Tìm hiểu sự biến đổi của vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (penaeus monodon) tại Cà Mau

m với dòng WSSV ở Thái Lan (WSSV – TH), Đài Loan (WSSV – TW) và Trung Quốc (WSSV – CN). Sử dụng các cặp mồi được thiết kế dựa trên đoạn gen của WSSV thuộc ORF14/15, ORF24/25, ORF75, ORF94, ORF125. Kết quả chứng minh các dòng WSSV ở việt Nam có cùng nguồn gốc với WSSV – TW (Đài Loan) và WSSV – TH (Thái Lan) khi sử dụng 2 cặp mồi ORF23/24 và ORF14/15, và kết quả này cho thấy ORF75 và ORF125 có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên cứu dịch tể học của bệnh đốm trắng sau này ở Việt Nam. Tran Thi Tuyet Hoa et al., (2005) sử dụng phương pháp PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 trên các mẫu tôm nuôi và tôm giống ở Việt Nam. Kết quả nghiên cứu đã xác định được số vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV trên tôm giống từ 4 đến 8 và trên tôm nuôi là 4 đến 9 trong đó kiểu gen của WSSV có 7 vùng lặp lại chiếm tỷ lệ cao nhất. Lê Vân Hải Yến, (2006) sử dụng phương pháp PCR- genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 để xác định số vùng lặp lại của virus gây bệnh đốm trắng trên 130 mẫu tôm sú thu tại Sóc Trăng, Trà Vinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy WSSV có 5, 7, 8, 9, 12 vùng lặp lại thuộc ORF94 trong đó kiểu gen có 8 vùng lặp lại chiếm tỷ lệ cao nhất trên 50%. Triệu Thanh Tuấn, (2006) cũng sử dụng phương pháp PCR-genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 để xác định số vùng lặp lại của virus gây bệnh đốm trắng trên 169 mẫu tôm sú có dấu hiệu đốm trắng thu ở Cà Mau, Bạc Liêu. Kết quả nghiên cứu đã nghi nhận được vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV có từ 4 đến 16 vùng lặp lại, trong đó kiểu gen có 5 vùng lặp lại chiếm tỷ lệ cao nhất (48,8% ở Bạc liêu, 68,4% ở Cà Mau). Pradeep et al., (2007), đã sử dụng ADN ly trích từ tôm hậu ấu trùng, tôm nuôi có nhiễm WSSV, đồng thời sử dụng cả tôm tự nhiên và cua của Ấn Độ. Nghiên cứu tìm hiểu sự thay đổi trên các vùng lặp lại của WSSV đã tìm ra trước 12 đây, bao gồm ORF94, ORF125 và ORF75. Đối với ORF94, có 13 kiểu gen được tìm thấy với số lần lặp lại từ 2 đến 16. Trong đó lặp lại 7 lần chiếm 11,3%, không có mẫu nào có số lần lặp lại 11 lần hoặc 15 lần được tìm thấy. Đối với ORF125, có 11 kiểu gen khác nhau được tìm thấy với số lần lặp lại từ 2 đến 14. Số lần lặp lại được tìm thấy nhiều nhất là 7 lần chiếm 47,1%, không tìm thấy mẫu nào có số lần lặp lại 6 lần hoặc 13 lần. Đối với ORF75 tìm thấy 6 kiểu gen khác nhau của vùng lặp lại. Trong đó các mẫu có cùng số lần lặp lại trên một ORF thì có số lần lặp lại không giống nhau trên một hoặc cả hai ORF khác. Từ những kết quả trên cho thấy cả 3 ORF có thể sử dụng để phân tích sự khác nhau và các dòng đặc trưng của WSSV. Về dịch tể học, ORF94 có vai trò lớn nhất, sau đó đến ORF125 và ORF75. Để xác định sự ảnh hưởng của bệnh đốm trắng, và tác hại của WSSV đối với tôm nuôi thì độc lực của WSSV là điều cần quan tâm. Marks et al., (2005) đã sử dụng kỹ thuật PCR dựa trên các mồi ORF 14/15 và ORF 23/24 để tiến hành phân lập định danh các dòng WSSV ở Thái Lan. Kết quả cho thấy dòng WSSV được phân lập vào năm 2005 (WSSV – TH) giống với dòng WSSV được phân lập từ năm 1996 (TH – 96 – II). Đồng thời, khi tiến hành gây cảm nhiễm trên tôm sú để so sánh độc lực của hai dòng virút này, cho thấy rằng đối với dòng TH – 96 – II gây chết 50% khoảng 14 ngày còn đối với dòng WSSV – TH chỉ mất 3,5 ngày. Và nghiên cứu đã khẳng định rằng độc lực của dòng WSSV – TH cao hơn độc lực của dòng WSSV TH – 96 – II thông qua thí nghiệm LD50. Khi xác định được tác nhân gây bệnh, phương thức lây truyền, và những ảnh hưởng của WSSV thì có nhiều nghiên cứu nhằm khống chế sự phát triển và khả năng gây hại của WSSV như: Witteveldt et al., (2003) đã sử dụng vacxin chứa vỏ của WSSV để phòng WSSV. Thí nghiệm đã chỉ ra rằng những tôm sống sót sau khi bị nhiễm WSSV sẽ có tỉ lệ sống cao hơn khi tái cảm nhiễm. Chúng tôi nghiên cứu khả năng của vacxin cho tôm thông phương pháp cho ăn, vacxin này chứa protein vỏ của WSSV. Tôm sú (Penaeus monodon) được cho ăn thức ăn viên áo 13 bên ngòai 1 lớp vi khuẩn không họat động biểu hiện 2 lọai protein vỏ của WSSV là VP19 và VP28. Vacxin chứa VP28 cho thấy tỉ lệ chết của tôm thấp hơn có ý nghĩa khi so sánh với lô đối chứng (vi khuẩn chỉ chứa vector rổng) thông qua phương pháp ngâm (tỉ lệ sống 61%), trong khi đó vacxin chứa VP19 không thể hiện sự bảo vệ nào. Để xác định sự tấn công và thời gian bảo vệ của vacxin, thí nghiệm cảm nhiễm được thực hiện sau khi sử dụng vacxin 3, 7 và 21 ngày. Tỉ lệ sống cao hơn có ý nghĩa được quan sát sau khi tôm sử dụng vacxin 3, 7 ngày (64% và 77%), nhưng sự bảo vệ đã giảm sau 21 ngày (tỉ lệ sống 29%). Trái với những hiểu biết hiện tại, động vật không xương sống không có hệ thống đáp ứng miễn dịch nhưng kết quả này cho thấy đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và khả năng bảo vệ có thể tạo ra ở P. monodon. Các thí nghiệm trên mở ra con đường mới phòng WSSV mang lợi ích cho công nghiệp nuôi tôm. Hứa Quyết Chiến, (2004) đã nghiên cứu và sử dụng thành công việc sử dụng chế phẩm SH'99 trong việc phòng bệnh virut đốm trắng trên tôm sú. Khi cho tôm ăn liên tiếp chế phẩm SH'99 ngay sau khi thả có thể giúp tôm phòng bệnh đốm trắng. Sarathi et al., (2007) đã sử dụng vi khuẩn có chứa VP28dsRNA vào trong thức ăn viên cho tôm ăn để làm giảm khả năng gây hại của WSSV. Có hai phương pháp được thử nghiệm. Phương pháp thứ nhất là trộn vi khuẩn có chứa VP28dsRNA vào trong thức ăn viên cho tôm ăn. Phương pháp hai trộn phức hợp mảnh nhỏ VP28dsRNA-chitosan vào trong thức ăn viên cho tôm ăn. Tôm khoẻ được gây cảm nhiễm bệnh đốm trắng bằng cách cho ăn tôm bị bệnh đốm trắng. Thí nghiệm được thực hiện trong 30 ngày. Kết quả cho thấy ở những lô tôm nhiễm WSSV có cho ăn dsRNA thì tỉ lệ sống cao hơn tôm ở lô đối chứng (vi khuẩn chứa véc tơ LITMUS38i không mang đoạn gen VP28). Tỉ lệ sống của tôm ở nghiệm thức sử dụnh vi khuẩn bất hoạt có chứa WSSV VP28dsRNA là 68%. Trong khi chỉ có 37% tôm sống sót ở nghiệm thức sử dụng phức hợp mảnh nhỏ VP28dsRNA-chitosan và 100% tôm chết được ghi nhận ở nghiệm thức đối chứng. Tôm còn sống cho kết quả xét nghiệm cho âm tính với WSSV bằng phương pháp PCR và Westnern Blot. Dựa trên kết quả đạt 14 được và những lợi thế của dsRNA cho thấy có thể ngăn chặn sự nhiễm WSSV ở tôm sú bằng cách cho tôm ăn vi khuẩn bất hoạt có chứa VP28dsRNA. 