Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-Β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó

Đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó MỤC LỤC MỞ ĐẦU . 1 CHưƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. ĐỊNH NGHĨA . 2 1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI. 2 1.2.1. Nguồn gốc 2 1.2.2. Phân loại enzyme . 3 1.3. CẤU TRÚC. 5 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất 5 1.3.2. Cấu trúc không gian . 6 1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC 8 1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae 10 1.6. Ứng dụng 11 1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 11 1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 12 1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi . 13 1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ 14 1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh 14 1.7. ẢNH HưỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRưỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE . 16 1.7.1. Nguồn carbon . 16 1.7.2. Nguồn nitrogen 17 1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy . 18 1.7.4. Ảnh hưởng của pH môi trường . 18 1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME . 19 1.8.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ . 19 1.8.2. Ảnh hưởng của pH . 20 1.8.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại . 20 1.8.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa . 21 Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP 22 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 22 2.1.1. Chủng giống . 22 2.1.2. Thiết bị. 22 2.1.3. Hóa chất . 22 2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào . 23 2.1.5. Môi trường . 24 2.2. PHưƠNG PHÁP . 25 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme . 25 2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase 25 2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase 25 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tốmôi trường lên khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 27 2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase 29 2.2.6. Điện di SDS-PAGE 30 2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase . 30 2.2.8. Các phương pháp sinh học phân tử . 32 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase cao . 36 3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28SrRNA 37 3.3. Tối ưu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase . 39 3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian . 39 3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng. 40 3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn carbon. 41 3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ carbon 43 3.3.5. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen 44 3.3.6. Ảnh hưởng của nồng độ nitrogen . 45 3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy . 46 3.3.8. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy . 47 3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase . 48 3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase 50 3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ưu 50 3.5.2. pH phản ứng tối ưu. 51 3.5.3. Độ bền nhiệt . 52 3.5.4. Độ bền pH 54 3.5.5. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ . 55 3.5.6. Ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa 56 3.5.7. Ảnh hưởng của ion kim loại . 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 KẾT LUẬN 59 KIẾN NGHỊ . 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 TIẾNG VIỆT . 61 TIẾNG ANH 64 PHỤ LỤC

pdf90 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 27/12/2012 | Lượt xem: 3966 | Lượt tải: 15download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-Β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC HÀ NỘI-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Quyền Đình Thi Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam HÀ NỘI-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng ý tƣởng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, CN. Đào Thị Tuyết và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và rèn luyện trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trƣờng ĐHSP - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngƣời thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó ! Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009 Học Viên Nguyễn Hữu Quân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 2 1.1. ĐỊNH NGHĨA ......................................................................................... 2 1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI............................................................. 2 1.2.1. Nguồn gốc ............................................................................................ 2 1.2.2. Phân loại enzyme ................................................................................. 3 1.3. CẤU TRÚC ............................................................................................. 5 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất .................................................................................. 5 1.3.2. Cấu trúc không gian ............................................................................. 6 1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC ................................................................................ 8 1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae ............................................................ 10 1.6. Ứng dụng .............................................................................................. 11 1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ...................................... 