 [90]. Hình 4.49: Cấu trúc hóa học của hợp chất A9 Bảng 4.11: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất A9 và chất tham khảo A9 (*) C δC ac δH mult bc (J = Hz) δC # δH## mult (J = Hz) 1 32,6 32,7 2 27,1 27,1 3 67,4 4,00 (1H, m) 67,7 4,03 (1H, m) 4 72,2 4,05 (d, J = 4,1 Hz) 72,6 4,08 (1H, d, J = 4,0 Hz) 5 78,2 78,5 95 6 79,5 4,82 (1H, d, J = 8,2 Hz) 79,8 4,84 (1H, d, J = 9,0 Hz) 7 72,7 4,37 (1H, d, J = 9,1 Hz) 72,9 4,40 (1H, d, J = 10,0 Hz) 8 79,4 79,9 9 40,2 40,5 2,35 (1H, brd , J = 11,0 Hz) 10 40,2 40,4 11 17,8 18,0 12 36,2 36,5 13 48,4 48,7 14 83,0 83,3 15 68,5 4,39 (1H, dd, J = 9,5; 4,9 Hz) 68,9 4,43 (1H, dd, J = 9,5; 5,0 Hz) 16 34,9 35,3 17 50,5 50,8 18 16,5 1,14 (3H, s, H3-18) 16,7 1,18 (3H, s) 19 17,4 1,37 (3H, s, H3-19) 17,4 1,41 (3H, s) 20 34,9 35,2 21 18,3 0,87 (3H, d, J = 6,3Hz) 18,7 0,91 (3H, d, J=7,0 Hz) 22 36,8 37,0 23 24,7 24,9 24 125,1 5,38 (1H, t, J=6,5Hz) 125,5 5,41 (1H, t, J=6,5Hz) 25 135,5 135,8 26 67,9 3,90 (3H, s) 68,2 3,94 (3H, s) 27 13,7 1,64 brs 13,9 1,67 brs c Đo trong MeOD, a 125 MHz, b 500 MHz; # 250 MHz; CD3OD, ## 62.9 MHz; đo trong pyridine (*): (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,4β,5,6α,7β,8,14,15α,26-nonaol 6-O-sulfate 4.1.11. Hợp chất A10: Muối natri (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,6α,8,14, 15α,26-hexaol 15-O-sulfate Hợp chất A10 được phân lập dưới dạng chất rắn, vô định hình. Phổ 1H-NMR xuất hiện 3 nhóm methyl bậc 3 với các tín hiệu singlet tại δH 1,02 (3H, s, H-19), 1,15 (3H, s, H-18), 1,64 (brs, H-27) và một tín hiệu doublet tại δH 0,87 (3H, d, J = 6,3 Hz, H-21) của một nhóm methyl bậc 2. Cũng trên phổ này, ở vùng trường yếu còn xuất hiện các tín hiệu của các proton oximetin tại δH 3,48 (1H, m), 3,68 (1H, dd, J = 4,2, 10,8 Hz), 4,93 (1H, dd, J = 8,8; 4,4 Hz), 3,90 (2H, s) và tín hiệu của một proton metin olephinic tại δH 5,38 (1H, t, J = 6,5 Hz). 96 Phổ 13C-NMR của hợp chất A10 (hình 4.50) cũng chỉ ra sự có mặt của các nguyên tử cacbon liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy tại δC 67,3; 68,2; 71,1; 76,6; 79,1; 84,9 và một liên kết đôi tại δC 125,3/135,5 ppm. Hình 4.50: Phổ 13C-NMR của hợp chất A10 Hình 4.51 : Cấu trúc hóa học của hợp chất A10 Bảng 4.12: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất A10 và chất tham khảo A10 (*) C δC ac δH mult bc (J = Hz) δC # δH## mult (J = Hz) 1 39,3 38,7 2 33,2 31,1 3 71,1 3,48 (1H, m) 70,6 3,52 (1H, m) 4 32,0 32,3 5 53,14 52,3 6 67,3 3,68 (1H, dd, J = 4,2; 10,8 Hz) 66,6 3,67 (1H, dd, J = 4,0; 11,0 Hz) 97 7 44,6 2,27 (1H, d, J = 4,4; 13,2 Hz) 43,8 2,31 (1Hb, dd, J = 4,0; 12,5 Hz) 8 79,1 78,4 9 48,2 47,6 10 36,3 36,6 11 18,8 18,2 12 35,4 35,7 13 47,5 46,9 14 84,9 84,4 15 76,6 4,93 (1H, dd, J = 8,8; 4,4 Hz) 76,2 4,97 16 34,6 33,9 17 51,4 50,7 18 17,4 1,15 (3H, s, H3-18) 16,8 1,19 (3H, s) 19 14,9 1,02 (3H, s, H3-19) 13,9 1,06 (3H, s) 20 34,4 34,8 21 18,5 0,85 (3H, d, J = 6,3Hz) 18,0 0,91 (3H, d, J=7,0 Hz) 22 37,2 36,6 23 25,1 24,4 24 125,3 5,38 (1H, t, J=6,5Hz) 124,9 5,40 (1H, brt, J=6,5Hz)) 25 135,5 134,9 26 68,2 3,90 (3H, s) 67,6 3,94 (3H, s) 27 13,9 1,64 brs 13,4 1,67 brs c Đo trong MeOD, a 125 MHz, b 500 MHz; # 250 MHz; CD3OD, ## 62.9 MHz; đo trong pyridine (*): (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,6α,8,14,15α,26-hexaol 15-O-sulfate [90] So sánh dữ liệu phổ NMR thu được của hợp chất A10 với hợp chất đã biết là muối natri (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,6α,8,14,15α,26-hexaol 15-O-sulfate thấy hoàn toàn trùng khớp (bảng 4.12). Hợp chất này cũng được phân lập từ loài sao biển Archaster typicus bởi nhóm nghiên cứu Riccio và các cs vào năm 1986 [90]. 4.1.12. Hợp chất A11: Muối natri (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,4β,6α,8,14, 15α,26 -heptaol 15-O-sulfate Về cơ bản, các phổ 1H-NMR và 13C-NMR (Phụ lục 12) của hợp chất A11 gần tương tự với các phổ tương ứng của hợp chất A10 (bảng 4.10), đặc biệt ở mạch 98 nhánh các giá trị độ dịch chuyển hóa học tại các vị trí tương ứng hoàn toàn trùng khớp nhau. Ở phần nhân 4 vòng của hợp chất A11, các giá trị độ dịch chuyển hóa học gần như tương tự với các giá trị tương ứng ở hợp chất A10. Chỉ có điểm khác là, ở hợp chất A11 độ dịch chuyển hóa học tại vị trí C-4 (δH 4,23; δC 72,3) dịch chuyển mạnh về phía trường thấp hơn so với giá trị C-4 δC (32,0) của hợp chất A10. Điều này chứng tỏ, hợp chất A11 có thêm một nhóm -OH tại vị trí C-4. Do đó, hợp chất A11 được xác định là muối natri (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,4β,6α,8,14, 15α,26-heptaol 15-O-sulfate. Hình 4.52: Cấu trúc hóa học của hợp chất A11 Bảng 4.13: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất A11 và A10 A10 A11 C δC ac δH mult bc (J = Hz) δC ac δH mult bc (J = Hz) 1 39,3 39,3 2 33,2 33,2 3 71,1 3,48 (1H, m) 67,6 3,43 (1H, m) 4 32,0 72,3 4,23 (1H, brs) 5 53,14 53,14 6 67,3 3,68 (1H, dd, J = 4,2; 10,8 Hz) 64,1 4,09 (1H, td, J = 4,2; 11,0 Hz) 7 44,6 2,27 (1H, d, J = 4,4; 13,2 Hz) 44,4 2,35(1H, d, J = 4,4; 12,8 Hz) 8 79,1 79,1 9 48,2 48,2 10 36,3 36,3 11 18,8 18,8 12 35,4 34,9 13 47,5 47,5 14 84,9 85,4 99 15 76,6 4,93 (1H, dd, J = 8,8; 4,4 Hz) 76,0 4,94 (1H, dd, J = 8,5; 4,5 Hz) 16 34,6 34,6 17 51,4 51,4 18 17,4 1,15 (3H, s, H3-18) 17,8 1,19 (3H, s, H3-18) 19 14,9 1,02 (3H, s, H3-19) 16,0 1,14 (3H, s, H3-19) 20 34,4 34,0 21 18,5 0,85 (3H, d, J = 6,3Hz) 18,5 0,85 (3H, d, J = 6,3Hz) 22 37,2 37,2 23 25,1 25,1 24 125,3 5,38 (1H, t, J=6,5Hz) 124,8 5,37 (1H, t, J=6,5Hz) 25 135,5 135,5 26 68,2 3,90 (3H, s) 68,3 3,90 (3H, s) 27 13,9 1,64 brs 13,5 1,63 brs c Đo trong MeOD, a 125 MHz, b 500 MHz 4.1.13. Hợp chất A12: (24R)-27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,8,14,15α,24- octanol Hợp chất A12 thu được ở dạng tinh thể hình kim, màu trắng. Phổ HR-ESIMS (phụ lục 13) của hợp chất A12 xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 485 [M-H]-. Ngoài ra, khi bắn phá tiếp mảnh