Thử nghiệm phân lập và tạo dòng nguyên bào sợi từ mô phôi thai người

x 5ml moâi tröôøng môùi ñeå loaïi boû trypsin vaø nhöõng teá baøo cheát. *./ Löu yù: moät bình roux chöùa ñaày teá baøo coù theå caáy chuyeàn sang 3 hoaëc 4 bình roux môùi. 4.5. Tieâu chuaån choïn maãu moâ thí nghieäm. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 61 + Choïn maãu moâ thai ngoaøi, nhaèm haïn cheá söï nhieãm ngoaøi taàm kieåm soaùt, maø noù coù nguoàn goác töø maãu moâ ban ñaàu, trong quaù trình nuoâi caáy. + Choïn maãu moâ phoâi thai trong giai ñoaïn töø 4 – 12 tuaàn tuoåi. Vì vaøo thôøi ñieåm naøy, ñoát phoâi ñang trong giai ñoaïn hình thaønh, phaùt trieån vaø bieät hoùa, nhöõng phaân ñoaïn trung bì giaøu tieàm naêng, chöùa raát nhieàu caùc teá baøo trung moâ cuõng nhö caùc nguyeân baøo sôïi. + Phoâi ôû trong giai ñoaïn 4 – 12 tuaàn tuoåi, coù kích thöôùc ñuû lôùn ñeå nhaän dieän, cuõng laø luùc thai trong tai voøi coù khaû naêng bò vôû, chaûy maùu vaø gaây ñau cho ngöôøi meï. Do ñoù, thöôøng xuyeân coù nguoàn maãu ñeå thu nhaän. 4.6. Tieâu chuaån ñaùnh giaù choïn nguoàn moâ muïc tieâu. + So saùnh maãu moâ tai voøi, maãu moâ phoâi thai ngoaøi giöõa hình aûnh chuïp noäi soi [16] vaø thöïc nghieäm. + Phoâi coù maøu traéng ñuïc, hôi ngaø, giai ñoaïn töø 4 – 12 tuaàn. Khi heä tuaàn hoaøn phoâi chöa phaùt trieån maïnh, khi heä tuaàn hoaøn phoâi phaùt trieån maïnh (vaøo khoaûng 26 ngaøy tuoåi)[15] thì phoâi daàn chuyeån sang maøu traéng, trong, vaø coù laãn nhöõng doøng maïch maùu. Phöông phaùp kieåm kieäm laïi sau khi ñaõ löïa choïn maãu ñem ñi caáy: Maãu caáy taùch baèng trypsin, nhanh moïc (trong voøng 24 - 48 giôø ñaõ bieåu hieän moïc baùm raát roõ raøng), hình daïng teá baøo raát ña daïng sau moät thôøi gian nuoâi; Neáu maãu caáy taùch baèng cô hoïc (nuoâi caáy nguyeân phaùt) thì bieåu hieän cuûa teá baøo moïc baùm chaäm hôn so vôùi taùch baèng phöông phaùp söû duïng trypsin, sau moät thôøi gian phaùt trieån moïc lan roäng teá baøo cuõng raát ña daïng. Taát caû ñieàu ñoù chöùng toû raèng, ñaây laø maãu moâ tieàm naêng, maãu moâ phoâi. Moät ñieàu ñaùng tin caäy nöõa laø: taát caû maãu moâ ñem khaûo nghieäm ñeàu naèm trong tai voøi maø laáy ra. 4.7. Tieâu chuaån loaïi tröø maãu moâ thí nghieäm. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 62 + Coù teá baøo moïc baùm khoâng nhieàu, chaäm (treân moät tuaàn vaãn chöa coù bieåu hieän moïc), hoaëc baùm maø khoâng moïc, hình daïng caùc teá baøo maø chuùng moïc baùm khoâng ña daïng. Taát caû ñieàu ñoù chöùng toû: maãu moâ ñem taùch caáy khoâng phaûi laø maãu moâ tieàm naêng. Loaïi tröø, khoâng phaûi moâ phoâi. + Keát hôïp vôùi tieâu chuaån ñaùnh giaù choïn nguoàn moâ muïc tieâu, ta söû duïng phöông phaùp nhuoäm, caét laùt khaûo saùt vi theå ñeå kieåm nghieäm khaû naêng ñuùng hay sai vaø loaïi tröø maåu khaûm nghieäm khoâng phaûi laø muïc tieâu . Cuoái cuøng ñöa ra keát luaän. 4.8. Tieâu Chuaån Ñaùnh Giaù Phöông Phaùp, Moâi Tröôøng Ñeå Loaïi tröø. + Tieát kieäâm maãu moâ cho ñeán heát khaû naêng coù theå. + Tieát kieäm moâi tröôøng nuoâi caáy. + So saùnh toác ñoä phaùt trieån cuûa töøng phöông phaùp trong quaù trình quan saùt thí nghieäm. + So saùnh khaû naêng chòu ñöïng cuûa teá baøo ñoái vôùi söï bieán ñoäng cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy (nhö khaû chòu ñöïng tröôùc söï thieáu huït moâi tröôøng dinh döôõng) ôû töøng phöông phaùp caáy. + So saùnh söï ña daïng veà hình daïng cuûa caùc teá baøo toàn taïi trong moâi tröôøng nuoâi caáy ôû töøng phöông phaùp caáy. + Töø ñoù, caùc phöông phaùp vaø caùc moâi tröôøng khoâng toái öu seõ ñöôïc loaïi tröø daàn, chæ coøn laïi moät moâi tröôøng moät phöông phaùp cho quaù trình nuoâi sô caáp. 4.9. Caùc yeáu toá caàn nghieân cöùu. + Qui trình voâ truøng trong quaù trình thao taùc nuoâi caáy. + Xaùc ñònh teá baøo muïc tieâu nuoâi caáy (Nguyeân baøo sôïi). + Xaùc ñònh phöông phaùp thích hôïp cho nuoâi caáy. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 63 + Xaùc ñònh moâi tröôøng thích hôïp cho nuoâi caáy trong ba moâi tröôøng ñaõ söû duïng ñeå so saùnh, nhaèm xaùc nhaän: hieäu quaû moïc vaø hieäu quaû kinh teá cho thí nghieäm. + Caáy truyeàn, xaùc ñònh vaø phaân laäp teá baøo muïc tieâu, ñi ñeán taïo doøng nguyeân baøo sôïi. 4.10. Soá laàn thí nghieäm. Traûi qua 6 laàn nuoâi caáy trong quaù trình thí nghieäm. 4.11. Kyõ thuaät nghieân cöùu vaø phöông phaùp thu thaäp soá lieäu. AÙp duïng bieän phaùp voâ truøng nghieâm ngaët. Nuoâi cho coù teá baøo moïc. Quan saùt teá baøo muïc tieâu, ghi nhaän baèng hình aûnh. So saùnh ñoái chieáu keát quaû thu thaäp ñöôïc vôùi keát quaû cuûa caùc taùc giaû khaùc vaø keát quaû cuûa baïn cuøng laøm thí nghieäm trong quaù trình quan saùt thí nghieäm. Khi maät ñoä teá baøo moïc baùm lan roäng chieám dieän tích beà maët chai caáy töø 80 – 100% thì thöïc hieän caáy truyeàn leân treân ba moâi tröôøng ban ñaàu. So saùnh toác ñoä phaùt trieån cuûa teá baøo muïc tieâu treân ba moâi tröôøng theo thôøi gian. Quan saùt keát quaû sau caáy truyeàn treân ba chai caáy, ñeám maät ñoä teá baøo taïi naêm vò trí caùch ñeàu nhau treân beà chai caáy treân chai caáy sau khi ñaùnh daáu nhaân dieän. Ghi nhaän baèng hình aûnh trong moãi laàn quan saùt. 4.12. Phöông phaùp xöû lyù soá lieäu. + Trình baøy caùc böôùc thu thaäp soá lieäu trong quaù trình thí nghieäm. + Nhaän xeùt keát quaû vaø phöông thu thaäp soá lieäu. + Nhaäp soá lieäu vaøo maùy tính vaø xöû lyù soá lieäu baèng phaàn meàm: EXCEL vaø PHOTOSHOP. + Caùc soá lieäu ñöôïc toång keát, tính toaùn vaø keát quaû ñöôïc trình baøy döôùi daïng bieåu ñoà coù keøm theo hình aûnh cho töøng giai ñoaïn thí nghieäm, hình aûnh cho töøng ngaøy khaûo saùt ñeå thu laáy soá lieäu. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 64 5. PHÖÔNG TIEÄN NGHIEÂN CÖÙU. 5.1 THIEÁT BÒ. Tuû caáy voâ truøng (Laminar Flow Class II – Nuaire, USA) Tuû nuoâi (hieäu Heraeus instrument, Merck.) Tuû aám, Memmert Noài aùp suaát (SANYO labo autoclave ) pH keá (TOLEDO, Germany) Maùy khuaáy töø gia nhieät, HB 502 vaø caù töø. Maùy aûnh (Olympus, Japan Maùy aûnh kyõ thuaät soá Maùy saáy Tuû laïnh thöôøng (SANYO SR-9R Basic , high quality) Kính hieån vi quan saùt ñoâi Leica(LEITZ LABORLUXS ) Kính hieån vi ñaûo ngöôïc pha(Nikon Eclipse TE 300, Japan) Caân ñieän töû, Sartorious Buoàng ñeám teá baøo hoàng caàu Maùy ly taâm KOKUSAN (TOKYO, KOKUSAN ENSINKI, JAPAN) Hình 18 : Tuû caáy voâ truøng Hình 19 : Thao taùc vôùi tuû caáy voâ truøng Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 65 5.2. DUÏNG CUÏ: Pipetteman 200 - 1000µL Hình 20: Tuû nuoâi (Tuû aám CO2) Hình 21: Quan saùt maåu döôùi kính hieån vi soi ngöôïc. Hình 24: Kính hieån vi quan saùt ñoâi Leica Hình 23: Maùy ly taâm Hình 22 : Maùy khuaáy töø gia nhieät Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 66 Ñaàu típ voâ truøng Pipetteman nhöïa Pipette thuûy tinh: 5ml – 0.05ml, 10ml – 0.1ml Boùp cao su Erlen 50ml, 100ml, 250ml Goøn khoâng thaám Ñóa petri Becher 50ml, 100ml, 250ml Keùo nhoïn vaø keùo thaúng (loaïi nhoû) Pince cong vaø pince thaúng (loaïi nhoû) OÁng tieâm vaø kim tieâm Lamelle vaø buoàng ñeám teá baøo hoàng caàu NEUBAUER OÁng ly taâm Bình xòt coàn vaø bình xòt nöôùc caát Bình kim loaïi chöùa coàn ñöïng duïng cuï thao taùc voâ truøng Ñeøn coàn Hoäp queït Khay raùc Quaàn aùo baûo hoä voâ truøng vaø gaêng tay voâ truøng. Hình 25: Ñaàu tuyùp, Pippetteman, Buoàng ñeám teá baøo hoàng caàu. Hình 26: Hoäp tuyùp voâ truøng, Bình Roux, OÁng ly taâm lôùn vaø nhoû, OÁng tieâm Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 67 5.3.HOAÙ CHAÁT Dung dòch PBS(-). Dung dòch trypsin 0.25%. Moâi tröôøng AMNIOMAXTM-C100 Basal Medium, vôùi L- Glutamine (Cat. No. 17001-082, Lot. No. 1145148, 90ml / 13.15 USD) coù boå sung AMNIOMAXTM-C100 Supplement (Cat. No. 12556-015, 15 ml / 29.25 USD), (GIBCOBRL). Boå sung 20% huyeát thanh (FBS). Moâi tröôøng DMEM (DULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM), vôùi L-Glutamine vaø 1000 mg Glucose/L, khoâng coù Phenol Red vaø Sodium Bicarbonate. Product Number::D-2902 (SIGMA). Boå sung 20% huyeát thanh (AHS). Moâi tröôøng EMEM . Coù boå sung huyeát thanh 20% (AHS) + MEM with Hank’s Salts, with L-glutamine + Cat. No. 21575-022 + Lot. No. 3073244. A. CHUAÅN BÒ HOAÙ CHAÁT *./Chuaån bò PBS(-) (Phosphate Buffered Saline free Ca2+ , Mg2+ .) + NaCl 10g. + KCl 0,25g + Na2HPO4.12H2O: 3,6g + K2HPO4 : 0,255g + Nöôùc caát: ñuû 1.000ml + Haáp khöû truøng ôû 125oC trong 30 phuùt. + Baûo quaûn laïnh ôû 4oC. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 68 *./ Chuaån bò Trypsin 0,25% töø trypsin 1%. + Duøng PBS(-) ñaõ ñöôïc haáp khöû truøng pha loaõng trypsin 1% vôùi tæ leä: 40:10 , ta thu ñöôïc 50ml trypsin 0,25%. B. VOÂ TRUØNG DUÏNG CUÏ VAØ HOAÙ CHAÁT. *./ Duïng cuï Duïng cuï baèng thuyû tinh vaø kim loaïi ñöôïc voâ truøng baèng caùch haáp khöû truøng hôi nöôùc vôùi autoclave (121oC 1atm trong 30 phuùt) Duïng cuï nhöïa lau, röûa nöôùc thöôøng, roái baèng caát hoaëc lau coàn 70o, ñeå khoâ töï nhieân vaø chieáu ñem chieáu xaï cho vaøo bao nilong giöõ voâ truøng: chai caáy, ñaàu tuyùp, oáng ly taâm… tröôùc khi söû duïng chieáu UV 30 phuùt. *./ Hoaù chaát. Voâ truøng hoùa chaát söï duïng baèng phin loïc (Filter) nhö: trypsin, PBS(-), DMEM, Huyeát thanh. Duøng moâi tröôøng cao thòt pepton vaø moâi tröôøng thaïch maùu ñeå kieåm tra ñoä voâ truøng cuûa dung dòch vaø moâi tröôøng nuoâi vaø hoùa chaát sau khi pha. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 69 CHÖÔNG III: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN. I. ./. KEÁT QUAÛ: Töø 9/3 ñeán 21/6/2004 : Chuùng toâi ñaõ thöïc hieän vaø thu ñöôïc keát quaû nhö sau: 1. Toùm taét keát sô löôïc quaû thu ñöôïc trong tieán trình thí nghieäm. 1.1./ Keát quaû nuoái caáy sô caáp. + Ñôït I: Taïi phoøng Di Truyeàn Hoïc – Beänh vieän Phuï saûn Töø Duõ. Hai laàn thöû nghieäm toång quaùt: So saùnh ba phöông phaùp, vaø so saùnh ba moâi tröôøng: *./ Laàn thöù nhaát (9/3): Nuoâi thaønh coâng, teá baøo moïc baùm raát toát, chæ 24 giôø sau khi caáy ñaõ coù xuaát hieän laùc ñaùc nhöõng 5 teá baøo ñôn daïng nguyeân baøo sôïi trong tröôøng hôïp nuoâi nguyeân phaùt vaø nuoâi töø dòch röûa. Teá baøo moïc baùm toát nhaát laø nuoâi caáy nguyeân phaùt vaø nuoâi töø dòch röûa, duy trì maãu nuoâi ñeå quan saùt ñöôïc khoaûng 30 ngaøy (ñeán ngaøy 9/4) keå töø ngaøy caáy, roài boû. *./ Laàn thöù hai (23/3): Coù teá baøo moïc baùm treân caû ba phöông phaùp vaø ba loaïi moâi tröôøng nhöng ñeán ngaøy thöù ba sau khi caáy daáu hieäu nhieãm ñaõ theå hieän: moâi tröôøng trong chai caáy bò ñoåi maøu nhanh choùng, trôû neân ñuïc, quan saùt maãu thaáy luùt nhuùt vi sinh vaät, ghi nhaän hình aûnh bò nhieåm xong roài boû. + Ñôït II: Taïi phoøng Moâ Phoâi – Trung taâm Ñaøo taïo Caùn Boä Y Teá Thaønh phoá Hoà Chí Minh. Hai laàn thöû nghieäm toång quaùt: So saùnh ba phöông phaùp, vaø so saùnh ba moâi tröôøng: *./ Laàn thöù nhaát (27/4): Khoâng coù daáu hieäu moïc, maø chæ thaáy coù moâ baùm ñaùy chai, quan saùt ñeán ngaøy 6/5 khoâng thaáy coù daáu hieäu moïc, roài boû. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 70 *./ Laàn thöù hai (8/5): Nuoâi thaønh coâng, teá baøo ôû caû ba phöông phaùp ñeàu moïc raát toát: Teá baøo muïc tieâu (Nguyeân baøo sôïi) bieåu hieän moïc roõ raøng chæ sau 24 giôø nuoâi (taùch baèng trypsin). Tröôøng hôïp maãu nuoâi töø dòch taùch baèng trypsin, vôùi maät ñoä teá baøo nuoâi ban ñaàu töø khoaûng: 106 – 107 teá baøo/ ml, teá baøo moïc baùm raát toát sau 24 giôø. Coøn neáu maät ñoä teá baøo khoâng ñaït yeâu caàu, töùc laø döôùi 106 teá baøo/ ml thì khoaûng töø 2 – 3 ngaøy sau môùi coù bieåu hieän moïc. ÔÛ ñaây, teá baøo muïc tieâu bieåu hieän moïc roõ raøng vaøo khoaûng ba ngaøy sau khi caáy (tröôøng hôïp maãu nuoâi nguyeân phaùt vaø nuoâi töø dòch röûa); moïc toát nhaát laø: ÔÛ chai :AMNIOMAX – trypsin, 9 ngaøy sau khi caáy (17/5) teá baøo phaùt trieån maïnh nhaát chieám töø 80% - 90% dieän tích beà maët chai caáy, ñeán ngaøy 21/5 coù daáu hieäu teá baøo cheát, duy trì ñöôïc ñeán ngaøy 7/6, coøn laïi laùc ñaùc