Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG Trang nhan đề Lời cảm ơn Mục lục Một số từ viết tắt Đặt vấn đề Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu, phương pháp Chương 3: Kết quả- biện luận Kết luận & kiến nghị Danh mục các công trình Tài liệu tham khảo Phụ lục ?ĐẶT VẤN ĐỀ “Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh Nội tiết và các Rối loạn chuyển hóa mà điển hình là bệnh đái tháo đường (Bệnh tiểu đường)”. Nhận xét này của nhóm chuyên gia về dự báo tình hình bệnh tật của Tổ chức Y tế thế giới đã đang trở thành hiện thực với những con số cụ thể. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2008) [77], hiện nay trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh tiểu đường và ước tính con số này sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030, chiếm khoảng 5% dân số thế giới. Đáng lo ngại hơn là các biến chứng của bệnh, cứ 10 giây có một người tử vong do nguyên nhân đái tháo đường, cứ 30 giây lại có một người đái tháo đường bị cắt cụt chi và cứ mỗi ngày có 5000 người mất khả năng nhìn do biến chứng mắt của bệnh. Mỗi năm có hơn 3,2 triệu người chết vì các bệnh liên quan tới đái tháo đường tương đương với số người tử vong vì bệnh HIV/AIDS [1]. Bệnh tiểu đường (BTĐ) đang trở thành gánh nặng cho mỗi nền kinh tế xã hội, mặc dù mỗi năm hàng nghìn tỷ đôla Mỹ được chi phí cho điều trị bệnh, nhưng chưa bao giờ và sẽ không bao giờ những chi phí khổng lồ về kinh tế có thể lấp đầy được những tổn thất, nhất là những mất mát về tinh thần do bệnh tật gây ra. Thực tế đáng lo ngại hơn là tình trạng bệnh xuất hiện ngày càng nhiều từ lớp trẻ [1]. Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc BTĐ ngày càng cao và ở các thành phố lớn tỷ lệ này đã tăng gấp đôi từ 2% lên 4% trong 10 năm giai đoạn 1990-2000. Số người mắc BTĐ hiện nay khoảng 4,5 triệu người, chiếm 5,7% dân số, trở thành nước có tốc độ phát triển BTĐ nhanh nhất thế giới [1]. Nguyên nhân của BTĐ là do thiếu insulin hoặc do cơ thể người bệnh kháng insulin. Insulin là một polypeptide hormone được sinh ra nhờ các tế bào ß của tuyến tụy động vật, có vai trò điều hoà lượng đường trong máu. Phương Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề -2- pháp điều trị BTĐ phổ biến hiện nay là tiêm insulin định kỳ cho người bệnh. Do số lượng người mắc BTĐ ngày càng cao nên nhu cầu sử dụng insulin càng lớn. Ở châu Âu, lượng insulin đã tăng lên 3 lần trong vòng 12 năm từ 1995-2007. Theo ước tính, nhu cầu insulin trên thế giới tăng từ khoảng 5.000kg trong nam 2007 lên khoảng 16.000kg vào năm 2010, với thị trường dự tính khoảng 11,8 tỷ Mỹ kim [41]. Năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh học Genetech đã dòng hóa thành công gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu hiện trong E. coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sản xuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin. Năm 1982, Humulin đã được FDA (Food & Drug Administration - Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành. Hiện nay có nhiều công ty dược phẩm trên thế giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis với nhiều loại sản phẩm insulin khác nhau. Công nghệ sản xuất insulin hiện nay thường được tiếp cận theo hai phương pháp: phương pháp một chuỗi polypeptide và phương pháp hai chuỗi polypeptide. Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp bằng phương pháp một chuỗi polypeptide bao gồm ba bước cơ bản. Đầu tiên là bước tạo dòng chủng chủ (thường là E. coli) có khả năng mang gen ngoại tổng hợp các chất tiền thân của insulin (proinsulin). Đây là khâu then chốt quyết định sự thành công của công nghệ do cần phải biến đổi các codon thích hợp để tăng cường hiệu quả biểu hiện. Tiếp theo là bước lên men, cảm ứng biểu hiện, thu nhận proinsulin và xử lý để thu nhận insulin. Protein được biểu hiện dưới dạng thể vùi nằm trong tế bào chất, do vậy cần phải biến tính để làm tan, sau đó tiến hành tái gấp cuộn để có proinsulin có cấu hình tự nhiên. Proinsulin tái gấp cuộn được xử lý bằng protease cắt loại đoạn nối nội phân tử (đoạn peptide C) để thu insulin có hoạt tính. Đối với phương pháp sản xuất theo 2 mạch polypeptide, Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề -3- trước hết phải tạo dòng các chủng chủ riêng rẽ mang các gen mã hóa cho 2 chuỗi polypeptide khác nhau (chuỗi A, chuỗi B). Sau đó tinh chế thu nhận các chuỗi polypeptide A và B và thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide để thu nhận insulin có hoạt tính. Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng insulin rất cao, tuy nhiên toàn bộ nguồn insulin sử dụng cho bệnh nhân mắc BTĐ đều phải nhập ngoại nên vừa gây tốn kém ngoại tệ vừa không chủ động được nguồn thuốc để đáp ứng chữa trị kịp thời cho bệnh nhân. Để đảm bảo cho điều trị toàn bộ bệnh nhân mắc BTĐ hàng ngày với liều dùng 0,5-1,0 U/kg trọng lượng cơ thể trong một ngày [78], thì Việt Nam cần phải nhập ngoại khoảng từ 120-240 triệu U/ năm, tương đương 420-840 kg insulin/ năm (100U =3,5 mg). Năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin tái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, có thể tiếp cận được công nghệ hiện đại để phát triển qui trình sản xuất insulin người tái tổ hợp trong nước, mang lại triển vọng góp phần giải quyết khó khăn trên. Mặc dù bản quyền sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã hết hạn tuy nhiên các công ty dược phẩm vẫn tiếp tục giữ những bí quyết công nghệ có tính thế mạnh của công ty nên rất khó tiếp cận để có được qui trình công nghệ đầy đủ nhằm sản xuất insulin. Do vậy, cần phải nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ riêng dựa trên những thông tin đã công bố và trình độ công nghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin trong nước đáp ứng được yêu cầu đặt ra. Năm 2007, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trị bệnh đái tháo đường”, mã số Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề -4- KC.04.09/06-10. Nội dung nghiên cứu của luận án là thực hiện một phần trong nội dung của đề tài cấp nhà nước này. Về mặt khoa học, mục tiêu của luận án nhằm bước đầu nghiên cứu qui trình tổng hợp insulin người tái tổ hợp theo phương pháp một chuỗi polypeptide trong E. coli bao gồm tạo dòng E. coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin, lên men, tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý để tạo insulin có hoạt tính. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công nghệ protein để tạo ra chế phẩm insulin có hoạt tính dùng làm thuốc trị bệnh tiểu đường. Luận án tập trung nghiên cứu cụ thể các vấn đề sau: - Tạo chủng E. coli tái tổ hợp có mang vector biểu hiện mini-proinsulin tái tổ hợp của người. - Xây dựng qui trình lên men nuôi cấy chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin. - Thiết lập qui trình thu nhận và tinh sạch mini-proinsulin từ tế bào chủng E. coli. - Xây dựng qui trình tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý thu nhận insulin có hoạt tính. - Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột.

