Xác định thành phần hóa học trên cao clorofom của cây Lược vàng_Callisia fragrans (Lindl.) Woodson

TÓM TẮT Cây Lược vàng có tên khoa học là Callisia fragrans (Lindl) Woodson, thuộc họ Thài lài (Commelinaceae). Cây Lược vàng có xuất xứ từ Trung và Nam Mỹ, bắt đầu được trồng làm cảnh ở Nga từ hơn 100 năm trước. Năm 2007, Lược vàng di thực từ Nga sang Việt Nam dưới hình thức là cây cảnh, lúc đầu ở Thanh Hóa, giờ đây cây Lược vàng đã nhanh chóng lan ra các tỉnh thành khác trong cả nước. Từ 2007 đến nay Lược vàng được người dân xem như là một thần dược, có tác dụng chữa được nhiều chứng bệnh từ thông thường đến nan y. Tuy nhiên người dân chỉ sử dụng theo kinh nghiệm hoặc dựa vào các bản dịch từ tiếng Nga sang. Cho đến nay chỉ có một số tài liệu công bố về thành phần hóa học của cây Lược vàng. Trong đó, có những kết quả không giống nhau, như công bố của viện dược liệu Việt Nam thì trong cây Lược vàng có chứa thành phần flavonoid là kaempferol và quercetin, nhưng theo nghiên cứu mới đây của Đại học Dược Hà Nội thì xác nhận là tuy có flavonoid nhưng không có 2 loại chất này. Tại An Giang, hiện nay vẫn chưa có tài liệu nào nghiên cứu về cây này. Nhằm kiểm tra xem cây Lược vàng được trồng tại địa phương ra sao, cùng với khoảng thời gian ngắn nên tôi chỉ tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cây Lược vàng trên cao trích clorofom. Qua quá trình thực nghiệm, sau khi tiến hành trích li và cô lập các chất hữu cơ trong phân đoạn cao trích clorofom. Tôi đã cô lập được một hợp chất ở phân đoạn M3 của cao trích này, chất này có dạng tinh thể hình kim màu trắng, sắc kí bản mỏng (hệ giải ly hexan: etyl axetat[7:3], hiện hình bằng H2SO4 đặc) cho một vết màu nâu tím với giá trị Rf=0,65, lúc đầu tạm đặt tên là MC5, sau đó nhờ ứng dụng các phương pháp vật lý (phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR) chúng tôi đề nghị hợp chất này là hỗn hợp của [IMG]file:///C:/DOCUME%7E1/Xp3/LOCALS%7E1/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image001.gif[/IMG]-Sitosterol và stigmasterol. Hi vọng trong tương lai, nếu có điều kiện tôi sẽ tiến hành khảo sát kĩ hơn và sử dụng cột sắc kí lớn hơn, để quá trình phân lập được lượng chất nhiều hơn tiện lợi cho việc tiến hành khảo sát tiếp theo. PHẦN I MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài: Từ thời xa xưa đến nay cha ông ta đã biết cách sử dụng những loại thảo mộc khác nhau để chữa một số bệnh thông thường, vừa không mất tiền vừa có thể trồng ngay tại vườn nhà để sử dụng. Vào năm 2007 đến nay dân gian xem cây Lược vàng như là một thần dược trị bách bệnh như: viêm răng, lợi, viêm họng, mụn nhọt, dị ứng, đến những bệnh nan y như ung thư, tiểu đường, tim mạch, Vấn đề đặt ra là phải nghiên cứu rõ hơn về cây Lược vàng, đặc biệt là thành phần hóa học của nó để xác định xem thật sự nó có tác dụng như dân gian truyền miệng không. Tuy nhiên, cho đến nay ngoài những bản dịch về kinh nghiệm chữa trị của cây Lược vàng từ tiếng Nga sang tiếng Việt thì ở Việt Nam chỉ có một số tài liệu nghiên cứu khoa học công bố về thành phần hóa học của cây Lược vàng. Trong số những nghiên cứu được công bố này, việc đưa ra thành phần hóa học một cách định tính về cây Lược vàng cũng có những điểm không giống nhau. Như công bố của viện dược liệu Việt Nam thì trong cây Lược vàng có chứa thành phần flavonoid là kaempferol và quercetin, tuy nhiên theo nghiên cứu mới đây của Đại học Dược Hà Nội thì xác nhận là tuy có flavonoid nhưng không có 2 loại chất này. Điều khác biệt này được cho là cây Lược vàng được trồng ở những nơi khác nhau, điều kiện sống khác nhau sẽ có thành phần hóa học khác nhau. Bên cạnh đó, tại An Giang hiện nay vẫn chưa có một công trình nào nghiên cứu trên cây này. Với những lí do trên, nhằm kiểm tra xem thành phần hóa học của cây Lược vàng trồng ở địa phương ra sao, cùng với điều kiện của phòng thí nghiệm Hoá học – Trường ĐHAG, và trình độ của bản thân, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định thành phần hóa học trên cao clorofom của cây Lược vàng_Callisia fragrans (Lindl.) Woodson” được trồng tại xã Lương Phi, huyện Tri Tôn, tỉnh An Giang. 2. Khách thể nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu: - Khách thể nghiên cứu: cây Lược vàng được trồng tại xã Lương Phi, huyện Tri Tôn, tỉnh An Giang. - Đối tượng nghiên cứu: thành phần hóa học trên cao clorofom của lá cây Lược vàng. 3. Mục đích và nhiệm vụ của đề tài: 3.1. Mục đích của đề tài: - Góp phần tìm hiểu thêm thành phần hóa học của cây Lược vàng, nhằm tìm hiểu thêm những công dụng của cây Lược vàng trong y học và đời sống. - Góp phần tìm hiểu quy trình trích ly, cô lập và xác định các chất hữu cơ từ cây Lược vàng, các phương pháp định tính và khảo sát thành phần hóa học của chúng. - Góp phần làm giàu kiến thức về việc nghiên cứu khoa học các hợp chất thiên nhiên. 3.2. Nhiệm vụ của đề tài: - Giới thiệu chung về nguồn gốc, đặc điểm, thành phần hoá học và một vài công dụng của cây Lược vàng. - Tìm hiểu quy trình trích ly các chất hữu cơ trong cây Lược vàng và sau đó tiến hành khảo sát thành phần hóa học trên cao clorofom của cây Lược vàng bằng cách trích ly, cô lập rồi định danh chất cô lập được. - Viết báo cáo các kết quả thực nghiệm. 4. Phạm vi nghiên cứu: 4.1. Về nội dung: Nghiên cứu và lập quy trình trích ly, cô lập các chất hữu cơ trên cao clorofom của cây Lược vàng, khảo sát thành phần hóa học trên phân đoạn cao này. 4.2. Thực nghiệm: Tiến hành trích ly, cô lập và khảo sát trong điều kiện của phòng thí nghiệm, trường ĐHAG. 5. Phương pháp nghiên cứu: 5.1. Về lý thuyết: - Tìm hiểu, phân tích và tổng hợp các tài liệu từ sách, báo, tạp chí khoa học chuyên ngành, mạng internet, từ đó so sánh, đối chiếu và rút ra những vấn đề có liên quan đến đề tài nghiên cứu. - Tìm hiểu các đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của cây Lược vàng. Tìm hiểu quy trình trích ly và cô lập các chất hữu cơ. 5.2. Thực nghiệm: - Tiến hành trích ly các chất hữu cơ trong cây Lược vàng, tạo cao clorofom từ các hoá chất và dụng cụ của phòng thí nghiệm. - Tiến hành phân lập các chất hữu cơ trong phân đoạn cao clorofom bằng sắc kí cột silica gel, sắc kí bản mỏng. - Khảo sát, biện luận cấu trúc hợp chất cô lập được. 6. Đóng góp của đề tài: - Giúp hiểu thêm về tính chất, thành phần hoá học và công dụng cây Lược vàng. - Làm nguồn tài liệu tham khảo cho độc giả quan tâm. 7. Thời gian thực hiện đề tài: Từ ngày 17/11/2010 đến 25/04/2011 8. Dàn ý của khóa luận: PHẦN I: MỞ ĐẦU PHẦN II: NỘI DUNG Chương I: Phần tổng quan I.1. Giới thiệu về họ Thài lài và chi Callisia. I.2. Giới thiệu chung về cây Lược vàng. I.3. Giới thiệu một số nhóm chất thiên nhiên. Chương II: Cơ sở lý thuyết II.1. Cơ sở lý thuyết về phương pháp chiết. II.2. Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc kí. II.3. Quy trình chung trích ly các chất hữu cơ. II.4. Một số phương pháp định tính các nhóm chất thiên nhiên. Chương III: Thực nghiệm III.1. Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ. III.2. Quy trình điều chế các loại cao. III.3. Định tính một số nhóm chất hữu cơ trong cây Lược vàng. III.4. Phân lập các chất hữu cơ trên cao clorofom của cây Lược vàng. III.5. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất cô lập được. PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Phụ lục Tài liệu tham khảo

doc58 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 26/01/2013 | Lượt xem: 3449 | Lượt tải: 5download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Xác định thành phần hóa học trên cao clorofom của cây Lược vàng_Callisia fragrans (Lindl.) Woodson, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
n khai thì điểm chấm này vẫn nằm trên cao khỏi mặt thoáng của dung dịch giải ly chứa trong bình).         Cẩn thận nhẹ nhàng để đầu nhọn của vi quản chạm nhẹ vào bề mặt bản mỏng để không nhìn thấy lỗ bề mặt. Chạm vào và lấy vi quản ra khỏi bề mặt thật nhanh để dung dịch mẫu thấm vào bản tạo thành một điểm tròn nhỏ vì nếu chạm lâu, điểm này sẽ lan to. Thổi nhẹ lên vết chấm để dung môi bay hơi mau không lan thành vết chấm to. Có thể chấm thêm lên ngay vết chấm cũ vài lần nữa để có vết đậm, rõ, đường kính không quá 2 mm. Nên chấm nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ dung dịch mẫu hơn là chấm một lần với lượng lớn mẫu.          Nếu cần chấm cùng lúc nhiều vết chấm lên một bản thì các vết chấm phải cách đáy bản 1cm và cách đều nhau 1cm và cách hai cạnh bên 1cm.       4. Chuẩn bị bình triển khai:         Bình hình khối trụ hoặc khối chữ nhật, có đường kính lớn hơn bề ngang bản mỏng một ít. Đặt một tờ giấy lọc bao phủ mặt trong của bình nhưng vẫn chừa một khoảng để có thể quan sát bên trong. Tính toán lượng dung môi giải ly sao cho khi vào bình, lớp dung môi sẽ dày khoảng 0,5 – 0,7 cm.         Cho dung môi giải ly vào bình, để yên 5-10 phút để bảo hòa hơi dung môi trong bình (nhờ tờ giấy lọc).         Bản mỏng được cầm thẳng đứng và được nhúng vào dung môi trong bình, khi nhúng vào phải cẩn thận để 2 cạnh bên của bản không chạm vào thành bình; lúc đó, vị trí của các vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,5cm.          Đậy nắp bình, dung môi sẽ được hút lên bản bởi lực hút mao dẫn. Theo dõi khi mực dung môi lên đến vạch tiền tuyến dung môi đã được vạch sẵn trước đó (cách đầu bản 0,5cm) thì lấy bản ra khỏi bình. Sấy nhẹ bản bằng máy sấy. Quan sát bằng mắt và dùng viết chì khoanh nhẹ các vết thấy được. Còn nếu không thấy gì trên bản, có thể nhìn dưới đèn tử ngoại (UV), bằng hơi iod hoặc phun bản với các thuốc hiện hình thích hợp.       5. Cách hiện hình vết sắc ký để xác định Rf:           Sau khi kết thúc quá trình sắc ký người ta phải tiến hành việc làm hiện hình vết sắc ký bằng phương pháp hóa học hoặc vật lý.           Khi làm hiện hình bằng phương pháp hóa học người ta phun lên bản mỏng một dung dịch thuốc thử có thể tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp thành hỗn hợp màu nhìn rõ bằng mắt thường.           Trong phương pháp vật lý, người ta có thể lợi dụng hiện tượng phát quang với các tia tử ngoại. Người ta dùng một chất chỉ thị phát quang tác dụng được với các cấu tử trong hỗn hợp. Người ta cũng có thể nhận dạng vết sắc ký bằng phương pháp phóng xạ.        6. Phân tích định tính:            Quá trình đồng nhất các chất (định tính) sẽ khá đơn giản khi vết sắc kí có màu đặc trưng hoặc có thể dùng các biện pháp khác nhau để hiện hình. Tuy nhiên số loại hợp chất như vậy, nhất là với các chất hữu cơ, không nhiều lắm.             Điểm xuất phát chung nhất cho phân tích định tính là dựa vào giá trị Rf vì đây là đặc trưng nhạy nhất của các chất. Tuy nhiên Rf lại phụ thuộc nhiều vào điều kiện xác định nó. Người ta có thể vượt qua trở ngại này bằng cách tuân thủ chặt chẽ các điều kiện chuẩn. Để thực hiện được việc đó người ta khống chế kích thước của bản, độ dày của lớp hấp phụ, thể tích mẫu, độ dày của tuyến dung môi và một số yếu tố khác. Khi tuân thủ các điều kiện chuẩn, giá trị Rf sẽ có độ lặp lại cần thiết và có thể dùng để so sánh với các số liệu cho trong các sổ tay, nếu chúng được đo trong cùng điều kiện và đáp ứng được yêu cầu phân tích định tính.             Nhưng phương pháp tin cậy nhất vẫn là phương pháp làm chứng. Theo phương pháp này, tại vạch xuất phát, bên cạnh giọt dung dịch mẫu nghiên cứu, người ta nhỏ một giọt chất tương ứng với thành phần giả thiết có trong mẫu. Do các yếu tố ảnh hưởng đến Rf của các chất như nhau nên sự trùng nhau của Rf của một cấu tử trong mẫu với Rf của các chất làm chứng cho phép kết luận chúng là Rf của cùng một chất. Nếu trong mẫu không có Rf nào trùng với Rf của chất làm chứng thì có nghĩa là trong mẫu không có hợp chất trùng tên với chất làm chứng.             Người ta có thể kết hợp sắc kí bản mỏng với các phương pháp khác. Thí dụ khi kết hợp sắc kí bản mỏng với sắc kí khí, sắc kí bản mỏng có thể trở thành một đetectơ đặc biệt. Khí thoát ra khỏi cột sắc kí, khí hướng vào vạch xuất phát của sắc kí bản mỏng và cho tiến hành quá trình sắc kí bản mỏng theo thủ tục chọn trước.             