11 1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm .............................................. 12 1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi ................................... 13 1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ .................................... 14 1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh .............. 14 1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ......................................... 16 1.7.1. Nguồn carbon ..................................................................................... 16 1.7.2. Nguồn nitrogen .................................................................................. 17 1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 18 1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ........................................................... 18 1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME ............................................... 19 1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ..................................................................... 19 1.8.2. Ảnh hƣởng của pH ............................................................................. 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại ......................................................... 20 1.8.4. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa ......................... 21 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................... 22 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ........................................................ 22 2.1.1. Chủng giống ....................................................................................... 22 2.1.2. Thiết bị ............................................................................................... 22 2.1.3. Hóa chất ............................................................................................. 22 2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào ............................................................. 23 2.1.5. Môi trƣờng ......................................................................................... 24 2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................... 25 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme ......................................................... 25 2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase.......................................................... 25 2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase............................................ 25 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase .................................................................... 27 2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................ 29 2.2.6. Điện di SDS-PAGE ............................................................................ 30 2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ........................... 30 2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ..................................................... 32 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 36 3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase cao ............................................................................................... 36 3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S rRNA............................................................................................................ 37 3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ..................... 39 3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ........................... 39 3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ........................................... 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ............................................................. 41 3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon .......................................................... 43 3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen .......................................................... 44 3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen ....................................................... 45 3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 46 3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy ............................................................... 47 3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................... 48 3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ............................................ 50 3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu .................................................................... 50 3.5.2. pH phản ứng tối ƣu ............................................................................. 51 3.5.3. Độ bền nhiệt ....................................................................................... 52 3.5.4. Độ bền pH .......................................................................................... 54 3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ....................................................... 55 3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa .................................................... 56 3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại ............................................................... 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 59 KẾT LUẬN .................................................................................................. 59 KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61 TIẾNG VIỆT ............................................................................................... 