ion phân tử m/z 485 bằng kĩ thuật (-) ESIMS/MS thu được các mảnh pic tại m/z 467 [(M−H)–H2O]−, 449 [(M−H)– 2H2O]−, 431 [(M−H)–3H2O]−, 413 [(M−H)–4H2O]−, 395 [(M−H)–5H2O]− chứng tỏ trong phân tử có sự mất đi lần lượt 1, 2, 3, 4, 5 phân tử H2O. Đây là đặc điểm rất đặc trưng của một hợp chất polyhydroxy steroid . Hình 4.53: Cấu trúc hóa học của hợp chất A12 100 Ngoài ra, các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (Phụ lục 13, xem 3.2.13) của A12 hoàn toàn tương tự với hợp chất A3, đặc biệt là 4 vòng A, B, C, D của khung sterol. Tuy nhiên, so với hợp chất A3, các giá trị δH 0,93; δC 10,2 ở vị trí C-26 của hợp chất A12 dịch chuyển về phía trường thấp hơn so với δH 3,57; δC 66,4 ở vị trí C-26 của hợp chất A3. Điều này chứng tỏ, ở vị trí cacbon C-26 của hợp chất A12 không gắn với nhóm –OH. Do đó, hợp chất này được xác định là (24R)-27- norcholestan-3β,4β,5α,6α,8,14,15α,24-octanol. Hợp chất này cũng đã được Riccio và nhóm nghiên cứu của Châu Văn Minh và cs phân lập từ loài sao biển này vào năm 1986 và 2007 [10, 90]. 4.1.14. Hợp chất A13: (24R)-27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,7β,8β,14α,15α, 24-nonanol. Hợp chất A13 thu được ở dạng tinh thể hình kim, màu trắng. Phổ HR-ESIMS (phụ lục 14) của hợp chất A13 xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 501 [M-H]- . Ngoài ra, khi bắn phá tiếp mảnh ion phân tử m/z 501 bằng kĩ thuật (-) ESIMS/MS thu được các mảnh pic tại m/z 463 [(M−H)–H2O]−, 445 [(M−H)– 2H2O]−, 423 [(M−H)–3H2O]−, 405 [(M−H)–4H2O]−, 383 [(M−H)–5H2O]− chứng tỏ trong phân tử có sự mất đi lần lượt 1, 2, 3, 4, 5 phân tử H2O. Tương tự như hợp chất A12, các phổ NMR cho thấy A13 cũng là một hợp chất steroid với 26 cacbon trong phân tử (phụ lục 14, xem 3.2.14). Hình 4.54: Cấu trúc hóa học của hợp chất A13 101 So sánh với hợp chất A12, chúng tôi nhận thấy tất cả các vị trí của A13 hoàn toàn trùng lặp, ngoại trừ ở vị trí C-7 nhóm CH2 đã được thay thế bằng một nhóm hidroximetin với δC 74,6; δH 4,97 (d, 11,4). Sự khác biệt này cũng được xác nhận qua phổ khối lượng EIS-MS với các pic ion tại m/z 501 [M-H]- và 525 [M+Na]+ tương ứng với công thức phân tử C26H46O9. Từ các kết quả phân tích trên cho phép khẳng định A13 là (24R)-27-Norcholestan-3β,4β,5α,6α,7β,8β,14α,15α,24-nonanol. Hợp chất này cũng đã được Riccio và nhóm nghiên cứu của Châu Văn Minh và cs phân lập từ loài sao biển này vào năm 1986 và 2007 [10, 90]. 4.1.15. Hợp chất A14: Archasteroside A (Hợp chất mới) Hợp chất A14 thu được ở dạng chất rắn, vô định hình. Hình 4.55: Phổ khối lượng HR-ESIMS của hợp chất A14 Trên phổ HR-ESIMS (-) xuất hiện pic phân tử [M-Na]- tại m/z 1285,5910 (phù hợp với CTPT C59H97O28S, 1285,5893). Trên phổ ESIMS (+) có mặt píc ion tại m/z 1331 [M+Na]+. Do đó, CTPT của A14 được xác định là C59H97O28SNa (M = 1308). Các píc ion mảnh tại m/z 1211 [(M+Na) – NaHSO4]+ trên phổ ESIMS+/MS và píc ion mảnh tại m/z 97 [HSO4]- trên phổ ESIMS-/MS chứng tỏ sự có mặt của nhóm sulfate trong phân tử A14. Ngoài ra, cũng trên phổ ESIMS/MS (-) xuất hiện tín hiệu của pic ion phân tử tại m/z 1285 [M-Na]- và một loạt các mảnh tại m/z 1139 [(M- Na) - 146]-, 993 [(M-Na)– 2 × 146]-, 847 [(M-Na) – 3 × 146]-, 701 [(M-Na) – 4 × 102 146]-, thể hiện sự mất đi từ một đến bốn đơn vị 6-deoxyhexose trong phân tử. Điều này chứng tỏ, trong cấu trúc của A14 có chứa mạch oligosaccharide. Hình 4.56: Phổ 1H-NMR của hợp chất A14 Trên phổ 1H-NMR của hợp chất A14, ở vùng trường mạnh xuất hiện tín hiệu của sáu nhóm methyl, trong đó có 3 tín hiệu singlet của 3 nhóm methyl bậc 3 (δH 0,95; 1,00; 1,45), 2 tín hiệu doublet của nhóm methyl bậc 2 với δH 0,96 (3H, d, 6,1 Hz), 0,97 (3H, d, 6,1 Hz) và một tín hiệu triplet của một nhóm methyl bậc 1 tại δH 0,95 (3H, t, 7,8 Hz). Tín hiệu doublet tại δH 2,98 (1H, d, 2,3 Hz) và doubledoublet tại δH 2,96 (1H, dd, 2,2; 8,0 Hz) chứng tỏ sự có mặt của 2 nhóm methin thuộc vòng epoxy. Vùng 3,0-4,0 ppm được xác định là của các nhóm hidroxymetin. Ngoài ra, cũng trên phổ này, ở vùng trường yếu còn quan sát thấy sự có mặt của một proton olefinic của nối đôi bị thế 3 lần >C=CH tại δH 5,26 và các tín hiệu doublet của 5 proton anomeric thuộc 5 gốc đường ở δH 4,81 (1H, d, J = 7,7 Hz), 4,91 (1H, d, J = 7,3 Hz), 4,94 (1H, d, J = 7,3 Hz), 5,00 (1H, d, J = 7,7 Hz), 5,23 (1H, d, J = 7,0 Hz). 103 Hình 4.57: Phổ 13C-NMR của hợp chất A14 Hình 4.58: Phổ DEPT 135 của hợp chất A14 Phổ 13C-NMR và DEPT của A14 cho thấy sự có mặt của 59 nguyên tử cacbon, trong đó có 10 nhóm CH3, 9 nhóm CH2, 36 nhóm CH và 4 cacbon bậc 4. Sự có mặt của nối đôi bị thế ba lần trong phân tử được xác định tại tín hiệu cộng hưởng δC 116,4 (d)/145,6 (s). 5 nhóm CH với các tín hiệu cộng hưởng tại δC 102,3; 103,7; 104,9; 105,0; 106,9 được xác định là các cacbon anomeric của 5 gốc đường. Ngoài ra, cũng trên các phổ này, trong vùng từ 60-90 ppm là các tín hiệu cộng hưởng của 27 nguyên tử cacbon liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy, bao gồm: 25 cacbon oximethin tại δC 73,6; 91,6; 69,6; 77,4; 82,4; 75,1; 85,6; 71,4; 94,2; 77,5; 104 75,7; 72,8; 73,6; 74,9; 72,3; 71,7; 76,2; 76,7; 75,4; 73,5; 77,3; 80,5; 59,5; 1 cacbon oximetilen tại δC 62,2; và 1 cacbon bậc 4 liên kết với oxi tại δC 71,2. Từ những thông tin trên có thể nhận dạng A14 là một hợp chất asterosaponine với mạch oligosaccharide có chứa 5 đơn vị đường đơn. Việc xác định chính xác độ dịch chuyển hóa học của các cacbon và các proton tương ứng theo phổ HSQC cho thấy, hợp chất A14 tương tự như hợp chất regularoside A [98]. Tuy nhiên, có điểm khác với regularoside A là ở vị trí C-24 của mạch nhánh, nhóm –CH3 bị thay thế bởi một nhóm –CH2CH3. Điều này cũng được khẳng định qua phổ MS, giữa A14 và regularoside A khác nhau 14 đơn vị C. Hình 4.59: Phổ HSQC của hợp chất A14 Giá trị độ dịch chuyển hóa học δH, δC của hợp chất A14 thông qua tương tác H-C trên phổ HSQC, tương tác HMBC, NOESY của các proton và cacbon cũng như so sánh với các giá trị phổ NMR của hợp chất regularoside A được trình bày trên bảng 4.14; 4.15. 