Kết quả phân tích sắc kí bản mỏng cho kết quả độc lập khi phân tích các chất, điều đó làm tăng độ tin cậy của kết quả phân tích.         7. Phân tích định lượng:             Người ta tiến hành phân tích định lượng các chất theo phương pháp sắc kí bản mỏng trực tiếp trên bản xử lý bằng các biện pháp thích hợp để lấy cấu tử nghiên cứu ra khỏi bản.             Khi xác định trực tiếp các cấu tử theo các vết sắc kí trên bản, người ta phải đo điện tích vết sắc kí, thí dụ đo bằng thước đo milimet và tìm lượng chất nghiên cứu theo đồ thị chuẩn đã lập sẵn.             Người ta cũng có thể tiến hành đo trực tiếp độ đậm của các vết sắc kí trên bản bằng phương pháp quang phổ đo quang nhờ các densitomet. Nồng độ chất nghiên cứu cũng được xác định theo thủ tục của phương pháp đường chuẩn.             Nhưng cách phân tích cho kết quả chính xác nhất vẫn là phương pháp tách chất phân tích ra khỏi bản. Việc tách các chất ra khỏi bản có thể thực hiện được bằng cơ học hay bằng cách rửa với dung môi thích hợp. Sau đó ta tiến hành xác định nồng độ các chất trong dung dịch rửa bằng các phương pháp thích hợp.         8. Ứng dụng của phương pháp sắc kí bản mỏng:           a. Các hợp chất hữu cơ:            Đây là phương pháp dùng để tách hầu hết các hợp chất hữu cơ, quá trình tách thực hiện nhanh, có độ chọn lọc cao. Với các chất chỉ cần có sự khác nhau rất ít về cấu trúc hay cấu hình là có thể thực hiện việc tách chúng ra khỏi nhau bằng phương pháp sắc kí bản mỏng. Phương pháp có thể sử dụng để tách và cô lập các hợp chất họ axit, rượu, alcaloit, amin, aminoaxit, protein và peptit, các chất kháng sinh v.v…Vì vậy phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm, dược học, y học v.v…           b. Các hợp chất vô cơ:            Phương pháp sắc kí bản mỏng được sử dụng để tách các cation, anion vô cơ. Dùng phương pháp sắc kí bản mỏng người ta có thể tách được các hệ cation, anion phức tạp, đặc biệt trong việc phân tích các cation kim loại có tính chất hóa học giống nhau.            Phương pháp sắc kí bản mỏng thường được kết thúc bằng các phương pháp quang phổ đo quang, phương pháp phổ huỳnh quang, các phương pháp điện hóa v.v…Nhờ việc kết hợp này mà độ nhạy, độ chọn lọc của các phương pháp tăng lên nhiều.             Vì các lý do trên đây, phương pháp sắc kí bản mỏng ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của khoa học, công nghệ và đời sống. II.2.7. Sắc kí lỏng dạng cột:[3] II.2.7.1. Đặc điểm chung của sắc kí lỏng dạng cột:            Trong phương pháp sắc kí cổ điển, cột sắc kí thường là những ống thủy tinh đường kính d = 0,5-5 cm và có độ dài l = 20-100 cm nạp đầy chất hấp phụ và pha động.             Pha động chuyển động dưới tác dụng của trọng lực. Tốc độ chuyển động của pha động được điều khiển nhờ van lắp ở phía dưới của cột.             Mẫu phân tích được đưa vào ở phần trên của cột.             Trong phương pháp rửa giải hoặc rửa đẩy, trong quá trình cho dung dịch rửa chạy qua cột sẽ xảy ra sự phân li, tách các cấu tử. Người ta thu thập dung dịch thoát chạy ra khỏi cột trong từng khoảng thời gian xác định, tiến hành phân tích nồng độ các cấu tử bằng các phương pháp thích hợp và xây dựng đồ thị hệ tọa độ: nồng độ cấu tử nghiên cứu C-thể tích dung dịch thoát ra V (đồ thị C-V).             Ngày nay nhờ có các cải tiến về thiết bị như  dạng cột, cách nạp mẫu, chất hấp phụ…người ta đã nhận được các kết quả phân tích có độ nhạy, độ chọn lọc cao hơn và được gọi là phương pháp sắc kí lỏng có hiệu quả cao. Đây là một trong các phương pháp phân tích chính để phân tích các chất hữu cơ.            Pha tĩnh rắn thường dùng là: Silica gel, nhôm oxit, chất hấp phụ biến tính. a.      Silica gel:            Đây là loại pha tĩnh được sử dụng rộng rãi trong dạng sắc kí lỏng-rắn. Silica gel có công thức hóa học là SiO2.xH2O đây chính là axit silixic, thuộc loại chất hấp phụ đặc thù. Sự hấp phụ các chất lên bề mặt các hạt silica gel do sự xuất hiện liên kết hidro giữa phân tử các chất nghiên cứu và bề mặt các hạt silica gel. Nếu liên kết hidro xuất hiện càng nhiều thì các phân tử bị giữ vào các hạt chất hấp phụ càng mạnh.            Trong sắc kí lỏng-rắn người ta thường dùng các loại silica gel với diện tích bề mặt 100-700 m2/g. Silica gel có tính axit (pH =3-5) nên hấp phụ tốt các hợp chất có tính bazơ hơn là các hợp chất có tính axit. Silica gel thường được sử dụng để tách, phân li, các hợp chất: hidrocacbon, rượu, phenol, andehit, axit hữu cơ, amin, lipid, các phức chất, v.v… b.      Nhôm oxit:            Bề mặt các chất hấp phụ nhôm oxit là hợp chất có tính phân cực mạnh (do các ion nhôm và oxi) tạo nên một trường tĩnh điện mạnh. Chất hấp phụ trên cơ sở nhôm oxit hấp phụ mạnh các hidrocacbon không no, các hdrocacbon mạch vòng (là những phân tử có cấu trúc điện tử hỗn tạp) hơn silica gel. c.      Các chất hấp phụ biến tính:            Trong sắc kí lỏng hiệu quả cao người ta thường dùng các chất hấp phụ biến tính trên cơ sở silica gel.            Với chất hấp phụ loại này, cân bằng hấp phụ, giải hấp được thiết lập nhanh hơn silica gel thường, độ lặp lại của kết quả phân tích cao hơn. Các chất hấp phụ thường là các hạt dạng hình cầu có kích thước trong khoảng hẹp và diện tích bề mặt 200-600 m2/g. II.2.7.2. Sắc kí lỏng-rắn:            Phương pháp sắc kí lỏng-rắn trên cột thường được sử dụng để tách và phân tích các hợp chất hữu cơ. Có hai cách sử dụng sắc kí lỏng-rắn: phương pháp sử dụng chất hấp phụ phân cực kết hợp với dung dịch rửa không phân cực (thuận pha) và phương pháp dùng chất hấp phụ không phân cực với dung dịch rửa phân cực (nghịch pha).            Trong phương pháp đầu, thời gian lưu và độ chọn lọc của quá trình tách do liên kết đặc thù (chủ yếu là liên kết hidro) giữa các chất cần tách với pha tĩnh và liên kết không đặc thù (của chất cần tách) với pha động. Khả năng tương tác của các phần hoạt động của phân tử cần tách với tâm hấp phụ của bề mặt pha tĩnh phụ thuộc nhiều vào cấu trúc không gian của chất cần tách. Nhờ vào đặc điểm này, mà người ta có thể thực hiện việc tách các đồng phân bằng phương pháp sắc kí lỏng-rắn trên cột.            