61 TIẾNG ANH ................................................................................................ 64 PHỤ LỤC .................................................................................................... 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ....................................... 22 Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ............................... 23 Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 23 Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae .............. 37 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 42 Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 49 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 57 Bảng 4.1. Đƣờng chuẩn glucose................................................................... 69 Bảng 4.2. Trình tự nucleotide của đoạn gene 28S rRNA từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ................................................................................................ 69 Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ..................... 70 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 70 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71 Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 72 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73 Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73 Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 74 Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase...................................... 75 Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase......................................... 76 Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 77 Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 77 Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. grisea ....................................................................................... 7 Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. grisea .. 8 Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase ......................................................................................................... 9 Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase .............. 10 Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. oryzae .................................................... 11 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose ................................................................... 26 Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ................................................................................................ 29 Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae ........ 36 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI (C). ............................................................................................................... 38 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................... 39 Hình 3.4. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 40 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 41 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp endo- β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 44 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 45 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................. 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme endo- β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 47 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 48 Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B) ................................................................ 49 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 51 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 52 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 53 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 54 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 55 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT g Microgram l Microliter APS Ammonium persulphate Cel Cellulose CMC Carboxyl methyl cellulase cs Cộng sự EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid kb Kilobase kDa Kilo Dalton M Marker (thang protein chuẩn) MTK Môi trƣờng khoáng MW Molecular Weight OD Optical density PCR Polymerase chain reaction SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N,N’,N,N’- Tetramethyl ethylene diamine Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane U Unit v/v Volume/volume w/v Weight/volume Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Endo-β-1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosidie một cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số chất tƣơng tự khác có cầu nối β-glucan. Endo-β-1,4-glucanase phân giải mạnh mẽ cellulose vô định hình. Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau nhƣ động vật (thuộc các nhóm thân mềm, lợn, gà); thực vật (mầm của các hạt ngũ cốc nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn thu enzyme chủ yếu vẫn từ vi sinh vật. Vi sinh vật sinh enzyme hết sức đa dạng nhƣ nấm sợi (Aspergillus niger, A. oryzae, A. aculeatus, Trichoderma viride) và vi khuẩn (thuộc họ Bacillus). Endo-β-1,4-glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành khác nhau nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy; công nghiệp chế biến thực phẩm; công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi; công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh. Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo-β-1,4-glucanase và nguồn vi sinh vật tổng hợp enzyme rất đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng các phế phụ phẩm trong nông nghiệp, chúng tôi đã chọn đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ngoại bào từ chủng A. oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo-β-1,4- glucanase. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐỊNH NGHĨA Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase là một trong ba dạng cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose. Enzyme này thể hiện hoạt tính mạnh mẽ trên cellulose vô định hình. 1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI 1.2.1. Nguồn gốc Endo-β-1,4-glucanase đƣợc thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhƣ động vật (các nhóm thân mềm, lợn, bò, gà); thực vật (trong hạt ngũ cốc nảy mầm là đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn). Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn thu enzyme chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu đƣợc nhiều lần trong năm và chủ động sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để nuôi cũng nhƣ dễ dàng điều khiển có định hƣớng nguồn enzyme hoặc gia tăng lƣợng enzyme. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật nên dễ dàng áp dụng các phƣơng pháp sinh học phân tử để tạo ra những chủng mới mang những đặc điểm nổi bật mà các đối tƣợng động vật, thực vật ít áp dụng nhƣ gây đột biến nhân tạo. Trong vi sinh vật, rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase. Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lẫn kị khí đều có khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase nhƣ Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. pumilis (Gordon et al.,1973), Acidothermus cellulobuticus (Bergquist et al., 1999, Nguyễn Lan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Hƣơng and Hoàng Đình Hòa, 2003). Ngoài ra còn có các loài ƣa kiềm nhƣ Cephalosporium sp. RYM-202 (Kang and Rhee, 1995). Các nhóm xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces griseus (Nguyễn Đức Lƣợng and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999, Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005) và Streptomyces reticuli cũng có khả năng tổng hợp mạnh enzyme. Các loại nấm mốc thuộc chi Aspergillus nhƣ A.niger (Coral et al., 2002, Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Omojasola and Jilani, 2008), A. candidus (Hong et al., 2001, Milala et al., 2009), A. flavus (Ojumu et al., 2003), A. fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996), A. oryzae và các chủng Trichoderma (Claeyssens et al., 1989, de la Mata et al., 1992, Cao Cƣờng and Nguyễn Đức Lƣợng, 2003) đều có khả năng sinh enzyme. Các nhóm thuộc chi Penicillium (Claeyssens et al., 1989, Bhat et al., 1990, Trịnh Đình Khá, 2006, Chinedu et al., 2008) cũng có khả năng tổng hợp enzyme cao. 1.2.2. Phân loại enzyme 1.2.2.1. Phân loại theo hội đồng danh pháp quốc tế Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase (EC 3.2.1.4) là một trong ba dạng enzyme của hệ cellulase, thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết -1,4-glucoside bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose (Chellapandi et al., 2008). Dựa trên đặc tính cấu trúc, endo-β-1,4-glucanase đƣợc gọi là endoglucanase hoặc 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4). Endo-β-1,4-glucanase thuộc vào dạng 1 của phức hệ celulase. Dạng 2 là exoglucanase, gồm 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase (giống nhƣ cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobio Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 hydrolase) (EC 3.2.1.91). Dạng 3 là -glucosidase hoặc -glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose (cellobiohydrolase) (Lee et al., 2002). 1.2.2.2. Phân loại theo đặc điểm phân tử Endo-β-1,4-glucanase đƣợc phân chia dựa vào đặc điểm phân tử nhƣ khối lƣợng phân tử, điểm đẳng điện và cấu trúc tinh thể. Dựa theo đặc tính và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do, nhóm enzyme thủy phân cellulose đƣợc chia làm 3 nhóm là Cel-1, Cel-2 và Cel-3. Trong đó Cel-1 và Cel-3 là endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có khối lƣợng là 62 kDa và 34 kDa. Cel-1 và Cel-3 có trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do là QQVGTTADAH và QELAQYDSAS. Trình tự amino acid của Cel-1 giống với endo-β-1,4-glucanase CelB, là enzyme thuộc họ 7 cellulase và có độ tƣơng đồng 72% với cellobiohydrolase I và exo-cellobiohydrolase I. Trình tự amino acid của Cel-3 có độ tƣơng đồng 90% với endo-β-1,4-glucanase CelA, là enzyme thuộc họ 12 cellulase. Khối lƣợng phân tử của Cel-1 và Cel-3 giống với CelB và CelA. Cel-2 là β-glucosidase (EC 3.2.1.21) có khối lƣợng phân tử là 120 kDa và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do của Cel-2 chƣa đƣợc xác định (Yamane et al., 2002). Khi nghiên cứu trên A. niger về hai gene mã hóa cellobiohydrolase (CbhA và CbhB) (Gielkens et al., 1990) cho thấy, cả hai enzyme này đều thuộc nhóm 7 của glycosyl hydrolase (GH7); trong đó CbhB bao gồm cấu trúc cellulose-bindingomin (CBD) với sự xúc tác riêng bởi các amino acid giàu liên kết peptide; còn CbhA chỉ gồm sự xúc tác, thiếu CBD và liên kết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 peptide. Sự phiên mã của gene CbhA và CbhB đƣợc cảm ứng bởi D-xylose. Ở chủng A. kawachi, (Hara et al., 2003) đã phát hiện ba gene mã hóa endoglucanase là cel5A, cel5B và cel61A. Trong đó, cel5A và cel61A có liên kết CBD1; còn cel5A và cel5B thuộc glycosyl hydrolase nhóm 5 (GH5), cel5B có cấu trúc rất giống cel5A, nhƣng thiếu CBD1 và sự liên kết. Cel5A gồm 4 đoạn intron, cel5B gồm 5 đoạn intron, còn cel61A thuộc nhóm GH61 không có intron. Dựa vào cấu trúc bậc một cơ bản, phức cellulase đƣợc chia làm 6 họ là A, B, C, D, E và F (Henrissat et al., 1989). Dựa vào trung tâm xúc tác phức cellulase đƣợc chia ra làm 9 họ A, B, C, D, E, F, G, H và I (Gilkes et al., 1991). Hiện nay, cellulase đƣợc xếp thành 12 họ khác nhau là 5, 6, 7, 8, 9, (10), 12, 44, 45, 48, 61 và 74. Trong đó, họ 9 chứa cellulases của vi khuẩn (hiếu khí và kỵ khí), nấm, thực vật và động vật (protozoa và mối); họ 7 gồm hydrolase nấm và họ 8 gồm hydrolase vi khuẩn (Lee et al., 2002). 