Nghiên cứu sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn aeromonasspp, vibrio spp trong môi trường ao nuôi cá tra (pangasianodon hypophthalmus )thâm canh ở Cần Thơ và vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre

ng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn Edwarsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila (được phân lập trên cá tra và trữ lạnh ở điều kiện - 800C trong môi trường BHI và glycerol). Thí nghiệm được tiến hành với 2 loại thuốc kháng sinh: doxycyclin, cefalexin. Mật độ vi khuẩn được xác định bằng 2 cách: so màu quang phổ với bước sóng 590 nm điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường NB cho đạt OD = 0.1±0.02 và so sánh với ống chuẩn McFarland (số 1: 0,1ml 1% BaCl2:9,9ml 1% H2SO4), mật độ vi khuẩn đạt khoảng 108 cfu/ml (A. hydrophila). Kết quả nồng độ MIC của chủng vi khuẩn A. hydrophila CAF2 với 2 loại thuốc kháng sinh (doxycyclin, cefalexin) bằng phương pháp so màu quang phổ: 32; 128 ppm, phương pháp so màu Macfarland 16; 128 mg/ml và nồng độ MIC của vi khuẩn A. hydrophila CAF133 cũng lần lược là: 16; 64 và 16; 32 mg/ml. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 15 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện: từ 11/2008-5/2009 Địa điểm thực hiện: - Thu mẫu nước và mẫu bùn tại tỉnh Cần Thơ, Trà Vinh và Bến Tre. - Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thuỷ Sản- Khoa Thuỷ Sản-Trường Đại Học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ Phiếu ghi nhận thông tin khi thu mẫu (phụ lục 1), giấy vệ sinh, bao tay, giấy nhôm, giấy làm dấu, bọc nylon, dây thun, thùng trữ lạnh, … Chai nút mài 100 ml, ống nghiệm 10ml, đĩa petri, đèn cồn, que trãi thuỷ tinh, bình xịt cồn, cốc đốt 250 ml, hộp đầu col pipet 0.5ml và 1ml, pipet 100- 1000ml, lame, lamelle. Cân điện tử, máy trộn mẫu nước (vortex), máy khuấy từ, nồi khử trùng áp suất, tủ sấy khô, tủ ấm, tủ lạnh, tủ vô trùng. 3.2.2 Môi trường, hoá chất và vật liệu nghiên cứu Hoá chất: NaCl, cồn 96o, cồn 70o, glycerol, nước cất, các loại hoá chất nhuộm Gram,.… Thuốc kháng sinh dùng trong kháng sinh đồ (6 loại): ampicillin-10mg (AM), chloramphenicol-30 mg (CHL), tetracyclin-30 mg (TE), doxycycline-30 mg (DO), streptomycin-10 mg (SM), trimethoprim + sulfamethoxazole-1,25/23,75 mg (SXT) của Bio-rad. Kháng sinh tinh dùng trong xác định MIC: chloramphenicol, oxytetracycline, streptomicine của Oxoid. Môi trường chung: TSA (Trypton Soy Agar) của Merck. Môi trường lập kháng sinh đồ: MHA (Mueller-Hinton Agar) của Merck. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 16 Môi trường chọn lọc: GSP Agar (Pseudomonas Aeromonas Selective Agar Base), TCBS (Thiosulphate citrate bile salt agar), BHIB (Brain heard in broth) của Merck. Nguồn vi khuẩn tham khảo: Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum, vi khuẩn chuẩn E. coli (ATCC 25922). 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Địa điểm thu mẫu Chọn dạng ao nuôi cá tra thâm canh ở Cần Thơ và hai tỉnh nước lợ Trà Vinh và Bến Tre. 3.3.2 Số mẫu Tổng số ao được thu là: 30 ao (30 mẫu nước + 30 mẫu bùn). Mỗi tỉnh tiến hành thu 10 ao. 3.3.3 Phương pháp thu mẫu Mẫu nước và bùn được thu ở ba điểm khác nhau ở trong ao: điểm cấp nước vào, giữa ao và điểm thoát nước. Phương pháp thu mẫu nước và bùn theo tài liệu của Le, at al., (2005) Đối với mẫu nước: tại mỗi điểm thu 100 ml bằng chai nút mài tiệt trùng và thu cách mặt nước 0-20 cm. Đối với mẫu bùn: tại mỗi điểm thu 10 ml bằng dụng cụ chuyên biệt (drivers) và thu ở lớp mặt 1 cm, sau đó cho mẫu vào chai đã tiệt trùng. Tất cả mẫu thu được trữ lạnh ở 4oC và chuyển về phòng thí nghiệm phân tích trong vòng 24 giờ. 3.3.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn Mẫu nước Các chai nước được lấy ra khỏi thùng và điều chỉnh về nhiệt độ phòng. Sau đó rút bỏ một ít nước trong mỗi chai sao cho có thể đảo đều mẫu nước trong chai. Ở mỗi chai hút 30ml/chai cho vào một chai rỗng đã được khử trùng. Trộn đều mẫu nước và tiến hành phân tích theo phương pháp của (Le, et al., 2005). Pha loãng 1 ml mẫu nước ban đầu thành 10ml trong nước muối sinh lý đã được tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Mẫu được pha loãng đến 10-4. Rút 0.1ml từ những mẫu pha loãng trãi đều trên môi trường thạch TSA, TCBS, PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 17 GSP Agar sau đó đem ủ trong điều kiện hiếu khí ở 28oC và đọc kết quả khi mẫu được ủ sau 24 giờ. Tất cả các thao tác đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Mẫu bùn Các chai bùn được lấy ra khỏi thùng và điều chỉnh về nhiệt độ phòng. Sau đó, cho tất cả bùn từ 3 chai được thu tại 3 điểm trong ao vào cùng một chai đã tiệt trùng và đảo đều mẫu sau đó tiến hành phân tích theo phương pháp của (Le, et al., 2005). Pha loãng 1g mẫu bùn thành 10ml trong nước muối sinh lý đã được tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Mẫu được pha loãng đến 10-4. Lấy 0.1ml từ những mẫu pha loãng trãi đều trên môi trường thạch TSA, TCBS, GSP Agar sau đó đem ủ trong điều kiện hiếu khí ở 28oC và đọc kết quả khi mẫu được ủ sau 24 giờ. Tất cả các thao tác đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng. 3.3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn (Theo cẩm nang Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993)) Quan sát tính di động Nhuộm Gram Phản ứng oxidase Phản ứng catalase Khả năng lên men và oxy hoá đường glucose (Fermentation/ oxidation: O/F) Kiểm tra năng phản ứng của vi khuẩn với O/129 (xem phụ lục 2). Từ đó xác định giống của vi khuẩn. 3.3.6 Phương pháp lập kháng sinh đồ (theo phương pháp của Kirby Bauer, 1966 được trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thuý Hằng, 2008). Phục hồi vi khuẩn Aeromonas spp và Vibrio spp từ tủ âm 800C, sau đó tiến hành nhuộm Gram kiểm tra tính thuần thì lập kháng sinh đồ. Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc thuần trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0.85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn và xác định mật số dựa vào máy so màu quang phổ, ở bước sóng 610 nm với giá trị OD = 0,1 ± 0,02 thì mật độ vi khuẩn là 108 tế bào/ ml. Sau khi xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành cho dung dịch vi khuẩn lên môi trường thạch. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 18 Dùng tâm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn, quét đều lên mặt môi trường thạch MHA. Sau đó dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa petri sau cho khoảng cách giữa 2 tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoãng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa petri 10-15mm. Mỗi đĩa petri (q100mm) môi trường đặt tối đa 6 đĩa kháng sinh. Sau khi hoàn tất việc dán đĩa thuốc kháng sinh, đặt đĩa petri vào tủ ấm ở điều kiện 28-300C. Sau 24 giờ tiến hành đọc kết quả. Sử dụng chủng tham khảo Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum, kết quả trong thí nghiệm được được đọc và so sánh với kết quả có trong tiêu chuẩn của (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2006). 3.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Qua việc sàn lọc kết quả kháng sinh đồ, sẽ chọn 4-5 chủng vi khuẩn để xác định giá trị MIC đối với 2-3 loại thuốc kháng sinh. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn dựa trên phương pháp (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2006b) v Các bước tiến hành: Ø Chuẩn bị môi trường-hóa chất Vi khuẩn được lấy từ tủ đông -80oC sau khi rã đông thì được cấy lên môi trường TSA, ủ trong tủ ấm từ 28oC sau 24 giờ. Riêng với vi khuẩn đối chứng E. coli (ATCC 25922) ủ ở 37oC. Kiểm tra và ghi nhận các đặc điểm hình thái của vi khuẩn, hình dạng, kích thước màu sắc khuẩn lạc và nhuộm Gram để xác định tính thuần. Nếu vi khuẩn chưa thuần thì tiếp tục tách ròng cho đến khi đạt được đĩa cấy thuần. Khi vi khuẩn đã thuần, lấy một ít khuẩn lạc trên đĩa TSA cho vào ống nghiệm chứa 5 ml NA, ủ ở 28oC, trong 18-20 giờ. Ø Chuẩn bị dung dịch thuốc Chuẩn bị dung dịch thuốc gốc: Chuẩn bị 2 chai (50 ml) dung dịch thuốc gốc có nồng độ 1024 và 256 µg/ml bằng dung môi thích hợp. Pha loãng 2 lần các nồng độ: 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024 µg/ml. pha loãng bằng nước muối sinh lý ( Bảng phụ lục 3) Chú ý: Ống nghiệm có nồng độ thuốc 512 và 256 µg/ml sẽ được pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 1024 µg/ml. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 19 Những ống nghiệm thuốc còn lại 128; 64; 32;….0,25 µg/ml được pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 256 µg/ml. Cần lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng các dung dịch thuốc tiếp theo. Nồng độ thuốc sẽ giảm đi một nữa khi cho dung dịch vi khuẩn vào. Ghi tên thuốc và nồng độ trước khi bắt đầu thí nghiệm. Ø Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn Xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm và điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường NA (không dùng nước cất) ở điểm OD = 0,1 (mật số vi khuẩn khoảng 108CFU/ml), sau đó được pha loãng về 105CFU/ml, mỗi chủng vi khuẩn đều được cấy trên môi trường TSA để kiểm tra sự thuần chủng và được ủ trong điều kiện với các ống MIC. Cho 3 ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm có chứa 3 ml dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau: 0,25; 0,5…1024 µg/ml (cần lắc đều). Thí nghiệm có 2 đối chứng: Đối chứng âm: (3 ml NA + 3 ml nước muối sinh lý). Đối chứng dương: (3 ml dung dịch vi khuẩn + 3 ml nước muối sinh lý). Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28oC, trong 20-24 giờ. Riêng với vi khuẩn đối chứng E. coli (ATCC 25922) ủ ở 37oC. Ø Đọc kết quả Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn, nếu có tạp khuẩn thì loại bỏ kết quả hoặc loại ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục thì làm lại thí nghiệm. Đọc kết quả bằng cách so sánh độ đục của ống MIC với ống đối chứng âm và dương. Giá trị nồng độ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng sinh, ở đó không có vi khuẩn phát triển. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 20 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Cùng với sự phát triển chung của ngành nuôi trồng thuỷ sản. Trong những năm gần đây, cá tra là đối tượng được xem là đang ở bước phát triển mạnh và đặc biệt quan tâm. Hiện nay cá tra không chỉ là đối tượng thuỷ sản riêng ở vùng nước ngọt mà còn được xem là vật nuôi khá phổ biến ở các vùng nước lợ. Về hình thức cũng được người dân cải tiến dần từ quảng canh sang quảng canh cải tiến, rồi đến bán thâm canh và sau cùng là thâm canh nhằm mục đích tăng năng suất nuôi và đáp ứng nhu cầu của thị trường. Song, việc nuôi trồng trên là phát triển tự phát, thiếu hoặc việc quy hoạch ở các địa phương chưa đuổi kịp sự phát triển, vấn đề bảo vệ môi trường sinh thái ở các địa phương và đặc biệt là ở vùng nuôi trồng thuỷ sản chưa được quan tâm, kỹ thuật chuyên môn và đặc biệt là việc quản lý dịch bệnh vẫn chưa được chú trọng. Bên cạnh đó, người dân thường có thói quen lạm dụng thuốc kháng sinh trong phòng trị cho động vật thuỷ sản đã tác động xấu đến môi trường sinh thái của thuỷ. Đặc biệt hơn, việc sử dụng thuốc kháng sinh trong thời gian dài sẽ làm phát sinh nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc, đa kháng thuốc. Những chủng vi khuẩn mang đặc tính kháng thuốc này sẽ phát tán theo môi trường nước phát tán đến nhiều nơi, gây tổn hại đến sức khoẻ của người tiêu dùng. Chính vì lý do trên, thí nghiệm xác định tính kháng thuốc và nồng độ MIC để xác định, so sánh sự kháng thuốc của vi khuẩn trong môi trường ao nuôi cá tra lâu năm (Cần Thơ) và vùng nước lợ mới được nuôi (Trà Vinh- Bến Tre) nhằm góp phần làm thay đổi cách nhìn về việc sử dụng hoá chất, thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản, góp phần bảo vệ môi trường sinh thái, sức khoẻ cộng đồng. 4.1 Kết quả thu mẫu, phân lập và định danh vi khuẩn Sau 6 đợt đi thu mẫu đã thu được 39 ao với tổng số chủng vi khuẩn phân lập là 144 chủng. Trong đó tổng số ao thu được ở Trà Vinh: 13 ao, Bến Tre: 6 ao, Cần Thơ 20 ao, tổng số chủng vi khuẩn được phân lập ở Trà Vinh là: 33 chủng trên môi trường GSP-Agar, 25 chủng trên môi trường TCBS; ở Bến Tre: 8 chủng trên môi trường GSP-Agar, 17 chủng trên môi trường TCBS, ở Cần Thơ: 61 chủng trên môi trường GSP-Agar. Tóm lại, có 102 chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường GSP-Agar và 42 chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường TCBS. Những chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường GSP- Agar là những khuẩn lạc có sắc tố vàng và tạo vòng màu vàng xung quanh khuẩn lạc trên môi trường này (xem phụ lục 4). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 21 Những khuẩn lạc có sắc tố màu đỏ cũng được nghiên cứu bởi Châu Huỳnh Thuỳ Trâm, (2009) với đề tài nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn Pseudomonas spp trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh ở Cần Thơ và vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh, Bến Tre. Hình 4.1: Đĩa phân lập Aeromonas spp màu vàng (mũi tên) trên môi trường GSP (a) , cấy Aeromonas spp trên môi trường GSP (b). Từ 144 chủng vi khuẩn chọn ra 26 chủng mang tính đại diện cho từng vùng và có hình thái khuẩn lạc giống nhau (9 chủng ở Trà Vinh, 8 chủng ở Bến Tre, 9 chủng ở Cần Thơ) được phân lập trên môi trường GSP- Agar và 42 chủng được phân lập trên môi trường TCBS để phục hồi, nuôi cấy, tách ròng trên môi trường TSA và TSA+, nhuộm Gram để kiểm tra độ thuần, sau đó tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản. Kết quả cho thấy những chủng được chọn định danh đến giống có khuẩn lạc màu vàng trên môi trường GSP- Agar đều là vi khuẩn Gram âm hình que có tính di động, có khả năng lên men và oxy hoá đường glucose, cho phản ứng oxidase và catalase dương tính. Sau đó tiến hành kiểm tra phản ứng O/129 thì 26 chủng vi khuẩn này đều kháng với O/129 (đường kính vòng vô trùng £9 mm) (phụ lục 5). Đồng thời, qua kết quả lập kháng sinh đồ với Ampicillin thì toàn bộ chủng những vi khuẩn này đều không thấy xuất hiện vòng vô trùng (phụ lục 5). Kết luận, 26 chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường GSP- Agar này đều thuộc giống Aeromonas spp. Những chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường TCBS là vi khuẩn Gram âm hình que. Song, sau khi kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản còn lại (tính di động, khả năng lên men và oxy hoá đường glucose, phản ứng oxidase và catalase), kiểm tra phản ứng với O/129 đã có 11 chủng thuộc giống Vibrio spp (phụ lục 6). Sau khi định danh đến giống 26 chủng Aeromonas spp và 11 chủng Vibrio spp được tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ cùng với hai chủng tham a b PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 22 khảo Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum trên môi trường MHA, kết quả của chủng chuẩn trong thí nghiệm là phù hợp với kết quả tiêu chuẩn của (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2006). Hình 4.2: Hình đĩa kháng sinh đồ chủng Aeromonas spp ở Cần Thơ, AM: ampicillin, CHL: chloramphenicol, DO: doxycyclin, OXT: oxytetracyclin, SM: streptomycin, SXT: trimethoprim + sulfamethoxazol. 4.2 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ 4.2.1 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Aeromonas spp ở Cần Thơ Năm 2007 tổng diện tích nuôi cá tra ở thành phố Cần Thơ là: 1.569,9 ha. Nơi đây được xem là cái noi của nghề nuôi cá tra thâm canh. Với nhiều năm kinh nghiệm Cần Thơ đã rất thành công trong lĩnh vực này và thu được sản lượng rất cao. Song vấn đề đáng lo ngại là hầu hết các hộ nuôi cá tra không có ao lắng sử lý nước thải, không có diện tích chứa bùn khi sên vét ao nuôi. Nước thải, bùn trong ao nuôi thải trực tiếp ra sông rạch. Bên cạnh đó việc quản lý dịch bệnh và sử dụng thuốc hoá chất còn lỏng lẻo. Nên hiện tượng phát sinh nhiều vi khuẩn kháng thuốc và đa kháng thuốc là điều không thể tránh khỏi. Nhìn chung, Cần Thơ có vi khuẩn kháng thuốc cao hơn so với tỉnh Trà Vinh và Bến Tre, trong đó đối với từng loại thuốc SXT, TE, SM vi khuẩn kháng thuốc là 3/9 chủng, 2/9 chủng kháng với DO. Riêng đối với kháng sinh SM thì Cần Thơ có 3/9 chủng kháng, bằng với tỉnh Trà Vinh và thấp hơn tỉnh Bến Tre (5/8 chủng). Bên cạnh đó, vi khuẩn có tính nhạy với kháng sinh cũng chiếm số lượng thấp: 5/9 chủng nhạy với TE, 4/9 chủng nhạy với DO, hai số lượng này thấp hơn khá nhiều so với tỉnh Trà Vinh, Bến Tre. Song, Cần Thơ lại có 5/9 chủng nhạy với thuốc SXT, cao hơn ở Bến tre (4/8 chủng) và cũng thấp hơn nhiều so với tỉnh Trà Vinh (8/9 chủng). Bên cạnh đó, Cần Thơ có vi khuẩn trung bình nhạy với từng loại thuốc kháng sinh ở mức khá cao: SM là 5/9 chủng, DO là 3/9 chủng, các thuốc kháng sinh còn lại 1/9 chủng. d AM TE SM CHL SXT DO PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 23 8 1 0 5 1 3 4 3 2 5 1 3 1 5 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Số c hủ ng v i k hu ẩn CHL SXT DO TE SM Tên thuốc S I R Hình 4.3: Biểu đồ đặc tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas spp tại Cần Thơ; R (kháng), I (trung bình nhạy), S (nhạy). Ngoài ra, số vi khuẩn đa kháng thuốc cũng ở mức cao hơn hai tỉnh còn lại. Trong 9 chủng Aeromonas spp khảo sát đã có 3 chủng đa kháng thuốc (xem bảng 4.1). Bảng 4.1 : Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp ở Cần Thơ Kết quả này hoàn toàn phù hợp vì theo kết quả điều tra của Nguyễn Chính (2005) 100% người nuôi được hỏi đều có sử dụng kháng sinh trong các giai đoạn nuôi khác nhau. Qua bảng 4.1 ta cũng nhận thấy vi khuẩn Aeromonas ở Cần Thơ kháng cao với SXT song đây là dạng kháng sinh phối hợp được nhiều người nuôi dùng trị bệnh cho cá trong hiện nay. Qua đó có thể suy luận, mặc dù hệ vi khuẩn Aeromonas spp nghiên cứu tồn tại trong môi trường nước và bùn nhưng cũng chịu sự tác động rất nhiều thuốc kháng sinh cũng như hệ vi khuẩn đang tồn tại trong cơ thể vật chủ. Theo Đỗ Thị Hoà (2004) bệnh do nhóm vi khuẩn Aeromonas spp đã gây thiệt hại không kém nghiêm trọng trong nghề nuôi thuỷ sản nước ngọt ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nó chung. Bệnh nhiễm trùng máu (bệnh xuất huyết, đốm đỏ…) do nhóm vi khuẩn này gây ra và thường gặp ở các động vật thuỷ sản nước ngọt. Theo Từ Thanh Dung và ctv (2005) A. hydrophila là tác nhanh gây bệnh đốm đỏ trên cá tra, basa và có thể sử dụng OXT, DO để trị bệnh này, trong khi đó kết quả nghiên cứu chỉ có 4/9 chủng Aeromonas spp nhạy với DO Các loại thuốc Số lượng SXT, DO, TE, SM 1 SXT, DO, TE 1 SXT, SM 1 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 24 và 5/9 chủng nhạy với DO. Sự khác biệt này có thể do DO, TE đã được người nuôi sử dụng trong thời gian dài nên đã tạo nên nhiều dòng vi khuẩn kháng thuốc. Ngoài ra, với kết quả nghiên cứu của Phuong et al., (2005) với 123 chủng vi khuẩn