vaøi teá baøo daïng hình caàu (troøn) ; Vaø ôû chai: AMNIOMAX – nguyeân phaùt, 13 ngaøy sau khi caáy (21/5) teá baøo moïc lan ra töø caùc maûnh moâ chieám ñaày dieän tích beà maët chai caáy khoaûng 70% - 80% , vaø taêng leân ñeán khoaûng 90% - 100% dieän tích beà maët chai caáy (10/6) vaø thôøi ñieåm coù xuaát hieän nhieàu teá baøo môùi moïc lan ra: daïng hình troøn (daïng caàu) hay hình daøi (daïng que) vaø coù caû daïng teá baøo phaân ra nhieàu nhaùnh ( 2, 3, hoaëc 4 nhaùnh ), ngaøy 11/6 ghi nhaän hình aûnh laàn cuoái. Ñeán ngaøy 12/6, thöïc hieän caáy truyeàn töø chai AMNIOMAX – nguyeân phaùt ra ba loaïi moâi tröôøng, ñeám maät ñoä teá baøo/ quang tröôøng 10X, quan saùt töøng ngaøy vaø ghi nhaän hình aûnh minh hoïa. + Ñôït III: Taïi phoøng Moâ Phoâi – Trung taâm Ñaøo taïo Caùn Boä Y Teá Thaønh phoá Hoà Chí Minh. Hai laàn thöû nghieäm treân moät phöông phaùp, so saùnh ba moâi tröôøng. *./ Laàn thöù nhaát (1/6): Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 71 Quan saùt töøng ngaøy, cöù caùch 24 giôø quan saùt moät laàn, ñeán ngaøy 7/6 vaãn cuõng chæ thaáy coù moâ baùm maø khoâng coù teá baøo moïc. Cho ñeán ngaøy 13/6, quan saùt thaáy vaøi teá baøo moïc lan ra töø maûnh moâ, khi quan saùt toaøn dieän beà maët chai caáy thaáy khoâng quaù 50 teá baøo vaø moïc lan ra töø moät maûnh moâ duy nhaát, caùc maûnh moâ coøn khoâng coù bieåu hieän moïc, vaø coù moät daïng teá baøo duy nhaát daïng hình que, quan saùt ñeán ngaøy 15/6 khoâng coù bieåu hieän gì ñaëc bieät, roài boû. *./ Laàn thöù hai (15/6): Nuoâi caáy treân gieáng, sau 24 giôø quan saùt treân caû ba moâi tröôøng coù laùc ñaùc vaøi teá baøo moïc lan ra töø moâ, soá löôïng teá baøo coù chieàu höôùng gia taêng. Quan saùt thí nghieäm, ghi nhaän hình aûnh laàn cuoái vaø ñoàng thôùi chaám döùt caû tieán trình thí nghieäm. 1.2. Keát quaû nuoâi caáy thöù caáp – caáy chuyeàn. Thöïc hieän caáy chuyeàn töø chai caáy AMNIOMAX – nguyeân phaùt ra ba loaïi moâi tröôøng: AMNIOMAX, DMEM, EMEM coù boå sung 20% huyeát thanh. Sau 24 giôø, vaø cöù caùch 24 giôø quan saùt maãu, ñeám maät ñoä teá baøo taïi 5 vò trí treân chai caáy roài laáy giaù trò trung bình ôû quang tröôøng 10X. Ghi nhaän hình aûnh cuûa ba chai ôû moãi laàn quan saùt. Roài chaám döùt thí nghieäm. Maät ñoä teá baøo khi taùch baèng trypsin, tröôùc khi caáy chuyeàn vaøo chai caáy môùi (tröôùc pha loaõng) laø: 4,35.106 teá baøo/ ml. *./ Caùch tính: Soá teá baøo ñeám trong 5 oâ lôùn:[Phuï luïc B] A = 7; B = 10; C = 17; D = 10; E = 14. N = 7 + 10 + 17 + 10 + 14 = 58 teá baøo/ 5 oâ lôùn. N’ = 5*58 = 290 teá baøo/buoàng ñeám. Maät ñoä teá baøo/1ml: C = 290*104 teá baøo/1ml. Vôùi ñoä pha loaõng a = 1,5 laàn thì: C’ = 1,5*290*104 = 4,35*106 teá baøo/1ml. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 72 *./ Pha loaõng ñeå ñuû theå tích cho vaøo ba chai caáy: Söû duïng 1,5 ml AMNIOMAXTM-C100 20% FBS laø moâi tröôøng dinh döôõng cao, coù thaønh phaàn boå trôï, coù chöùa huyeát thanh ñeå öùc cheá trypsin trong luùc caáy truyeàn. Ñem ñeám maät ñoä coù: C’ = 4,35*106 teá baøo/1ml. Boå sung theâm 1,5 ml AMNIOMAXTM- C100 20% FBS nöõa ñeå ñöôïc 3ml vaø chia ñeàu cho ba chai caáy nhö sau: + Chai AMNIOMAX: 1ml dòch huyeàn phuø (coù FBS) + 4ml AMNIOMAXTM-C100 20% FBS. + Chai DMEM: 1ml dòch huyeàn phuø (coù FBS) + 4 ml DMEM 20% AHS. + Chai EMEM: 1ml dòch huyeàn phuø (coù FBS) + 4 ml EMEM 20% AHS. *./ Maät ñoä ôû moãi chai sau pha loaõng ñem nuoâi laø: C’’ = n/v = (0.5*4,35*106 / 5) = 0,435*106 (teá baøo/5ml moâi tröôøng). *./ Sau 24 giôø, sau khi caáy truyeàn (13/5), quan saùt chæ thaáy laùc ñaùc vaøi teá baøo ôû caû ba chai; Caùch 48 giôø (14/5) sau khi caáy truyeàn soá löôïng teá baøo treân quang tröôøng 10X, baét ñaàu taêng leân ñaùng keå, baét ñaàu quan saùt vaø ñeám maät ñoä. 1.3. Hình aûnh ghi nhaän ñöôïc trong caùc ñôït nuoâi caáy. *./ Ñôït I: Caùc hình aûnh teá baøo nuoâi caáy moïc lan ra moâ nguyeân phaùt laàn 1 ñôït I. Hình 27: AÛnh teá baøo lan ra tö ø moâ Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 73 *./ Ñôït II: Caùc hình aûnh teá baøo nuoâi caáy moïc lan ra moâ nguyeân phaùt laàn 2 ñôït II. Hình 28: AÛnh teá baøo lan ra tö ø moâ, nuoâi caáy sô caáp Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 74 14.6 35% 16% 49% AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20% AHS *./ Ñôït III: Caùc hình aûnh teá baøo nuoâi caáy moïc lan ra moâ nguyeân phaùt laàn 2 ñôït III. 2. SOÁ LIEÄU VAØ HÌNH AÛNH GHI NHAÄN ÑÖÔÏC SAU KHI CAÁY TRUYEÀN. 2.1.Baûng soá lieäu, vaø hình aûnh (ngaøy 14/6) Baûng 3: Vò trí treân chai / Moâi tröôøng AMNIOMAX DMEM EMEM 1 4 1 4 2 2 0 2 3 1 1 3 4 1 1 4 5 3 2 2 Maät ñoä trung bình/quang tröôøng 10X 2,2 1 3 Hình 29: AÛnh teá baøo lan ra tö ø moâ, nuoâi caáy sô caáp Bieåu ñoà 1 Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 75 *./ Caùc aûnh minh hoïa cho caùc teá baøo sau caáy chuyeàn, quan saùt ngaøy 14/6. Thöù töï aûnh: A-D-E. (ÖÙng vôùi: AMNIOMAX-DMEM-EMEM). Hình 30: AÛnh nuoâi caáy thöù caáp, 14/6: A-D-E 2.2. Baûng soá lieäu, vaø hình aûnh (ngaøy 15/6) Baûng 4: Vò trí treân chai / Moâi tröôøng AMNIOMAX DMEM EMEM 1 10 3 4 2 4 2 5 3 9 2 12 4 11 3 7 5 9 4 18 Maät ñoä trung bình/quang tröôøng 10X 8,6 2,8 9,2 *./ Nhaän xeùt 1: Ngaøy ñaàu (14/6), soá löôïng teá baøo ñeám ñöôïc ôû treân ba moâi tröôøng, coù ñoä cheânh leäch khoâng cao. Nhìn toång theå, teá baøo moïc treân caùc chai caáy laø raát chaäm (ñaõ sau 48 giôø sau khi caáy chuyeàn), coù leõ maät ñoä teá baøo ñem caáy chuyeàn khoâng ñaït tæ leä nhö yeâu caàu (106 – 107). Nhöng teá baøo moïïc baùm treân moâi tröôøng EMEM 20%AHS thì nhieàu hôn so vôùi hai moâi tröôøng coøn laïi, soá löôïng teá baøo moïc treân moâi tröôøng DMEM 20%FBS laø ít nhaát. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 76 *./ Caùc aûnh minh hoïa cho caùc teá baøo sau caáy chuyeàn, quan saùt ngaøy 15/6. Thöù töï aûnh: A-D-E. (ÖÙng vôùi: AMNIOMAX-DMEM-EMEM). Hình 31: AÛnh nuoâi caáy thöù caáp, 15/6: A-D-E *. Nhaän xeùt 2: Ngaøy 15/6, caùch sau 72 giôø sau khi caáy chuyeàn. Maät ñoä teá baøo treân quang tröôøng 10X ôû tröôøng hôïp moâi tröôøng: AMNIOMAX vaø EMEM taêng leân raát ñaùng keå; duy chæ maät ñoä teá baøo treân quang tröôøng 10X ôû DMEM taêng leân raát chaäm. Bieåu ñoà 2: 15.6 42% 14% 44% AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20% AHS Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 77 2.3./ Baûng Soá Lieäu Vaø Hình Aûnh (Ngaøy 16/6) Baûng 5: Bieåu ñoà 3 *./ Caùc aûnh minh hoïa cho caùc teá baøo sau caáy chuyeàn, quan saùt ngaøy 16/6. Thöù töï aûnh: A-D-E. (ÖÙng vôùi: AMNIOMAX-DMEM-EMEM). 16.6 38% 11% 51% AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20% AHS *./ Nhaän xeùt 3: Ngaøy 16/6, caùch sau 96 giôø sau khi caáy chuyeàn. Maät ñoä teá baøo ôû caû ba chai caáy ñeàu taêng leân, nhieàu nhaát laø maät ñoä teá baøo treân moâi tröôøng EMEM, keá ñeán laø ôû moâi tröôøng AMNIOMAX, maät ñoä teá baøo taêng ít nhaát laø ôû moâi tröôøng DMEM. Vò trí treân chai / Moâi tröôøng AMNIOMAX DMEM EMEM 1 15 4 16 2 7 3 15 3 12 4 20 4 13 3 13 5 13 3 18 Maät ñoä trung bình/quang tröôøng 10X 12 3,4 16,4 Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 78 Hình 32: AÛnh nuoâi caáy thöù caáp, 16/6: A-D-E 2.4./ Baûng Soá Lieäu Vaø Hình Aûnh (Ngaøy 17/6) Baûng 6 Bieåu ñoà 4 17.6 29% 3% 68% AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20% AHS *./ Quan saùt xong, roài thay moâi tröôøng cho ba chai caáy truyeàn vaøo ngaøy 17/6. Vò trí treân chai / Moâi tröôøng AMNIOMAX DMEM EMEM 1 9 1 30 2 6 0 12 3 7 0 21 4 9 2 17 5 10 1 17 Maät ñoä trung bình/quang tröôøng 10X 8,2 0,8 19,4 Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 79 *./ Caùc aûnh minh hoïa cho caùc teá baøo sau caáy chuyeàn, quan saùt ngaøy 17/6. Thöù töï aûnh: A-D-E. (ÖÙng vôùi: AMNIOMAX-DMEM-EMEM). Hình 33: AÛnh nuoâi caáy thöù caáp, 17/6: A-D-E *./ Nhaân xeùt 4: Ngaøy 17/6, caùch sau 120 giôø sau khi caáy chuyeàn (töùc laø caùch 5 ngaøy sau khi caáy chuyeàn, ñeán ngaøy cuoái cuøng cuûa kyø haïn thay moâi tröôøng). Maät ñoä teá baøo treân quang tröôøng 10X ôû moâi tröôøng EMEM taêng leân, vöôït troäi. Trong khi ñoù maät ñoä teá baøo treân quang tröôøng 10X ôû hai moâi tröôøng: AMNIOMAX, DMEM giaûm so vôùi 24 giôø tröôùc ñoù, coù leõ do caïn kieät nguoàn dinh döôõng maø chöa ñöôïc boå sung, vaø coäng theâm moâi tröôøng trôû neân cuõ cuõng laø moät nguyeân nhaân goùp phaàn gaây aûnh höôûng ñeán söï giaûm xuùc maät ñoä ôû hai tröôøng hôïp treân. Coøn tröôøng hôïp, treân moâi tröôøng EMEM coù nguoàn dinh döôõng doài daøo hôn moâi tröôøng DMEM coù theå laø do söï pha troän giöõa: 1ml AMNIOMAX vaø 4ml EMEM vaø ñoàng thôøi söû duïng huyeát thanh ngöôøi (AHS) laøm chaát boå trôï trong moâi tröôøng EMEM. Khi pha troän hai moâi tröôøng treân laïi vôùi nhau ñoàng nghóa vôùi söï keát hôïp ñoàng thôøi hai hoãn hôïp boå trôï: FBS vaø AHS trong cuøng moät moâi tröôøng. Coù leõ, vì leõ ñoù maø hoãn hôïp caùc doøng teá baøo, trong ñoù coù nguyeân baøo sôïi phaùt trieån raát toát vaø teá baøo moïc baùm vöôït troäi treân EMEM ñöôïc pha troän, toát hôn so vôùi ngay caû teá baøo moïc teân moâi tröôøng AMNIOMAX. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 80 2.5./ Baûng Soá Lieäu Vaø Hình Aûnh (Ngaøy 18/6) Baûng 7: *./ Caùc aûnh minh hoïa cho caùc teá baøo sau caáy chuyeàn, quan saùt ngaøy 18/6. Thöù töï aûnh: A-D-E. (ÖÙng vôùi: AMNIOMAX-DMEM-EMEM). 18.6 36% 6% 58% AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEMAH% AHS EMEM 20% AHS *./ Nhaän xeùt 5: Ngaøy 18/6, töùc laø caùch 1 ngaøy (24 giôø) sau khi thay moâi tröôøng. Maät ñoä teá baøo treân quang tröôøng 10X ôû caû ba moâi tröôøng tieáp tuïc taêng so vôùi ngaøy 1 tröôùc ñoù (caùch ñoù 24 giôø). Teá baøo ñöôïc phuïc hoài khaû naêng taêng sinh, do ñoù maät ñoä teá baøo treân quang tröôøng 10X ôû moâi tröôøng: AMNIOMAX, DMEM taêng leân maø khoâng bò giaûm xuoáng tieáp tuïc. Coøn maät ñoä teá baøo treân quang tröôøng 10X ôû EMEM thì khoâng ngöøng ñöôïc nhaân leân. Vò trí treân chai / Moâi tröôøng AMNIOMAX DMEM EMEM 1 17 2 45 2 17 4 22 3 25 4 37 4 35 5 44 5 16 2 33 Maät ñoä trung bình/quang tröôøng 10X 22 3,4 36,2 Bieåu ñoà 5 Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 81 Hình 34: AÛnh nuoâi caáy sô caáp, 18/6: A-D-E 2.6./ Baûng Soá Lieäu Vaø Hình Aûnh (Ngaøy 21/6) Baûng 8: Bieåu ñoà 6 21.6 37% 1% 62% AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20% AHS Vò trí treân chai / Moâi tröôøng AMNIOMAX DMEM EMEM 1 21 1 39 2 400 1 100 3 13 1 200 4 23 2 150 5 11 2 300 Maät ñoä trung bình/quang tröôøng 10X 93,6 1,4 157,8 Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 82 Moâi tröôøng 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 21/6 AMNIOMAX 2,2 8,6 12 8,2 22 93,6 *./ Caùc aûnh minh hoïa cho caùc teá baøo sau caáy chuyeàn, quan saùt ngaøy 21/6. Thöù töï aûnh: A-D-E. (ÖÙng vôùi: AMNIOMAX-DMEM-EMEM). II. BAØN LUAÄN: 1. So saùnh baûng soá lieäu treân cuøng moâi tröôøng A. Treân Cuøng Moâi Tröôøng: Amniomax. Baûng 9: *./ Nhaän xeùt 6: Ngaøy 21/6, töùc laø caùch 9 ngaøy (216 giôø) sau khi caáy chuyeàn, vaø caùch 4 ngaøy (96 giôø) sau khi thay moâi tröôøng laàn thöù nhaát, vaø caùch 2 ngaøy khoâng quan saùt. Maät ñoä teá baøo treân quang tröôøng 10X ôû moâi tröôøng EMEM taêng voït raát cao; coøn maät ñoä teá baøo ôû ôû moâi tröôøng AMNIOMAX cuõng taêng, nhöng ít hôn so vôùi ôû EMEM. Duy chæ maät ñoä teá baøo treân quang tröôøng 10X ôû moâi tröôøng DMEM laïi tieáp tuïc giaûm so vôùi tröôùc ñoù 2 ngaøy. Lyù do giaûi thích cho ñieàu naøy Hình 35: AÛnh nuoâi caáy thöù caáp, 21/6: A-D-E Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 83 2.2 8.6 12 8.2 22 93.6 0 20 40 60 80 100 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 AMNIOMAXTM-C100 20% FBS AMNIOMAXTM-C100 20% FBS 21/6 Bieåu ñoà 7: B. Treân Cuøng Moâi Tröôøng: DMEM Baûng 10: * Nhaän xeùt 7: Maät ñoä teá baøo treân quang tröôøng 10X ôû moâi tröôøng AMNIOMAX, nhìn chung khoâng ngöøng taêng leân theo thôøi gian (tröø tröôøng hôïp maät ñoä teá baøo ngaøy 17/6). Ñieàu ñoù chöùng toû raèng moâi tröôøng naøy phuø hôïp