2.6 Kỹ thuật PCR và các ứng dụng Kỹ thuật nhân DNA đặc hiệu PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis phát minh 1985 đã mở ra cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Kỹ thuật này là kỹ thuật hoàn toàn mới trong nghiên cứu và phân tích gen, PCR cho phép tạo ra một số lượng lớn đoạn DNA cần lựa chọn mà không cần tách và nhân dòng ( 2.6.1 Quy trình Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1: Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút Bước 2: Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C (45-60°C). Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian: 1-2 phút. Bước 3: DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA- polymerase. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. ( 15 2.6.2 Những ứng dụng của PCR Kỹ thuật PCR được áp dụng cho nhiều lĩnh vực khác nhau. Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2004), kỹ thuật PCR được ứng dụng vào các lĩnh vực sau Trong thủy sản: (i) Phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn giúp cho quá trình chọn lọc cá thể thủy sản có chất lượng tốt trong chọn giống và ương nuôi; (ii) Chẩn đoán bệnh: điều tra nguyên nhân bùng nổ bệnh và cách giải quyết khi dịch bệnh xảy ra, đồng thời đề ra hướng ngăn chặn sự xuất hiện của dịch bệnh; (iii) Phòng bệnh và kiểm soát bệnh: kiểm tra tôm giống và tôm bố mẹ ở các trại giống, kiểm tra tôm nhập khẩu trước khi cho thả nuôi ở các địa phương. Trong các lĩnh vực khác: (i) Nghiên cứu khoa học: xác định trình tự đoạn ADN cần nghiên cứu, phát hiện đột biến, nghiên cứu quá trình tiến hóa phân tử, phục hồi gen tồn tại hàng triệu năm; (ii) Chọn giống vật nuôi và cây trồng từ đó lựa chọn được những cá thể bố mẹ thuần chủng, sạch bệnh trong thời gian ngắn; (iii) Y học và khoa học hình sự: áp dụng để chẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi rút, vi khuẩn, nấm, chẩn đoán sớm ung thư và các bệnh do di truyền, xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm. 2.6.3 Hạn chế Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) phương pháp PCR có những hạn chế sau. Phương pháp PCR thừơng không hoạt động với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải qua thực nghiệm. Sự ngoại nhiễm là vấn đề cực kỳ quan trọng, nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Sự sai sót do Taq polymerase, cứ 10.000 nucleic thì enzyme gắn sai 1 nucleic. 16 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 01 đến tháng 07 năm 2008. Các mẫu tôm có dấu hiệu đốm trắng đã được thu từ các huyện Đầm Dơi (2 ao), Phú Tân (1 ao), Thới Bình (2 ao), Trần Văn Thời (3 ao), và Thành Phố Cà Mau (14 ao), tỉnh Cà Mau. Quá trình phân tích mẫu được thực hiện tại phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn sinh học và bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại Học Cần Thơ. Bảng đồ hành chính tỉnh Cà Mau 17 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Mẫu vật Tổng số 24 ao tôm sú (20 con/ ao) có dấu hiệu đốm trắng hoặc đỏ thân đã được thu. Ghi nhận đầy đủ các thông tin như (tên chủ hộ, địa chỉ, ngày thu mẫu, mô hình, ngày thả giống, nguồn giống, dấu hiệu bệnh lý, tỷ lệ chết, thức ăn, cách thay nước, cải tạo ao nuôi…) vào phiếu thu mẫu. Mẫu được trữ trong nitơ lỏng hay trữ lạnh (vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm) và được trữ trong tủ âm 800C. 3.2.2 Dụng cụ 3.2.2.1 Dụng cụ thu mẫu Thùng trữ mẫu, bọc nilon, dây thun, viết chì, giấy bóng mờ. 3.2.2.2 Dụng cụ phân tích PCR Máy vortex, tủ âm 800C, lò vi sóng, máy luân nhiệt, máy ủ, máy li tâm, bộ điện di, máy chụp hình gel. Pipet tự động, hộp đựng đầu col, đầu col, ống eppendorf, giá đựng ống eppendorf, ống đong 100 ml, chai nút mài 250 ml, cốc 250 ml. 3.2.3 Hóa chất 3.2.3.1 Phân tích PCR Kit IQ 2000-WSSV, TE buffer, Ethanol, Ethidium Bromide, dung dịch diện di TAE 0.5X, Agarose, dNTPs, MgCl2, dung dịch đệm, mồi, Taq ADN polymerase, Primer 3.4 Phương pháp Nested-PCR (Theo tài liệu hướng dẫn sử dụng của bộ kit IQ- 2000 WSSV của công ty Farming Intelligene Technology Coperation, Đài Loan) gồm các bước: ly trích DNA, khuyếch đại DNA, điện di, đọc kết quả. 18 3.4.1 Qui trình ly trích DNA ADN được ly trích từ mang tôm sú với bộ chiết tách DTAB – CTAB. Mang tôm được cho vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 600 µl DTAB. Sử dụng que nghiền tiệt trùng để nghiền mẫu mang tôm. Ủ mẫu sau khi nghiền ở 750C khoảng 10 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng. Trộn đều bằng máy vortex, ly tâm nhẹ. Sau đó thêm 700 µl Chloroform, lắc đều 20 giây và ly tâm 12.000 vòng trong 5 phút. Cẩn thật chuyển phần nước trong ở bên trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới, thêm vào 100 µl CTAB và 900 µl nước cất, lắc đều, ủ 750C khoảng 10 phút. Để nguội ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm 12.000 vòng trong 10 phút. Bỏ phần nước trên, thêm 150 µl Dissolve Solution, ủ ở 750C khoảng 10 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Ly tâm 12.000 vòng trong 5 phút. Chuyển phần dịch trong sang ống eppendorf 1,5 ml mới có chứa 300 µl ethanol 95%. Sau đó lắc đều, ly tâm 12.000 vòng trong 5 phút. Rửa ADN bằng 200 µl ethanol 70%, làm khô ADN trước khi hoà tan trong 120 µl TE buffer. Trữ mẫu ADN ly trích ở -200C cho đến khi phân tích. 3.4.2 Qui trình khuếch đại Thành phần hóa chất Phản ứng PCR bước 1: 8 µl/phản ứng First PCR PreMix 7,5 µl Iqzyme ADN polymerase 0,5 µl Phản ứng PCR bước 2: 15 µl/phản ứng Nested PCR PreMix 14 µl Iqzyme ADN polymerase 1 µl Điều kiện phản ứng Phản ứng PCR được thực hiện 2 bước: PCR bước 1: Nhiệt độ 940C trong 30 giây, nhiệt độ 620C trong 30 giây, nhiệt độ 720C trong 30 giây, lặp lại chu kỳ này 5 lần. Tiếp theo, nhiệt độ 940C trong 15 19 giây, nhiệt độ 620C trong 15 giây, nhiệt độ 720C trong 20 giây, lặp lại chu kỳ này 15 lần. Cuối cùng, nhiệt độ 720C trong 30 giây, nhiệt độ 200C trong 30 giây. PCR bước 2: Nhiệt độ 940C trong 20 giây, nhiệt độ 620C trong 20 giây, nhiệt độ 720C trong 30 giây, lặp lại chu kỳ này 25 lần. Tiếp theo, nhiệt độ 720C trong 30 giây. Cuối cùng, nhiệt độ 200C trong 30 giây. 3.4.3 Cách chuẩn bị phản ứng Việc chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng Nested-PCR bước 1 và bước 2 được thực hiện dựa theo số lượng mẫu cần phân tích. Mỗi lần chuẩn bị mẫu cần có 1 đối chứng dương và 1 đối chứng âm (nước cất)