Việc tăng các nhóm chức trong phân tử sẽ làm tăng khả năng lưu các chất trên cột do tăng khả năng tạo liên kết hidro giữa các phân tử với chất hấp phụ. Trái lại, khi tăng độ dài của mạch cacbon của nhóm ankyl thì độ lưu sẽ giảm vì khi đó tương tác đặc thù của hệ chất nghiên cứu-chất hấp phụ hầu như không thay đổi mà liên kết không đặc thù của hệ chất rửa- chất nghiên cứu lại tăng. a.      Chọn dung dịch rửa giải:            Trong sắc kí lỏng- rắn việc chọn đúng chất làm dung dịch rửa cũng quan trọng như việc chọn chất hấp phụ. Ở đây có sự cạnh tranh của khả năng tạo liên kết giữa phân tử chất nghiên cứu với pha tĩnh và chất hấp phụ rắn. Thực nghiệm chứng minh khả năng rửa của dung dịch rửa phụ thuộc vào hằng số điện môi của dung môi. Khả năng rửa của dung môi cũng tăng lên một lượng không lớn lắm khi thêm dung môi phân cực mạnh hơn vào dung môi ít phân cực.            Trong trường hợp chất hấp phụ không phân cực, người ta hay dùng nước hoặc hỗn hợp nước-dung môi hữu cơ làm dung dịch rửa. Ở đây, hợp chất nghiên cứu có tương tác không đặc thù với pha tĩnh kị nước. Một trong những cơ chế lưu giữ chất nghiên cứu trên cột là tương tác của mạch cacbon no ưa dung môi của chất hấp phụ với bộ phận không phân cực của phân tử chất nghiên cứu. Các nhóm chức phân cực trong dung dịch rửa có khả năng tạo liên kết hidro với các phân tử nước. Sự tăng số gốc kị nước sẽ làm tăng khả năng tương tác của phân tử chất nghiên cứu với chất hấp phụ không phân cực và làm tăng khả năng lưu.            Sự làm tăng số nhóm chức phân cực sẽ làm tăng tương tác của chất nghiên cứu với pha động do đó làm giảm khả năng lưu giữ chất nghiên cứu trên cột. Thành phần của dung dịch rửa vừa ảnh hưởng đến độ lưu giữ cũng như độ chọn lọc của việc tách các hợp chất trên pha tĩnh không phân cực.            Khi thay đổi dung dịch rửa khác nhau, cân bằng trong sắc kí ngược pha thiết lập nhanh hơn trong sắc kí thuận pha nhiều lần. b.      Ứng dụng:             Phương pháp sắc kí lỏng-rắn thường được sử dụng để phân tích các hợp chất hữu cơ trong công nghệ, các hợp chất hữu cơ như: xác định thành phần trong dầu mỏ, các hidrocacbon, tách các đồng phân cis, trans, v.v… II.3. QUY TRÌNH CHUNG TRÍCH LY CÁC CHẤT HỮU CƠ:             Bột lá khô được trích kiệt bằng cồn (etanol) theo phương pháp ngâm dầm (ở nhiệt độ phòng) hoặc có thể áp dụng thêm các phương pháp hiện đại để tăng cường hiệu suất và giảm thời gian trích ly như: gia nhiệt, sử dụng vi sóng, sử dụng CO2 lỏng ở trạng thái siêu tới hạn,…Sau đó lọc, cất thu hồi dung môi ta được cao etanol toàn phần. Từ cao toàn phần này, tiếp tục tiến hành phân lập các chất hữu cơ bằng cách hòa tan cao trích vào dung môi thích hợp rồi chiết lần lượt bằng các đơn dung môi có độ phân cực tăng dần (hoặc có thể trích pha rắn trên silica gel giải ly bằng các đơn dung môi có độ phân cực tăng dần). Thu hồi các dịch chiết tương ứng, cất thu hồi dung môi để được các loại cao tương ứng. II.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT THIÊN NHIÊN: II.4.1. Định tính Steroid: Có thể thử nghiệm với ống nghiệm hoặc sắc kí bản mỏng.         a. Phản ứng Libermann-Burchard:          - Thử với ống nghiệm: Hỗn hợp 1 ml anhidrid acetic và 1 ml CHCl3 để lạnh ở 00C, rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Cho mẫu vào ở dạng rắn hoặc pha trong clorofom. Phản ứng dương tính là cho màu: xanh dương, lục, đỏ hoặc cam. Màu bền.          - Dung dịch phun xịt bản: Trộn cẩn thận 5 ml anhidrid acetic vào 5 ml H2SO4 đậm đặc. Để nguội, rót 50 ml metanol vào hỗn hợp trên. Phun xịt lên bản mỏng và sấy ở 1100C trong 5 đến 10 phút. Steroid cho màu dương-lục.         b. Phản ứng Rosenheim:          - Thử với ống nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch thử, 2 giọt acid tricloroacetic, nếu dung dịch chuyển sang màu xanh dương. Phản ứng dương tính.          - Dung dịch phun xịt bản: Hòa tan 25 g CCl3COOH trong 100 ml clorofom. Phun xịt lên bản mỏng và sấy bản ở 1000C trong 5-10 phút, quan sát bản dưới đèn UV sẽ thấy xuất hiện vết nếu có steroid.         c. Phản ứng Rosenthaler:          - Thử với ống nghiệm: Cho lần lượt 1 ml dung dịch thử, 2 giọt vanilin 1% trong etanol, thêm 1 giọt HCl đậm đặc, phản ứng dương tính nếu có màu lục hoặc tím.          - Dung dịch phun xịt bản: Hòa tan 1 g vanilin trong 100 ml dung dịch acid ortophosphoric 50% . Phun xịt lên bản mỏng và sấy ở 1200C trong 10-20 phút đến khi hiện vết có màu vàng thì phản ứng dương tính.         d. Phản ứng Salkowski:          Hòa tan 1-2 mg mẫu trong 1 ml CHCl3 và nhỏ vào 1 ml H2SO4 đậm đặc. Phản ứng dương tính là cho màu đỏ sẩm, xanh, xanh tím.         e. Phản ứng Noller:          - Thử với ống nghiệm: Cho lần lượt 1 ml dung dịch thử, 2-4 giọt dung dịch SnCl4, nếu có màu đặc trưng so với ống đối chứng và bền vững là dương tính.          - Dung dịch phun xịt bản: Hỗn hợp 20 ml CHCl3, 20 ml acid acetic băng, 3 ml SnCl4. Phun xịt lên bản mỏng và sấy ở 1200C trong 5-10 phút đến khi hiện vết là dương tính.         f. Phản ứng Carr-Price:           - Thử với ống nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch thử, 1-2 giọt dung dịch 20% SbCl3 trong clorofom, nếu có màu đặc trưng so với ống đối chứng và bền vững là dương tính.          - Dung dịch phun xịt bản: Hòa tan 1 g triclorur antimoin (SbCl3) trong 1 g acid acetic băng. Phun xịt lên bản mỏng và sấy ở 1000C trong 5-10 phút, cho đến khi xuất hiện vết màu vàng. II.4.2. Định tính Ankaloid:         a. Thuốc thử Mayer:          Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60ml nước cất và hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất. Trộn 2 dung dịch này lại và thêm nước cho đủ 100 ml.          Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa mẫu thử, nếu có ankaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý tủa tạo thành sẽ có thể hòa tan trở lại trong lượng dư thuốc thử.         b. Thuốc thử Dragendorff:          Hòa tan 8 g Nitrat bismuth (Bi(NO3)3.H2O) trong 25 ml HNO3 30% (d=1,18). Hòa tan 28 g KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Trộn 2 dung dịch này lại, để yên trong tủ lạnh 50C sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch có màu cam đỏ được chứa trong chai màu nâu để che ánh sáng, cất trong tủ lạnh.         - Định tính bằng ống nghiệm: Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch axit loãng có chứa mẫu thử, nếu có ankaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam nâu.         - Phun xịt lên bản mỏng: trong một bình phun xịt, cho vào lần lượt theo thứ tự: 20 ml nước cất, 5 ml HCl 6N, 2 ml dung dịch thuốc thử Dragendorff và 5 ml NaOH 6N. Phun xịt lên bản mỏng, nếu có ankaloid sẽ cho vết màu cam đỏ.         c. Thuốc thử Wagner:          Hòa tan 1,27 g Iod (I2) và 2 g KI trong 20 ml nước cất, thêm nước cho đủ 100 ml.          Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch acid loãng có chứa mẫu thử, nếu có ankaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu. II.4.3. Định tính Flavonoid:          Có nhiều phương pháp để phát hiện flavonoid chẳng hạn như:         a. Nhận biết bằng hơi amoniac:           Cao trích cây được chấm lên giấy lọc sau đó cho vào lọ bão hòa hơi amoniac. Vết flavonoid thường cho màu vàng.         b. Tác dụng với H2SO4 đậm đặc:           Hòa tan hợp chất chứa flavonoid vào H2SO4 đậm đặc: flavon và flavonol cho màu vàng đậm đến màu da cam và có phát huỳnh quang đặc biệt. Chalcon, aurone cho màu đỏ hoặc xanh dương-đỏ. Flavanon cho màu từ cam đến đỏ.         c. Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/etanol:           Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch flavonoid hòa tan trong etanol, sẽ có màu từ vàng đến cam đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoanthocyanidin sẽ có màu vàng. Flavonol màu từ vàng đến cam. Aurone cho màu đỏ đến đỏ tím.         d. Phản ứng Cyanidin của Wilstatter:          Phản ứng khử bằng bột Mg trong HCl/etanol.          Cho vào ống nghiệm khoảng 2 ml mẫu thử; thêm vào 1 ml ancol tert-butyl hoặc ancol isoamyl; 0,5 ml HCl đậm đặc; 3-5 hạt Mg kim loại. Đun nhẹ trong vài phút; lớp ancol ở trên sẽ xuất hiện màu. Nếu là Flavon; flavanon; flavanonol; xanthone sẽ cho màu cam; đỏ; tím.          Nếu dùng bột kẽm thay thế bột Mg, thì chỉ có flavanonol cho màu hồng nhạt hoặc không màu.         e. Phản ứng với thuốc thử axit boric-axitoxalic:         Thuốc thử gồm 15 ml dung dịch axit boric 10% và 5 ml dung dịch axit oxalic 10%. Sau khi phun thuốc thử lên bản mỏng, sấy ở 1200C trong 10-15 phút, các flavon và flavonol phát quang màu lục hoặc vàng lục.   II.4.4. Định tính Tanin:         a. Thuốc thử Stiasny:         Hòa 20 ml dung dịch formol 36% với 10 ml HCl đậm đặc làm thuốc thử.          Lấy lần lượt 2 ml mẫu thử, 1ml thuốc thử vào ống nghiệm, đun nóng. Nếu có tanin thì có kết tủa vô định hình màu xám.         b. Thuốc thử chì axetat:         Cho 2 ml mẫu thử vào ống nghiệm rồi cho tiếp từng giọt dung dịch chì axetat bão hòa, phản ứng dương tính là xuất hiện kết tủa vàng nâu.         c. Thuốc thử FeCl3 1%:          Lấy 2 ml mẫu thử vào ống nghiệm rồi cho tiếp từng giọt dung dịch FeCl3 1%, nếu có tanin thì dung dịch sẽ chuyển sang màu xanh đen hoặc xanh lục. CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM III.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ: III.1.1. Nguyên liệu:           Lá của cây Lược vàng được thu hái tại xã Lương Phi, huyện Tri Tôn, tỉnh An Giang. III.1.2. Hóa chất:      Bảng 3: Tên các hoá chất đã sử dụng và một số chỉ tiêu sử dụng chúng STTTên và CTPTKhối lượng mol phân tử (g/mol)Độ tinh khiếtNhiệt độ sôi (0C)Khối lượng riêngXuất xứ1Clorofom (CHCl3)119,3899%61,21,48 g/mlTQ2Ete dầu hỏa 10%45-70 TQ3n-Hexan (C6H12)86,2099,0%68,70,659 g/mlTQ4Axeton (CH3COCH3)50,0899,5%  TQ5Etyl axetat (CH3COOC2H5)88,1199,5%77 TQ6Bản mỏng (2020 cm) Nhôm silica gel 60 F254    Đức7Etanol (C2H5OH)46,0799,7%55-57 TQ8Natri hiđroxit (NaOH)40,0096,0  TQ9Silica gel (0,063-0,2 mm)60,09   Đức10Natri sunfat (Na2SO4)142,0499%  TQ11H2SO4 đậm đặc98,0895-98%  TQ12Ancol isoamyl88,1598,5%  TQ13Bột Mg24,3199%  TQ14HCl đặc36,4636-38%  TQIII.1.3. Dụng cụ:            - Bếp điện             - Erlen 1000ml, 250ml, 10ml             - Ống sinh hàn nước             - Giá sắt - Cân phân tích - Máy cô quay chân không thu    hồi dung môi (Heidolph) - Ống nhỏ giọt - Ống mao quản - Kéo - Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml,          25ml - Cột sắc kí - Cốc 50ml, 100ml, 250ml - Bình phun xịt - Ly thủy tinh, nắp thủy tinh - Quả bóp cao su III.2. QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO:           Do chưa tìm được quy trình chiết tách riêng cho cây Lược vàng. Với điều kiện phòng thí nghiệm của trường Đại học An Giang. Chúng tôi đề nghị quy trình dựa trên cơ sở nghiên cứu quy trình chung chiết tách và cô lập các hợp chất hữu cơ, các bước cụ thể của quy trình như sau: III.2.1. Xử lí nguyên liệu:          - Chọn lá cây Lược vàng tươi, già (bỏ lá vàng héo, sâu). Sau đó lá Lược vàng được rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô.          - Lá khô được cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 700C trong khoảng 3 giờ, sao cho lá vừa giòn, lấy lá ra nghiền nhỏ thành bột.(hình 13) III.2.2. Trích ly các chất hữu cơ trong cây Lược vàng:          - Cân mỗi lần khoảng 200 g bột nguyên liệu khô cho vào erlen 1000ml, cho tiếp một lượng dung môi cần chiết vào cho ngập nguyên liệu, sau đó lắp dụng cụ chiết hồi lưu và chiết ở nhiệt độ sôi lần lượt của ete dầu hỏa (45-700C), clorofom (61,20C), etyl axetat (770C) để được các dịch chiết tương ứng (hình 14). Quy trình trên được lặp lại 6 lần.          - Các dịch chiết tương ứng cùng một dung môi đem cô quay chân không thu hồi dung môi (hình 15) được các loại cao tương ứng:          + Cao ete dầu hỏa: 2,3 g          + Cao clorofom: 4,25 g. (hình 16)          + Cao etyl axetat: 3,65 g.                                                     