cho nuoâi caáy nguyeân phaùt (sô caáp) vaø cho caû caáy chuyeàn teá baøo nguyeân baøo sôïi. Lieàu löôïng 5 ml moâi tröôøng AMNOOMAX öùng vôùi 5 ngaøy nuoâi teá baøo laø phuø hôïp. Duy nhaát moät ñieàu caàn löu yù laø khi taùch teá baøo baèng trypsin hay khi caáy truyeàn coù söû duïng tôùi trypsin thì kyø haïn ngaøy thay moâi tröôøng laàn ñaàu tieân khoâng ñöôïc vöôït quaù 4 ngaøy ñoái vôùi tröôøng hôïp moâi tröôøng AMNIOMAX. Toát nhaát laø trong khoaûng töø 2 – 3 sau khi caáy taùch baèng trypsin thì thay moâi tröôøng laàn thöù nhaát. Coù theå moâi tröôøng trong chai caáy luoân luoân cuõ cuõng gaây aûnh höôûng ñeán söï taêng tröôûng cuûa teá baøo. Moâi tröôøng 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 21/6 DMEM 1 2,8 3,4 0,8 3,4 1,4 Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 84 *./ Nhaän xeùt 7: Maät ñoä teá baøo treân quang tröôøng 10X ôû moâi tröôøng DMEM, coù taêng leân theo thôøi gian, nhöng raát chaäm, söû duïng lieàu löôïng moâi tröôøng 5 ml öùng vôùi 5 ngaøy thay laø khoâng phuø hôïp ñoái vôùi moâi tröôøng DMEM. Coù leõ lieàu löôïng moâi tröôøng söû duïng ít so vôùi nhu caàu phaùt trieån cuûa teá baøo, khoâng ñuû dinh döôõng cho teá baøo taêng sinh.Trong khoaûng 4 ngaøy ñaàu, maät ñoä teá baøo treân moâi tröôøng DMEM coù taêng, nhöng töø ngaøy thöù 4 ñeán ngaøy thöù 5 thì maät ñoä teá baøo giaûm maïnh. Vaø ñieàu ñoù laëp laïi ñeán 2 laàn, tieáp tuïc xaûy ra söï giaûm maät ñoä trong kyø thay moâi tröôøng laàn thöù nhaát. Cho moâi tröôøng vaøo nuoâi teá baøo baét ñaàu töø ngaøy 12/6, teá baøo bieåu hieän taêng sinh cho ñeán ngaøy 16/6, vaø ñeán ngaøy 17/6 maät ñoä teá baøo giaûm ñoät ngoät. Thay moâi tröôøng laàn thöù nhaát vaøo chieàu ngaøy 17/6, ñeán ngaøy 18/6 teá baøo bieåu hieän taêng sinh trôû laïi; vaø ñeán ngaøy 21/6, töùc laø sau 4 ngaøy sau khi thay moâi tröôøng, khi quan saùt trôû laïi thì maät ñoä teá baøo coù bieåu hieän giaûm, Chöùng toû chæ coù caùch 4 ngaøy roài thay moâi tröôøng cuõng khoâng phuø hôïp. Vaäy lieàu löôïng moâi tröôøng 5ml (DMEM) öùng vôùi 5 ngaøy thay laø khoâng phuø hôïp. Bieåu ñoà 8 1 2.8 3.4 0.8 3.4 1.4 0 2 4 6 8 10 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 DMEM 20% AHS DMEM 20% AHS 21/6 Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 85 *./ Nhaän xeùt 8: ÔÛ moâi tröôøng EMEM maät ñoä teá baøo luoân taêng trong suoát quaù trình nuoâi vaø quan saùt. Coù leõ lieàu löôïng moâi tröôøng khaù phuø hôïp cho tröôøng hôïp nuoâi teá baøo caáy chuyeàn. Trong khi ñoù, cuõng söû duïng moâi tröôøng naøy, trong tröôøng hôïp nuoâi teá baøo sô caáp, thì teá baøo phaùt trieån khoâng quaù 7 - 9 ngaøy thì ñaõ bò suy thoaùi roài cheát. Maëc duø cuõng söû duïng lieàu löôïng moâi tröôøng töông töï. Moâi tröôøng 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 21/6 EMEM 3 9,2 16,4 19,4 36,2 157,8 Moâi tröôøng 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 21/6 AMNIOMAX 2,2 8,6 12 8,2 22 93,6 DMEM 1 2,8 3,4 0,8 3,4 1,4 EMEM 3 9,2 16,4 19,4 36,2 157,8 C. Treân Cuøng Moâi Tröôøng: EMEM. Baûng 11: Error! 2. So saùnh baûng soá lieäu giöûa caùc moâi tröôøng. Baûng 12: 3 9.2 16.4 19.4 36.2 157.8 0 50 100 150 200 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 21/6 EMEM 20% AHS EMEM 20% AHS Bieåu ñoà 9 Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 86 2.2 1 3 8.6 2.89.2 12 3.4 16.4 8.2 0.8 19.4 22 3.4 36.2 93.6 1.4 157.8 0 20 40 60 80 100 120 140 160 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 21/6 AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20%AHS *./ Nhaän xeùt 9: (1).AMNOOMAX: Maät ñoä teá baøo taêng theo thôøi gian ñaàu nuoâi caáy. Chæ tröø söï kieän ngaøy 17/6, ngaøy thöù 5 sau khi caáy chuyeàn, maät ñoä teá baøo bò giaûm ñoät ngoät. Ngay sau ñoù, laäp töùc thay moâi tröôøng, vaø quan saùt nhöõng ngaøy tieáp theo maät ñoä teá baøo khoâng ngöøng taêng leân. Chöùng toû loaïi moâi tröôøng vaø lieàu löôïng moâi tröôøng söû duïng cho caáy truyeàn cuõng nhö nuoâi caáy sô caáp laø khaù phuø hôïp, seõ laø khoâng ñuû neáu maät ñoä teá baøo quaù cao ( moïc baùm treân 70% dieän tích chai caáy), caàn löu yù tôùi söï ñoåi maøu cuûamoâi tröôøng trong khi quan saùt. (2).DMEM: Maät ñoä teá baøo taêng trong voøng 2 – 3 ngaøy ñaàu sau khi thay moâi tröôøng, khi chuyeån qua ngaøy thöù 4 hoaëc ngaøy thöù 5 cuûa kyøhaïn thay moâi tröôøng thì teá baøo baét ñaàu coù hieän töôïng suy thoaùi. Chöùng toû lieàu löôïng 5ml DMEM öùng vôùi 5 ngaøy thay laø khoâng phuø hôïp. Caàn thieát phaûi ñieàu chænh laïi 5 ml moâi tröôøng DMEM trong voøng 2 - 3 ngaøy thì thay, coù leõ seõ phuø hôïp. Toác ñoä vaø maät ñoä teá baøo moïc treân moâi tröôøng DMEM keùm xa 2 moâi tröôøng coøn laiï; Coù leõ do dinh döôõng khoâng phuø hôïp hoaëc do nhieàu lyù do khaùc maø ta chöa hoaëc khoâng kieåm soaùt ñöôïc. (3).EMEM: Maät ñoä teá baøo khoâng ngöøng taêng theo thôøi gian ñaàu nuoâi caáy ñoái vôùi tröôøng hôïp EMEM. Moâi tröôøng phuø hôïp vaø lieàu löôïng moâi tröôøng söû duïng laø phuø hôïp trong nuoâi caáy thöù caáp. Bieåu ñoà 10 Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 87 3. Nhöõng ñieåm khaùc bieät cuûa caùc loaïi moâi tröôøng aûnh höôõng ñeán keát quaû nuoâi AMNIOMAX: laø loaïi moâi tröôøng thöông maïi, daïng dòch loûng, chuyeân söû duïng ñeå nuoâi nguyeân baøo sôïi töø nöôùc oái [Phoøng di ttuyeàn hoïc , beänh vieän phuï saûn Töø Duõ], coù söû duïng chaát boå trôï, huyeát thanh (FBS). Moâi tröôøng AMNIOMAX phuø hôïp cho caû nuoâi caáy sô caáp vaø nuoâi caáy thöù caáp, treân moâi tröôøng naøy nguyeân baøo sôïi moïc raát toát. EMEM: laø loaïi moâi tröôøng thöông maïi, daïng dòch loûng, boå sung huyeát thanh (AHS), chæ phuø hôïp cho nuoâi caáy thöù caáp, teá baøo seõ moïc baùm toát neáu coù söï pha troän theâm moät ít AMNIOMAX (tæ leä 1:4). EMEM khoâng phuø hôïp cho nuoâi caáy sô caáp, coù nhieàu lyù do ñeå giaûi thích cho ñieàu naøy, nhöng coù leõ, chuû yeáu do lieàu löôïng moâi tröôøng söû duïng quaù ít so vôùi nhu caàu söû duïng cuûa teá baøo. DMEM: laø moâi tröôøng thöông maïi, daïng