Bước 1 Cho 8 µl hỗn hợp thứ nhất cho vào ống eppendorf 0,2 ml đã được làm dấu, thêm 2 µl ADN chiết tách hoặc đối chứng. Thực hiện qui trình khuếch đại PCR bước 1.
Bước 2 Sau khi qui trình khuếch đại thứ nhất kết thúc thêm 15 µl hỗn hợp thứ hai vào mỗi ống eppendorf chứa sản phẩm của bước 1. Thực hiện qui trình khuếch đại PCR bước2. 3.4.4 Chạy điện di Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0.5X và bản thạch (gel) chứa 1.5% agarose. Chuẩn bị gel: Cân 1.5g agarose vào chai 250 ml thêm vào 100 ml TAE 0.5X, lắc đều và đun nóng dung dịch bằng lò vi sóng cho tới khi agarose tan hoàn toàn, để dung dịch nguội khoảng 50 - 60oC cho 4µl Ethidium Bromide lắc đều và đổ gel vào khay đã được gắn lược và dán băng keo ở hai đầu. Khi gel đặc lại, cẩn thận gỡ lược và keo dán ra khỏi khay đựng gel. Điện di: Cho gel vào bồn điện di, thêm dung dịch TAE 0.5X vào cho vừa bao phủ gel. Dùng pipet hút 10µl mẫu phân tích, đối chứng dương, đối chứng âm trộn với một giọt 6X loading Dye cho vào từng giếng, đồng thời ta cho thang DNA để 20 kiểm tra kích thước sản phẩm. Sử dụng dòng diện một chiều 90V để điện di. Thời gian điện di khoảng 45 đến 60 phút. Đọc và ghi nhận kết quả với thiết bị chụp ảnh gel (Vilber Loumart). 3.4.5 Đọc kết quả Mẫu hiện lên vạch tương ứng 550 bp và 296 bp thì mẫu dương tính với WSSV. Mẫu chỉ hiện vạch tương ứng 848 bp thì mẫu âm tính với WSSV, đó là DNA của tôm. 3.5 PCR-genotyping 3.5.1 PCR-genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94. (Wongteerasupaya et al., 2003 được tối ưu hoá bởi Trần thị Mỹ Duyên, 2006). 3.5.1.1 Điều kiện phản ứng Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR-genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 được thực hiện qua các bước. Trước tiên làm nóng ở 85oC trong 15 giây. Ở 94oC trong 20 giây, ở 60oC trong 20 giây, ở 72oC trong 1 phút, lặp lại 40 chu kỳ. Ở 72oC trong 10 phút và bước tổng hợp cuối cùng 20oC trong 1 phút. 3.5.1.2 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng PCR-genotyping (ORF94) Tổng thể tích cho phản ứng là 50 µl với các thành phần hoá chất có nồng độ được liệt kê ở bảng 3.1 Bảng 3.1: thành phần và nồng độ hoá chất thực hiện phản ứng PCR-genotyping (ORF94) Hóa chất Nồng độ phản ứng PCR Buffer 1 X MgCl2 1,5 mM dNTP mix 200 µM ORF94-F 25 pmol ORF94-R 25 pmol Taq polymerase 2,5 U AND 1 µl 21 Trình tự cặp mồi ORF94 Tên mồi Trình tự mồi ORF94-F 5'-TCT-ACT-CGA-GGA-GGT-GAC-GAC-3' ORF94-R 5'-AGC-AGG-TGT-GTA-CAC-ATT-TCA-TG-3 3.5.1.3 Đọc kết quả Kết quả điện di được ghi nhận bằng thiết bị chụp ảnh gel (Vilber Loumart). Căn cứ vào thang ADN (1 kb plus ladder) để xác định số lần lặp lại của mẫu phân tích. Công thức tính số lần lặp lại của trình tự 54 bp: X = x + (54* n) Trong đó: X là chiều dài sản phẩm x là số nuceotide từ vị trí gắn mồi đến vùng lặp lại n là số lần lặp lại của trình tự 54 bp 3.5.2 PCR-genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 (ứng dụng qui trình được thực hiện trong đề tài của Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008) 3.5.2.1 Điều kiện phản ứng Đầu tiên ở giai đoạn làm nóng, nhiệt độ 940C trong 3phút, tiếp theo nhiệt độ 940C trong 30 giây, nhiệt độ 520C trong 30 giây, nhiệt độ 720C trong 1 phút, lặp lại chu kỳ này 35 lần. Cuối cùng, 720C trong 7 phút. 3.5.2.2 Thành phần hoá chất tham gia phản ứng PCR-genotyping (ORF125) Tổng thể tích cho phản ứng là 25 µl với các thành phần hoá chất có nồng độ được liệt kê ở bảng 3.2. Bảng 3.2: thành phần và nồng độ hoá chất thực hiện phản ứng PCR-genotyping (ORF125) Hóa chất Nồng độ phản ứng Buffer 1 X MgCl2 2 mM dNTP 200 µM ORF125-flank Forward 20 pmol ORF125-flank Reverse 20 pmol Taq DNA polymerase 2 U 22 DNA ly trích 1 µl Trình tự cặp mồi ORF125 Mồi được sử dụng là ORF125-flank Forward, mồi ORF 125-flank Reverse được thiết kế để khuếch đại đoạn gen có trình tự lặp lại 69bp. Tên mồi Trình tự mồi ORF125- flank Forward 5’ – CGA AAT CTT GAT ATG TTG TGC – 3’ ORF125- flank Reverse 5’ – CCA TAT CCA TTG CCC TTC TC – 3’ 3.5.2.3 Đọc kết quả Kết quả điện di được ghi nhận bằng thiết bị chụp ảnh gel (Vilber Loumart). Căn cứ vào thang ADN (1 kb plus ladder) để xác định số lần lặp lại của mẫu phân tích. Công thức tính số lần lặp lại của trình tự 69 bp: X = x + (69* n) Trong đó: X là chiều dài sản phẩm x là số nuceotide từ vị trí gắn mồi đến vùng lặp lại n là số lần lặp lại của trình tự 69 bp 23 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả xác định sự hiện diện của WSSV trong các mẫu tôm Qua các đợt thu mẫu đề tài đã thu được 24 ao (20 con/ ao), có dấu hiệu đốm trắng và đỏ thân. Mẫu tôm được thu chủ yếu thuộc các huyện Đầm Dơi (2 ao), Trần Văn Thời (3 ao), Thới Bình (2 ao), Phú Tân (1 ao) và thành phố Cà Mau (14 ao) tỉnh Cà Mau được thu từ tháng 02 đến 05 năm 2008. Vì các khu vực này trong năm tôm bị bệnh chết trên diện rộng và giao thông đi lại thuận tiện cho nên việc thu mẫu được tiến hành thuận lợi. Trong 24 ao thu được thì có 2 ao nuôi theo hình thức thâm canh, 4 ao nuôi quảng canh cải tiến năng suất cao, các ao còn lại 18 ao được nuôi trong mô hình quảng canh cải tiến. Như vậy các mẫu tôm thu được chủ yếu từ các ao nuôi trong mô hình quảng canh cải tiến, các ao nuôi có diện tích khá lớn (hơn 1 ha), nguồn nước được lấy trực tiếp từ các con kênh vào ao mà không qua xử lý, con giống thả nuôi không được qua xét nghiệm, mật độ nuôi 1-2 con/ m2, và được thả nối đuôi, các yếu tố trên cũng có thể dẩn đến bệnh bùng phát trong các ao nuôi. Theo Trần Ngọc Hải, (2004) thì trong mô hình quảng canh cải tiến có rủi ro cao do bệnh nhưng việc quản lý ao nuôi rất ít được quan tâm. Các ao được thu chủ yếu ở sâu trong nội địa nên dòng chảy của nước yếu việc tháo nước để cải tạo ao rất khó khăn. Khi tôm nuôi bị bệnh thì người nuôi bơm nước ra kênh để thu hoạch tôm, do dòng chảy của nước yếu nên mầm bệnh không được cuốn trôi đi mà nó vẫn còn tồn tại xung quanh và các khu vực lân cận khi các ao khác lấy nước vào thì bệnh bùng phát nhất là ở Thới Bình, và Tắc Vân. Theo Lighner., (1996) thì virus gây bệnh đốm trắng chủ yếu lây truyền theo chiều ngang. 