phân lập từ môi trường ao nuôi tại ĐBSCL, hầu hết những chủng này kháng với chloramphenicol (30ug) và tetracyclin (30mg) tỉ lệ 111/123, trimethoprim/sulfadiazine (25mg) (109/123), tỉ lệ kháng này cao hơn nhiều so với kết quả nghiên cứu Aeromonas spp tại Cần Thơ có vi khuẩn kháng TE, SXT có cùng tỉ lệ 3/9 chủng và không kháng với CHL. Bên cạnh đó, nghiên cứu của (Sarter et al., 2006) kết luận trong số 92 chủng vi khuẩn phân lập từ 3 ao nuôi cá tra khác nhau đã có 17,8% kháng với AM-OTC-SXT- NA, 15,1% kháng với OTC-SXT-NA, 13,7% kháng với AM-C-FT-SXT-NA, 9,6% kháng với AM-FT-OTC, 8,2% kháng với AM-C-FT-OTC-SXT-NA. Qua đó ta thấy, hiện tượng kháng, đa kháng thuốc của vi khuẩn ở các vùng nuôi cá tra nói riêng, vùng tham gia nuôi trồng thuỷ sản nói chung đang ngày càng gia tăng, đang là mối quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu, là nổi lo của người dân. 4.2.2 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Aeromonas spp ở Trà Vinh Trà Vinh với vị trí ven biển, trước đây đã phát triển mô hình nuôi tôm sú với tốc độ khá nhanh. Tuy nhiên, do nuôi tự phát thiếu qui hoạch cho nên khó kiếm soát được nguồn giống, thuốc và hoá chất phòng trị bệnh, nguồn nước thải chủ yếu trực tiếp ra sông làm ô nhiễm. Mặc dù, cá tra chỉ mới đươc xem là đối tượng nuôi của tỉnh vào năm 2003 nhưng hiện nay cá tra đã nuôi khá phổ biến ở Trà Vinh. Hiện nay, đa số vi khuẩn Aeromonas spp trong trong ao nuôi cá tra ở Trà Vinh nhạy với SXT (chiếm 8/9 chủng) kế đến là DO (7/9), CHL và TE (6/9) và thấp nhất là SM chỉ có 1/9 chủng. Song, vi khuẩn trung bình nhạy và kháng với SM lại ở mức cao (trung bình nhạy là 5/9 chủng và kháng là 3/9 chủng), trong khi đó vi khuẩn trung bình nhạy, kháng đối với từng loại thuốc kháng sinh còn lại (CHL, SXT, TE) ở mức thấp hơn là 2/9 và 1/9 và không có chủng nào kháng với DO. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 25 6 2 1 8 0 1 7 2 0 6 2 1 1 5 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Số c hủ ng v i k hu ẩn CHL SXT DO TE SM Tên Thuốc S I R Hình 4.4: Biểu đồ đặc tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas spp tại Trà Vinh. Kết quả này khá phù hợp với kết quả nghiên cứu của Châu Hồng Thuý (2008) về sự kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra nuôi thâm canh ở tỉnh này là: có 63,3% vi khuẩn nhạy, 20% vi khuẩn trung bình nhạy, 16,7% vi khuẩn kháng với CHL; 66,7% vi khuẩn nhạy, 26,7% vi khuẩn trung bình nhạy, 6,7% vi khuẩn kháng với DO; 30% vi khuẩn nhạy, 60% vi khuẩn trung bình nhạy; 10% vi khuẩn kháng với TE. Điều đó cho thấy rằng tính kháng thuốc của vi khuẩn phụ thuộc vào điều kiện môi trường mà vi khuẩn đang tồn tại. Mặc dù, hai nghiên cứu này được tiến hành trên hai loài vi khuẩn khác nhau (Edwardsiella ictaluri, Aeromonas spp) và trên hai đối tượng hoàn toàn khác nhau (cá; nước và bùn), nhưng tất cả những yếu tố này cùng tồn tại trong ao nuôi thuộc cùng tỉnh nên cùng chịu những sự ảnh hưởng chung từ môi trường. Qua đó có thể suy luận, mặc dù hệ vi khuẩn Aeromonas spp nghiên cứu tồn tại trong môi trường nước và bùn nhưng cũng chịu sự tác động của thuốc kháng sinh giống như hệ vi khuẩn đang tồn tại trong cơ thể vật chủ. Theo nghiên cứu của Dung et al., (2008) về sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên cá tra ở ĐBSCL cho thấy đa số vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đã kháng với streptomycin (83% chủng vi khuẩn), oxytetracycline (81%), kết quả này cao hơn rất nhiều so với kết quả thu được streptomycin: 3/9 chủng, tetracycline: 1/9 chủng. Điều này có thể lý giải như sau: do các dòng vi khuẩn mà tác giả nghiên cứu chủ yếu thu từ những vùng nuôi thuỷ sản lâu năm (An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ) cho nên thời gian sử dụng thuốc kháng sinh ở những nơi đó cũng khá dài, từ đó đã tạo nên nhiều dòng vi khuẩn kháng thuốc. Trong khi ở Trà Vinh phong trào nuôi cá tra chỉ mới bắt đầu khoảng 4 năm trở lại đây, nên có thời gian sử dụng thuốc kháng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 26 sinh ngắn hơn, vì vậy tỉ lệ vi khuẩn kháng thuốc trong ao nuôi ở Trà Vinh thấp hơn so với các nơi khác. Tuy nhiên, mặc dù có tính kháng thuốc thấp hơn tỉnh Cần thơ, Trà Vinh cũng xuất hiện vi khuẩn đa kháng nhưng ở mức thấp hơn và phạm vi kháng thuốc hẹp hơn so với những chủng vi khuẩn ở Cần Thơ. Bảng 4.2: Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp ở Trà Vinh Bên cạnh đó, Trà Vinh lại có 1/9 chủng Aeromonas spp kháng và 2/9 chủng trung bình nhạy với chloramphenicol, trong khi ở Bến Tre và Cần Thơ thì không có vi khuẩn kháng lại với loại kháng sinh này. Song, đây là loại thuốc kháng sinh đã xếp vào danh sách cấm sử dụng, đây là điều đáng quan tâm của các cơ quan chức năng ở địa phương này. 4.2.3 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Aeromonas spp ở Bến Tre Bến Tre có địa hình nằm sát biển, bốn bề đều có sông nước bao bọc, hệ thống kênh rạch chằn chịt. Trong tỉnh có: 64.592 diện tích đất mặn, đất bị mặn chủ yếu do tác động của nước thuỷ triều và nước ngằm mặn, thường xảy ra vào mùa khô. Hiện nay tình hình nuôi cá tra của tỉnh phát triển khá nhanh. Qua kết quả kháng sinh đồ cho thấy nhóm vi khuẩn Aerommonas spp trong môi trường ao nuôi cá tra ở tỉnh này có tính nhạy với kháng sinh ở mức cao giống như ở Trà Vinh, trong đó vi khuẩn nhạy với CHL là 8/8 chủng và có 7/8; 6/8; 4/8 chủng nhạy với DO, TE, SXT, kết quả này không có sự khác biệt lớn với kết quả ở tỉnh Trà Vinh (7/9; 6/9; 8/9). Song, trong những chủng Aeromonas spp này lại không có chủng nào nhạy với SM. Trái lại, Aeromonas spp trung bình nhạy và kháng với kháng sinh SM đang ở mức cao (3/8; 5/8 chủng), ở Trà Vinh là 5/9; 3/9 chủng. Những thuốc kháng sinh còn lại có vi khuẩn kháng thuốc ở mức thấp (1/8 chủng). (Hình 4.5) Các loại thuốc Số lượng SXT, TE 1 CHL, SM 1 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 27 8 0 4 3 1 7 0 1 6 1 1 0 3 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Số c hủ ng v i k hu ẩn CHL SXT DO TE SM Tên thuốc S I R Hình 4.5: Biểu đồ đặc tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas spp tại Bến Tre. Bên cạnh đó, Bến Tre cũng có số lượng vi khuẩn đa kháng thuốc tương đương với Trà Vinh (2/8 chủng), nhưng tính đa kháng thuốc lại khác nhau (ở Trà Vinh có 1 chủng kháng