Sơ đồ: Quy trình điều chế các loại cao                                                                   Phơi khô, sấy ở 700C                                                                 Xay nhuyễn                                                                  Trích bằng ete dầu hỏa,                                                                     Lọc, cất thu hồi dung môi                                                       Trích bằng clorofom                                                  Lọc, cất thu hồi dung môi                                    Trích bằng etyl axetat                                 Lọc, cất thu hồi dung môi                                                                                                                              Hình 13: Sấy lá lược vàng                      Hình 14: Chiết hồi lưu                                                                              Hình 15: Cô quay chân không thu hồi dung môi                                                                            Hình 16: Cao clorofom                          III.3. ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ NHÓM CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY LƯỢC VÀNG:         Quy trình điều chế cao etanol để định tính các nhóm chất tương tự như quy trình điều chế các loại cao bên trên, ở đây chỉ thay dung môi trích bằng etanol. III.3.1. Định tính Steroid: (hình 17) III.3.1.1. Tạo mẫu thử:        Lấy 0,1g cao etanol hòa tan trong 20ml dung môi clorofom, sau đó lọc lấy dịch lọc làm mẫu thử. Mẫu thử có màu vàng xanh nhạt. III.3.1.2. Phản ứng Libermann-Burchard:       - Tạo thuốc thử: Lấy 1ml anhidrid axetic, 1ml CHCl3 để trong tủ lạnh 00C, sau đó thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc.       - Cho 2 ml mẫu thử vào một ống nghiệm làm ống chuẩn.       - Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm từ từ thuốc thử vào thấy dung dịch chuyển sang màu xanh dương. Phản ứng dương tính. III.3.1.3. Phản ứng Rosenheim:       - Tạo thuốc thử: Hòa tan 0,1g axit tricloroacetic vào 10ml CHCl3.       - Lấy 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm làm ống chuẩn.       - Lấy 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, cho thêm vào 4 giọt dung dịch thuốc thử, thấy dung dịch chuyển sang màu xanh dương. Phản ứng dương tính. III.3.1.4. Phản ứng Rosenthaler:       - Tạo thuốc thử: Hòa tan 0,1g vanilin vào 10ml etanol, sau đó nhỏ thêm một giọt HCl đậm đặc vào.       - Lấy 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn.       - Lấy 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm từ từ từng giọt thuốc thử vào thấy dung dịch trong ống nghiệm chuyển sang màu lục nhạt. Phản ứng dương tính. III.3.1.5. Phản ứng Salkowski:       - Lấy 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm làm ống chuẩn.       - Lấy 2ml mẫu thử vào ống nghiệm khác, thêm từ từ từng giọt axit H2SO4 đậm đặc, thấy dung dịch trong ống nghiệm chuyển sang màu xanh tím. Phản ứng dương tính.      Kết quả định tính trong cao trích etanol của cây Lược vàng có steroid.                        Phản ứng Libermann-Burchard       Phản ứng Rosenheim                                Phản ứng Rosenthaler              Phản ứng Salkowski                           Hình 17: Các phản ứng định tính Steroid                       (ống nghiệm thứ nhất là ống chứa mẫu thử chuẩn)   III.3.2. Định tính Ankaloid: (hình 18) III.3.2.1. Tạo mẫu thử:         Cân 0,25 g cao trích etanol, hòa tan cao này trong hỗn hợp điete etyl : clorofom (1:1) và HCl 1%. Lấy dịch axit này làm mẫu thử. III.3.2.2. Phản ứng với thuốc thử Mayer:        - Tạo thuốc thử: Hòa tan 1,36g HgCl2 trong 60ml nước cất và hòa tan 5g KI trong 10ml nước cất. Trộn 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100ml.       - Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn.       - Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt. Phản ứng dương tính. III.3.2.3. Phản ứng với thuốc thử Dragendorff:       - Tạo thuốc thử: Hòa tan 8g Nitrat bismuth Bi(NO3)3.H2O trong 25 ml dung dịch HNO3 30% (d=1,18). Hòa tan 2,8 g KI và 1ml HCl 6N trong 5ml nước cất. Trộn 2 dung dịch này lại, để yên trong tủ lạnh 50C khoảng 5 phút, lọc. Dung dịch có màu cam đỏ.       - Lấy 2ml mẫu thử cho vào một ống nghiệm làm ống chuẩn.       - Lấy 2ml mẫu thử cho vào một ống nghiệm khác, sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào thấy xuất hiện tủa màu nâu cam. Phản ứng dương tính. III.3.2.4. Thuốc thử Wagner:        - Tạo thuốc thử: Hòa tan 1,27g I2 và 2g KI trong 20ml nước cất. Thêm nước cho đủ 100ml.       - Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm làm mẫu chuẩn.       - Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào thấy xuất hiện tủa vàng nâu. Phản ứng dương tính.          Kết quả định tính trong cao trích etanol của cây Lược vàng có ankaloid.          Với thuốc thử Mayer      Với thuốc thử Dragendorff   Với thuốc thử Wagner                                    Hình 18: Các phản ứng định tính Ankaloid III.3.3. Định tính Flavonoid: (hình 19) III.3.3.1. Tạo mẫu thử:         Lấy 0,25 g cao trích etanol hòa tan vào 10 ml nước trong 1 becher bằng cách đun cách thủy trong 5 phút, để nguội lọc lấy dịch lọc làm mẫu thử. Mẫu thử sau khi lọc có màu vàng. III.3.3.2. Phản ứng Cyanidin:       - Cho 2 ml mẫu thử vào một ống nghiệm làm mẫu chuẩn để so sánh.       - Cho 2 ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm khoảng 5 giọt dung dịch axit HCl đặc, một ít bột Mg kim loại, để yên đến khi dung dịch hết sủi bọt. Đun nóng và nhỏ từ từ alcol isoamil dọc theo thành ống nghiệm, quan sát hiện tượng ta thấy lớp ancol trên bề mặt dung dịch xuất hiện màu đỏ tím. Phản ứng dương tính. III.3.3.3. Phản ứng với H2SO4 đặc:       - Cho vào ống nghiệm thứ nhất 2 ml mẫu thử làm chuẩn so sánh.       - Cho vào ống nghiệm khác 2 ml mẫu thử rồi thêm từ từ từng giọt H2SO4 đặc, thấy dung dịch lúc đầu có màu vàng nhạt chuyển sang màu cam đậm. Phản ứng dương tính.       Như vậy, kết quả định tính cho thấy trong cao trích etanol của cây Lược vàng có sự hiện diện của flavonoid.                                            