105 Hình 4.60: Phổ HMBC của hợp chất A14 Hình 4.61: Phổ COSY của hợp chất A14 Phân tích chi tiết các tương tác nhận được trên phổ 1H-1H COSY cho phép ghép nối các mảnh cấu trúc từ C-1 đến C-8; C-11 đến C-13; C-13/C-18; C-22 đến C-26; C-25/C-27; C-24/C-28/C-29 của phần aglycon của A14 (Hình 4.64). Trên cơ sở các kết quả phổ COSY thu được, cùng các tương tác HMBC giữa các proton của 106 nhóm H-18 (δH 1,00) với C-12 (δC 42,2)/C-13 (δC 41,7) /C-14 (δC 53,7) /C-17 (δC 59,5); H-19 (δH 0,95) với C-1 (δC 35,9)/C-5 (δC 49,2)/C-9 (δC 145,6)/C-10 (δC 38,2); H-21 (δH 1,45) với C-17 (δC 59,5)/C-20 (δC 71,2)/C-22 (δC 64,6); H-28 (δC 1,34) với C-23 (δC 56,0)/C-24 (δC 48,4)/C-25 (δC 29,7)/C-29 (δC 12,2); H-29 (δH 0,95) với C- 28 (δC 21,2) /C-24 (δC 48,4); H-11 (δH 5,26) với C-8 (δC 35,2)/C-10 (δC 38,2)/C-13 (δC 41,7) cho phép khẳng định vị trí của các nhóm H-18, H-19, H-21 và một liên kết đôi ở vị trí 9(11) của phần nhân steroid; phần nhánh có chứa cầu epoxy tại C-22/C- 23, một nhóm hydroxy tại C-20 và có một nhóm –CH2CH3 tại vị trí C-24. Hình 4.62: Phổ NOESY của hợp chất A14 Hóa lập thể phần anglycon của A14, ngoài so sánh dữ liệu phổ NMR với hợp chất regularoside A còn được chứng minh bằng các tín hiệu tương tác trên phổ NOESY. Tương tác NOE giữa H-3/H-19; H-6/H-19 cho phép khẳng định proton H- 3 cấu hình α, H-6 có cấu hình β. Cấu hình 20-R được xác định dựa trên độ dịch chuyển hóa học của H3-21 ở δ 1,28 (theo tài liệu [90], δ 1,28 ứng với cấu hình 20-R còn δ 1,13 ứng với cấu hình 20S-hydroxy-22,23-epoxy steroid, CD3OD). 107 Hình 4.63: Cấu trúc hóa học của hợp chất A14 Hình 4.64: Các tương tác 1H-1H COSY, HMBC chính của hợp chất A14 Trên phổ NOESY có tương tác giữa H-22/H-24; H-22/H-21 mà H-21 có cấu hình α, do đó, H-22, H-24 cũng có cấu hình α. Trên phổ 1H-NMR, hằng số tương tác giữa H-22 và H-23 rất nhỏ, với J = 2,3 Hz, bởi vậy, H-23 được xác định ở dạng β. Qua đó, hóa lập thể của C-22, C-23, C-24 được xác định là: 22R, 23S, 24S. Từ 108 những phân tích trên đã khẳng định được A14 là một asterosaponine có aglycon (20R,22R,23S,24S) 22,23-epoxy-24-ethyl-5α-cholest-9(11)-ene-3β,6α,20-triol liên kết glycoside tại vị trí C-6 và liên kết với nhóm O-sulfat tại vị trí C-3. Hình 4.65: Tương tác NOESY chính phần aglycon của hợp chất A14 Bảng 4.14: Kết quả phổ NMR phần aglycon của A14 và regularoside A STT δCb (*) δCb A14 δHc (J in Hz) A14 NOESY HMBC 1 36,2 35,9 1,41- 1,66 (2H, m) H11, H3 2 29,5 29,4 1,89 - 2,78 (2H, m) H19, H3 3 77,9 77,3 4,89, m H1, H2, H5 4 31,0 30,7 1,70 - 3,47 (2H, m) H19 5 49,5 49,2 1,52, m H3 6 80,9 80,5 3,81, m H19 7 41,6 41,3 1,25 - 2,70 (2H, m) 8 35,5 35,2 2,06, m H18 9 146,0 145,6 10 38,5 38,2 11 116,7 116,4 5,26, m H1 C8, C10, C13 12 42,5 42,2 2,09 - 2,31 (2H, m) H18, H21 C9, C11, C14 13 42,0 41,7 14 54,0 53,7 1,19, m H17 15 23,2 25,0 1,16 - 1,67 (2H, m) 16 25,3 22,9 1,86 - 2,13(2H, m) H22 17 59,8 59,5 1,70, m H14, H22 C18 18 13,8 13,2 1,00, s H8, H12, H21, H22 C12, C13, C14, C17 19 19,3 19,1 0,95, s H2, H4, H6 C1, C5, C9, C10 20 71,4 71,2 21 23,7 23,5 1,45, s H12, H18, H22 C17, C20, C22 Hình 4.65: Tương tác NOESY chính phần aglycon của hợp chất A14 109 22 64,3 64,6 2,89, d (2,3) H16, H17, H21 C20 23 57,6 56,0 2,96, dd (2,2, 8,5) H21, H25 C24 24 42,0 48,4 1,01, m 25 31,8 29,7 1,88, m H23, H25 C23, C24 26 20,4 19,7 0,97, d (6,1) C24, C25, C27 27 19,4 19,3 0,96, d (6,1) C24, C25, C26 28 13,0 21,2 1,34, m C23, C24, C25, C29 29 12,2 0,95, t (7,8) C24, C28 a C5D5N, b 125.8 MHz, c 500 MHz. (*): regularoside A [89] Bảng 4.15: Kết quả phổ NMR chuỗi đường của A14 và regularoside A STT δCb (*) δCb (A14) δHc (J in Hz) (A14) HMBC (H→C) NOESY (H→H) Glu 1 105,1 105,0 4,91, d (7,3) C-6 of aglycon H-6 of aglycon; H-3, H-5 Glu 2 74,0 73,6 3,97, t (8,2) C-1 Glu 3 91,9 91,6 3,84, t (8,8) C-2, C-4 Glu; C-1 Qui2 H-1 Glu 4 69,9 69,6 4,04, t (9,6) 5 77,7 77,4 3,82, m H-1 Glu 6 62,7 62,2 4,44, dd (2,5, 12,0) 4,27, dd (5,3, 11,9) Qui2 1 103,9 103,6 4,96, d (7,3) C-3 Glu H-3, H-5 Qui2; H-3 Glu 2 82,6 82,5 4,07, t (7,9) C-1 Qui2, C-1 Qui4 3 75,2 75,1 4,11, t (8,8) C-2 Qui2 H-1 Qui2 4 85,8 85,6 3,55, t (8,4) C-3, C-5 Qui2; C-1 Qui3 H-6 Qui2, H-1 Qui3 5 72,6 71,4 3,88, m H-1 Qui2 6 18,0 18,0 1,71, d (6,0) C-4, C-5 Qui2 H-4 Qui2 Qui3 1 102,3 102,3 4,82, d (8,0) C-4 Qui2 H-3, H-5 Qui3; H-4 Qui2 2 84,3 84,3 3,98, t (8,2) C-3 Qui3 3 77,5 77,5 4,10, t (9,1) H-1 Qui3 4 76,0 75,7 3,60, t (9,0) C-3, C-5 Qui3 H-6 Qui3 5 73,1 72,8 3,68, m H-1 Qui3 6 17,9 17,7 1,46, d (6,0) C-4, C-5 Qui3 H-4 Qui3 Fuc 1 106,9 106,9 5,01, d (7,7) C-2 Qui3 H-2 Qui3; H-3, H-5 Fuc 110 2 71,6 73,7 4,38, dd (7,8, 9,6) C-1, C-3 Fuc 3 75,1 74,9 4,04, dd (3,9, 9,7) H-1 Fuc 4 73,7 72,3 3,97, d (2,5) H-6 Fuc 5 72,0 71,7 3,77, m C-4 Fuc H-1 Fuc 6 17,0 16,9 1,48, d (6,5) C-5 Fuc H-4 Fuc Qui4 1 105,2 105,9 5,25, d (7,4) C-2 Qui2 H-3, H-5 Qui4 2 75,6 76,3 4,02, t (8,5) 3 76,9 76,9 4,07, t (8,9) H-1 Qui4 4 76,4 75,5 3,96, t (8,8) H-6 Qui4 5 73,8 73,6 3,69, m H-1 Qui4 6 18,3 17,8 1,80, d (6,5) C-4, C-5 Qui4 H-4 Qui4 a C5D5N, b 125.8 MHz, c 500 MHz. (*): regularoside A [89] Ở phần mạch saccharide, sự có mặt của 3 đơn vị đường Qui, 1 đơn vị đường Glu và 1 đơn vị đường Fuc được chỉ ra trên phổ 1D-TOCSY. Thứ tự liên kết giữa các phân tử đường và phần aglycon cũng được khẳng định dựa trên các tín hiệu tương tác trên phổ HMBC. Trên phổ HMBC cho các tín hiệu thể hiện có sự tương tác giữa H-1 của Glu với H-6 (C-6) của anglycol, H-1 của Qui2 với H-3 (C-3) của Glu, H-1 của Qui3 và H-4 (C-4) của Qui3, H-1 của Qui4 với C-2 của Qui2 và H-1 của Fuc với H-2 (C-2) của Qui3. Từ đó suy ra được vị trí liên kết giữa các đường với nhau và giữa cụm đường với phần aglycon của hợp chất steroid là Fuc(1-2)- Qui1(1-4)-Qui2(1-3)[Qui3(1-2)]-Glu(3-1)-Aglycon. Dựa vào các tín hiệu trên phổ 1D-, 2D-NMR ta xác định được các giá trị cacbon và proton của cụm đường (xem bảng 4.15). Cấu hình D của các phân tử đường có trong A14 (glucose, fucose, quinovose) được chứng minh bằng cách thủy phân với TFA 2M, rồi tiến hành phản ứng ancol phân với (R)-(-)-octanol, sau đó acetyl hóa và xác định tR của dẫn xuất octyl thu được bằng phương pháp GC theo quy trình của Leontein và cs [55]. Kết quả phổ GC của các đơn vị đường được trình bày trong phần 3.2.15. Từ các kết quả phổ khối lượng HR-ESIMS, phổ 1D-, 2D-NMR nêu trên, hợp chất A14 được xác định là (20R,22R,23S,24S)-6α-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-β- D-quinovopyranosyl-(1→4)-β-D-quinovopyranosyl-(1→3)-[β-D-quinovopyranosyl- 111 (1→2)]-β-D-glucopyranosyl}-22,23-epoxy-24-ethyl-20-hydroxy-5α-cholest-9(11) - ene-3β-yl sulfat. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên phân lập được từ thiên nhiên và được chúng tôi đặt tên là Archasteroside A. 4.1.16. Hợp chất A15: Archasteroside B (Hợp chất mới) Hình 4.66: Phổ (-)/(+) HR-ESIMS của hợp chất A15 Trên phổ HRESIMS (-) (hình 4.61) xuất hiện pic phân tử tại m/z 1243,5796 [M-Na]- (tính toán lý thuyết cho công thức C57H95O27S, 1243,5787), trên phổ ESIMS(+) cho pic tại m/z 1289 [M+Na]+. Qua đó thiết lập được công thức phân tử của A15 là C57H95O27SNa. So sánh các dữ kiện phổ phần đường của A14 và A15 cho thấy, ở cả hai hợp chất đều chứa 5 phân tử đường đơn, tuy nhiên, có sự khác biệt là tại C-6 ở phần aglycon của A14 liên kết với 3-β-D-glucopyranosyl còn phần aglycon của A15 liên kết với 3-β-D-quinovopyranosyl (xem bảng 16). Trên phổ ESIMS/MS(-) xuất hiện pic phân tử tại m/z 1243 [M-Na]- và một loạt các mảnh píc tại m/z 1097 [(M-Na)-146]-, 951 [(M-Na)-2x146]-, 805 [(M-Na)-3x146]-, 659 [(M- Na)-4x146]-, 513 [(M-Na)-5x146]-, chứng tỏ sự mất đi 1, 2, 3, 4, 5 đơn vị 6- 112 deoxyhexose trong phân tử. Dựa vào các tín hiệu trên phổ NOESY và HMBC đã xác định được vị trí liên kết của các phân tử đường: H-1 của Qui1 liên kết với C-6 của anglycon, H-1 của Qui2 liên kết với C-3 của Qui1, H-1 của Qui3 liên kết với C- 4 của Qui2, H-1 của Qui4 và C-2 của Qui2, H-1 của Fuc và C-2 của Qui3. Các dữ liệu trên phổ 1H- và 13C-NMR (phụ lục 16) của phần aglycon trong A15 tương tự với các tín hiệu trong A14 và đều chỉ ra sự có mặt của khung steroid Δ9(11)-3β,6α-dihydroxy liên kết với nhóm sufat ở vị trí C-3, liên kết với cụm đường ở vị trí C-6 và ở mạch nhánh có nhóm OH ở vị trí C-20 nhưng không có nhóm chức epoxy ở vị trí C-22, C-23 (xem bảng 17). Tuy nhiên các tín hiệu của 4 cacbon C-14, C-15, C-16, C-18 và proton H-18 trên phổ NMR của A15 khác với các tín hiệu phổ ở các vị trí này của A14. Cùng với các dữ kiện trên phổ khối lượng chứng tỏ sự có mặt của một nhóm OH ở vị trí C-16 của vòng D. Hình 4.67: Phổ HSQC của hợp chất A15 113 Hình 4.68: Cấu trúc hóa học của hợp chất A15 Hình 4.69: Phổ 1H-1H COSY của hợp chất A15 Từ các tín hiệu trên phổ COSY, HMBC, HSQC và NOESY cho thấy, hợp chất glycoside này chứa phần aglycon là (20S)-5α-cholest-9(11)-en-3β,6α,16β,20β- tetraol, tương tự như phần aglycon của hợp chất downeyoside K, được phân lập từ loài sao biển Henricia downeyae [83]. Đây là hợp chất mới, lần đầu tiên được phân lập trong tự nhiên. 114 Hình 4.70: Phổ NOESY của hợp chất A15 NaO3SO O HO OH H3C O O HO O O HOHO OHH3C O O HO HO H3C O O HO OH H3C O HO Qui4 Qui1 Fuc OH Qui3 Qui2 H3C OH HMBC NOESY COSY Hình 4.71: Các tương tác 1H-1H COSY, HMBC chính của hợp chất A15 Bảng 4.16: Dữ kiện phổ 1H-, 13C-NMR, HMBC và NOESY của các đường trong A15 (C5D5N) C No. δC δH (J Hz) HMBC (H→C) NOESY (H→H) Qui1 1 104,8 4,80, d (8,1) C-6 của aglycon H-6 của aglycon; H-3, H-5 Qui1 115 a C5D5N, b 125,8 MHz, c 500 MHz. Bảng 4.17: Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR phần aglycon của A14 và A15 STT C δCac A14 δHba A14 δCac A15 δH (J Hz) A15 STT C δCac A14 δH (J Hz) A14 δCac A15 δH (J Hz) A15 1 35,9 1,66, m 35,9 1,68, m 15 25,0 1,67,m 38,9 2,46, dt (7,5; 12,7) 1,41, m 1,41, m 1,16, m 1,65, m 2 29,4 2,78, m 29,4 2,79, m 16 22,9 1,86, m 73,2 4,87, m 2 73,8 3,95, t (8,1) C-3 Qui1 3 91,0 3,76, t (8,9) C-1 Qui2 H-1 Qui1, H-1 Qui2 4 74,4 3,52, t (9,2) C-3 Qui1 H-6 Qui1 5 71,7 3,67, m H-1 Qui1 6 18,2 1,56, d (6,0) C-4, C-5 Qui1 H-4 Qui1 Qui2 1 103,6 4,96, d (7,3) C-3 Glu H-3, H-5 Qui2; H-3 Glu 2 82,5 4,07, t (7,9) C-1 Qui2, C-1 Qui4 3 75,1 4,11, t (8,8) C-2 Qui2 H-1 Qui2 4 85,6 3,55, t (8,4 C-3, C-5 Qui2; C-1 Qui3 H-6 Qui2, H-1 Qui3 5 71,4 3,88, m H-1 Qui2 6 18,0 1,71, d (6,0) C-4, C-5 Qui2 H-4 Qui2 Qui3 1 102,3 4,82, d (8,0) C-4 Qui2 H-3, H-5 Qui3; H-4 Qui2 2 84,3 3,98, t (8,2) C-3 Qui3 3 77,5 4,10, t (9,1) H-1 Qui3 4 75,7 3,60, t (9,0) C-3, C-5 Qui3 H-6 Qui3 5 72,8 3,68, m H-1 Qui3 6 17,7 1,46, d (6,0) C-4, C-5 Qui3 H-4 Qui3 Fuc 1 106,9 5,01, d (7,7) C-2 Qui3 H-2 Qui3; H-3, H-5 Fuc 2 73,7 4,38, dd (7,8, 9,6) C-1, C-3 Fuc 3 74,9 4,04, dd (3,9, 9,7) H-1 Fuc 4 72,3 3,97, d (2,5) H-6 Fuc 5 71,7 3,77, m C-4 Fuc H-1 Fuc 6 16,9 1,48, d (6,5) C-5 Fuc H-4 Fuc Qui4 1 105,9 5,25, d (7,4) C-2 Qui2 H-3, H-5 Qui4 2 76,3 4,02, t (8,5) 3 76,9 4,07, t (8,9) H-1 Qui4 4 75,5 3,96, t (8,8) H-6 Qui4 5 73,6 3,69, m H-1 Qui4 6 17,8 1,80, d (6,5) C-4, C-5 Qui4 H-4 Qui4 116 1,89 m 1,89 m 2,13, m 3 77,3 4,89, m 77,4 4,89, m 17 59,5 1,70, m 60,4 1,38, d (7,0) 4 30,7 3,47, m 30,7 3,45, d (11,2) 18 13,2 1,00,s 14,8 1,42, s 1,70, m 1,70, m 19 19,1 0,95, s 19,2 0,97, s 5 49,2 1,52, m 49,3 1,50, m 20 71,2 76,0 6 80,5 3,81, m 80,2 3,80, dt (4,4, 10,8) 21 23,5 1,45,s 26,3 1,47, s 7 41,3 2,70, m 41,3 2,71, dt (5,0; 12,6) 22 64,6 2,89, d (2,3) 44,7 1,96, m 1,25, m 1,29, q (11,5) 23 56,0 2,96, dd (2,2; 8,5) 22,5 1,62, m 8 35,2 2,06, m 35,0 2,26, m 1,48, m 9 145,6 145,7 24 48,4 1,01, m 40,0 1,20, m 10 38,2 38,2 25 29,7 1,88, m 27,9 1,55, m 11 116,4 5,26, m 116,5 5,26, d (5,8) 26 19,7 0,97, d (6,1) 22,6 0,88, d (6,5) 12 42,2 2,31, m 42,9 2,34, dd (6,4, 6,3) 27 19,3 0,96, d (6,1) 