boät, pha thaønh moâi tröôøng daïng loûng, boå sung huyeát thanh (AHS). DMEM khoâng phuø hôïp cho caû nuoâi caáy sô caáp vaø nuoâi caáy thöù caáp, coù nhieàu lyù do ñeå giaûi thích cho ñieàu naøy, nhöng coù leõ, chuû yeáu do lieàu löôïng moâi tröôøng söû duïng quaù ít so vôùi nhu caàu söû duïng cuûa teá baøo. Moät ñieàu minh chöùng cuï theå cho khaûng ñònh: teá baøo khoâng moïc toát treân moâi tröôøng cô baûn (DMEM, EMEM) bôûi lyù do söû duïng lieàu löôïng moâi tröôøng khoâng phuø hôïp, khoâng ñuû dinh döôõng cho teá baøo sinh tröôûng vaø phaùt trieån laø: caùc taùc giaû khaùc cuõng söû duïng caùc loaïi moâi tröôøng naøy, cho keát quaû raát toát, lieàu löôïng moâi tröôøng söû duïng laø 5ml moâi tröôøng öùng vôùi 2ngaøy thay [29]. Vaø moät baïn, trong cuøng nhoùm nghieân cöùu veà teá baøo, baïn Nguyeãn Leâ Xuaân Tröôøng (0018200) ñaõ nuoâi raát thaønh coâng teá baøo töø phoâi thai chuoät treân moâi tröôùng DMEM 10% FBS, lieàu löôïng söû duïng laø 6ml moâi tröôøng öùng vôùi 2 ngaøy thay. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 88 Nhö vaäy: ÔÛ moâi tröôøng AMNIOMAX: Lieàu löôïng 1ml AMNIOMAX öùng vôùi 1 ngaøy nuoâi ôû caùc tröôøng hôïp: nuoâi nguyeân phaùt, nuoâi töø dòch röûa, cuõng nhö nuoâi teá baøo rôøi taùch baèng trypsin, laø phuø hôïp. ÔÛ moâi tröôøng cô baûn: Lieàu löôïng 1ml DMEM, 1ml EMEM öùng vôùi 1 ngaøy nuoâi ôû caùc tröôøng hôïp nuoâi nguyeân phaùt, nuoâi töø dòch röûa, laø khoâng phuø hôïp, caàn thieát phaûi taêng lieàu löôïng leân töø 2 – 3 ml moâi tröôøng cô baûn treân moät ngaøy nuoâi, coù leõ seõ phuø hôïp ÔÛ moâi tröôøng cô baûn: Lieàu löôïng 1ml DMEM, 1ml EMEM öùng vôùi 1 ngaøy nuoâi ôû tröôøng hôïp nuoâi teá baøo rôøi taùch baèng trypsin laø töông ñoái phuø hôïp. Do ngay töø ñaàu ta ñaõ söû duïng ngay 5ml moâi tröông cô baûn neân trong khoaûng döôùi 7 ngaøy ñaàu sau khi caáy, ñaõ coù teá baøo moïc, nhöng trong nhöõng ngaøy keá tieáp sau ñoù teá baøo cheát daàn, coù leõ do khoâng ñuû dinh döôõng. 4. Lyù do löïa choïn phöông phaùp vaø keát luaän moâi tröôøng toái öu trong ba moâi tröôøng söû duïng . * Lyù do löïa choïn phöông phaùp nuoâi caáy nguyeân phaùt sau caùc laàn thí nghieäm toång quaùt: Do ôû phöông phaùp naøy coù öu ñieåm chuû yeáu laø duy trì ñöôïc laâu daøi caùc doøng teá baøo sô caáp ñeå quan saùt, so saùnh ; maëc duø noù coù khuyeát ñieåm laø moïc chaäm vaø chaäm moïc hôn töø 1 – 2 ngaøy so vôùi phöông phaùp taùch baèng trypsin vaø taùch töø dòch röûa. Teá baøo nuoâi baèng phöông phaùp nguyeân phaùt noù coù khaû naêng choáng chòu cao tröôùc söï bieán ñoäng cuûa moâi tröôøng nhö: coù theå moïc vaø phaùt trieån döôùi ñieàu kieän khoâng coù CO2 5% ,vaø uû ôû 36,5oC trong hôn moät tuaàn (9 ngaøy). Teá baøo nuoâi baèng phöông phaùp nguyeân phaùt vaãn moïc vaø phaùt trieån toát trong khi sai kyø haïn thay moâi tröôøng leân ñeán ba ngaøy. Song song ñoù, phöông phaùp taùch baèng trypsin, do töø ñaàu teá baøo ñaõ bò taùc ñoäng bôûi hoùa chaát neân chæ sau Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 89 ba ngaøy sai kyø haïn thay moâi tröôøng, deà lôùp ñôn teá baøo ñaõ bong choác vaø cheát haàu heát, chæ coøn laïi hai cuïm laùc ñaùc vaøi teá baøo. Löu yù, haàu heát khaû naêng chòu söï bieán ñoäng ñoù dieãn ra treân moâi tröôøng AMNIOMAXTM-C100 20% FBS. Nuoâi caáy teá baøo töø dòch röûa, khaû naêng chòu söï bieán ñoäng cuûa ñieàu kieän moâi tröôøng nuoâi caáy cuõng cao, nhöng bò taùc ñoäng (stress) laàn thöù hai, nhö laø, khoâng thay moâi tröôøng ñuùng kyø haïn thì haàu heát lôùp ñôn moïc lan bong ra, roài cheát, gioáng y nhö trong tröôøng hôïp taùch baèng trypsin. Vaø duø sau ñi nöõa, phöông phaùp nuoâi caáy töø dòch röûa cuõng chæ laø moät hình thöùc tieát kieäm, taän duïng nguoàn maãu trong ñieàu kieän hieám hoi maãu thí nghieäm. Vaø do ñoù khoâng ñöôïc löïa choïn vaø ñaùnh giaù laø phöông phaùp toái öu. Öu ñieåm duy nhaát cuûa phöông phaùp taùch baèng trypsin laø thu ñöôïc moät löôïng lôùn teá baøo rôøi , nhanh moïc (bieåu hieän söï moïc chæ sau 24 giôø) vaø toác ñoä moïc nhanh, ñoàng loaït, Caùc doøng teá baøo cuûa phoâi taùch baèng trypsin ngay töø ñaàu ñaõ theå hieän söï ña daïng veà hình thaùi cuûa teá baøo. Trong khi nuoâi nguyeân phaùt vaø nuoâi töø dòch röûa, söï ña daïng caùc doøng teá baøo chæ bieåu hieän: khi maät ñoä teá baøo moïc lan toûa trôû neân cao (töø 70% - 80%) ; vaø khi bò taùc ñoäng bôûi söï bieán ñoäng cuûa moâi tröôøng nhö: khoâng coøn choã troáng ñeå moïc lan toûa, hoaëc nguoàn dinh döôõng caïn kieän daàn ñeán möùc ñoä hieám hoi, vaø bò taùc ñoäng bôûi trypsin. Vì nhöõng lyù do neâu treân, trong ñieàu kieän nghieân cöùu mang tính chaát moâ taû thöû nghieäm: khaûo saùt, moâ taû, so saùnh teá baøo, neân phöông phaùp nuoâi caáy nguyeân phaùt ñöôïc löïa choïn ñeå khaûo nghieäm. Muïc ñích cuoái cuøng trong tieán trình thí nghieäm cuûa chuùng toâi goàm ba caáp ñoä: Caáp ñoä 1: Nuoâi cho baèng ñöôïc teá baøo moïc baùm, lan roäng vaø duy trì ñöôïc caùc doøng teá baøo ñoù phaùt trieån trong giôùi haïn tuoåi ñôøi theá heä cuûa chuùng. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 90 Caáp ñoä 2: Xaùc ñònh ñöôïc teá baøo muïc tieâu ñeå ghi nhaän hình aûnh; xaùc nhaän chính xaùc hình daïng, ñaëc ñieåm cuûa teá baøo muïc tieâu daïng nguyeân baøo sôïi trong chai caáy – ñoái töôïng caàn phaân laäp vaø ñeå ñi ñeán taïo doøng. Caáp ñoä 3: Phaân laäp vaø taïo doøng thuaàn nguyeân baøo sôïi. Vaø cuoái cuøng keát quaû cuûa chuùng toâi chæ döøng laïi ôû möùc giöõa chöøng cuûa caáp ñoä hai. Vì lyù do kinh phí vaø thôøi gian haïn heïp Beân caïnh nhöõng thaønh coâng laø nuoâi ñöôïc teá baøo moïc theo muïc tieâu cô baûn ñaõ ñeà ra, ñaõ giöõ ñöôïc teá baøo ñaït ñeán maät ñoä cao, 90% - 100% dieän tích beà maët chai nuoâi vaø ñaõ caáy chuyeàn ñöôïc; vaø roài moïc toát maø khoâng coù daáu hieäu bò nhieãm; song song ñoù cuõng coù nhöõng haïn cheá nhaát ñònh: + Chæ nhaän dieän ñöôïc teá baøo ôû möùc ñoä so saùnh hình aûnh caùc teá baøo muïc tieâu ghi nhaän ñöôïc vôùi teá baøo nguyeân baøo sôïi cuûa caùc