Phản ứng Cyanidin                  Phản ứng với H2SO4 đặc                            Hình 19: Các phản ứng định tính flavonoid             (ống nghiệm đầu tiên trong mỗi hình là ống chứa mẫu thử chuẩn) III.3.4. Định tính Tanin: (hình 20) III.3.4.1. Tạo mẫu thử:        Giống như cách tạo mẫu thử cho định tính flavonoid như trên. III.3.4.2. Phản ứng với thuốc thử chì axetat:       - Tạo thuốc thử: Hòa tan một lượng axetat chì vào 10ml nước cho đến khi không tan được nữa, sau đó vừa khuấy vừa đun nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn cho tan hết, cho tiếp khoảng 2g axetat chì vào khuấy tiếp. Cuối cùng, lấy ra để nguội thấy có xuất hiện tinh thể axetat chì tạo thành là được dung dịch bão hòa axetat chì trong nước.       - Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn.       - Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, và cho tiếp từng giọt axetat chì vào thấy  xuất hiện kết tủa màu vàng nâu. Phản ứng dương tính. III.3.4.3. Phản ứng với thuốc thử FeCl3 5%:      - Lấy 2ml mẫu thử cho vào một ống nghiệm làm ống chuẩn.      - Lấy 2ml mẫu thử cho vào một ống nghiệm khác, nhỏ từng giọt FeCl35% vào nhận thấy dung dịch chuyển sang màu nâu đen. Phản ứng dương tính.       Như vậy, kết quả định tính tanin cho thấy trong cao trích etanol của cây Lược vàng có sự hiện diện của tanin.                                        Với thuốc thử chì axetat              Với thuốc thử FeCl3 1%                              Hình 20: Các phản ứng định tính Tanin             (ống nghiệm đầu tiên trong mỗi hình là ống chứa mẫu thử chuẩn)          Kết luận: Các kết quả định tính cho thấy trong cây Lược vàng có chứa steroid, ankaloid, flavonoid, tanin. III.4. PHÂN LẬP CÁC CHẤT HỮU CƠ TRÊN CAO CLOROFOM CỦA CÂY LƯỢC VÀNG:         Thực hiện việc phân lập các chất hữu cơ trong cao clorofom bằng sắc kí cột silica gel.       - Chuẩn bị cột chạy sắc kí: cột thủy tinh có khóa và nút mài, đường kính 3,4 cm, chiều dài 50cm, rửa sạch, kiểm tra xem khóa có đảm bảo kín khi đóng hay không, sấy khô, sau đó tráng bằng dung môi rửa giải đầu tiên, cố định cột trên giá sắt theo chiều thẳng đứng.       - Chất nhồi cột: silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063-0,2 mm) được hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ.       - Nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt: cân một lượng silica gel gấp từ 25-50 lần khối lượng cao cần phân lập, cho từ từ mỗi lần một ít silica gel trên vào cốc chứa sẵn một lượng dung môi gấp 5-10 lần trọng lượng silica gel và khuấy đều đến khi cho hết silica gel vào cốc. Tiếp tục khuấy đến khi hỗn hợp đồng nhất và hết bọt khí. Bấy giờ, mở nhẹ khóa cột để cho dung môi có sẵn trong cột chảy ra chầm chậm, rót chất hấp phụ dạng sệt thành dòng từ từ vào thành cột, vừa rót vừa gõ nhẹ cho cột chặt. Rửa thành cột bằng hệ dung môi rửa giải. Ổn định cột bằng cách mở khóa cột cho dung môi chảy nhẹ đến khi lượng silica gel trên cột nén xuống mức không đổi. Cho lượng dung môi rửa giải chảy đến khi cách bề mặt silica gel khoảng 3mm, khóa cột và nhồi cao. III.4.1. Phân lập cao clorofom bằng sắc kí cột silica gel:         Cho 2 gam cao clorofom trộn với một lượng nhỏ silica gel để nạp vào đầu cột silica gel theo phương pháp nạp khô, sau đó giải li bằng các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần từ ete dầu hỏa đến clorofom rồi đến axeton (chú ý là trong quá trình thay đổi dung môi phải thay đổi một cách từ từ bằng cách tăng lên 9:1, 7:3, 5:5, 3:7, 1:9 rồi mới đến 100% dung môi mới để tránh gây gãy cột). Dung dịch giải li qua cột được hứng vào các erlen (mỗi erlen là 100ml).         Dung dịch giải li được cô đuổi dung môi để thu được các phân đoạn chất (sắc kí bản mỏng giống nhau ta gom thành một phân đoạn).                                                                                                   Hình 21: Sắc kí cột silica gel         Kết quả sắc kí cột áp dụng trên cao clorofom ta thu được 8 phân đoạn kí hiệu từ M1 đến M8, được trình bày trong bảng sau:                   Bảng 4: Kết quả sắc ký cột  áp dụng trên cao clorofom Phân đoạnDung môi giải lySố thứ tự lọKhối lượng (mg)Đặc điểmSKBM, hiện hình bằng H2SO4 đặc (hệ giải ly, số vết, Rf)Ghi chúM1E1-21756Dầu vàng camHexan:etylaxetat[9:1], cho 1 vệt dầu rộng 1cm, Rf=0,56Không khảo sát tiếpM2E-E:C22-36220Dầu vàng nhạtHexan:etylaxetat[9:1], cho 1 vệt dầu vàng, Rf=0,68Không khảo sát tiếpM3E:C-C37-4132Tinh thể trắng.Hexan:etylaxetat[7:3], cho 1 vết màu nâu tím Rf=0,65 và 1 vết dầu mờ phía trênTiếp tục khảo sátM4C42-5063Dầu trắng lẫn vàngHexan:etylaxetat[7:3], cho 1 vệt dầu dàiKhông khảo sát tiếpM5C51-5723Kết tinh màu vàng cam đậmToluen:etylaxetat:axit fomic[5:4:1], cho 3 vết có lẫn dơKhông khảo sát tiếpM6C-C:A58-71274Kết tinh xanh đenToluen:etylaxetat:axit fomic[5:4:1], cho nhiều vếtKhông khảo sát tiếpM7A72-7750Kết tinh vàng cam nhạt.Toluen:etylaxetat:axit fomic[5:4:1], cho nhiều vếtKhông khảo sát tiếpM8A-A:M78-8743Kết tinh màu vàng xanh.Toluen:etylaxetat:axit fomic[5:4:1], cho 1 vết vàng cam lẫn dơ, Rf=0,36Tiếp tục khảo sát                   Trong đó:    E: Ete dầu hỏa.         E-C: Từ ete dầu tăng lên clorofom                             C: Clorofom.            C-A: Từ clorofom tăng lên axeton                             A: Axeton.                A-M: Từ axetaon tăng lên metanol Tính chất từng phân đoạn như sau:         - Phân đoạn M1: Dạng dầu vàng cam, chứa chủ yếu là chất béo (đóng rắn ở nhiệt độ thường và tan chảy khi đun nóng), SKBM (hệ giải ly là hexan:etyl axetat[9:1]) cho một vệt dầu giữa bản (Rf=0,56) rộng khoảng 1cm. Không khảo sát tiếp ở phân đoạn này. (hình 22, 23)         - Phân đoạn M2: Dạng dầu vàng nhạt, củng chủ yếu là chất béo, SKBM (hệ giải ly là hexan:etyl axetat[9:1]) và hiện hình bằng H2SO4 đặc, cho một vệt dầu màu vàng (Rf=0,68). Không khảo sát tiếp phân đoạn này. (hình 22, 23)         - Phân đoạn M3: Có dạng tinh thể hình kim, màu trắng lẫn dầu, SKBM (hệ giải ly là hexan:etyl axetat[7:3]) hiện hình bằng H2SO4 đặc, cho một vết màu nâu tím (Rf=0,65) và một vết dầu mờ ở phía trên. Khảo sát tiếp phân đoạn này. (hình 22, 23)         - Phân đoạn M4: Dạng dầu hơi vàng, SKBM (hệ giải ly hexan:etyl axetat[7:3]) hiện hình bằng H2SO4 đặc, cho một