22,5 0,87, d (6,5) 2,09, m 2,00, m 28 21,2 1,34, m 13 41,7 41,6 29 12,2 0,95, t (7,8) 14 53,7 1,19, m 52,0 1,14, m a C5D5N, b 125,8 MHz, c 500 MHz. 4.1.17. Hợp chất A16: Archasteroside C (Hợp chất mới) Hợp chất A16 được phân lập dưới dạng bột vô đình hình, không màu. Hình 4.72: Phổ HR-ESIMS, HR-ESIMS/MS của hợp chất A16 117 Trên phổ khối phân giải cao HRESIMS (-) xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 1241,5648 [M-Na]- (tính toán lý thuyết cho công thức C57H93O27SNa, 1241,5630). Trên phổ ESIMS (+) xuất hiện pic m/z 1287 [M+Na]+. Từ các tín hiệu trên phổ khối và phổ NMR chứng tỏ A16 có công thức phân tử là C57H93O27SNa. Sự xuất hiện các mảnh pic tại m/z 1167 [(M-Na)-NaHSO4]+ trên phổ ESI (+) và mảnh pic m/z 97 [HSO4]- gợi ý rằng trong A16 có nhóm sufat. Hình 4.73: Phổ 1H-NMR của hợp chất A16 Hình 4.74: Phổ 13C-NMR của hợp chất A16 Trên phổ 1H và 13C-NMR cho các tín hiệu thể hiện phần aglycon của A16 có mặt 2 nhóm methyl góc CH3-18, CH3-19 (δH 0,77; 0,98 ppm; δC 13,6; 19,7 ppm), một liên kết đôi ở vị trí 9(11) (δH 5,33 ppm; δC 146,4; 117,8 ppm), một nhóm CH-3 (δH 4,17 ppm, δC 79,7 ppm) liên kết với nhóm sulfate và một nhóm CH-6 (δH 3,57 ppm, δC 81,2 ppm) liên kết với mạch oligosaccharide. Đây là các tín hiệu rất đặc 118 trưng của một nhân steroid của hợp chất asterosaponine. Các dữ liệu phổ này cũng chỉ ra rằng, ở phần mạch nhánh của aglycon có một nhóm methyl bậc bốn δH 0,9 (s, H-21), 2 nhóm methyl bậc 2 CH3-26 và CH3-27 (δH 2 x 0,90 ppm; δC 22,9, 22,8 ppm), 2 nhóm methylene C H2-22 và CH2-24 [δH 2,61 ppm, d, J = 15,2 Hz, 2,51 ppm, d, J = 15,3 Hz, 2,37 ppm, dd, J= 3,6 Hz, J=7,1 Hz; δC 55,3, 54,8 ppm) và một nhóm C=O ở vị trí C-23 (δc 213,8 ppm). Các giá trị phổ trên rất phù hợp với các giá trị phổ của một aglycon đã biết (thornasterin A) là 3β,6α,20-trihydroxyxholest- 9(11)-ene-23-on với cụm đường gắn ở vị trí C-6 và một nhóm sulfate gắn ở vị trí C- 3. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của tín hiệu singlet tại vị trí C-21 δH 1,33 (H- 21) mà cấu hình của vị trí C-20 được xác định là S [90]. Cấu trúc của phần aglycon của hợp chất CH3 được khẳng định lại bằng phổ 2 chiều 1H-1H COSY-45, HSQC, HMBC, ROESY. Dữ liệu phổ được trình bày trên bảng 4.17.a, bảng 4.17.b. Hình 4.75: Phổ HSQC của hợp chất A16 Trên phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu thể hiện sự có mặt của năm proton anomeric δH 4,40, 4,53, 4,45, 4,41 and 4,52 (với hằng số tương tác J = 7,6 ÷ 8,0 Hz) kết hợp với phổ HSQC xác định được các nguyên tử cacbon liên kết với các proron anome tại δC 104,6, 104,1, 103,0, 2 × 107,0. Từ các dữ kiện phổ trên, đồng thời, kết hợp với phổ khối lượng cho thấy, A16 có năm phân tử đường đơn được liên kết với nhau và liên kết với aglycon bởi liên kết β. Các tín hiệu doublet ở δH 2 × 1,26, 1,43, 119 1,24, and 1,36 trên phổ 1H-NMR của các nhóm CH3 chứng tỏ sự có mặt của 5 phân tử đường đơn không có mặt của nguyên tử oxy ở vị trí cacbon số 6. Trên phổ ESIMS xuất hiện tín hiệu của pic ion phân tử tại m/z 1241 [M-Na]- và một loạt các mảnh píc m/z 1141 [(M - Na) - 100], 995 [(M-Na)-100-146]-, 849 [(M-Na)-100- 2x146]-, 703 [(M-Na)-3 × 146]-, 557 [(M - Na) - 100 - 4 × 146],411 [(M-Na)-100 - 5 × 146] chứng tỏ sự mất đi 1,2,3,4,5 đơn vị 6-deoxyhexose trong phân tử. Hình 4.76: Phổ HMBC của hợp chất A16 NaO3SO O HO O OH H3C O O O HO O O HO HO OH H3C O HO HO O H3C O HO OH H3C HO H3C Qui1 Qui2Fuc1 Fuc2 Qui3 OH O COSY ROESY HMBC Hình 4.77: Các tương tác 1H-1H COSY, HMBC, ROESY chính của hợp chất A16 120 Bảng 4.18: Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR phần aglycon hợp chất A16 C δCab δHac ( J Hz) C δCab δHac ( J Hz) 1 36,8 1,42 (1H, m, H-1) 14 55,1 1,27 (1H, m, H-14) 1,72 (1H, m, H’-1) 15 25,9 1,77 (1H, m, H-15) 2 29,6 2,25 (1H, m, H-2) 1,22 (1H, m, H’-15) 1,62(1H, m, H’-2) 16 23,7 1,88 (1H, m, H-16) 3 79,7 4,17 (1H, m, H-3) 1,69 (1H, m, H’-16) 4 31,0 2,59 (1H, d, J=11,9,H-4) 17 60,4 1,64 (1H, m, H-17) 1,32 (1H, m, H’-4) 18 13,6 0,77 (3H, s, H-18) 5 50,1 1,25 (1H, m, H-5) 19 19,7 0,98 (3H, s, H-19) 6 81,2 3,57 (1H, m, H-6) 20 75,0 - 7 41,8 2,38 (1H, m, H-7) 21 26,6 1,33 (3H, s, H-21) 0,96 (1H, m, H’-7) 22 55,3 2,61 (1H, d, J=15,2,H-22) 8 36,4 2,07 (1H, m, H-2) 2,51(1H,d, J=15,2,H’-22) 9 146,4 - 23 213,8 - 10 39,2 - 24 54,8 2,37 (2H, dd, J=3,6; J=7,1; H-24) 11 117,8 5,33 (1H, m, H-11) 25 25,4 2,08 (1H, m, H-25) 12 43,4 2,24 (1H, m, H-12) 26 22,9 0,90 (3H, s, H-26) 2,04 (1H, m, H’-12) 27 22,8 0,90 (3H, s, H-27) 13 42,5 - a MeOD-d4, b 125,8 MHz, c 700 MHz. Bảng 4.19: Số liệu phổ 1H- NMR, 13C-NMR, HMBC và ROESY của các đường trong hợp chất A16 C   δCab δHac ( J Hz) HMBC ROESY Qui1 1 104,6 4,40 (d, J = 7,6) 6 aglycon; 3, 5 Qui1 2 74,4 3,33 (m) 3 91,1 3,33 (m) 1 Qui1 4 75,2 3,03 (t, J = 8,8) 3 Qui1 6 Qui1 5 72,6 3,35 (m) 1 Qui1 6 18,2 1,26 (d, J = 6,2) 4, 5 Qui1 4 Qui1 Qui2 1 104,1 4,53 (d, J = 7,7) 3 Qui1 3, 5 Qui2 2 85,1 3,48 (t, J = 8,4) 1, 3 Qui2; 1 Qui3 1 Qui3 3 75,4 3,70 (t, J = 9,2) 4 Qui2 1, 5 Qui2 4 85,6 3,24 (t, J = 9,3) 3, 5 Qui2 6 Qui2, 1 Fuc1 5 72,4 3,56 (m) 1, 3 Qui2 6 18,3 1,43 (d, J = 6,1)) 4, 5 Qui2 4 Qui2 121 Fuc1 1 103,0 4,45 (d, J = 7,6) 3, 5 Fuc1; 4 Qui2 2 82,3 3,67 (m) 3 Fuc1, 1 Fuc2 3 75,1 3,67 (m) 1 Fuc1 4 72,5 3,62 (br,s) 6 Fuc1 5 72,1 3,72 (m) 4 Fuc1 1 Fuc1 6 16,5 1,26 (d, J = 6,2) 4, 5 Fuc1 4 Fuc1 Fuc2 1 107,0 4,41 (d, J = 8,0) 2 Fuc1 3, 5 Fuc2 2 73,8 3,53 (dd, J = 7,7, J = 10,1) 1, 3 Fuc2 3 75,0 3,47 (dd, J = 9,4, J = 3,5) 1 Fuc2 4 73,0 3,56 (d, J = 2,9) 3 Fuc2 6 Fuc2 5 72,6 3,62 (m) 1, 4 Fuc2 1 Fuc2 6 16,8 1,24 (d, J = 6,4) 4, 5 Fuc2 4 Fuc2 Qui3 1 107,0 4,52 (d, J = 7,7) 2 Qui2 5 Qui3; 2 Qui2 2 76,7 3,28 (d,d, J = 7,3, J = 9,5) 3 77,0 3,32 (t, J = 9,1) 4 76,2 3,10 (t, J = 9,2) 3 Qui3 6 Qui3 5 74,7 3,34 (m) 1 Qui3 6 18,0 1,36 (d, J = 6,3) 4, 5 Qui3 4 Qui3 a MeOD-d4, b 125.8 MHz, c 700 MHz. Dựa trên việc phân tích phổ 1D-TOCSY (phụ lục 17) của từng đơn vị đường