pdf10 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 22/08/2013 | Lượt xem: 3507 | Lượt tải: 3download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
-132- Luaän aùn Tieán só Phuï luïc PHUÏ LUÏC 5.1. PHUÏ LUÏC 1: Xaùc ñònh trình töï amino acid cuûa 6His-MPI baèng phöông phaùp MS/MS 5.1.1. Phöông phaùp 5.1.1.1. Thuûy phaân protein trong gel baèng enzyme trypsin Protein sau khi ñöôïc phaân taùch qua SDS-PAGE ñöôïc caét nhoû (kích thöôùc xaáp xæ 1mm3) vaø tieán haønh thuûy phaân protein trong gel theo caùc phöông phaùp ñaõ ñöôïc moâ taû (Cohen SL vaø Chait BT, 1997; Shevchenko A et al, 2000; Stensballe A vaø Jensen ON, 2001). Caùc protein sau thuûy phaân ñöôïc chieát ruùt ra khoûi gel baèng dung dòch chieát (60% acetonitrile, 1% TFA). Dòch chieát coù chöùa caùc peptide ñöôïc laøm khoâ baèng heä maùy SPD1010 SpeedVacñ System (ThermoSavant, USA). 5.1.1.2. Phaân taùch thaønh phaàn protein baèng saéc kyù loûng moät chieàu Hoãn hôïp peptide sau khi ñöôïc thuûy phaân ñöôïc phaân tích qua heä thoáng saéc kyù loûng moät chieàu thoâng qua coät ngöôïc pha (reverse phase, RP-C18). Maãu ñöôïc ñöa vaøo vôùi theå tích 20μl vaø ñöôïc ñaåy leân coät vôùi toác ñoä doøng 30μl/ phuùt baèng 0,1% formic acid. Caùc peptide baùm treân coät RP-C18 (75μm id.x15cm) ñöôïc thoâi ra baèng pha linh ñoäng A (0,1% formic acid) vaø B (85% acetonitrile vaø 0,1% formic acid) vôùi toác ñoä doøng 200nl/phuùt, theo gradient noàng ñoä tuyeán tính töø 5 ñeán 100% pha linh ñoäng B trong 90 phuùt. Coät ngöôïc pha C18 ñöôïc gaén vaøo ñaàu ñöa maãu Silica Tip keát noái vôùi maùy khoái phoå QSTA®XL baèng nguoàn ESI. 5.1.1.3. Ghi phoå LC-ESI-MS/MS Maùy khoái phoå QSTA®XL ñöôïc vaän haønh ôû cheá ñoä IDA (Information Dependent Acquisition) ñeå thöïc hieän vieäc chuyeån töø queùt phoå TOF MS ñôn ñoái vôùi caùc ion naèm trong daûi khoái (TOF mass) töø 400 ñeán 1200 sang khoái phoå lieân -133- Luaän aùn Tieán só Phuï luïc tieáp treân 3 ion phaân töû coù maät ñoä cao nhaát vaø lôùn hôn 15 ñöôïc xaùc ñònh töï ñoäng nhôø phaàn meàm BioAnalyst QS v1.8 (AppliedBiosystems). Sai soá veà khoái (mass tolerance) ñöôïc ñaët ôû möùc 100ppm, thôøi gian khoâng thöïc hieän laïi MS/MS ñoái vôùi moät maûnh laø 90 giaây. Hieäu ñieän theá ñöôïc ñaët ñeå ion hoùa maãu laø 2200V. 5.1.1.4. Phaân tích phoå khoái peptide baèng phaàn meàm Mascot Phoå khoái MS/MS ñöôïc phaân tích baèng phaàn meàm Mascot v1.8, ñaây laø phaàn meàm coù khaû naêng phaân tích döõ lieäu phoå MS/MS ñeå nhaän daïng protein döïa treân thuaät toaùn Mowse (Perkins DN et al., 1999) ñöôïc phaùt trieån bôûi MatrixScience (London, UK). Cô sôû döõ lieäu ñöôïc duøng ñeå tìm kieám trong Mascot laø NCBInr, moät cô sôû döõ lieäu caùc protein khoâng ñoàng nhaát vaø toaøn dieän vôùi khoaûng treân 1,7 trieäu trình töï khaùc nhau ñöôïc caøi ñaët treân moät maùy tính HP Proliant Server. 