24 Ngoài ra do các ao được thu từ tháng 02 đến 05 đây là mùa nắng sự biến đổi nhiệt độ giữa ngày và đêm rất lớn khoảng 10oC tôm nuôi bị sốc, tôm nuôi sẽ yếu dần và dẩn đến bệnh. Theo Bùi Quang Tề, (2003) cho rằng sự thay đổi đột ngột của nhiệt độ có thể dẫn đến tôm bị sốc và chết. Nếu nhiệt độ chênh lệch giữa ngày và đêm có thể làm cho tôm bị sốc và chết tốt nhất không để nhiệt độ dao động quá 3oC. Bùi Quang Tề đã đưa ra ví dụ cụ thể về sự chêch lệch nhiệt độ dẫn đến tôm bị sốc và chết. Năm 2002 tại 3 tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng có 193.271 ha tôm nuôi bị chết vào khoảng trung tuần tháng 3 (chiếm 57%) tổng diện tích thả nuôi mà nguyên nhân chính là nhiệt độ không khí đã lên cao đến 37oC (Bùi Quang Tề, 2003). Mặc dù tôm được thu có dấu hiệu đốm trắng và đỏ thân đây là biểu hiện của WSSV nhưng khi phân tích (mỗi ao 5 con) bằng phương pháp PCR sử dụng bộ kít IQ2000-WSSV thì tỉ lệ nhiễm WSSV của các ao là tương đối thấp chỉ có 12 ao có sự hiện diện của WSSV chiếm 50% như vậy chúng ta không nên dựa vào dấu hiệu bên ngoài mà kết luận. Các ao không nhiễm WSSV nhưng tôm nuôi có dấu hiệu bệnh và chết có thể tôm bị mầm bệnh khác tấn công gây bệnh như vi khuẩn. Vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng gây bệnh đốm trắng ở tôm sú nuôi tại Malaysia. Tôm có các đốm trắng đục, mờ nhìn thấy trên khắp cơ thể, khi bốc vỏ nhìn rỏ hơn, khi kiểm tra các mẫu bằng phương pháp PCR thì cho kết quả âm tính với WSSV (Wang et al., 2000). Cũng có thể do các mẫu này trong quá trình bảo quản để vận chuyển về phòng thí nghiệm không được tốt. Qua các đợt thu mẫu (mỗi đợt đi thu từ 2 đến 3 ngày) cho thấy khi bảo quản mẫu bằng nitơ lỏng có chất lượng tốt hơn là bảo quản bằng nước đá. Theo Triệu Thanh Tuấn, 2006 cho rằng các mẫu được bảo quản trong nước đá khoảng 8 giờ thì chất lượng mẫu vẫn đảm bảo. Trong các ao mà có nhiễm WSSV tỉ lệ nhiễm rất cao 100% (12/12 ao) đều này cho thấy WSSV lây lan rất mạnh trong ao nuôi. Mức độ nhiễm chủ yếu là nhiễm nhẹ 25 (32/60 mẫu) chiếm 53%, nhiễm trung bình (22/60 mẫu) chiếm 37%, và (6/60 mẫu) nhiễm nặng chiếm 10%. 53% 37% 10% Nhiễm nhẹ Nhiễm trung bình Nhiễm nặng Hình 4.1: Thể hiện tỉ lệ cảm nhiễm WSSV 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu tôm trong các ao có dấu hiệu đốm trắng tại Cà Maubằng gel 1%. Giếng M: marker với trọng lượng phân tử được đánh dấu 848bp, 630bp, 333bp.Giếng 1 là đối chứng (+), giếng 2 là đối chứng (-), giếng 3, 4, 5 mẫu nhiễm nặng (+++),giếng 6, 7, 8 mẫu nhiễm trung bình (++), giếng 9, 10, 11 ,mẫu nhiễm nhẹ (+). Mức độ nhiễm nhẹ chiếm tỉ lệ cao (53%) là do khi phát hiện bệnh thì người nuôi tiến hành thu hoạch nên WSSV không có điều kiện để phát triển. Trong cùng một ao thì mức độ nhiễm cũng không giống nhau có mẫu nhiễm nhẹ, cũng có những mẫu nhiễm rất nặng. Các ao tôm có mức độ nhiễm nhẹ chủ yếu là các ao nuôi quảng canh cải tiến vì đây là môi trường hở, ao nuôi có diện tích rộng và tôm nuôi với mật độ thấp nên WSSV khó có thể lây lan trên diện rộng trong thời gian ngắn. Mức độ nhiễm trung bình và nặng thì tập trung vào các ao nuôi theo mô hình quảng canh cải tiến năng suất cao và thâm canh vì đây là mô hình khép kín, ao 848bp 630bp 333bp 26 nuôi có diện tích nhỏ, nuôi ở mật độ cao nên WSSV có thể lây lan nhanh và mạnh. Theo Lighner, (1996) tôm nuôi có thể chết 100% sau 3-10 ngày có dấu hiệu đốm trắng. Theo Nguyễn Văn Hảo, (2004) cho rằng khi tôm nhiễm WSSV ở mức (+) đã có biểu hiện đặc trưng của bệnh như tôm yếu, dạt vào bờ màu sắc thân có màu hồng đỏ và bắt đầu chết. Khi nhiễm WSSV ở mức (++) tôm chết với cường độ nhanh hoặc chết rải rác sau đó tăng nhanh. Mẫu tôm phân tích phần lớn nhiễm nhẹ (+) là do lúc thu mẫu thu nhưng con tôm còn sống bằng cách chài, sổ ra cống, hay đặt lú cho nên rất giống với mô tả ở trên. Một vài thông tin về các ao nhiễm WSSV Bảng 4.1: Một vài thông tin về ao nuôi nhiễm WSSV trong các mẫu tôm thu tại Cà Mau Tôm nhiễm WSSV chủ yếu từ 45 đến 90 ngày thả nuôi nhưng nhiều nhất là 60 ngày tuổi vì đây là giai đoạn thuận lợi cho virus gây bệnh phát triển và theo nhiều nghiên cứu trước cho rằng tôm nhiễm WSSV chủ yếu từ 30 đến 60 ngày thả nuôi. Theo Nguyễn Văn Hảo, (2006) tôm nhiễm WSSV chủ yếu xuất hiện sau 1-2 tháng thả nuôi. Theo Bùi Quang Tề, (2003) cho rằng tôm nuôi có thể nhiễm WSSV trong bất kỳ thời gian nào sau khi thả nuôi, ở tháng thứ nhất và tháng thứ tư thì ít nhiễm bệnh mà nhiễm bệnh chủ yếu từ 2-3 tháng thả nuôi. Do tôm được nuôi chủ yếu trong mô hình quảng canh, quảng canh cải tiến, con giống ít được kiểm tra nguồn giống cung cấp chủ yếu là ở địa phương và các tỉnh miền trung, ao nuôi Ao Mô hình Thời Gian Ngày thu Địa điểm Nguồn giống CM1 Quảng canh cải tiến 60 28/11/07 Tân Thành Tắc Vân CM2 Quảng canh cải tiến 63 12/03/08 Tắc Vân Miền Trung CM3 Quảng canh cải tiến 65 11/03/08 Tân Thành Cái Nước CM4 Quảng canh cải tiến 65 12/03/08 Tân Thành Cái Nước CM5 Thâm canh 60 19/03/08 Phú Tân Miền Trung CM6 Quảng canh cải tiến NSC 60 22/03/08 Thới Bình Miền Trung CM7 Quảng canh cải tiến 60 22/03/08 Thới Bình Gành Hào CM8 Quảng canh cải tiến NSC 45 10/04/08 Đầm Dơi Miền Trung CM9 Quảng canh cải tiến 90 20/05/05 Tắc Vân Miền Trung CM10 Quảng canh cải tiến 80 20/05/08 Tắc Vân Miền Trung CM11 Thâm canh 45 18/05/08 Đầm Dơi Miền Trung CM12 Quảng canh cải tiến 60 19/05/08 Tân Thành Bạc Liêu 27 không được cải tạo kỹ, nguồn nước không được xử lý, môi trường nuôi biến động và thả giống nối đuôi nên tạo điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh phát triển và bùng phát bệnh trong các ao nuôi gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi. Triệu Thanh Tuấn, (2006) thì các mẫu tôm thu được phần lớn ở giai đoạn từ 45 đến 90 ngày tuổi. Đây là độ tuổi mẫn cảm nhất của tôm sú đối với bệnh đốm trắng do tác nhân WSSV gây ra (Lightner, 1996). 