xác định được độ dịch chuyển hóa học và hằng số tương tác của proton ở vị trí C1- C5 của các đơn vị đường quinovose và proton ở vị trí C1-C4 của các đơn vị đường fucose. Thông số phổ của proton ở vị trí C5 của các đơn vị đường fucose được xác định bằng cách chiếu bước sóng điện tử vào nguyên tử H không liên kết với nguyên tử oxy (H-6). Dựa vào các tín hiệu phổ hai chiều 1H-1H COSY-45, HSQC, HMBC, ROESY cho phép chúng tôi xác định được các giá trị cacbon và proton của mạch oligosaccharide trong hợp chất A16, ngoại trừ các vị trí C2 (δC 82,3, δH 3,67) và C3 (δC 75,1, δH 3,67) của phân tử đường Fuc1. Vị trí của các nhóm thế trong phân tử Fuc1 được xác định dựa vào phổ HMBC có khả năng thiết lập mối tương quan giữa các proton và các nguyên tử cacbon liền kề. Trên phổ HMBC có tín hiệu thể hiện sự tương tác giữa proton anomeric H-1(δH 4,45) với nguyên tử C tại δC 82,3. Do đó, vị trí C2 của Fuc1 được xác định. Các dữ liệu phổ của các phân tử đường đơn rất phù hợp với dữ liệu phổ của β-fucopyranose, β-quinovopyranose ở cuối mạch và 3-O-β- 122 quinovopyranose, 2,4–di-O-β-quinovopyranose và 2-O-β-fucopyranose trong một hợp chất asterosaponine đã biết. Thủy phân A16 với 2M TFA sau đó xử lý với (R)-(-)-octan-2-ol và tiến hành acetyl hóa thu được fucoside octyl acetylat và quinovose octyl acetylat. Cấu hình D- của Fuc và Qui được xác định bằng cách so sánh thời gian lưu của các dẫn xuất với các mẫu chuẩn D-, L- của các đường đơn sử dụng phương pháp sắc kí khí (GC). Vị trí của các liên kết glycoside giữa các phân tử đường và giữa mạch oligosaccharide với phần aglycon của hợp chất A16 được chứng minh bởi các phổ ROESY, HMBC (bảng 4.18, bảng 4.19): C-1 của Qui1 tương tác với H-6 của aglycol, H-1 của Qui2 với C-3 của Qui1, H-1 của Qui3 với H-1, C-1 của Qui2, H-1 của Fuc1 với H-4 của Qui2, H-1 của Fuc2 với C-2 của Fuc1. Hình 4.78: Cấu trúc hóa học của hợp chất A16 Từ các thông tin trên, cấu trúc hóa học của hợp chất A16 được xác định là (20S)-6α-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-β-D-fucopyranosyl-(1→4)-[β-D-quinovopy ranosyl-(1→2)]-β-D-quinovopyranosyl-(1→3)-β-D-quinovopyranosyl}-20-hydroxy- 5α-cholest-9(11)-en-23-one-3β-yl sulfate. Đây là một asterosaponine mới có cấu trúc của mạch đường gồm toàn các đơn vị đường bị deoxy hóa, β-D-fucose, β-D- quinovose, rất hiếm gặp trong tự nhiên. 123 Bảng 4.20: Bảng tổng hợp các chất phân lập được từ sao biển Archaster typicus AT4 {(24R)-27-nor-5α-cholestane-3β, 6α,8,14,15α,24-hexaol} A1 {(24R)-27-nor-5α-cholestane- 3β,4β,6α,8,14,15α,24-heptaol)} (Hợp chất mới) A2 ((24R)-24-O-α-D-glucopyranosyl-27- nor-5α-cholestan-3β,4β,5,6α,7β,8,14, 15α,24-nonaol) (Hợp chất mới). HO OH OH OH OH OH OH OH OH A3 ((24R)-5α-cholestane-3β,4β,5,6α,8,14,15α, 24,26-nonaol) (Hợp chất mới) A4 (Muối natri (24S)- & (24R)-5α-cholest- 25(27)-ene-3β,6α,8,14,15α, 24,26- heptaol 15-O-sulfate) (Hợp chất mới) A5 (Muối natri (23E)-27-nor-25-oxo-5α- cholest-23-ene-3β,6α,8,14,15α-pentaol 15-O- sulfate) (Hợp chất mới) A6 (3-O-sulfoasterone) A7 (Δ24-3-O-sulfothornasterol A) 124 OSO3Na OH OH O A8 (Δ24-3-O-sulfothornasterol) A9 (Muối natri (24E)-5α-cholest-24-ene- 3β,4β,5,6α, 7β,8,14,15α,26-nonaol 6-O- sulfate) A10 (Muối natri (24E)-5α-cholest-24-ene- 3β,6α,8,14,15α,26-hexaol 15-O-sulfate) A11 (Muối natri (24E)-5α-cholest-24-ene- 3β,4β,6α,8,14,15α,26-heptaol 15-O-sulfate) A12 ((24R)-27-norcholestan-3β,4β,5α,6α, 8,14,15α,24-octanol) A13 ((24R)-27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,7β,8β, 14α,15α,24-nonanol) A14-Archasteroside A (Hợp chất mới) 125 A15 - Archasteroside B (Hợp chất mới) A16 - Archasteroside C (Hợp chất mới) 4.2. Kết quả thử hoạt tính sinh học 4.2.1. Hoạt tính chống ung thư in vitro Với mục đích tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính chống ung thư, một số hợp chất phân lập được từ sao biển Archaster typicus được tiến hành thử hoạt tính sinh học dựa trên mô hình sàng lọc in vitro của Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Hoa Kỳ. Các hợp chất này được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư và ảnh hưởng của chúng đến hoạt động của một số yếu tố phiên mã liên quan đến ung thư là NF-κB và p53. 126 Các yếu tố phiên mã NF-κB và p53 là các nhóm protein tham gia vào hoạt động đọc và dịch mã di truyền trên gen. Khi bị kích thích bởi nhiều tác nhân khác nhau, chúng liên kết với phân tử ADN tại vị trí đặc hiệu và khởi động chương trình làm tăng hoặc giảm quá trình biểu hiện gen đích thông qua việc kích hoạt hay kìm hãm sự có mặt của ARN polymease. Các nhóm protein này đóng nhiều vai trò sinh lý quan trọng bao gồm điều khiển các quá trình phiên mã trong tế bào, đáp ứng các tín hiệu từ môi trường nội bào và ngoại bào, điều khiển hoạt động của các chu trình tế bào... NF-κB điều chỉnh hơn 200 gen, bao gồm cả những gen tham gia vào quá trình miễn dịch và viêm, ức chế quá trình chết theo chương trình, tăng sinh tế bào và các phản hồi tiêu cực của NF-κB. NF-κB điều hòa tích cực gen mã hóa cytokine (TNFα, IL1β, IL1β, IL6, IL2, IL12, IFNγ), các phân tử tế bào bám dính mạch máu (VCAM)-1, phân tử bám dính gian bào (ICAM)-1, các chemokine (IL-8, protein viêm đại thực bào (MIP)-1α, methul (MCP)-1 và các emzyme cảm ứng (COX-2, iNOS). NF-κB cũng đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn quá trình chết theo chương trình (programmed cell dead hay apoptosis) của tế bào thông qua cơ chế thúc đẩy sự sinh sản các gen antiapoptosis (Bcl-2, Bcl-XL, cIAP-1 và -2, TRAF-1 và 2-) và ức chế các gen proapoptosis (Bax, Fas, p53, caspase-1). Các yếu tố liên quan đến sự di căn của tế bào ung thư như các protein MMP (bao gồm MMP-2, -3, -9 và -13), ICAM, VCAM cũng chịu tác động của yếu tố nhân NF-κB. Ngoài ra, NF-κB cũng có thể ngăn chặn di cư tế bào nội môi thông qua việc tăng bài xuất các chất ức chế tế bào của MMP-1 như được mô tả trong tế bào hình sao [54]. Như vậy sự kích hoạt NF-κB có liên quan mật thiết đến sự phát sinh và phát triển ung thư. P53 (còn được gọi là protein 53 hoặc protein khối u 53), là một loại protein ức chế khối u ở người được mã hóa bởi gen TP53 [29, 42, 73, 88]. P53 có vai trò sinh học rất quan trọng bởi nó tham gia điều chỉnh chu kỳ của tế bào, duy trị sự ổn định bằng cách ngăn chặn sự đột biến gen [4, 7, 15, 17, 39, 68, 75, 76, 83, 97, 106]. 