5.1.2. Keát quaû Saéc kyù ñoà keát quaû phaân taùch thaønh phaàn protein qua heä thoáng saéc kyù loûng moät chieàu ñöôïc ghi nhaän treân Hình 5.1. + Phoå treân cuøng laø phoå ion toång soá hoãn hôïp peptide sau thuyû phaân. Keát quaû cho thaáy löôïng peptide thu ñöôïc khaù cao (> e5), ñaûm baûo löôïng peptide cho phaân tích MS/MS. + Phoå thöù hai laø phoå queùt TOF MS cuûa hoãn hôïp peptide + Phoå thöù ba vaø boán laø phoå MS/MS cuûa hai ion coù m/z töông öùng 549,2 vaø 417,2. Ñaây laø keát quaû phaân tích vaø tìm kieám protein töø nhöõng peptide ñöôïc phaân tích MS/MS. Keát quaû tìm kieám chæ ra insulin vôùi soá ñaêng kyù gi:266373 [76] vaø maûnh peptide ñöôïc tìm thaáy baèng thöïc nghieäm laø FFYTPKTR. Phoå MS/MS cuûa peptide coù trình töï FFYTPKTR ñöôïc xaùc ñònh baèng thöïc nghieäm. -134- Luaän aùn Tieán só Phuï luïc Hình 5.1. Keát quaû phaân tích vaø nhaän daïng MPI. -135- Luaän aùn Tieán só Phuï luïc Taøi lieäu tham khaûo: 7. Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS (1999), Probabilitybased protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis, 20, pp. 355-356. 8. Cohen S L, Chait BT (1997), Mass spectrometry of whole proteins eluted from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis gels. Analytical Biochemistry, 247, pp. 257-267. 9. Stensballe A, Jensen ON (2001), Simplified sample preparation for mass spectrometry: in-gel digestion on the maldi probe. Proteomics, 1, pp. 955-66. 5.2. PHUÏ LUÏC 2: Hình aûnh caùc thieát bò chính trong nghieân cöùu 5.2.1. Heä thoáng leân men Hình 5.2. Heä thoáng leân men mini-jar 5L. -136- Luaän aùn Tieán só Phuï luïc Hình 5.3. Heä thoáng leân men pilot. 5.2.2. Maùy phaù teá baøo microfluidizer Hình 5.4. Maùy phaù teá baøo Microfluidizer M-110EH-30. -137- Luaän aùn Tieán só Phuï luïc 5.2.3. Maùy tinh cheá protein FPLC (A) (B) Hình 5.5. Heä thoáng FPLC duøng ñeå tinh cheá protein. (A) qui moâ phoøng thí nghieäm; (B) qui moâ pilot. 5.2.4. Maùy phaân tích protein RP-HPLC Hình 5.6. Heä thoáng saéc kyù ngöôïc pha RP-HPLC. -138- Luaän aùn Tieán só Phuï luïc 5.2.5. Maùy loïc protein daïng tieáp tuyeán (A) (B) Hình 5.7. Heä thoáng loïc tieáp tuyeán protein. (A) qui moâ phoøng thí nghieäm; (B) qui moâ pilot. 5.2.6. Ly taâm sinh khoái Hình 5.8. Maùy ly taâm cao toác thu sinh khoái teá baøo qui moâ pilot. -139- Luaän aùn Tieán só Phuï luïc 5.2.7. Maùy ño ñöôøng huyeát Hình 5.9. Maùy ño ñöôøng huyeát Accu-check Active. 