4.2 Kết quả phân tích PCR-genotyping Các mẫu tôm có kết quả dương tính với WSSV của 60 mẫu bằng phương pháp Nested-PCR (bộ kit IQ2000) trong 12 ao thuộc các huyện Phú Tân (1 ao), Đầm Dơi (2 ao), Thới Bình (2 ao), Tắc Vân (3 ao), Tân Thành (4 ao) được sử dụng trong PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 nhằm tìm hiểu đặc điểm của vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 trên các mẫu tôm thu tại Cà Mau. 4.2.1 Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 4.2.1.1 Phản ứng PCR-genotyping (ORF94) thực hiện theo qui trình của Trần Thị Mỹ Duyên, (2006) Theo Trần Thị Mỹ Duyên, (2006) thực hiện phản ứng PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV theo thành phần hoá chất phản ứng với thể tích 50µl thì cho kết quả tối ưu và đã được Lê Vân Hải Yến và Triệu Thanh Tuấn, (2006) ứng dụng để xác định vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV trên các mẫu tôm sú thu tại Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau. Tuy nhiên có sự thay đổi thể tích của phản ứng từ 50 µl thành 25 µl. Cụ thể, đề tài thực hiện qui trình PCR-genotyping (ORF94) theo thành phần phản ứng PCR Buffer (1 X), MgCl2 (1,5 mM), dNTP (200 µM), mix ORF94-R (25 pmol), ORF94-F (25 pmol), DNA mẫu (200 pmol) với tổng thể tích là 25 µl. Trong nghiên cứu này khi thực hiện phản ứng khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 thì nồng độ hoá chất không 28 đổi nhưng giảm thể tích hoá chất xuống ½ tức là thể tích của phản ứng còn 25µl thì vẫn cho kết quả tốt. Để kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình sau khi giảm thể tích, nghiên cứu đã tiến hành thực hiện thử phản ứng với 10 mẫu dương tính với WSSV trong đó có 3 mẫu nhiễm nhẹ (+), 3 mẫu nhiễm trung bình (++), 4 mẫu nhiễm nặng (+++) Bảng 4.2: Cường độ nhiễm của 10 mẫu kiểm tra Thứ tự điện di Mẫu phân tích Cường độ nhiễm 1 3a (+) 2 3d (+) 3 3e (+) 4 3c (++) 5 4b (++) 6 4c (++) 7 11c (+++) 8 11d (+++) 9 11e (+++) 10 12e (+++) 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 Hình 4.3: Kết quả điện di kiểm tra 10 mẫu sau khi giảm thể tích. Giếng M: Thang DNA 1kb plus. Giếng 1, 2, 3 mẫu nhiễm nhẹ (+). Giếng 4, 5, 6 mẫu nhiễm trung bình (++). Giếng 7, 8, 9, 10 mẫu nhiễm nặng (+++) Dựa vào kết quả chạy điện di cho thấy các mẫu có kích thước sản phẩm khác nhau. Các mẫu 3a, 3c, 3d, 3e, có kích thước 453 bp tương ứng với 5 vùng lặp lại, và các mẫu 11c, 11d, 11e có cùng kích thước 615 bp ứng với 8 vùng lặp lại. Mẫu 4b có 10 vùng lặp lại với kích thước 723 bp, trong khi đó mẫu 4c lại có 5 vùng lặp 650 bp 500 bp 29 lại. Đặc biệt là mẫu 12e có hai vạch DNA có kích thước là 399 bp, và 561 bp ứng với số vùng lặp lại là 4 và 7. Kết quả kiểm tra cho thấy cả 10 mẫu cho kết quả rõ ràng các vạch DNA sáng và rõ nét, kể cả những mẫu có 2 vạch DNA tương ứng với hai vùng lặp lại. Như vậy có thể sử dụng rộng rãi qui trình này để xác định vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV vì nó cho kết quả tốt mà còn giảm giá thành của phản ứng. 4.2.1.2 Kết quả phân tích các mẫu WSSV thu tại Cà Mau (PCR-genotyping- ORF94) Mẫu tôm sú dùng trong nghiên cứu là các mẫu tôm có kết quả dương tính với WSSV bằng phương pháp Nested-PCR (bộ kit IQ2000) trong 12 ao thuộc các huyện Phú Tân (1 ao), Đầm Dơi (2 ao), Thới Bình (2 ao), Tắc Vân (3 ao), Tân Thành (4 ao). DNA ly trích từ tôm bị nhiễm WSSV được sử dụng trong PCR- genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94. Bằng phương pháp PCR-genotyping sử dụng cặp mồi ORF94-F và ORF94-R cho thấy có sự khác biệt về số vùng lặp lại thuộc ORF94 trên bộ gen WSSV giữa các ao thu được và ngay trong cùng một ao. Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 trên các mẫu tôm thu tại Cà Mau đã xác định được 7 kiểu gen WSSV tương ứng với 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 vùng lặp lại (Bảng 4.3) (Hình 4.4). Trong đó 6, 8 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất so với các vùng khác 24,6%, tiếp sau đó là 5 vùng lặp lại chiếm 20,5%, 7 vùng lặp lại chiếm 13,9%, 4 vùng lặp lại chiếm 10,9%, 10 vùng lặp lại chiếm 3%, và thấp nhất là có 9 vùng lặp lại chiếm 1,5%. 30 Bảng 4.3: Kết quả phân tích các nhóm vùng lặp lại thuộc ORF94 trong các ao tôm thu tại Cà Mau 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 Hình 4.4: Kết quả điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 trên mẫu WSSV thu ở Cà Mau. M: Thang DNA 1kb plus. Giếng 1-5 thuộc ao CM1 có 5 vùng lặp lại. Giếng 6-10 thuộc ao CM2 có 6 vùng lặp lại. Kết quả đạt được tương tự như trong nghiên cứu của Wongteerasupaya et al., (2003) đã xác định được 12 kiểu gen của WSSV Thái Lan nhờ vào số lần lặp lại của trình tự 54 bp thuộc ORF94 từ 6 đến 20 lần, trong đó 8 lần lặp lại chiếm nhiều nhất 32%. Ngân hàng gen ghi nhận số vùng lặp lại của WSSV Thái Lan và WSSV của Đài Loan là 6 vùng lặp lại. Và Tran Thi Tuyet Hoa et al, (2005) khi nghiên cứu trên tôm nuôi ở Việt Nam bằng phương pháp PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 cho rằng kiểu gen của WSSV được phân lặp trên tôm bệnh đốm trắng có số vùng lặp lại là từ 4 đến 9 trong đó 7 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất. Số mẫu phân tích của từng ao Số vùng lặp lại thuộc ORF94 CM1 CM2 CM3 CM4 CM5 CM6 CM7 CM8 CM9 CM10 CM11 CM12 4 5 2 5 5 5 4 6 5 5 1 5 7 3 5 1 8 1 2 5 5 3 9 1 10 1 1 453 bp 507 bp 31 Theo kết quả nghiên cứu Lê Vân Hải Yến, (2006) xác định số vùng lặp lại thuộc ORF94 trên các mẫu tôm thu tại Sóc trăng là 5, 7, 8, 12, trong đó kiểu gen có 8 vùng lặp lại chiếm nhiều nhất 50%, và tại Trà Vinh là 5, 8, 9 vùng lặp lại và kiểu gen có 8 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất 57,1%, và không có mẫu nào có 6 vùng lặp lại. Kết quả này có sự khác biệt lớn đối với kết quả nghiên cứu của Triệu Thanh Tuấn, (2006) khi sử dụng PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 trên các mẫu tôm thu tại Cà Mau và Bạc Liêu đã phân lập được 6 kiểu gen tương ứng WSSV, từ 4 đến 16 vùng lặp lại trong đó kiểu gen có 5 vùng lặp lại chiếm tỷ lệ cao nhất (48,8% ở Bạc liêu, 68,4% ở Cà Mau) và không có mẫu có 6, và 8 vùng lặp lại đối với mẫu tôm thu