1 protein thuộc nhóm p53 (có trong nấm men) cố định chặt chẽ 3 đặc hiệu trên một 127 protein khác gọi là cyclin. Protien này được tổng hợp rất nhanh khi đi qua điểm kiểm soát và trong một thời gian rất ngắn. Protein p53 do sự cố định này có hình dạng hoạt động của protein kinase nó trở nên có khả năng cố định các gốc phosphat trên các protein đã được xác định. Sự cố định đó diễn ra ở serin và threonin. Protein p53 (khối lượng 53 kDa) được cảm ứng mỗi khi ADN bị thương tổn do bức xạ ion hóa hay do các chất gây đột biến phosphoprotein. Phospho này là một yếu tố kiểm soát sự biểu lộ của nhiều gen, đặc biệt sự biểu lộ của gen WAF mà protein tương ứng ngăn cản replicase A cố định trên ADN (ức chế sự tái bản). p53 cũng là một yếu tố ức chế sự phiên mã (vậy là ức chế cả sự dịch mã gen mã hóa cho cyclin E. Sự ức chế replicase A và cyclin E, cả hai phong bế chu kì tế bào ở G1 dẫn đến sự ngừng nhân bản, cho phép tế bào liên quan sửa chữa các thương tổn xảy ra ở ADN Ngoài ra, p53 cũng được biết đến là loại gen bị đột biến thường xuyên nhất trong ung thư và thiếu hụt nó dẫn tới nguy cơ gia tăng mạnh các bệnh nguy hiểm này [70, 71]. Việc đánh giá và tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính ức chế sự kích hoạt yếu tố phiên mã NF-κB hay kích hoạt p53 có thể cung cấp thêm một đích cho việc ngăn ngừa hoặc dự phòng ung thư. 4.2.1.1. Hoạt tính gây độc tế bào Các hợp chất phân lập được từ loài sao biển Archaster typicus được tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung ở người (Hela) và dòng tế bào ung thư biểu mô của chuột (JB6 Cl 41) theo phương pháp được mô tả trong mục 2.2.3.1. Kết quả thử nghiệm cho thấy, có 2 hợp chất có kí hiệu là A14 và A15 thể hiện có khả năng gây độc tế bào. Kết quả thí nghiệm được nêu trong bảng 4.21. Bảng 4.21: Kết quả hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ loài sao biển Archaster typicus IC50 (µM) Dòng tế bào Chất A14 A15 128 Hela 24 14 JB6 P+ Cl14 37 18 Hợp chất A15 thể hiện hoạt tính mạnh hơn với giá trị IC50 lần lượt là: 14 µM; 18 µM. 4.2.1.2. Tác động đến sự hoạt hóa các yếu tố nhân NF-κB; p53- A15 có hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với 2 dòng tế bào ung thư nên được lựa chọn để đánh giá tác động lên các yếu tố nhân NF-κB; p53- theo phương pháp được mô tả trong mục 2.2.3.2. Kết quả cho thấy: Ở nồng độ 12,5 µM, hợp chất A15 thể hiện hoạt tính kích hoạt phiên mã p53 mạnh gấp 1,3 lần khi so với mẫu tế bào không được xử lí với chất thử A15. Song, không kích hoạt NF-κB. Theo tìm hiểu của chúng tôi đây là hợp chất asterosaponine đầu tiên được thử nghiệm hoạt tính phiên mã yếu tố nhân p53 và cho kết quả khá khả quan. Từ các kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và tác động lên các yếu tố phiên mã NF-κB và p53 có thể thấy hoạt tính kích hoạt p53 và không kích hoạt NF-κB là những cơ chế ức chế sự phát triển tế bào ung thư của A15. Kết quả này giúp định hướng nghiên cứu tiếp để có thể sử dụng sao biển trong việc phân lập hoạt chất và bào chế dược phẩm có tác dụng trong điều trị ung thư cũng như tạo các chế phẩm dạng thực phẩm chức năng phục vụ cuộc sống. 4.2.2. Hoạt tính ức chế sự thụ tinh và phát triển của phôi thai trên loài cầu gai Strongylocentrotus intermedius Các hợp chất thuộc nhóm polyhydroxy steroid phân lập được từ loài sao biển Archaster typicus được đánh giá hoạt tính ức chế sự thụ tinh bằng thử nghiệm gây độc giao tử (trứng, tinh trùng) của loài cầu gai Strongylocentrotus intermedius theo phương pháp được mô tả trong mục 2.2.3.3. Kết quả thí nghiệm được trình bày như trong bảng 4.22. 129 Đối với thử nghiệm ức chế sự thụ tinh của trứng loài Cầu gai Strongylocentrotus intermedius (bảng 4.22), bốn hợp chất A1, A9, A10, A11 đều thể hiện hoạt tính. Trong đó, có ba hợp chất A9, A10, A11 thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị EC100 lần lượt là: 25 μg/ml, 25 μg/ml, 25 μg/ml; EC50 lần lượt là: 12 μg/ml, 20 μg/ml, 17 μg/ml. Hợp chất A1 thể hiện hoạt tính yếu hơn với giá trị EC50 75 μg/ml. Bảng 4.22: Kết quả hoạt tính gây độc giao tử Nồng độ ức chế (μg/ml)a Tinh trùng cầu gai Phôi bào 8 Hợp chất EC100 EC50 EC100 EC50 A1 100 75 >100 - A2 >100 - >100 - A3 >100 - >100 - A4 100 - >100 - A5 100 85 >100 - A9 25 12 50 23 A10 25 20 100 90 A11 25 17 100 60 (-) không thử Đối với thử nghiệm ức chế sự phát triển phôi bào 8 của loài Cầu gai Strongylocentrotus intermedius, ba hợp chất A9, A10, A11 đều thể hiện hoạt tính, trong đó hợp chất A9 thể hiện có độ độc mạnh nhất với giá trị EC100 50 μg/ml, EC50 23 μg/ml. Hai hợp chất còn lại A10, A11 có độc tính yếu hơn với giá trị EC100 lần lượt là: 100 μg/ml, 100 μg/ml; EC50 lần lượt là: 90 μg/ml, 60 μg/ml. Thử nghiệm gây độc giao tử (trứng, tinh trùng) của loài cầu gai là phép thử tiêu chuẩn để đánh giá độc tính ở mức tế bào và phôi thai, có thể sử dụng được cả hai loại kính hiển vi quang học và điện tử. Phương pháp này thích hợp không chỉ trong đánh giá độ độc sinh thái biển (mức độ ô nhiễm nước biển) mà còn để đánh giá độ độc với người, là phương pháp thử nhanh độ độc của thuốc cũng như để nghiên cứu dị dạng của bào thai [53]. 130 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu sâu về lớp chất steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus thu thập ở vùng biển Việt Nam. 1. Về nghiên cứu hóa học: Đã phân lập được 17 hợp chất. Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và các phương pháp hóa lý khác. Các hợp chất phân lập và xác định cấu trúc được bao gồm: • (24R)-27-nor-5α-cholestane-3β,6α,8,14,15α,24-hexaol (AT4) • (24R)-27-nor-5α-cholestane-3β,4β,6α,8,14,15α,24-heptaol (A1) • (24R)-24-O-α-D-glucopyranosyl-27-nor-5α-cholestan-3β,4β,5,6α,7β,8,14, 15α,24-nonaol (A2). • (24R)-5α-cholestane-3β,4β,5,6α,8,14,15α,24,26-nonaol (A3) • Muối natri (24S)- & (24R)-5α-cholest-25(27)-ene-3β,6α,8,14,15α,24,26- heptaol 15-O-sulfate (A4) • Muối natri (23E)-27-nor-25-oxo-5α-cholest-23-ene-3β,6α,8,14,15α-pentaol 15-O-sulfate (A5) • 3-O-sulfoasterone (A6) • 3-O-sulfothornasterol A (A7) • Δ24-3-O-sulfothornasterol A (A8) • Muối natri (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,4β,5,6α,7β,8,14,15α,26-nonaol 6-O- sulfate (A9) • Muối natri (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,6α,8,14,15α,26-hexaol 15-O-sulfate (A10) 131 • Muối natri (24E)-5α-cholest-24-ene-3β,4β,6α,8,14,15α,26-heptaol 15-O- sulfate. (A11) • (24R)-27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,8,14,15α,24-octanol (A12) • (24R)-27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,7β,8β,14α,15α,24-nonanol (A13) • Archasteroside A (A14) • Archasteroside B (A15) • Archasteroside C (A16) Trong số đó có 9 hợp chất mới là AT4, A1, A2, A3, A4, A5, A14, A15 và A16. Ngoài ra, 6 hợp chất A6, A7, A8, A9, A10, A11 lần đầu tiên được tìm thấy ở loài Archaster typicus của Việt Nam. 2. Về nghiên cứu hoạt tính sinh học: 2.1. Đã khảo sát hoạt tính chống ung thư in vitro của các hợp chất mới qua đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư và ảnh hưởng đến hoạt động của các yếu tố phiên mã NF-κB và p53. Kết quả cho thấy: - Các hợp chất A14 và A15 có hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư cổ tử cung ở người (Hela) (IC50 là 24 µM và 14 µM) và dòng tế bào ung thư biểu mô của chuột (JB6 Cl 41) với giá trị IC50 là: 37 µM và 18 µM - Ở nồng độ 12,5 µM hợp chất A15 kích hoạt phiên mã p53 mạnh gấp 1,3 lần so với mẫu đối chứng song không kích hoạt NF-κB. Đây là hợp chất asterosaponine đầu tiên được đánh giá tác dụng đến hoạt động phiên mã của yếu tố nhân p53 và cho kết quả khá khả quan. Kết quả này cũng cho thấy hoạt tính kích hoạt p53 và không kích hoạt NF-κB cũng là cơ chế ức chế sự phát triển của tế bào ung thư của A15. 2.2. Đã khảo sát hoạt tính ức chế sự thụ tinh và phát triển phôi thai của các hợp chất polyhydroxy steroid bằng thử nghiệm gây độc giao tử (trứng, tinh 132 trùng) của loài cầu gai Strongylocentrotus intermedius. Kết quả thử nghiệm cho thấy: Có 4/8 hợp chất thử nghiệm có hoạt tính gây độc tế bào với tinh trùng và phôi bào dạng 8 của loài Cầu gai. Trong số đó hợp chất A9 có hoạt tính mạnh nhất với giá trị EC50 = 12 μg/ml trong phép thử gây độc tinh trùng và EC50 = 23 μg/ml trong phép thử gây độc phôi bào 8. Kiến nghị: Đây là công trình bước đầu nghiên cứu về hoạt tính sinh học của một số hợp chất steroid phân cực phân lập từ loài sao biển. Các thử nghiệm sinh học này mới chỉ dừng ở mức độ thăm dò, cần được tiếp tục khảo sát toàn diện hơn. 133 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 1. Alla A. Kicha, Natalia V. Ivanchina, Trinh T. T. Huong, Anatoly I. Kalinovsky, Pavel S. Dmitrenok, Sergey N. Fedorov, Sergey A. Dyshlovoy, Pham Q. Long, Valentin A. Stonik (2010), “Two new asterosaponines, archasterosides A and B, from the Vietnamese starfish Archaster typicus and their anticancer properties”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 20, pp. 3826-3830. 2. Natalia V. Ivanchina, Alla A. Kicha, Trinh T.T. Huong, Anatoly I. Kalinovsky, Pavel S. Dmitrenok, Irina G. Agafonova, Pham Q. Long, Valentin A. Stonik (2010), “Highly hydroxylated steroids of the starfish Archaster typicus from the vietnamese waters”, steroids, 75, pp. 897–904. 3. Alla A. Kicha, Trinh T. T. Huong, Natalia V. Ivanchina, Anatoly I. Kalinovsky, Pavel S. Dmitrenok, Sergey N. Fedorov, Sergey A. Dyshlovoy, Pham Q. Long, Valentin A. Stonik (2010), “Asterosaponin archasteroside C from the starfish Archaster typicus, Russ Chem Bull, 50, pp. 724-527. 4. Trịnh Thị Thu Hương, Phạm Quốc Long, Alla A. Kicha, Natalia V. Ivanchina, Anatoly I. Kalinovsky, Pavel S. Dmitrenok, and Valentin A. Stonik (2009), “A new polyhidroxy steroid from the starfish Archaster typicus”, Tạp chí Hoá học, T. 47 (4A), Tr. 374-379, 5. Trịnh Thị Thu Hương, Chu Quang Truyền, Nguyễn Tiến Đạt, Châu Văn Minh, Phạm Quốc Long, Alla A. Kicha, Natalia V. Ivanchina, Anatoly I. Kalinovsky, Pavel S. Dmitrenok, Valentin A. Stonik (2010), “Các hợp chất Asterosaponine phân lập từ loài sao biển Archaster typicus Việt Nam”, Tạp chí khoa học và công nghệ, T. 48 (4A), Tr.1-8. 134 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AT4 Phụ lục 2: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A1 Phụ lục 3: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A2 Phụ lục 4: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A3 Phụ lục 5: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A4 Phụ lục 6: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A5 Phụ lục 7: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A6 Phụ lục 8: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A7 Phụ lục 9: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A8 Phụ lục 10: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A9 Phụ lục 11: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A10 Phụ lục 12: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A11 Phụ lục 13: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A12 Phụ lục 14: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A13 Phụ lục 15: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A14 Phụ lục 16: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A15 Phụ lục 17: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT A16 Phụ lục 18: PHỔ GC CÁC ĐƯỜNG CỦA HỢP CHẤT A14, A16 VÀ PHỔ GC CỦA CÁC ĐƯỜNG CHUẨN 148 163 172 182 190 198 206 209 213 216 220 224 228 235 242 269 285 301