5.3. PHUÏ LUÏC 3: Kyù hieäu caùc amino acid theo kyù töï Baûng 5.1. Baûng kyù hieäu theo kyù töï cuûa amino acid Amino acid Kyù hieäu Amino acid Kyù hieäu Isoleucine I Serine S Leucine L Tyrosine Y Valine V Tryptophan W Phenylalanine F Glutamine Q Methionine M Asparagine N Cysteine C Histidine H Alanine A Glutamic acid E Glycine G Aspartic acid D Proline P Lysine K Threonine T Arginine R (Nguoàn: -140- Luaän aùn Tieán só Phuï luïc 5.4. PHUÏ LUÏC 4: Baûng maõ codon öa duøng trong E. coli Baûng 5.2. Baûng maõ codon öa duøng trong E. coli Class Class Amino Acid Codon I II III Amino Acid Codon I II III ttt 55.09 29.08 67.14 ctt 9.70 5.56 19.00 Phe ttc 44.91 70.92 32.86 ctc 10.40 8.03 9.04 tta 10.99 3.44 20.09 cta 3.09 0.83 6.81 Leu ttg 13.02 5.47 15.05 Leu ctg 52.79 76.67 29.99 tct 13.26 32.41 19.63 cct 13.71 11.23 28.30 tcc 15.02 26.56 11.34 ccc 11.19 1.63 16.26 tca 10.83 4.79 22.09 cca 18.63 15.25 31.50 Ser tcg 16.88 7.39 10.60 Pro ccg 56.47 71.89 23.94 tat 54.42 35.23 69.60 cat 56.80 29.77 61.69 Tyr tac 45.58 64.77 30.40 His cac 43.20 70.23 38.31 taa caa 33.40 18.65 37.06 TER tag Gln cag 66.60 81.35 62.94 tgt 40.90 38.85 55.71 cgt 38.99 64.25 26.05 Cys tgc 59.10 61.15 44.29 cgc 42.23 32.97 21.94 TER tga cga 5.52 1.07 12.80 Trp tgg 100.00 100.00 100.00 Arg cgg 8.97 0.80 13.62 att 51.20 33.49 47.57 gtt 23.74 39.77 34.33 atc 44.37 65.94 26.65 gtc 22.48 13.45 18.95Ile ata 4.43 0.57 25.78 gta 14.86 19.97 21.78 Met atg 100.00 100.00 100.00 Val gtg 38.92 26.81 24.94 -141- Luaän aùn Tieán só Phuï luïc act 14.85 29.08 26.83 gct 14.52 27.54 22.86 acc 46.83 53.60 24.45 gcc 27.62 16.14 23.67 aca 10.52 4.67 27.93 gca 19.63 24.01 31.27 Thr acg 27.81 12.65 20.80 Ala gcg 38.23 32.30 22.19 aat 40.87 17.25 64.06 gat 62.83 46.05 70.47 Asn aac 59.13 82.75 35.94 Asp gac 37.17 53.95 29.53 aaa 75.44 78.55 72.21 gaa 68.33 75.35 66.25 Lys aag 24.56 21.45 27.79 Glu gag 31.67 24.65 33.75 agt 13.96 4.52 18.73 ggt 32.91 50.84 31.79 Ser agc 30.04 24.33 17.61 ggc 43.17 42.83 24.51 aga 1.75 0.62 15.63 gga 9.19 1.97 24.75 Arg agg 1.54 0.29 9.96 Gly ggg 14.74 4.36 18.95 (Nguoàn: Heùnaut and Danchin, 1996 [29]) 5.5. PHUÏ LUÏC 5: Keát quaû theo doõi haøm löôïng ñöôøng trong maùu chuoät sau khi tieâm insulin Baûng 5.3. Keát quaû theo doõi haøm löôïng ñöôøng trong maùu chuoät sau khi tieâm insulin Haøm löôïng ñöôøng (mg/dl) sau khi tieâm Maãu chuoät Troïng löôïng chuoät (g) Noàng ñoä maãu (IU/ml) 0 phuùt 30 phuùt 60 phuùt 1. Insulin chuaån (chöùng döông) 25,08 0,02508 231 37 59 2. Dung dòch PBS (chöùng aâm) 20,45 - 155 115 93 3. Maãu Insulin taùi toå hôïp A 18,35 0,01835 331 238 240 4. Maãu insulin taùi toå hôïp B 26,76 0,02676 231 175 188

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf11.pdf
  • pdf0.pdf
  • pdf1.pdf
  • pdf10.pdf
  • pdf2.pdf
  • pdf3.pdf
  • pdf4.pdf
  • pdf5.pdf
  • pdf6.pdf
  • pdf7.pdf
  • pdf8.pdf
  • pdf9.pdf
  • jpgHoangVanQuocChuong.jpg
Luận văn liên quan