tại Bạc Liêu và 8 vùng lặp lại đối với mẫu tôm thu tại Cà Mau. Pradeep et al., (2007), đã sử dụng ADN ly trích từ tôm hậu ấu trùng, tôm nuôi có nhiễm WSSV tại Ấn Độ để xác định số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94, và ORF125. Đối với ORF94, có 13 kiểu gen được tìm thấy với số vùng lặp lại từ 2 đến 16. Trong đó 7 vùng lặp lại chiếm cao nhất 11,3% không có mẫu nào có số vùng lặp lại 11 lần hoặc 15 lần được tìm thấy. Theo bảng 4.1 cho thấy 3 ao CM1, CM3, CM4 đều thuộc xã Tân Thành, thành phố Cà Mau các ao này gần nhau. Trong đó CM1 thả giống miền Trung, CM3, CM4 cùng có nguồn giống Cái Nước. Khi so sánh số vùng lặp lại giữa các ao tôm nhiễm WSSV cho thấy các ao CM1, CM3, CM4 đều có 5 vùng lặp lại. Kết quả này có thể dự đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú ở các ao này là cùng một kiểu gen WSSV. Trong trường hợp này có thể WSSV đã lây nhiễm theo chiều ngang giữa các ao trong vùng. Theo Bùi Quang Tề, (2003) cho rằng WSSV lây nhiễm chủ yếu theo chiều ngang. Hai ao CM6, CM7 được thu cùng một ngày, cùng thuộc xã Hồ Thị Kỹ huyện Thới Bình, nhưng có số vùng lặp lại khác nhau. Theo bảng 4.1 hai ao này có nguồn giống khác nhau, ao CM6 thả giống miền Trung, ao CM7 thả giống Gành Hào. Kết quả này cho thấy bệnh đốm trắng trong hai ao này có kiểu gen khác nhau, trong trường hợp này có thể WSSV lây truyền qua nguồn tôm giống. Theo Tran Thi Tuyet Hoa et al., (2005) cho rằng nguồn gốc chính của sự lây 32 nhiễm và bùng phát dịch bệnh đốm trắng trên tôm không phải là từ giáp xác tự nhiên mà là từ nguồn giống. 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 Hình 4.5: Kết quả điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 trên mẫu WSSV thu ở Cà Mau. Giếng M thang DNA 1kb plus (invitrogen).Giếng 1, 2, 3 thuộc ao CM4 ( giếng 3 có 2 vạch tương ứng 5 và 8 vùng lặp lại). Giếng 4,5, thuộc ao CM9. Giếng 7, 8, 9, 10 thuộc ao CM12 (giếng 7 có 2 vạch tương ứng với 8 và 9 vùng lặp lại) Trong cùng một ao thì số vùng lặp lại hầu như hoàn toàn giống nhau 9/12 ao chỉ có 3 ao có số vùng lặp lại khác nhau là CM4, CM6, CM12 (Hình 4.5). Như vậy bệnh đốm trắng trên tôm trong cùng một ao cảm nhiễm cùng một kiểu gen WSSV (9/12 ao). Đôi khi trong cùng một ao số vùng lặp lại khác nhau tức là có sự biến đổi kiểu gen của WSSV nó tồn tại hai vùng lặp lại trên cùng một bộ gen. Có trường hợp trong cùng một mẫu có 2 vùng lặp lại thuộc ORF94 (5/60 mẫu) nghĩa là trong cùng một con tôm có sự hiện diện của hai kiểu gen WSSV. Theo Tran Thi Tuyet Hoa et al., (2005) cho rằng sự cảm nhiễm cùng lúc nhiều kiểu gen WSSV trên tôm sú là phổ biến. 4.2.2 Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 Mẫu tôm sú dùng trong nghiên cứu là các mẫu tôm có kết quả dương tính với WSSV bằng phương pháp Nested-PCR (bộ kit IQ2000) trong 12 ao thuộc các huyện Phú Tân (1 ao), Đầm Dơi (2 ao), Thới Bình (2 ao), Tắc Vân (3 ao), Tân Thành (4 ao). DNA ly trích từ tôm bị nhiễm WSSV đã được sử dụng trong PCR- genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 và tiếp tục được sử dụng trong PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125. 615 bp 453 bp 33 Kết quả phân tích PCR-genotyping sử dụng cặp mồi ORF125-flank Forward và ORF125-flank Reverse khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 đối với 60 mẫu dương tính với WSSV đã được kiểm tra bằng phương pháp Nested-PCR cho thấy có sự khác nhau về số vùng lặp lại trên bộ gen của WSSV giữa các ao thu được và cả trong cùng một ao (Bảng 4.4), (Hình 4.6). Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 trên các mẫu tôm thu tại Cà Mau đã xác định được 5 kiểu gen WSSV có (4, 5, 6, 7, 8 vùng lặp lại) với tỉ lệ tương ứng là 19%, 24%, 47%, 1,3%, 8,7%. Tuy có sự khác biệt số vùng lặp lại giữa các mẫu tôm trong cùng một ao, và giữa các ao, nhưng trong số tất cả các mẫu phân tích thì kiểu gen có 6 vùng lặp lại xuất hiện nhiều nhất, chiếm tỉ lệ cao nhất 47% và thấp nhất có 7 vùng lặp lại chiếm 1,3% so với các vùng lặp lại khác. Bảng 4.4: Kết quả phân tích các nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125 trong các ao tôm thu tại Cà Mau Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Bui Thi Minh Dieu et al., (2004) sử dụng cặp mồi ORF125-flank Forward và ORF125-flank Reverse khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 đã phân lặp được 3 dòng WSSV trên mẫu tôm thu ở miền Trung, Việt Nam tương ứng với số vùng lặp lại là 5, 6, 7. Tuy nhiên kết quả này có phần khác biệt so với kết quả nghiên cứu của Pradeep et al., (2007), đã sử dụng ADN ly trích từ tôm hậu ấu trùng, tôm nuôi có nhiễm WSSV tại Ấn Độ để xác định số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94, và ORF125. Đối với ORF125, có 11 kiểu gen khác nhau được tìm thấy với số vùng lặp lại từ 2 đến 14. Trong đó số lần Số mẫu phân tích của từng ao Số vùng lặp lại thuộc ORF125 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 4 1 5 5 2 5 1 2 2 1 5 5 6 5 5 4 3 5 5 5 7 1 8 1 5 34 lặp lại được tìm thấy nhiều nhất là 7 lần chiếm 47,1%, không tìm thấy mẫu nào có số vùng lặp lại 6 lần hoặc 13 lần. 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 Hình 4.6: Kết quả điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 trên mẫu WSSV thu ở Cà Mau. Giếng M thang DNA 1kb Plus. Giếng 1-5 thuộc ao CM7 có 5 vùng lặp lại . Giếng 6-10 thuộc ao CM8 có 6 vùng lặp lại. Ngoài ra, trong cùng một ao thì số vùng lặp lại giữa các mẫu là giống nhau (10/12 ao nhiễm WSSV). Đôi khi trong cùng một ao thì lại có sự khác biệt của số vùng lặp lại thuộc ORF125 ao CM2, CM4 điều này cho thấy có hai kiểu gen khác nhau của WSSV. Cũng có khi trong cùng một mẫu lại song song tồn tại hai vùng lặp lại thuộc ORF125 8/60 mẫu, điều này cho thấy hai dòng virut cùng tấn công trên một con tôm. Như vậy cho thấy trong cùng một ao có thể tồn tại nhiều vùng lặp lại thuộc ORF125 tức là có sự khác biệt kiểu gen của WSSV hay có thể nói trong cùng một ao có thể tồn tại nhiều dòng WSSV gây bệnh cho tôm nuôi. Theo Tran Thi Tuyet Hoa et al., (2005) cho rằng sự cảm nhiễm cùng lúc nhiều kiểu gen WSSV trên tôm sú là phổ biến. 652 bp 583bp 35 4.2.3 Mối liên hệ giữa số vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 