taùc giaû nöôùc ngoaøi ghi nhaän baèng kính hieån vi ñieän töû queùt hay khính hieån vi quang hoïc, hoaëc nhaän dieän thoâng qua caùc khaùi nieäm, ñònh nghóa veà ñaëc ñieåm hình thaùi cuûa nguyeân baøo sôïi trong quaù trình quan saùt maø khoâng xaùc ñònh ñöôïc chaéc chaén 100% treân maãu nuoâi caáy ñaâu laø nguyeân baøo sôïi thoâng qua daáu aán teá baøo (boä Kít thöû marker beà maët). Coù nghóa laø keát quaû thí nghieäm chæ döøng laïi ôû möùc ñoä khaûo saùt, so saùnh, ñònh tính maø khoâng ñaït ñeán möùc ñoä ñònh löôïng. Do ñoù, maät ñoä teá baøo muïc tieâu xaùc ñònh ñöôïc treân moâi tröôøng nuoâi caáy chæ döøng laïi ôû möùc ñoä töông ñoái, nhöõng muïc tieâu ñöôïc xaùc ñònh ñoù laø teá baøo baùm ñaùy, taïo thaønh lôùp ñôn, vaø coù khaû naêng moïc ñôn leõ. + Do soá laàn caáy truyeàn chæ döøng laïi ôû möùc ñoä n = 1, cho neân chöa taïo ra ñöôïc doøng teá baøo thuaàn duy nhaát, maëc duø soá löôïng veà ñoä daïng cuûa teá baøo coù giaûm xuoáng hoaëc coù söï bieán ñoåi vaø coù xuaát hieän daïng teá baøo môùi. * Trong caùc ñôït nuoâi caáy, keát quaû thí nghieäm cho thaáy, moâi tröôøng AMNIOMAX cho pheùp caùc doøng teá baøo moïc raát toát, nhaát laø doøng teá baøo nguyeân Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 91 baøo sôïi. Do ngay töø ñaàu, veà baûn chaát cuûa moâi tröôøng, ñaây laø moâi tröôøng giaøu dinh döôõng, moâi tröôøng thöông maïi chuyeân cho nuoâi caáy nguyeân baøo sôïi töø nöôùc oái (15-16 tuaàn tuoåi) ñeå chaån ñoaùn beänh di truyeàn cuûa thay nhi tröôùc sinh [Phoøng di truyeàn, beänh vieän Töø Duõ], neân caùc teá baøo moïc treân moâi tröôøng naøy laø raát toát, ñaëc bieät ñoái vôùi nuoâi caáy sô caáp. Ñoù laø ñieàu hieån nhieân, khoâng coøn gì ñeå baøn caûi, Nhöng duy nhaát moät ñieåm haïn cheá cuûa noù laø ñaéc tieàn Muïc ñích so saùnh moâi tröôøng cuûa chuùng toâi laø khaûo saùt xem: moâi tröôøng cô baûn (nhö: DMEM, EMEM), noù coù cho caùc doøng teá baøo, cuõng nhö doøng nguyeân baøo sôïi phaùt trieån ñöôïc vaø phaùt trieån toát hay khoâng. Ñeå xem chuùng ta coù theå nuoâi nguyeân baøo sôïi moïc toát treân caùc moâi tröôøng cô baûn naøy nhö laø caùc taùc giaû khaùc treân theá giôùi ñaõ töøng nuoâi cho noù moïc toát hay khoâng. Vaø neáu nguyeân baøo sôïi coù theå moïc toát treân moâi tröôøng cô baûn thì caàn lieàu löôïng vaø kyø haïn thay moâi tröôøng laø bao nhieâu thì toái öu. Neáu chuùng ta coù theå nuoâi nguyeân baøo sôïi moïc toát treân hai moâi tröôøng cô baûn treân thì töø ñoù chuùng ta coù theå tieát kieäm ñöôïc chi phí nuoâi caáy, chi phí nghieân cöùu, vaø coù theå haï giaù thaønh saûn phaåm trong tröôøng hôïp keát quaû nghieân cöùu ñi tôùi öùng duïng saûn xuaát, taïo saûn phaåm thöông maïi. Nhöng ngay töø ñaàu, chuùng ta ñaõ xaùc ñònh khoâng ñuùng lieàu löôïng caàn thieát vaø kyø haïn thay moâi tröôøng phuø hôïp ñeå cho caùc teá baøo sô caáp coù theå moïc vaø duy trì söï phaùt trieån cuûa noù treân hai loaïi moâi tröôøng cô baûn ñoù. Vôùi 1ml EMEM hoaëc 1ml DMEM öùng vôùi moät ngaøy nuoâi roài môùi thay moâi tröôøng laø quaù ít, vaø laø khoâng ñuû dinh döôõng ñeå cho teá baøo phaùt trieån vaø taêng tröôûng. Baèng chöùng roõ raøng laø trong caùc laàn nuoâi , töø ñaàu teá baøo ñaõ moïc treân taát caû caùc loaïi moâi tröôøng, coù daáu hieäu taêng tröôûng, nhöng chæ sau töø 3 -7 ngaøy nuoâi thì daáu hieäu phaùt trieån chaám döùt vaø taøn luïi treân hai loaïi moâi tröôøng cô baûn. Ñieàu naøy theå hieän roõ raøng nhaát ôû phöông phaùp nuoâi nguyeân phaùt vaø nuoâi töø dòch röûa, vôùi caùch aùp duïng kieåu thay moâi tröôøng: ngaøy 1 thay 1 ml moâi tröôøng, ngaøy 2 thay 2 ml moâi tröôøng, … , ngaøy 5 thay 5 ml moâi tröôøng, vaø roài duy trì maõi caùch thay: cöù 5 ml moâi tröôøng thì 5 Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 92 ngaøy sau thay, cho ñeán khi keát thuùc maãu thí nghieäm. Chính vì leõ ñoù, maø duy chæ coù moâi tröôøng AMNIOMAX laø moâi tröôøng giaøu dinh döôõng cho pheùp caùc teá baøo moïc baùm , lan roäng, phaùt trieån tieáp sau 7 ngaøy nuoâi caáy (tính töø ngaøy caáy). 5.Caùc yeáu toá lieân quan aûnh höôûng ñeán keát quaû tieán trình thí nghieäm *./ Thieáu CO2 hôn moät tuaàn trong nuoâi caáy Trong thí nghieäm Ñôït I, laàn thöù nhaát, maëc duø maãu chai caáy thieáu CO2 5% vaø tieáp dieãn trong 9 ngaøy lieân tieáp maø chæ uû ôû nhieät ñoä 36,5oC nhöng teá baøo vaãn moïc baùm vaø phaùt trieån toát; ñaëc bieät laø ôû chai nuoâi nguyeân phaùt vaø dòch röûa. Lyù do giaûi thích cho ñieàu naøy laø: nuoâi moâ töø phöông phaùp nguyeân phaùt vaø töø dòch röûa, teá baøo ngay töø ñaàu khoâng bò taùc ñoäng bôõi hoùa chaát, khaû naêng caûm öùng chuyeån daïng, khaû naêng ñaùp öùng vôùi söï bieán ñoäng moâi tröôøng vaãn coøn nguyeân veïn treân maøng teá baøo. Hôn nöõa, nguyeân baøo sôïi laø loaïi teá baøo moïc baùm raát toát so vôùi caùc loaïi teá baøo khaùc, trong cô theå , teá baøo nguyeân baøo sôïi ñoùng vai troø chuû yeáu trong quaù trình söû a chöûa vaø laøm laønh hoùa veát thöông. [12],[13],[30] *./ AÛnh höôûng cuûa hoùa chaát. Tieán haønh khöû truøng tuû nuoâi thì caàn phaûi ñeå caùch ly, ñeå thoùang tuû nuoâi trong khoaûng thôøi gian daøi (ít nhaát moät tuaàn) roài môùi söû duïng tuû nuoâi uû maãu caáy . Neáu khoâng seõ aûnh höôûng ñeán söï phaùt trieån cuûa teá baøo uû trong tuû . *./ AÛnh höôûng cuûa nguoàn maãu khoâng oån ñònh. Coù laàn caáy maø khoâng thu ñöôïc phoâi töø nguoàn maãu ñem veà. Nhö ôû Ñôït III laàn 1. 6. Nhöõng thuaän lôïi trong tieán trình thí nghieäm. Do maãu laáy töø nguoàn phoâi thai ngoaøi thoâng qua moå ñöôøng buïng trong ñieàu kieän phoøng voâ truøng neân ñaõ haïn cheá gaàn 100% nguy cô nhieãm maãu caáy töø nguoàn maãu laáy ôû beänh vieän phuï saûn Töø Duõ. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 93 Do aùp duïng qui trình voâ truøng cuûa Ngaân Haøng Moâ thuoäc Boä moân Moâ Phoâi - Trung taâm Ñaøo taïo Caùn Boä Y Teá Thaønh phoá Hoà Chí Minh neân nguy cô nhieãm töø quaù trình thao taùc ñaõ haïn cheá vaø kieåm soaùt ñöôïc. Nhôø vaøo hai lyù do treân maø quaù trình thí nghieäm cuûa chuùng toâi taïi Boä moân Moâ Phoâi - Trung taâm Ñaøo taïo Caùn Boä Y Teá Thaønh phoá Hoà Chí Minh ñaõ kieåm soaùt ñöôïc söï nhieãm trong suoát quaù trình nuoâi caáy. 7. So saùnh hình daïng caùc loaïi teá baøo daïng nguyeân baøo sôïi. A./ So saùnh ñaëc ñieåm hình thaùi cuûa teá baøo nuoâi caáy ñöôïc töø moâ phoâi ngöôøi vôùi teá baøo nuoâi caáy ñöôïc töø moâ phoâi chuoät vaø vôùi teá baøo nuoâi caáy ñöôïc töø gai nhau. Hình 36: AÛnh teá baøo töø phoâi chuoät. Nguyeãn Leâ Xuaân Tröôøng (0018200) Hình 37: AÛnh teá baøo töø phoâi ngöôøi, Ñôït II laàn 2 Hình 38: AÛnh teá baøo gai nhau ngöôøi Huyønh Duy Thaûo (0018168) Hình 39 : AÛnh teá baøo töø phoâi ngöôøi, Ñôït II laàn 2 Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 94 B./ So saùnh ñaëc ñieåm hình thaùi cuûa teá baøo trung moâ nuoâi caáy ñöôïc vôùi caùc loïai teá baøo khaùc vaø vôùi teá baøo trung moâ chuïp döôùi kính hieån vi ñieän töû queùt. Hình 42: Teá baøo muïc tieâu vaø teá baøo daïng ñaëc bieät Hình 43: Teá baøo muïc tieâu vaø teá baøo daïng ñaëc bieät Hình 41: AÛnh doøng teá baøo trung moâ[39] Hình 40: AÛnh teá baøo trung moâ [34] Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 95 Hình 46: AÛnh caùc daïng teá baøo ñaëc bieät. Hình 45: AÛnh caùc daïng teá baøo ñaëc bieät. Hình 44: AÛnh phaùt hoïa teá baøo trung moâ töø caên bì[21] Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 96 Hình 48: AÛnh caùc daïng teá baøo ñaëc bieät. Hình 47: AÛnh caùc daïng teá baøo ñaëc bieät. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 97 C./ So saùnh ñaëc ñieåm hình thaùi cuûa nguyeân baøo sôïi nuoâi caáy ñöôïc vôùi caùc loïai teá baøo khaùc vaø vôùi nguyeân baøo sôïi chuïp döôùi kính hieån vi ñieän töû queùt. Hình 49: AÛnh nguyeân baøo sôïi Döôùi kính hieån vi ñieän töû queùt [10] Hình 50: AÛnh nguyeân baøo sôïi. Hình 52: AÛnh nguyeân baøo sôïi. Hình 51 : AÛnh nguyeân baøo sôïi Söû duïng thu nhaän teá baøo maàm.[38] Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 98 Û Hình 54: AÛnh nguyeân baøo sôïi phaùc hoïa vaø ghi nhaän[9] Hình 53: Teá baøo sôïi ghi nhaän vaø phaùc hoïa[9] Hình 55: AÛnh nguyeân baøo sôïi döôùi kính hieån vi ñieän töû.[10] Hình 56:Teá baøo daïng nguyeân baøo sôïi sau caáy chuyeàn. Hình 57:Teá baøo daïng nguyeân baøo sôïi tröôùc caáy chuyeàn. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 99 CHÖÔNG IV: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ I./. KEÁT LUAÄN: Nhö vaäy, trong keát quaû nghieân cöùu naøy, ñaõ xaùc ñònh ñöôïc moät soá vaán ñeà cuï theå nhö sau: Tai voøi chöùa ñöïng thai ngoaøi töû cung, do quaù trình moå noäi soi vaø khi thai quaù non thaùng ( döôùi 5 tuaàn tuoåi) thì maãu moâ raát khoù xaùc ñònh treân ñaïi theå. Coù laàn chuùng toâi ñaõ caáy maø khoâng phaûi laø moâ muïc tieâu (caáy khoâng ñuùng ñoái töôïng nghieân cöùu neân coù theå khoâng coù teá baøo moïc). Ñieàu ñoù döôïc xaùc ñònh sau khi ñem moät phaàn maãu moâ aáy ñi caét laùt khaûo saùt vi theå. (nhö ôû Ñôït III laàn 1). Trong ba phöông phaùp thì phöông phaùp nuoâi nguyeân phaùt maãu moâ phoâi thai sau khi taùch baèng cô hoïc, ñeå taïo nhöõng maûnh moâ 1-3 mm3 , cho keát quaû nuoâi toát nhaát so vôùi hai phöông phaùp coøn laïi. Thôøi gian teá baøo soáng vaø phaùt trieån trong tröôøng hôïp nuoâi nguyeân phaùt thì laâu hôn so vôùi hai phöông phaùp nuoâi coøn laïi. Trong caùc loaïi moâi tröôøng nuoâi: AMNIOMAX, DMEM, EMEM thì moâi tröôøng AMNIOMAX cho keát quaû nuoâi toát nhaát trong tröôøng hôïp nuoâi sô caáp so vôùi hai moâi tröôøng coøn laïi. Coøn trong tröôøng hôïp nuoâi caáy thöù caáp thì moâi tröôøng EMEM cho keát quaû nuoâi cuõng khoâng keùm AMNOMAX. Trong quaù trình caáy chuyeàn, hai moâi tröôøng cô baûn: DMEM, EMEM ñeàu coù pha theâm moät ít AMNIOMAX vôùi tæ leä 1:4. AMNIOMAX coù chöùa huyeát thanh ñöôïc söû duïng ñeå öùc cheá trypsin sau khi teá baøo bò taùc ñoäng trong luùc caáy chuyeàn. Keát quaû teá baøo sau caáy chuyeàn moïc treân moâi tröôøng EMEM toát hôn moâi tröôøng DMEM ( caû hai coù pha theâm moät ít AMNIOMAX, chæ pha theâm trong laàn caáp lieäu moâi tröôøng laàn ñaàu tieân), vaø ñoàng thôøi teá baøo moïc toát hôn caû tröôøng hôïp teá baøo nuoâi treân moâi tröôøng AMNIOMAX. Thử nghiệm và phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến Trang 100 Cho ñeán luùc keát thuùc thí nghieäm, teá baøo sau caáy chuyeàn vaãn phaùt trieån toát (chæ tröø tröôøng hôïp nuoâi treân moâi tröôøng DMEM). II. ./ ÑEÀ NGHÒ: Do bò giôùi haïn veà thôøi gian neân keát quaû chuùng toâi ñaït ñöôïc khaù khieâm toán, ñeå ñaït ñöôïc keát quaû cao hôn vaø ñeå coù theå ñi saâu vaøo höôùng öùng duïng keát quaû nuoâi caáy vaøo thöïc tieãn, chuùng toâi coù moät soá yù kieán ñeå kieán nghò: Chuaån hoùa qui trình nuoâi caáy, xaùc ñònh theâm nöõa caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình nuoâi caáy. kieåm nghieäm laïi lieàu löôïng moâi tröøông cô baûn ñaõ ñöôïc ñeà caäp ñeán ôû phaàn thaûo luaän. Thöû nghieäm nuoâi caáy ñeå xaùc ñònh laïi lieàu löôïng vaø kyø haïn thay moâi tröôøng toái öu cho tröôøng hôïp nuoâi sô caáp vaø thöù caáp treân hai loaïi moâi tröôøng cô baûn:EMEM, DMEM. Thöû nghieäm nuoâi Nguyeân baøo sôïi töø caùc nguoàn khaùc nhau ñeå kieåm nghieäm laïi khaû naêng vaø phöông phaùp haïn cheá söï nhieãm. Thöû nghieäm phaân laäp vaø taïo doøng baèng phöông phaùp caáy chuyeàn lieân tuïc vaø ñoàng thôøi so saùnh vôùi vieäc phaân laäp vaø taïo doøng treân moâi tröôøng thaïch, thöïc hieän caáy truyeàn vaø thu nhaän nguyeân baøo sôïi baèng voøng rings. Ñeå töø ñoù, xaùc ñònh möùc ñoä aûnh höôûng cuûa hoùa chaát leân caùc teá baøo nuoâi caáy sô caáp vaø caùc teá baøo sau khi caáy chuyeàn. Kieåm nghieäm laïi tính öu vieät cuûa söï pha troän moâi tröôøng nuoâi caáy: AMNIOMAX + EMEM (tæ leä 1:4) , vaø söï pha troän giöõa FBS vaø AHS taùc ñoäng, aûnh höôûng ñoái vôùi toác ñoä taêng tröôûng cuûa teá baøo trong quaù trình nuoâi caáy sô caáp vaø thöù caáp . Söû duïng daáu aán teá baøo ñeå xaùc ñònh nguyeân baøo sôïi baèng marker beà maët, hoùa huyønh quang mieãn dòch.