1.3. CẤU TRÚC Endo-β-1,4-glucanase đƣợc tạo ra từ các loài khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau. Endo-β-1,4-glucanase từ nấm A. oryzae có khối lƣợng phân tử khoảng 34 kDa và 62 kDa (Yamane et al., 2002), chủng A. oryzae KBN616 là 31 kDa và 53 kDa (Kitamoto et al., 1996), chủng Trametes hirsuta khoảng 40,6 kDa (Nozaki et al., 2007), chủng A. terreus M11 khoảng 25 kDa (Gao et al., 2008). 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất Nghiên cứu của Nozaki và cs (2007) cho thấy, endo-β-1,4-glucanase thuộc họ 5 (GH 5) chứa CBM ở đầu nitơ, có trọng lƣợng phân tử khoảng 44 kDa và đƣợc gọi là ThEG. ThEG từ chủng Trametes hirsuta là một chuỗi polypeptide có chứa 384 amino acid và có độ tƣơng đồng cao với En-1 từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 chủng Irpex lacteus (73%); EG từ chủng Humicola grisea (46%) và EglB từ chủng A. niger (49%). Ở chủng A. oryzae KBN616, Kitamoto và cs (1996) đã nhân dòng phân tử, tinh sạch và mô tả đặc điểm của 2 gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase là CelA và CelB. Gene CelA gồm 877 pb với 2 đoạn intron. Protein do CelA mã hóa gồm 239 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase H. Gene CelB chứa 1248 bp không chứa đoạn intron. Protein do CelB mã hóa gồm 416 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase C. Sau khi tinh sạch, protein của CelA và CelB có khối lƣợng phân tử khoảng 31 kDa và 53 kDa. Ở chủng nấm chịu nhiệt Humicola grisea, (Sandgren et al., 2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A, enzyme này thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo nên các chuỗi α, β và các vùng nối. 1.3.2. Cấu trúc không gian Phân tử Cel12A đƣợc cấu tạo bởi 15 chuỗi β tạo thành 2 phiến gấp nếp β là A và B. Phiến A gồm 6 chuỗi β (A1-A6) và phiến B gồm 9 chuỗi β (B1-B9). Hai phiến này xếp chồng lên nhau thành hình bánh kẹp. Bề mặt lõm của phiến B tạo nên khe dài 35 Å để liên kết với cơ chất, khe này chạy dọc bề mặt của enzyme. Trung tâm hoạt động của enzyme là hai gốc glutamyl 120 và 205 ở chủng H. grisea. Sáu gốc phía ngoài phân bố phía trên phân tử giống nhƣ gài các amino acid tự do. Hai trong số các gốc đó nằm ở đầu nitơ. Các dải xoắn β đƣợc nối với nhau bởi các vùng nối, có 4 vùng nối với các gốc từ 29-32, 40-47, 92-96 và 165-169; các vùng này nối tiếp tƣơng ứng với chuỗi β: B2 đến A2, A2 đến A3, A5 đến B5 và A6 đến B7. Ba gốc cysteine là C175, C206 và C216 đƣợc định vị trên chuỗi β là A6, B4 và A4. Các chuỗi bên tập Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 trung trong lõi giữa hai phiến β, nơi mà bề mặt xúc tác đƣợc tăng lên (Hình 1.1). Gốc cysteine 175 nằm ở chuỗi β A6 trên phiến nhỏ A và tạo ra mấu lồi ở bề mặt của enzyme gần cấu trúc xoắn α. Chuỗi bên ở trong lõi giữa hai phiến β, liên kết với 6 amino acid T85, T123, A144, F175, I177 và F180 bằng lực vanderval. Liên kết giữa các amino acid có kích thƣớc từ 3,5 đến 4,1 Å (Hình 1.2A). Gốc cysteine 206 nằm gần trung tâm xúc tác Glu 205 trên chuỗi B4. Đầu của chuỗi bên ở lõi phiến β, nơi có hệ thống tƣơng tác chặt chẽ với các chuỗi bên của 8 gốc Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 và T204; cùng với sự tách rời giữa các nguyên tử trong chiều dài từ 3,3-4,9 Å (Hình 1.2B). Gốc cysteine 216 nằm trên chuỗi A4 ở phiến A, phiến này làm tăng bề mặt xúc tác của enzyme. Gốc cysteine này có chuỗi bên trong vùng lõi bên dƣới điểm hoạt động, nơi tƣơng tác với chuỗi bên của 5 gốc W48, V87, W89, F214 và F219 có kích thƣớc từ 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.2C). Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. Grisea (Sang et al., 2003) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. Grisea 1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC Endo-β-1,4-glucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Tuy nhiên, để thủy phân cellulose thành glucose thì cần có sự hiệp đồng của các dạng enzyme trong phức hệ cellulase. Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase sẽ thủy phân phân tử có liên kết β-1,4-glucosidie theo những cách khác nhau. Ban đầu, endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các liên kết 1,4-β-glucan của sợi cellulose để tạo nên các phần tử nhỏ hơn (sợi cellobiose). Sau đó các sợi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 này sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải phóng ra glucose (Lee et al., 2002) (Hình 1.3). Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase (Lee et al., 2002) Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase cùng các enzyme khác nhƣ exo-β-1,4- glucozidase (cellobiase) sẽ tham gia thủy phân cellulose theo cơ chế ban đầu endo-β-1,4-glucanase tác động vào vùng vô định hình trên phân tử cellulose và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó, exo-β-1,4-glucosidase sẽ cắt từng đoạn cellobiose. Kết quả tạo ra các cello oligosacharide mạch ngắn, cellobiose và glucose. Các cellobiase sẽ thủy phân tiếp tạo thành glucose (Hình 1.4). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase 1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae A. oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002). Bào tử của A. oryzae có màu vàng hoa cau, không chứa độc tố aflatoxin. A. oryzae tiết ra môi trƣờng các enzyme thủy phân nhƣ cellulase, pectinase, xylanase và hemicellulase khi sống trên môi trƣờng có nguồn cơ chất tƣơng ứng cellulose, pectin, xylan và hemicellulose. Nên A. oryzae đã đƣợc ứng dụng rất rộng rãi trong quá trình sản xuất, chế biến đồ ăn và trong công nghiệp sản xuất các enzyme. Ở Nhật Bản A. oryzae đƣợc sử dụng trong quá trình sản xuất thức ăn nhƣ xì dầu, rƣợu sakê và trong công nghiệp sản xuất enzyme nhƣ amylase, protease, hemicellulose, cellulase, oxidoreductase, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 lipase, phytase và pectinase. Ở Việt Nam A. oryzae đƣợc sử dụng chủ yếu trong quá trình làm tƣơng. Năm 2001, bộ gene di truyền của A. oryzae đã đƣợc phân tích và giải mã. Hệ gene gồm 8 nhiễm sắc thể với 12 ngàn gene và 37 triệu cặp base (Galagan et al., 2005, Machida et al., 2005) (Hình 1.5). Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. Oryzae (Machida et al., 2005) 1.6. Ứng dụng Với khả năng thủy phân liên kết β-glucoside, endo-β-1,4-glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành công nghiệp khác nhau nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ, hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh. 1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lƣợng cao các chất khó tan là lignin và một phần Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn. Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lƣợng cho quá trình nghiền cơ học. Trƣớc khi nghiền hóa học, gỗ đƣợc xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin. Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần đƣợc tẩy mực trƣớc khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã đƣợc dùng để tẩy trắng mực in trên giấy. Kỹ thuật này mở ra triển vọng đầy hứa hẹn trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy (Đặng Thị Thu et al., 2004). 1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm Trong quá trình sản xuất các loại nƣớc quả và nƣớc uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ bỏ hạt đƣợc nghiền, thu đƣợc thịt quả nghiền có dạng dịch nhuyễn. Từ thịt quả nghiền đã ép bã thu đƣợc dịch quả. Dịch này thƣờng chứa các thành phần tế bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao. Để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nƣớc quả và giảm bớt một số công đoạn, việc bổ sung endoglucanase rất quan trọng. Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa. Sự kết hợp của glucanase và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào. Trong quá trình sản xuất, ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của nƣớc quả có thịt sẽ tốt hơn. Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase đã đƣợc sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 giảm lƣợng diacetyl đƣợc tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia. Trong dịch lên men có chứa một lƣợng β-glucan, chất này ảnh hƣởng tới khả năng lọc và gây đục cho bia (Đặng Thị Thu et al., 2004). Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp khô, phƣơng pháp này cho chất lƣợng cà phê không cao. Để tiến hành nâng cao chất lƣợng cà phê, phƣơng pháp lên men đã đƣợc áp dụng. Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly trích dịch quả. Trong khâu bóc vỏ, cellulose gây hiện tƣợng thẫm mầu, làm giảm chất lƣợng sau khi sấy, đồng thời cản trở cho việc bóc vỏ. Khi sử dụng chế phẩm A. niger có tên thƣơng mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho thấy số lƣợng cà phê đƣợc bóc vỏ tăng, hạt cà phê đƣợc bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt nhƣ hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao. Trong quá trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% (Nguyễn Đức Lƣợng, 2003). 1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi Nguồn thức ăn cung cấp năng lƣợng cho gia súc và gia cầm chủ yếu là ngũ cốc và phụ phẩm của ngũ cốc. Ngoài protein, lipit, chất dinh dƣỡng cung cấp năng lƣợng chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate. Trong đó, các polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside. Các chất này làm tăng độ nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột hấp thụ các chất dinh dƣỡng. Các chất này có trong vách tế bào thực vật, ngăn trở các enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dƣỡng nhƣ protein, tinh bột và lipit có trong bào chất, từ đó cản trở sự tiêu hóa, hấp thụ các chất dinh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 dƣỡng này. Bổ sung β-glucanase trực tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật. Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu cellulose nhƣ rơm, rạ, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang đƣợc triển khai ở nhiều nƣớc, trong mọi lĩnh vực nhƣ sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc. Trong lĩnh vực này, nấm sợi thƣờng đƣợc sử dụng lên men các nguồn phế thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lƣợng các amino acid cân đối, các vitamin và tạo hƣơng thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi (Đặng Thị Thu et al., 2004, Vũ Duy Giảng, 2009). 1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ Trong giai đoạn đƣờng hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá hủy thành tế bào nhƣ cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lƣợng đƣờng tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rƣợu tăng lên 1,5% (Đặng Thị Thu et al., 2004). 1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trƣờng dẫn tới mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trƣờng sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con ngƣời. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trƣờng rất có hiệu quả. Hiện nay, có rất nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải. Sau khi nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣa nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải (Lý Kim Bảng et al., 1999) đã tuyển chọn đƣợc 3 chủng xạ khuẩn, 4 chủng vi khuẩn ƣa nhiệt trong bể rác thải có khả năng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 phân giải cellulose mạnh. Đặng Minh Hằng (1999) cũng phân lập đƣợc 2 chủng nấm có khả năng phân giải cellulose mạnh và đã tối ƣu đƣợc các điều kiện nuôi cấy 2 chủng nấm đó nhằm nâng cao khả năng tổng hợp cellulase. Hai mƣơi chủng xạ khuẩn, 40 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose đã đƣợc phân lập và khi bổ sung các chủng đó vào bể ủ sẽ rút ngắn thời gian ủ 5-7 ngày (Nguyễn Lan Hƣơng et al., 1999). 192 chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose đã đƣợc phân lập và thuần khiết từ các mẫu đất rác, rơm mục, gỗ mục; trong đó số chủng có khả năng phân giải cellulose rất mạnh chiếm 42% (Phạm Thị Ngọc Lan et al., 1999). Nguyễn Lan Hƣơng và Hoàng Đình Hòa (2003) cũng đã phân lập đƣợc 15 chủng Bacillus có hoạt tính CMCase từ các mẫu rác sinh hoạt chứa cacboxymetyl cellulose. Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã đƣợc nghiên cứu và sản xuất. Chế phẩm Micromix 3 đƣợc tạo ra bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải cellulose cao đã đƣợc bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí sẽ rút ngắn đƣợc thời gian ủ 15 ngày, giảm một nửa thời gian lên men, đồng thời lƣợng mùn tạo thành cũng cao hơn 29% và các chất dinh dƣỡng cao hơn 10% so với bể đối chứng (Lý Kim Bảng et al., 1999). Phức hệ cellulase đƣợc sử dụng để xử lý nguồn nƣớc thải do các nhà máy giấy thải ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao). Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định tới chất lƣợng, số lƣợng giấy là cellulose. Vì vậy, nƣớc thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xƣởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao (Trần Đình Toại and Trần Thị Hồng, 2007). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE Nấm sợi A. oryzae chủ yếu sống hoại sinh phân giải nguồn cơ chất trong môi trƣờng nơi chúng sống dựa vào hệ enzyme ngoại bào do chúng tiết ra để sinh trƣởng và phát triển. Tốc độ tiết enzyme phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, pH, nguồn carbon và nguồn nitrogen. 1.7.1. Nguồn carbon Tùy loài vi sinh vật mà nguồn carbon đƣợc sử dụng để sinh endo-β-1,4- glucanase là khác nhau, có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài lại thích hợp với nhiều nguồn carbon. Nguồn carbon có thể là các loại carbohydrate đơn giản nhƣ đƣờng đơn, đƣờng đôi hoặc phức tạp nhƣ tinh bột, cellulose, xylan. Nguồn carbon phức tạp này thƣờng tồn tại ở hầu hết các sản phẩm, phế phẩm nhƣ trấu cám, vỏ quýt, sơ dừa, lõi ngô, bã mía, vỏ cà phê, mùn cƣa. Những chất này thƣờng đƣợc sử dụng làm nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase. Kawamori và cs (1987) khi nghiên cứu trên chủng Thermoascus aurantiacus A-131 và Thermoascus reese QM 9414 cho thấy Avicel là nguồn carbon thích hợp nhất để chủng T. reese QM 9414 sinh tổng hợp CMCase, tiếp đến là bã mía, cellulose, lactose, CMC và xylan. Trong khi lõi ngô và xylan lại là nguồn carbon thích hợp cho chủng T. aurantiacus A-131 sinh tổng hợp CMCase (Kawamori et al., 1987). Nguồn phế phẩm từ quả cam ngọt (vỏ, cùi) đã đƣợc sử dụng làm nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh cellulase ở chủng A. niger, T. longi và Saccharomyces cerevisae (Omojasola and Jilani, 2008). Các loài Penicillium pinophilum, P. persicium, P. brasilianum sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự nhiên, còn đối với nguồn carbon là xylan hoặc birchwood xylan thì khả năng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 sinh tổng hợp cellulase rất kém (Henning et al., 2005). Lê Thị Thanh Xuân và cs (2005) khi nghiên cứu chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces cho thấy chúng sinh trƣởng mạnh nhất trên nguồn carbon là glucose và tinh bột, nhƣng nguồn carbon thích hợp để chủng sinh tổng hợp cellulase là cellulose và CMC. Trịnh Đình Khá (2006), khi nghiên cứu chủng Penicillium sp. DQT- HK1 cho thấy, chủng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trên nguồn carbon là rơm với nồng độ 0,6%. 1.7.2. Nguồn nitrogen Nguồn nitrogen ảnh hƣởng mạnh tới tốc độ tiết enzyme của các loài vi sinh vật. Nguồn nitrogen tồn tại ở dạng vô cơ nhƣ urea, ammonium sulfate, natri nitrate và ở dạng các hợp chất hữu cơ cao phân tử nhƣ cao thịt, cao thịt bò, bột đậu tƣơng, bột cá hay peptone. Tùy loài vi sinh vật mà nguồn nitrogen đƣợc sử dụng là khác nhau. Đa số các loài có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ, tuy nhiên mức độ đồng hóa từng loại nitrogen để sinh enzyme lại phụ thuộc vào từng loài. Tang và cs (2004) khi tối ƣu điều kiện nuôi cấy chủng B. subtilis nhận thấy nguồn nitrogen vô cơ không thích hợp cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase; còn nguồn nitrogen là cao nấm men và bột đậu tƣơng rất thích hợp cho khả năng sinh enzyme (Tang et al., 2004). Nguồn nitrogen là urea và bột đậu tƣơng ảnh hƣởng mạnh mẽ tới quá trình tổng hợp cellulase của chủng A. niger NRRL-363 (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003); Acharya và cs (2008) khi nghiên cứu trên chủng A. niger cho thấy peptone, ammonium sulfate và urea là nguồn nitrogen thích hợp cho chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase. Ở một số chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt nguồn nitrogen vô cơ là KNO3 thích hợp cho tổng hợp cellulase mạnh nhất (Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005). Bột đậu tƣơng là nguồn nitrogen thích hợp cho chủng Penicillium sp. DQT-HK1 sinh tổng hợp cellulase (Trịnh Đình Khá, 2006). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ ảnh hƣởng sâu sắc tới quá trình sống của vi sinh vật nói chung và của nấm mốc nói riêng. Mỗi loài vi sinh vật thích nghi với một vùng nhiệt độ khác nhau, căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ, các loài vi sinh vật đƣợc chia làm 3 nhóm là nhóm vi sinh vật ƣa lạnh và chịu lạnh; nhóm vi sinh vật ƣa ấm và nhóm vi sinh vật chịu nhiệt. Các loài ƣa lạnh sinh trƣởng đƣợc trong điều kiện nhiệt độ dƣới 15°C; các loài ƣa ấm sinh trƣởng và phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20-37°C. Các loài chịu nhiệt sinh trƣởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50°C. Khi nghiên cứu các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase cho thấy, ở chủng vi khuẩn B. subtilis nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme là 37°C (Tang et al., 2004). Đối với các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt thì nhiệt độ thích hợp để các chủng này sinh enzyme cao từ 45-55°C (Nguyễn Lan Hƣơng et al., 1999, Tăng Thị Chính et al., 1999). Ở các chủng nấm mốc nhiệt độ thích hợp để sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase nằm trong khoảng từ 28-50°C (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Ojumu et al., 2003, Narasimha et al., 2006, Omojasola and Jilani, 2008). Chủng Penicillium sp. DQT-HK1 sinh tổng hợp cellulase tối đa ở nhiệt độ 30°C (Trịnh Đình Khá, 2006). 1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng pH môi trƣờng ảnh hƣởng rất lớn tới khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Mỗi loài vi sinh vật có pH nuôi cấy khác nhau phù hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme. pH thích hợp cho mỗi loài có thể là acid, trung tính hay kiềm. pH thích hợp đối với các chủng vi khuẩn ƣa ấm sinh tổng hợp cellulase là 6,5-7,0 và pH tối ƣu là 7,0; còn các chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt là 7,0-7,5 và pH tối ƣu là 7,5 (Trần Đình Toại et al., 2008). Chủng Bacillus sinh tổng hợp mạnh nhất ở pH 7,5. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 cellulase mạnh trong môi trƣờng có pH ban đầu là 8,0 (Tăng Thị Chính et al., 1999). Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus lại thích hợp ở pH trung tính (Nguyễn Đức Lƣợng and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999). Các chủng nấm Aspergillus lại thích hợp trong khoảng pH từ 4,5-6,0 (Đặng Minh Hằng, 1999, Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Trịnh Đình Khá, 2006, Omojasola and Jilani, 2008). 1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME Mỗi loại enzyme đƣợc tổng hợp từ các loài khác nhau có cấu trúc và hoạt tính sinh học khác nhau. Nhiệt độ, pH, các dung môi hữu cơ, chất tẩy rửa hay các ion kim loại có ảnh hƣởng rất lớn tới hoạt tính của enzyme. 1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chƣa ảnh hƣởng đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp và khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50°C. Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt độ giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dƣới 0°C hoạt độ của enzyme giảm nhiều nhƣng lại có thể phục hồi khi đƣa về nhiệt độ thích hợp. Endo-β-1,4-glucanase gồm Cel 1 và Cel 3 từ chủng A. oryzae hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ lần lƣợt là 50C và 60C (Fukuda et al., 2002). Endo-β- 1,4-glucanase gồm Cel A và Cel B từ chủng A. oryzae KBN616 có hoạt tính mạnh nhất ở nhiệt độ lần lƣợt là 55C và 45C (Kitamoto et al., 1996). Endoglucanse III từ Trichoderma reesei có hoạt tính tối đa đạt 55C (Macarron et al., 1993), nhiệt độ tối ƣu của -glucosidase từ chủng Trichoderma reesei QM 9414 và chủng Trametes hirsuta là 50C (de la Mata et al., 1992, Nozaki et al., 2007). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 1.8.2. Ảnh hƣởng của pH Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH môi trƣờng, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của các ion H+ và OH- cũng ảnh hƣởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các enzyme mà pH thích hợp có thể là trung tính, kiềm hoặc là acid. Endo-β-1,4-glucanase do các loài khác nhau có pH tối ƣu khác nhau. Theo những nghiên cứu trƣớc đây, pH thích hợp để endo-β-1,4-glucanase của chủng A. niger NRRL-363 hoạt động mạnh nhất là 5,5 (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003). Endo-β-1,4-glucanase của Chủng Trametes hirsuta là 5,0 và chủng A. oryzae gồm Cel-1 và Cel-3 lần lƣợt là 3,5 và 4,5 (Fukuda et al., 2002). CMCase của A. niger Z10 hoạt động ở dải pH rộng từ 3,0-9,0 và hoạt động mạnh nhất ở pH 4,5 và 7,5 (Coral et al., 2002). 1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại Các ion kim loại làm biến đổi vận tốc phản ứng của enzyme, chúng có thể kích thích hoặc ức chế hoạt động của enzyme. Một số ion kim loại có khả năng liên kết phối trí với các nguyên tử oxy hoặc nguyên tử nitơ của nhóm cacboxyl, amine hoặc peptide của các enzyme, làm cho trung tâm hoạt động của enzyme có độ bền rất lớn; đồng thời các ion kim loại này tạo ra một dạng thuận lợi cho enzyme hoặc làm cho enzyme kết gắn đƣợc với cơ chất. Do đó tốc độ thủy phân của enzyme đƣợc tăng lên. Các ion kim loại nặng ở nồng độ gây biến tính có thể kìm hãm không thuận nghịch hoạt độ của enzyme. Theo những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, các ion kim loại nhƣ Cu2+; Hg2+, Ag+ ức chế mạnh hoạt tính của các enzyme nhƣ xylanase, endoglucanase, mannanase, protease, cellulase (Nguyễn Thị Thảo, 2005, Trịnh Đình Khá, 2006, Đỗ Thị Tuyên et al., 2008, Gao et al., 2008). Trong khi đó ion Ca2+ làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp. D04 lên 40% so với đối chứng, Mg2+ làm giảm nhẹ hoạt tính (chỉ đạt 92%) và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính so với

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfTuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó.pdf