Bảng 4.5: Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 Số ao phân tích PCR-genotyping Số vùng lặp lại thuộc ORF94 Số vùng lặp lại thuộc ORF125 CM1 5 vùng lặp lại 6 vùng lặp lại. CM2 6 vùng lặp lại 3 mẫu có 6 vùng lặp lại. 1 mẫu có 6 và 5 vùng lặp lại. 1 mẫu có 6 và 8 vùng lặp lại CM3 5 vùng lặp lại 3 mẫu có 6 vùng lặp lại. 1 mẫu có 5 vùng lặp lại. 1 mẫu có 5 và 6 vùng lặp lại CM4 3 mẫu có 5 vùng lặp lại. 1 mẫu có 10 vùng lặp lại. 1 mẫu có cả 5 và 8 vùng lặp lại. 2 mẫu có 5 vùng lặp lại. 3 mẫu có 6 vùng lặp lại. CM5 4 vùng lặp lại. 6 vùng lặp lại. CM6 3 mẫu có 7 vùng lặp lại. 2 mẫu có 8 vùng lặp lại 4 mẫu có 6 vùng lặp lại. 1 mẫu có 5 và 6 vùng lặp lại. CM7 6 vùng lặp lại 5 vùng lặp lại CM8 4 mẫu có 7 vùng lặp lại. 1 mẫu có cả 6 và 7 vùng lặp lại. 6 vùng lặp lại CM9 4 mẫu có 8 vùng lặp lại. 1 mẫu có cả 8 và 10 vùng lặp lại 3 mẫu có 8 vùng lặp lại. 1 mẫu có 7 và 8 vùng lặp lại. 1 mẫu có 4 và 8 vùng lặp lại CM10 6 vùng lặp lại 4 vùng lặp lại. CM11 8 vùng lặp lại 4 vùng lặp lại CM12 3 mẫu có 8 vùng lặp lại. 1 mẫu có cả 4 và 9 vùng lặp lại. 1 mẫu có 4 và 7 vùng lặp lại. 3 mẫu có 5 vùng lặp lại. 2 mẫu có 4 và 5 vùng lặp lại. Trong cùng một ao CM2, CM3 số vùng lặp lại thuộc ORF125 khác nhau (ao CM2 có 5, 6, 8 vùng lặp lại, ao CM3 có 5 và 6 vùng lặp lại) đôi khi có hai vùng lặp lại trong cùng một mẫu. Như vậy là trong cùng một con tôm có thể nhiễm hai dòng WSSV khác nhau (hiện tượng nhiễm kép). Theo Tran Thi Tuyet Hoa et al., (2005) 36 cho rằng sự cảm nhiễm cùng lúc nhiều kiểu gen (genotype) WSSV trên tôm sú là phổ biến. Trong khi đó số vùng lặp lại của hai ao CM2 và CM3 thuộc ORF94 lại hoàn toàn giống nhau (ao CM2 có 6 vùng lặp lại, CM3 có 5 vùng lặp lại) điều này cho thấy có thể có sự biến đổi số vùng lặp lại thuộc ORF125 mà số vùng lặp lại thuộc ORF94 không thay đổi, hay là trong ao tồn tại hai dòng WSSV mà số vùng lặp lại thuộc ORF125 khác nhau còn số vùng lặp lại thuộc ORF94 thì giống nhau và ngược lại. Các ao CM2, CM7, CM10 có số vùng lặp lại thuộc ORF94 giống nhau đều có 6 vùng lặp lại nhưng số vùng lặp lại thuộc ORF125 của 3 ao này là khác nhau (ao CM2 có 6 vùng lặp lại, CM7 có 5 vùng lặp lại, CM 10 có 4 vùng lặp lại) và ngược lại ở các ao CM1, CM5, CM8 thì có số vùng lặp lại thuộc ORF125 là giống nhau trong khi đó số vùng lặp lại thuộc ORF94 lại khác nhau cả 3 ao. Kết quả này rất giống với nghiên cứu của Pradeep et al., (2007), đã sử dụng ADN ly trích từ tôm hậu ấu trùng, tôm nuôi có nhiễm WSSV, đồng thời sử dụng cả tôm tự nhiên và cua của Ấn Độ. Nghiên cứu tìm hiểu sự thay đổi trên các vùng lặp lại của WSSV đã tìm ra trước đây, bao gồm ORF94, ORF125 và ORF75. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong đó các mẫu có cùng số lần lặp lại trên một ORF thì có số lần lặp lại không giống nhau trên một hoặc cả hai ORF khác. 37 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết Luận Xác định được có 7 nhóm vùng lặp lại thuộc ORF94 (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 vùng lặp lại) và 5 nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125 (4, 5, 6, 7, 8 vùng lặp lại). Kiểu gen WSSV có 6, 8 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất 24,6% đối với ORF94 và đối với ORF125 thì kiểu gen có 6 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất 47%. Số vùng lặp lại thuộc ORF94, và ORF125 trên bộ gen WSSV ở các thời điểm thu mẫu, và các ao khác nhau thì khác nhau. Trong cùng một ao số vùng lặp lại trên bộ gen WSSV thường giống nhau (9/12 ao đối với ORF94, 10/12 ao đối với ORF125), và trong cùng một mẫu có thể tồn tại hai vùng lặp lại (5/60 mẫu đối với ORF94 và 8/60 mẫu đối với ORF125) Sự khác biệt giữa các vùng lặp lại trên bộ gen của WSSV ở các ao tôm bệnh đốm trắng cho thấy, đang tồn tại nhiều kiểu gen WSSV khác nhau có khả năng gây bệnh đốm trắng trên tôm. 5.2 Đề xuất Sử dụng phương pháp PCR-genotyping trên các mẫu tôm sú bố mẹ, sú giống, và các loài giáp xác trong ao nhiễm WSSV để tìm hiểu con đường lan truyền và phân bố kiểu gen WSSV Thử nghiệm gây cảm nhiễm đối với các kiểu gen WSSV khác nhau nhằm xác định độc lực của virus gây bệnh đốm trắng. 38 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Báo Thương Mại, 2008. Xuất khẩu thủy sản Việt Nam nhanh chóng vượt kế hoạch năm 2007. ( Ngày truy cập 20/02/2008. 2. Bùi Quang Tề, 2003. Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh. 3. Bùi Quang Tề, 2006. Bệnh học thuỷ sản. NXB nông nghiệp, Hà Nội. 4. Bui Thi Minh Dieu., Marks, H., Siebenga, J. J., Goldbach, R. W., Zuidema, D., Duong, T. P. & Vlak, J. M. 2004. Molecular epidemiology of White spot syndrome virus within Vietnam. J Gen Virol 85:3607-3618. 5. Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007. Bài giảng Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh. Trường Đại học Cần Thơ. 6. Huỳnh Văn Tùng, 2006. Đánh giá thông tin liên quan tới quản lý sức khỏe tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ở ĐBSCL. Luận văn tốt nghiệp đại học. Trường Đại học Cần Thơ. 7. Hứa Quyết Chiến, 2004. Bước đầu nghiên cứu và thử nghiệm về ảnh hưởng của chế phẩm SH99 đến khả năng phòng bệnh virut (WSSV, MBV) cho tôm sú. 8. Lê Như Nguyệt, 2004. Ứng dụng và so sánh các phương pháp phát hiện virus đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng kỹ thuật PCR. Luận văn tốt nghiệp đại học. Trường Đại học Cần Thơ. 9. Lê Xuân Sinh, 2003. A Bio-economic Model of a shrimp hatchery in the Mekong River Delta of Vietnam. Luận án tiến sĩ Kinh tế nông nghiệp- Đại học Sydney, Autralia. 10. Lê Xuân Sinh, 2005. Bài giảng Kinh tế thuỷ sản. Trường Đại học Cần Thơ. 11. Lê Vân Hải Yến, 2006. Tìm hiểu mối quan hệ giữa kiểu gen của WSSV với bệnh đốm trắng trên tôm sú (P. monodon) nuôi tại Sóc Trăng và Trà Vinh. Luận văn tốt nghiệp đại học. Trường Đại học Cần Thơ. 12. Lightner DV, 1996. A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp. World aquaculture Society, Baton Rouge, LA. 13. Lo, C.F., C.H. Ho, S.E. Peng, C.H. Chen, H.C. Hsu, Y.L. Chiu, C.F. Chang, K.F. Lin, M.S. Su, M.S. Wang, and G.H. Kou. 1997. White spot syndrome 39 baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods. Dis. Aquat. Ogr, 27:215-225 14. Marks. H, Josyanne. J. A van Duijse, Zuidema. D and Hulten. W. C, 2005. Fitness and virulence of ancestral white spot syndrome virus isolate from shrimp. Virus research 110, 9-20. 