với SXT-TE, 1 chủng kháng với CHL-SM; ở Bến Tre 1 chủng kháng với DO-TE, một chủng kháng với SXT-SM) (Bảng 4.3) Bảng 4.3 : Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp ở Bến Tre Điều này cho thấy rằng, khả năng nhạy, trung bình hoặc kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: thời gian, địa điểm thu mẫu, tình hình sử dụng thuốc kháng sinh ở địa điểm đó. Do vậy, mỗi vùng nuôi khác nhau thì hiệu quả sử dụng thuốc kháng sinh khác nhau dẫn đến sự sai khác về độ nhạy của thuốc kháng sinh giữa các vùng là điều thiết yếu. 4.2.4 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Vibrio spp ở Trà Vinh và Bến Tre Theo Frerichs et al., (1993) các loài Vibrio trừ V. cholerae và V. metschnikovii, rất cần Na+ để phát triển, trong khi đó Aeromonas spp không cần độ mặn và sống trong môi trường không có muối. Với đặc điểm như thế, nhóm Vibrio spp phần lớn được tìm thấy trong nước mặn và môi trường nước ở cửa sông và phần lớn là mầm bệnh cho cá và các động vật khác sống trong vùng này. Aeromonas spp thì trái ngược lại, cơ bản nó là những sinh vật nước ngọt, vì vậy nó là mầm bệnh các động vật nước ngọt. Tuy nhiên, Sự khác biệt này không hoàn toàn, nhóm Aeromonas spp cũng lây nhiễm trên cá nước mặn và Vibrio spp cũng có thể nhiễm trên cá nước ngọt. Theo đó, mục đích của Các loại thuốc Số lượng DO, TE 1 SXT, SM 1 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 28 nghiên cứu là nhằm kiểm tra mối tương tác của hai nhóm vi khuẩn này ở tại vùng nước mặn nhiễm ngọt (Trà Vinh, Bến Tre), đồng thời kiểm tra khả năng phát triển của một số nhóm vi khuẩn gây bệnh cũng như mục đích hạn chế mầm bệnh, hạn chế phát sinh vi khuẩn đa kháng thuốc trên cá tra ở tại vùng này. Kết quả tất cả chủng vi khuẩn Vibrio spp đều nhạy với các loại thuốc kháng sinh. Đối với kháng sinh TE, DO, SXT, CHL đều không thấy xuất hiện vi khuẩn kháng thuốc. Riêng kháng sinh AM có số vi khuẩn nhạy 10/11 chủng. Đặc biệt hơn, không có chủng vi khuẩn nào nhạy với SM, ngược lại số vi khuẩn kháng lại kháng sinh này 9/11 chủng, kết quả này khá cao so với kết quả của vi khuẩn Aeromonas spp kháng lại thuốc kháng sinh SM ở tỉnh Trà Vinh (3/9 chủng), tỉnh Bến Tre (5/8 chủng) đồng thời không có vi khuẩn Vibrio spp đa kháng thuốc. (Hình 4.6) 11 0 11 0 11 0 10 1 0 11 0 0 2 9 0 2 4 6 8 10 12 Số c hủ ng v i k hu ẩn CHL SXT DO AM TE SM Tên thuốc S I R Hình 4.6: Biểu đồ đặc tính kháng thuốc của vi khuẩn Vibrio spp tại Trà Vinh, Bến Tre. Phuong et al., (2005) đã kiểm tra độ nhạy của 5 loại kháng sinh trên 32 chủng Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú ở ĐBSCL cho thấy tất cả đều kháng với ampicilin và chỉ 1–3 chủng được kiểm tra là kháng với oxinilic acid, streptomycin, tetracycline, oxytetracycline và chloramphenicol. Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2006) đã xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon). Kết quả kháng sinh đồ 26 trong 27 chủng vi khuẩn được phân lập với 6 loại thuốc kháng sinh thì có 100% chủng thử nghiệm kháng với AM và có khoãng từ (hoặc ít hơn) 15% kháng với SXT, TE, CHL. Phần lớn (77%) các chủng vi khuẩn chỉ kháng với một loại kháng sinh. Số chủng khác kháng với 2 loại kháng sinh (15%). Có một chủng kháng 4 loại và 1 chủng kháng với 6 loại kháng sinh thử nghiệm. Nhìn chung, kết quả nghiên cứu này có tỉ lệ vi khuẩn Vibrio kháng, đa thuốc cao hơn kết quả đang nghiên cứu. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 29 Nhưng với kết quả nghiên cứu của Trần Thị Tuyết Hoa và ctv (2004) về tính kháng thuốc của 50 chủng vi khuẩn Vibrio được phân lập từ hệ thống ương tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) ở các trại sản xuất giống tại Cần Thơ thì có sự tương đồng (các chủng vi khuẩn này đều nhạy với kháng sinh TE và có 40/50 chủng vi khuẩn kháng lại SM). Kết quả nghiên cứu Nguyễn Thị Tiên (2007) về khả năng kháng thuốc của vi khuẩn phân lập trên tôm sú Penaeus monodon bệnh phân trắng tại Bến Tre, Sóc Trăng là 26,3% kháng với AM, 21.05% kháng với SM, kháng với TE là 5,26%, và không có vi khuẩn kháng với CHL. Kết quả này cũng có sự khác biệt đáng kể so với kết quả nghiên cứu. Nhưng khi xét về mặt thời gian, không gian cho ta thấy những nghiên cứu này vào những năm khác nhau và tại những nơi khác nhau nên có kết quả khác nhau là điều tất yếu . Song, nhìn chung tính kháng thuốc của Vibrio spp của các tác giả đã nghiên cứu cũng ở mức khá cao. Nhưng, với kết quả nghiên cứu được thì không có vi khuẩn kháng với các kháng sinh nghiên cứu ngoại trừ SM (8/11 chủng kháng) trong khi vi khuẩn Aeromonas spp từ môi trường ao nuôi của hai tỉnh này lại có 1/9 chủng kháng (tỉnh Trà Vinh) và 1/8 chủng kháng (tỉnh Bến Tre) với CHL, SXT, DO, TE. Sự khác biệt này được giải thích như sau: do đặc điểm của vùng khảo sát luôn có một mùa nước ngọt và một mùa nước mặn trong năm nên hệ vi khuẩn trong ao nuôi cũng thường xuyên biến đổi. Do vậy hệ vi khuẩn Vibrio spp tồn tại trong ao chỉ tiếp xúc với hệ vi khuẩn Aeromonas spp và Vibrio spp khác trong thời gian ngắn nên ít bị ảnh hưởng, tương tác từ hệ vi khuẩn khác, từ đó đặc tính nhạy với kháng sinh của hệ vi khuẩn này được ổn định. Bên cạn đó, ở tất cả nghiên cứu đều có SM kháng cao với cả Aeromonas spp và Vibrio spp điều này cũng dể dàng nhận thấy được bởi do SM có tính lờn thuốc xảy ra nhanh (Bùi Kim Tùng và ctv, 2001). 4.3 Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh lên vi khuẩn Sau khi lập kháng sinh đồ, trong số nhóm vi khuẩn Aeromonas spp ở mỗi tỉnh chọn ra một chủng mang tính đa kháng thuốc và 1 chủng Vibrio spp để xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu đối với 3 loại thuốc: oxytetracyclin (OXT), chloramphenicol (CHL), streptomicin (SM). Kết quả giá trị MIC của chủng chuẩn E. coli (ATCC 25922) với cả 3 loại thuốc kháng sinh điều nằm trong khoãng cho phép theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2006b. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 30 Hình 4.7: Kết quả MIC của chủng Aeromonas spp ACT097 với nồng độ là 64 ppm Giá trị MIC của các chủng khảo sát như sau: Bảng 4.4 : Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Giá trị MIC (mg/ml) Vi khuẩn OXT CHL SM Aeromonas spp ATV0811 64 32 16 Aeromonas spp ABT099 32 1 32 Aeromonas spp ACT097 32 32 64 Vibrio spp VBT0930 0.125 4 32 Giá trị MIC của các loài vi khuẩn với SM ít biến động và có giá trị khá cao (16-64 mg/ml) trong khi đó giá trị MIC trên OXT và CHL lại biến động khá lớn (OXT: 0,125-64 mg/ml; CHL: 1-32 mg/ml) so với nghiên cứu của Nguyễn Thị Tiên (2007) giá trị MIC của CHL trên một số loài vi khuẩn Vibrio gây bệnh phân trắng trên tôm sú là 2-256 mg/ml, điều đó cho thấy hệ vi khuẩn Vibrio trên tôm sú có tính kháng thuốc cao trong khi giá trị MIC của Vibrio khảo sát lại tương đối thấp hơn (4 mg/ml) Mặc khác, theo nghiên cứu của Châu Hồng Thuý, (2008) đã xác định giá trị MIC của 16 chủng vi khuẩn E. ictaluri từ cá tra bệnh mủ gan tại Trà Vinh cho thấy giá trị MIC với CHL từ 0,5-4 mg/ml, mặc dù được khảo sát trên cùng địa điểm và thời gian nhưng giá trị MIC của ATV0811 với CHL là 32 mg/ml. Kết quả khác biệt này có thể là do hai loài vi khuẩn này khác nhau nên tính kháng thuốc của nó cũng khác nhau. Tuy nhiên, đối với OXT thì thí nghiệm cho kết quả MIC từ 0,125-64 mg/ml tương đương với nghiên cứu của Dung et al., (2008) trên vi khuẩn gây bệnh mủ gang (Edwardsiella ictaluri) ở ĐBSCL với giá trị MIC: 0,125-64 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 31 mg/ml, qua đó ta thấy các vi khuẩn đang tồn tại trong môi trường mang đặc tính kháng cũng tương đương với vi khuẩn gây bệnh trên cá. Qua kết quả nghiên cứu thấy, việc dùng thuốc kháng sinh trong thuỷ sản đã gây tác động lớn đến môi trường. Khi thuốc kháng sinh được sử dụng với số lượng lớn hoặc trong thời giàn dài sẽ để lại sự tồn lưu trong môi trường, điều này dễ làm phát sinh nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc. Khi vi khuẩn có yếu tố kháng thuốc nó không chỉ truyền cho vi khuẩn cùng loài mà còn truyền giữa các loài với nhau, chính lý do đó đã làm cho nhiều loại thuốc kháng sinh trở nên vô tác dụng. Vì vậy, để bảo vệ sức khoẻ vật nuôi nói riêng và lợi ích cộng đồng nói chung thì việc hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh, bảo vệ môi trường sinh thái là rất cần thiết. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 32 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1. Kết luận Qua kết quả nghiên cứu tính kháng của từng nhóm vi khuẩn tại các vùng khác nhau cho thấy vi khuẩn ở Cần Thơ có tính kháng thuốc cao nhất với 3/9 chủng vi khuẩn đa kháng thuốc, vi khuẩn kháng với SM, TE, SXT là 3/9 chủng, kháng với DO 2/9 chủng, không có vi khuẩn kháng với CHL. Vi khuẩn tại Trà Vinh và Bến Tre có tính kháng thuốc tương đương nhau. Trong đó, Trà Vinh với vi khuẩn đa kháng thuốc là 2/9 chủng và kháng với từng loại thuốc CHL, SXT, DO, TE 1/9 chủng, riêng SM 3/9 chủng kháng. Bến Tre vi khuẩn đa kháng thuốc 2/8 chủng, 1/8 chủng kháng với SXT, DO, TE, riêng SM có 5/8 chủng kháng và không có vi khuẩn kháng với CHL. Tính nhạy cảm của vi khuẩn Vibrio rất cao, không có chủng nào kháng với từng loại kháng sinh (CHL, SXT, DO, AM), riêng SM có 9/11 chủng kháng. Giá trị MIC của 3 chủng Aeromonas spp ở 3 vùng và chủng Vibrio spp VBT0930 khá cao và có sự biến động lớn CHL: 1-32 mg/ml, OXT: 0,125-64 mg/ml, riêng với SM thì giá trị MIC cao và ít biến đông (16-64 mg/ml). Qua đó ta thấy, nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh ở các vi khuẩn trong môi trường nước và bùn đối với loại kháng sinh này rất cao. 5.2 Đề xuất Do thời gian thực hiện đề tài có hạn vì thế các thí nghiệm tiếp theo cần khảo sát thêm nhiều vùng nuôi thuỷ sản khác nhau ở ĐBSCL để nghiên cứu trên phạm vi rộng hơn. Cần thử nghiệm trên nhiều loại thuốc kháng sinh để khảo sát tính kháng thuốc một cách khá toàn diện của vi khuẩn trên nhiều loại thuốc khác nhau. Tiếp tục nghiên cứu các chủng vi khuẩn còn lại có trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Ứng dụng sinh kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu cơ sở di truyền về sự kháng thuốc của vi khuẩn. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 33 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Kim Tùng, Bùi Kim Hoàng và Bùi Kim Tân, 2001. Thuốc kháng sinh. Sở khoa học công nghệ và môi trường tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu. 255 trang. 2. Bùi Quang Tề, 2003. Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. 112 trang. 3. Bùi Thị Tho, 2003.Thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng trong chăn nuôi, nhà xuất bản Hà Nội. 323 trang. 4. Châu Hồng Thuý, 2008. Khảo sát tình hình xuất hiện bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra nuôi thâm canh ở tỉnh Trà Vinh. Luận văn cao học. Khoa thuỷ sản. Trường Đại Học Cần Thơ, 75 trang. 5. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006. Methods for broth dilution susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals: informational supplement. M49-A. Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, USA. 6. Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh Phương, 2006. Xác định vị trí phân loại và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phat sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon). Tạp chí nghiên cứu khoa học: 42-52. 300 trang. 7. Đỗ Thị Hoà, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội. 2004. Giáo trình bệnh học thuỷ sản. Khoa nuôi trồng thuỷ sản - Đại Học Thuỷ Sản Nha Trang. 346 trang. 8. Dung, T.T., F. Haesebrouck, N.A. Tuan, P. Sorgeloose, M. Baele and A. Decosrere, 2008. Antimicrobial susceptibility pattern of Edwardsiella ictaluri isolates from natural outbreak of bacillary necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in Viet Nam. Microb Drug Resist: 14(4): 311-6. 9. Durborow, R. M. and R. F. Floyd, 1996.Medicated feed for food fish. Souhern Regional Aquaculture Center (SRAC) publicction no. 743pp. 10. Frerichs, G. N. and S. d. Millar. 1993. Mannual for the isolate and indentification of fish bacterial pathogent. Institute of aquqculture, University of Stirling, Scotland. 107pp. 11. Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008. Tiêu chuẩn hoá phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila tại khoa Thuỷ Sản. Luận văn tốt nghiệp khoa Thuỷ Sản- Trường Đại Học Cần Thơ. 38 trang. 12. Inglis, V, R. J. Roberts and N. R. Bromage, 1993. Bacterial diseases of fish. Institte of aquaculture, University Press, Cambridge. 