15. Nguyễn Anh Tuấn, 1995. Hiện trạng, thử thách và tiềm năng của nghề nuôi tôm biển trên thế giới và Việt Nam. Hội thảo về quản lý dịch bệnh trong nuôi tôm ở ĐBSCL. 16. Nguyễn Minh Niên, 2004. Hiện trạng nuôi trồng thuỷ sản các tỉnh ven biển ĐBSCL. Viện NC NTTS II. 17. Nguyễn Văn Hảo, 2003. Quản lý sức khỏe tôm nuôi. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh. 18. Nguyễn Văn Hảo, 2004. Một số bệnh thường gặp trên tôm sú (Penaeus monodon). Các phương pháp chẩn đoán và phòng trị. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh. 19. Nguyễn Tiến Hưng, 2008. Đất rừng phương Nam: Nuôi tôm sinh thái cho rừng thêm xanh (Kỳ 5). Ngày truy cặp 05/07/2008 20. Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003. Ứng dụng kỹ thuật mô bệnh học trong chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú (P. monodon). Luận văn tốt nghiệp đại học. Trường Đại học Cần Thơ. 21. Phùng Văn, 2005. Năm 2010: Cà Mau xuất khẩu tôm đạt 1 tỷ USD. Ngày truy cập 05/07/2008 22. Pradeep. B, Shekar M, Gudkovs N, Karunasagar I, Karunasagar I, 2007. Genotyping of white spot syndrome virus prevalent in shrimp farms of India. Diseases of Aquatic Organisms 78:189-198 23. Sarathi. M, Martin. C. S, Venkatesan. C, Sahul Hameed. A. S. 2007. Oral Administration of Bacterially Expressed VP28dsRNA to 6 Protect Penaeus monodon from White Spot Syndrome Virus. 24. Sở Thủy Sản Bạc Liêu, 2005. Báo cáo tổng kết tình hình thực hiện kế hoạch phát triển ngành thủy sản 25. Sở Thủy Sản Sóc Trăng, 2005. Báo cáo tổng kết tình hình thực hiện kế hoạch phát triển ngành thủy sản 26. Sở Thủy Sản Sóc Trăng, 2007. Báo cáo tổng kết năm 2007, kế hoạch khuyến ngư 2008. 40 27. Tạp chí khuyến ngư Việt Nam số 45. 28. Trần Diệu Thắng, 2006. Khảo sát quản lý dịch bệnh trong nuôi tôm sú (P. monodon) thâm canh ở tỉnh Bạc Liêu. Luận văn tốt nghiệp đại học. Trường Đại học Cần Thơ. 29. Trần Ngọc Hải, 2004. Giáo trình kỹ thuật sản xuất giống và nuôi giáp xác. Trường Đại Học Cần Thơ. 30. Trần Thị Mỹ Duyên, 2006. Ứng dụng kỹ thuật PCR-genotyping trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV). Luận văn tốt nghiệp đại học. Trường Đại học Cần Thơ. 31. Tran Thi Tuyet Hoa, R. A. Hodgson, D. T. Oanh, N. T. Phuong, N. J. Preston, and P. K. Walker. 2005. Genotypic variations in tandem repeat DNA segments between ribonucleotide reductase subunit genes of white spot syndrome virus (WSSV) isolates from Vietnam. In P. Walker, R. Lester and M. G. Bondad- Reantaso (eds). Disease in Asian Aquaculture V.pp339-351. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila. 32. Trần Thị Tuyết Hoa, 2004. Bài giảng Bệnh virus trên động vật thuỷ sản. Trường Đại học Cần Thơ. 33. Trần Thị Tuyết Hoa, 2004. Bài giảng Sinh học phân tử. Trường Đại học Cần Thơ. 34. Triệu Thanh Tuấn, 2006. Khảo Sát mối quan hệ giữa kiểu gen của WSSV với bệnh đốm trắng trên tôm sú (P. monodon) nuôi tại Bạc Liêu và Cà Mau. Luận văn tốt nghiệp đại học. Trường Đại học Cần Thơ. 35. Tuyết Anh, 2008. Cà Mau: hơn 39.000 ha tôm nuôi bị chết. Ngày truy cập 05/07/2008. 36. Wang. A. L, W.-N. Wang, L. Sun, F.C. Li,M.S. Guo, L. Su and X.M. Zhai, 2000. Morphogenesis and Ultrastructure of a Baculovirus in the Juveniles of Penaeus chinensis. Asian Fisheries Science 15:229-237 37. Okumura. T, Nagai. F, Yamamoto. S, Oomura. H, Inouye. K, Ito. M and Sawada. H, 2003. Detection of white spot syndrome virus (WSSV) from hemolymph of Penaeid shrimps Penaeus japonicus by reverse passive latex agglutination assay using high-density latex particles. 38. Vaseeharan. B, Jayakumar. R and Ramasany. P, 2003.PCR-based detection of white spot syndrome virus in cultured and captured crustaceans in Indian. Letter in Applied Microbiology, p37, 443, 447. 41 39. Vlak, J.M., J. R. Bonami, T. W. Flegel, G. H. Kou, D. V. Lighner, C. F. Lo, P. C. Loh, and P. J. Walker. 2002. NIMAVIRIDAE A new virus family infecting aquatic invertebrates. ICTV, Paris, 2002. 40. Witteveldt. J, Carolina. C, Cifuentes, Just M. Vlak, and Marie¨lle C. W. van Hulten 2003. Protection of Penaeus monodon against White Spot Syndrome Virus by Oral Vaccination. Joural of virology, Feb. 2004, p. 2057–2061 Vol. 78, No. 4. 41. Wongteerasupaya, C., Pungchai. P, Withyachumnarnkul, V. Boonsaeng, S. Panyim, T. W. Flegel, and P. J. Walker. 2003. High variation in repetitve DNA fragment lengh for white spot syndrome virus (WSSV) isolates in Thailand. Dis aquat org 54: 253-275 42. Ngày truy cập 25/02/2008 42 PHẦN VII PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU Ao Mã số PCR- IQ2000 ORF94 ORF125 CM1 a b c d e (++) (++) (+) (++) (++) 5 vùng lặp lại 6 vùng lặp lại. CM2 a b c d e (+) (+) (++) (+) (+) 6 vùng lặp lại 3 mẫu có 6 vùng lặp lại. 1 mẫu có 6 và 5 vùng lặp lại. 1 mẫu có 6 và 8 vùng lặp lại CM3 a b c d e (+) (+) (++) (+) (+) 5 vùng lặp lại 3 mẫu có 6 vùng lặp lại. 1 mẫu có 5 vùng lặp lại. 1 mẫu có 5 và 6 vùng lặp lại CM4 a b c d e (+) (+++) (++) (+) (+) 3 mẫu có 5 vùng lặp lại. 1 mẫu có 10 vùng lặp lại. 1 mẫu có cả 5 và 8 vùng lặp lại. 2 mẫu có 5 vùng lặp lại. 6 mẫu có 6 vùng lặp lại. CM5 a b c d e (+) (+) (++) (++) (++) 4 vùng lặp lại. 6 vùng lặp lại. CM6 a b c d e (+) (+) (++) (++) (++) 3 mẫu có 7 vùng lặp lại. 2 mẫu có 8 vùng lặp lại 4 mẫu có 6 vùng lặp lại. 1 mẫu có 5 và 6 vùng lặp lại. CM7 a b c (+) (++) (++) 6 vùng lặp lại 5 vùng lặp lại 43 d e (++) (++) CM8 a b c d e (+) (+) (+) (+) (+) 4 mẫu có 7 vùng lặp lại. 1 mẫu có cả 6 và 7 vùng lặp lại. 6 vùng lặp lại CM9 a b c d e (++) (+) (+) (+) (+++) 4 mẫu có 8 vùng lặp lại. 1 mẫu có cả 8 và 10 vùng lặp lại 3 mẫu có 8 vùng lặp lại. 1 mẫu có 7 và 8 vùng lặp lại. 1 mẫu có 4 và 8 vùng lặp lại CM10 a b c d e (+) (+) (++) (+) (+++) 6 vùng lặp lại 4 vùng lặp lại. CM11 a b c d e (+) (+) (+++) (+++) (++) 8 vùng lặp lại 4 vùng lặp lại CM12 a b c d e (++) (+) (+) (+) (+++) 3 mẫu có 8 vùng lặp lại. 1 mẫu có cả 4 và 9 vùng lặp lại. 1 mẫu có 4 và 7 vùng lặp lại. 3 mẫu có 5 vùng lặp lại. 2 mẫu có 4 và 5 vùng lặp lại.