312 pp. 13. Kiêm Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, Nguyễn Thị Như Ngọc và Phạm Thanh Liêm, 2007. Thuốc và hoá chất trong nuôi trồng thuỷ sản. Khoa thuỷ sản. Trường Đại Học Cần Thơ. 79 trang. 14. Kruse, H, and H. Sorum, 1994. Transfer of Multiple Drug Resistance Plasmids between bacteria of Diverse Origins in Natural PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 34 Microenviroments. Applied and environmental microbiology, 60: 4015- 4021. 15. Lê Thị Barrow, G.I. and R. K. A. Feltham, 1993. Cowan and Steel’s manual for the indentification of medical bacteria, 3rd edn. Cambridge Univesity Press, Cambridge. 262pp. 16. Le, T. X, Y. Munekage and S. Kato, 2005. Antibiotic resistance in bacteria from shrimp farming in mangrove areas. Science of the Total Environment 349 95-105. 17. Neela, F. A, L.Nonaka. and S. Suzuki, 2006. The diversity of multi-drug resistace profiles in tetracycline-resistant Vibrio species isolated from coastal seawater. The Journal of Microbiology, 45: 64-68. 18. Nguyễn Chính, 2005. Đánh giá tình hình sử dụng thuốc thú y thuỷ sản trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở An Giang và Cần Thơ. Luận văn cao học. Khoa thuỷ sản. Trường Đại Học Cần Thơ, 80 trang. 19. Nguyễn Hà Giang, 2008. Tiêu chuẩn hoá phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh hoá của vi khuẩn Aeromonas hydrophila tại khoa thuỷ sản. Luận văn tốt nghiệp đại học, Khoa Thuỷ Sản-Trường Đại Học Cần Thơ. 42 trang. 20. Nguyễn Mạnh Hùng, 2008. Khảo sát mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước và vi khuẩn Coliforms trong cơ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) trong nuôi ao. Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa Thuỷ Sản-Trường Đại Học Cần Thơ. 47 trang. 21. Nguyễn Phước Tương và Trần Diễm Quyên, 2000. Sử dụng thuốc và biện dược thú y. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 314 trang. 22. Nguyễn Thị Thuý Hằng, 2008. Tiêu chuẩn hoá phương pháp lập kháng sinh đồ trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila tại khoa thuỷ sản. Luận văn tốt nghiệp đại học khoa Thuỷ Sản- Trường Đại Học Cần Thơ. 56 trang. 23. Nguyễn Thị Tiên, 2007. Xác định đặc điểm sinh hoá của mầm bệnh vi khuẩn phân lập trên tôm sú (Penaeus monodon) bệnh phân trắng. Luận văn tốt nghiệp đại học khoa Thuỷ Sản- Trường Đại Học Cần Thơ. 48 trang. 24. Petersen, A., J. S. Andersen, T.Kaewmak, T. Somsiri, and A. Dalsgaard, 2002. Impact of Integrated Fish Farming on Antimicrobial Resistance in a Pond Environment. Applied and enviromental microbiology,68: 6036- 6042. 25. Prescot, J. F, J. D. Baggot and R. D. Walker, 2000. Antimicrobial therapy in veterinary medicine. Iowa State University Press/Ames. 795 pp. 26. Saavedra, M.J, S. G. Novais, A. Alves, P. Rema, M. Tacao, A. Correia and A. M. Murcia, 2004. Resistance to b-lactam antibiotics in Aeromonas hydrophila isolated from rainbow trout (oncorhynchus mykiss). International Microbiology 7:207-211. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 35 27. Sarter,S, H. N. K. Nguyen, L.T. Hung, J. Lazard and D. Montet, 2006. Antibiotic resistance in Gram-negative bacteria isolated from farmed catfish. Food Control 18 (2007) 1391-1396. 28. Tô Công Tâm, 2002. Khảo sát sự biến động các yếu tố thuỷ lý hoá của nước và các nhóm vi khuẩn gây bệnh trong ao nuôi cá tra mùa lũ. Luận văn tốt nghiệp đại học, Khoa Thuỷ Sản, Trường Đại Học Cần Thơ. 27 trang. 29. Trần Anh Dũng, 2005. Khảo sát tác nhân gây bệnh trong ao nuôi cá tra thâm canh ở tỉnh An Giang. Luận văn thạc sĩ ngành nuôi trồng thuỷ sản, Khoa Thuỷ Sản, Trường Đại Học Cần Thơ. 66 trang. 30. Trần Thị Thu Hằng, 2006. Dược lực học, tái bản lần tám. Nhà xuất bản Phương Đông, trang 629-699. 31. Trần Thị Tuyết Hoa, Nguyễn Thị Thu Hằng, Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2004. Thành phần loài và khả năng gây bệnh của nhóm vi khuẩn Vibrio phân lập từ hệ thống ương tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii). Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ. Tập chí khoa học 2004. Trang 153-164. 32. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005. Giáo trình bệnh học thuỷ sản. Khoa thuỷ sản. Trường Đại Học Cần Thơ, 123 trang. 33. Các trang web: www.thuocbietduoc.com.vn www.laocai.gov.vn. www.nhanong.net. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 36 PHỤ LỤC Phụ lục 1 PHIẾU THU MẪU Số TT:……. Ngày thu mẫu: .................................................................................................... Họ và tên người nuôi: ......................................................................................... Địa chỉ: ............................................................................................................... Điện thoại: .......................................................................................................... Loài cá: ............................................................................................................... Tuổi hay cỡ cá: ................................................................................................... Trọng lượng (g): ................................................................................................. Chiều dài (cm): ...................................... Chiều Cao (cm): ................................. Kích thước ao: Dài (m): ............ Rộng (m): ................. Sâu (m): ........................ Kích thước bè: Dài (m): ............ Rộng (m): ................. Sâu (m): ........................ Số lượng cá thả trong ao hay bè: ......................................................................... Mật độ cá thả (con/m2, con/m3): .......................................................................... Ngày thả cá: ........................................................................................................ Nguồn giống: ...................................................................................................... Vệ sinh, cải tạo ao/bè (có/không): ....................................................................... Hóa chất đã sử dụng, liều lượng:......................................................................... Vôi: .................................................................................................................... Thuốc tím: .......................................................................................................... Các loại khác: ..................................................................................................... ........................................................................................................................... Loại thức ăn: ....................................................................................................... Ngày mua thức ăn: .............................................................................................. Thức ăn tươi sống: ............................................................................................ % thức ăn/trọng lượng cơ thể: ............................................................................. Tần số cho ăn: .................................................................................................... Thức ăn chế biến: .............................................................................................. % thức ăn/trọng lượng cơ thể: ............................................................................. Tần số cho ăn: .................................................................................................... Nguồn nước: ...................................................................................................... PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 37 Chất lượng nước: ................................................................................................ Các chỉ tiêu môi trường: ..................................................................................... pH: .............................. NH4+: ................................. Độ kiềm: .......................... Màu nước trong ao hay bè: ................................................................................. Có thay nước hay không: .................................................................................... Thời gian thay nước: ........................................................................................... Ngày xuất hiện bệnh: ........................................................................................ Số cá chết hàng ngày: Tăng/giảm: ...................................................................... Ngày bắt đầu dung thuốc: ................................................................................... Các loại thuốc đã sử dụng, liều lượng: ................................................................ Loại thuốc sử dụng có hiệu quả không: ............................................................... Tên người thu mẫu PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 38 Phụ lục 2 1. Xác định các chỉ tiêu cơ bản (Theo cẩm nang Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993)) Quan sát tính di động Sự di động của vi khuẩn có thể quan sát bằng phương pháp giọt nước treo ở vật kính 40X. Các bước thực hiện như sau: Cho Vaseline lên bốn góc của lamelle và đặc ngửa lamelle trên bàn. Dùng que cấy tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle. Tiệt trùng que cấy, lấy một ít vi khuẩn cho lên lamelle hoà vào nước muối sinh lý. Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn . Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước được treo ngược trên lamelle. Đặt lame lên kính hiển vi quan sát tính di động của vi khuẩn ở vật kính 40X. Nhuộm Gram Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ một giọt nước cất lên lame, dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn trãi đều lên giọt nước cất. Để khô ở nhiệt độ phòng sau đó hơ lướt lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn trên lame. Các bước nhuộm Gram: Nhỏ dung dịch crystal violet lên lame. Để 1 phút. Rửa bằng nước cho hết màu tím trên lame (khoảng 2 giây), để khô ở nhiệt độ phòng. Nhỏ dung dịch 95% cồn:5% aceton để tẩy màu bằng cách nghiên lame rồi nhỏ từ từ dung dịch cho đến khi giọt nước cuối lame không còn màu tím. Rửa và để khô ở nhiệt độ phòng. Nhỏ dung dịch safranin lên lame, để khoảng 2 phút. Rửa và để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát ở vật kính 100X. Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh. Vi khuẩn Gram âm (G-) có màu hồng đỏ. Phản ứng oxidase Sử dụng test Bactident Oxidase. Dùng que cấy phết một ít vi khuẩn lên giấy tâm cytochrome oxidase. Vi khuẩn cho phản ứng oxidase (+) sẽ làm giấy chuyển sang màu tím hoặc tím đen trong vòng 60 giây và ngược lại. Phản ứng catalase PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 39 Dung que cấy nhặt một ít vi khuẩn lên lame, sau đó nhỏ lên vi khuẩn một giọt H2O2 3%. Vi khuẩn cho phản ứng catalase (+) sẽ gây ra hiện tượng sủi bọt trong dung dịch H2O2 3% và ngược lại. Khả năng lên men và oxy hoá đường glucose (Fermentation/ oxidation: O/F) Môi trường O/F (xem công thức pha chế trên nhãn). Đun và khuấy cho tan hoàn toàn. Tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút, để nguội 45oC. Thêm 1% glucose tiệt trùng. Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Cấy vi khuẩn vào hai ống nghiệm có chứa môi trường OF. Sau đó cho phủ 0.5-1 ml dầu paraffin tiệt trùng vào 1 ống nghiệm để tạo thành điều kiện yếm khí trong ống nghiệm. Để tủ trong tủ ấm ở 28oC. Đọc kết quả sau 1-7 ngày. Lên men (F) khi ống có phủ paraffin chuyển sang màu vàng. Oxidation (O) khi ống không phủ paraffin chuyển sang màu vàng. Không đổi khi cả hai ống đều có màu xanh lá cây hoặc xanh lơ. Khả năng phản ứng với O/129 Tiến hành giống như kháng sinh đồ. Đọc kết quả đường kính vòng vô trùng ³ 20 mm: nhạy; < 20: kháng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 40 Phụ lục 3 Bảng: nồng độ thuốc và dung dịch vi khuẩn cần pha STT Nồng độ cần pha (µg/ml) Thuốc kháng sinh (ml) Thể tích nước muối sinh lý (ml) Thể tích dd thuốc kháng sinh (ml) Thể tích dd vi khuẩn (ml) Nồng độ cuối cùng (µg/ml) 1 1024 25 (dd thuốc gốc 1) 0 3 3 512 2 512 25 (1024) 25 3 3 256 3 256 25 (512) 25 3 3 128 4 128 25 (dd thuốc gốc 2) 25 3 3 64 5 64 25 (128) 25 3 3 32 6 32 25 (64) 25 3 3 16 7 16 25 (32) 25 3 3 8 8 8 25 (16) 25 3 3 4 9 4 25 (8) 25 3 3 2 10 2 25 (4) 25 3 3 1 11 1 25 (2) 25 3 3 0,5 12 0,5 25 (1) 25 3 3 0,25 13 0,25 25 (0,5) 25 3 3 0,125 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version