vệt dầu dài khoảng 1,2cm ( Rf=0,6-0,72). Không khảo sát tiếp. (hình 22, 23)         - Phân đoạn M5: Kết tinh màu cam đậm, SKBM (hệ giải ly Toluen: etyl axetat: axit fomic[5:4:1]) hiện hình bằng H2SO4 đặc cho 3 vết màu vàng nâu nhạt ở khoảng giữa bản, 3 vết gần nhau và có vệt dơ dài. Không khảo sát tiếp do có nhiều chất mà khối lượng phân đoạn nhỏ. (hình 22, 24)         - Phân đoạn M6: Kết tinh màu xanh đen, SKBM (hệ giải ly Toluen:etyl axetat: axit fomic[5:4:1]) cho nhiều vết (Rf từ 0,25 đến 0,5). Không khảo sát tiếp do quá nhiều chất trong phân đoạn. (hình 22, 24)         - Phân đoạn M7: Kết tinh vàng nhạt, SKBM (hệ giải ly Toluen:etyl axetat: axit fomic[5:4:1]), hiện hình bằng H2SO4 đặc, cho nhiều vết (có 2 vết rõ nhất là một vết màu hồng tím và một vết màu xanh dương). Không khảo sát tiếp phân đoạn này do nhiều chất với khối lượng phân đoạn nhỏ. (hình 22, 24)         - Phân đoạn M8: Kết tinh màu vàng xanh, SKBM (hệ giải ly Toluen:etyl axetat: axit fomic[5:4:1]) và hiện hình bằng H2SO4 đặc, cho chủ yếu một vết màu vàng cam (Rf=0,36) và ít dơ. Sẽ khảo sát tiếp phân đoạn này. (hình 22, 24)         Tóm lại: Sau khi tiến hành sắc kí cột silica gel áp dụng trên cao clorofom ta thu được 8 phân đoạn, trong đó các phân đoạn M3 và M8 tiến hành SKBM cho một vết rõ lại ít dơ, với khối lượng là 32mg và 43mg, tiếp tục khảo sát tiếp các phân đoạn này.                           Hình 22: Các  phân đoạn chất thu được sau khi tiến hành                             sắc kí cột silica gel áp dụng trên cao clorofom                                                     Hình 23: SKBM phân đoạn M1, M2,       Hình 24: SKBM phân đoạn M5, M6,                        M3 và  M4                                        M7 và M8 (hệ giải ly (hệ giải ly hexan:etyl axetat [7:3])          Toluen:etyl axaetat: axit fomic[5:4:1])  Thuốc thử hiện hình H2SO4 đặc                  Thuốc thử hiện hình H2SO4 đặc         III.4.2.  Khảo sát phân đoạn M3:          Phân đoạn M3 có dạng tinh thể trắng, SKBM với hệ giải ly hexan:etyl axetat [7:3], hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 đặc, cho một vết chính rõ màu nâu tím và vết dầu mờ phía trên. M3 có khối lượng là 32 mg tương đối nhỏ nhưng ít dơ nên tiếp tục chọn phương pháp xử lý tiếp theo là sắc kí điều chế bằng bản mỏng đối với phân đoạn này.          Cơ sở của phương pháp sắc kí điều chế bằng bản mỏng là dùng các bản mỏng khổ lớn đề tách các cấu tử riêng biệt nhằm cô lập riêng chất cần phân lập.         Tiến hành: Mẫu M3 được pha vào một dung môi thích hợp là clorofom với lượng tối thiểu dung môi rồi dùng ống vi quản kéo một vệt dài theo đường xuất phát của bản mỏng (bản mỏng khổ lớn 5 cm x 10 cm) cách đáy bản mỏng 1cm. Kéo lặp lại khoảng 3 lần trên một bản, sau đó cho bản mỏng triển khai với hệ hexan:etyl axetat [7:3] sẽ có những băng chất song song (ở đây chất khảo sát không thể nhìn thấy trực tiếp cần được hiện hình bằng thuốc thử, nên tôi cắt một phần nhỏ ở mép rìa bản mỏng để hiện hình bằng H2SO4 đặc, rồi so sánh vết hiện hình với bản mỏng để khoanh vùng khu vực chất cần cô lập trên bản mỏng).          Cuối cùng dùng Spatule cạo lấy lớp chất hấp phụ đã khoanh vùng trên bản mỏng rồi dùng dung môi clorofom để trích chất hữu cơ ra khỏi chất hấp phụ (bằng cách đun sôi chất hấp phụ với dung môi clorofom nhiều lần rồi lọc lấy dịch clorofom).          Thu hồi phần dịch clorofom sau khi trích đem cô đuổi dung môi ta thu được chất có dạng tinh thể hình kim màu trắng (6 mg). Tiến hành SKBM trên nhiều hệ dung li khác nhau (hiện hình bằng H2SO4 đặc) chỉ cho một vết duy nhất màu nâu tím. Đặt tên chất này là MC5.                                                                   Hình 25: Hợp chất MC5 cô lập được                                                                                                                                                                                                             Hình 26: SKBM cao clorofom, phân đoạn M3,                                                   hợp chất MC5                                                                     (hệ giải ly hexan: etyl axetat[7:3],                                           hiện hình bằng H2SO4 đặc)                                    Trong đó:                                        C: cao clorofom                                        M3: phân đoạn M3                                        MC5: hợp chất MC5   III.5. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC:         Hợp chất MC5 thu được từ phân đoạn M3 của cao clorofom, có dạng tinh thể hình kim màu trắng (hình 25).        - Nhiệt độ nóng chảy: 137-1400C.        - Sắc kí bản mỏng: giải ly với hệ dung môi hexan: etyl axetat[7:3], thuốc thử hiện hình là H2SO4 đặc, cho một vết duy nhất màu nâu tím với Rf=0,65 (hình 26).        - Phổ MS (phụ lục 1), phổ đồ cho các pic: 53, 55, 57, 81, 83, 95, 105, 107,  124, 133, 145, 147, 159, 163, 195, 207, 229, 253, 289, 412.         - Phổ 1H-NMR, CDCl3 (phụ lục 2), ppm: 7,19 ppm (proton của nhóm benzen hoặc >CH-O-); 5,28 ppm (proton của nhóm –CH=); 5,1ppm (proton của nhóm –CH=), 4,95 ppm (proton của nhóm -CH=); 3,5 ppm (proton của nhóm C-OH, CH3-O-, -CH2-O- hoặc >CH-O-) và độ dịch chuyển hóa học từ 2,3 đến 0,6 ppm là proton các nhóm (>CH-, -CH2-, CH3-)        - Phổ 13C-NMR, CDCl3,(phụ lục 3, 3A, 3B):          + Các pic cóppm: 140,79; 138,28; 129,34; 121,69 có thể là tín hiệu cacbon của anken (có nối đôi C=C), dị vòng thơm hoặc hợp chất thơm.          + Các pic có ppm: 77,24; 76,98; 76,73; 71,82 có thể là tín hiệu cacbon nhóm C-O hoặc cacbon nhóm ankin.          + Các pic có ppm: 56,89; 56,12; 56,02; 51,24; 50,19 có thể là tín hiệu cacbon bậc 3, bậc 4, và –CH2-O.          + Các pic có ppm: 45,91; 42,35; 40,42; 39,82; 39,71; 37,29; 36,15 có thể là cacbon bậc 2, bậc 3, bậc 4.          + Các pic có ppm: 34,00; 33,76; 31,91; 31,7 30,14 có thể là tín hiệu cacbon bậc 2, bậc 3.          + Các pic có ppm: 29,68; 29,33; 29,23; 28,87; 28,23; 26,73; 26,19; 25,38; 24,36; 24,3; 23,12 là tín hiệu cacbon bậc 1, bậc 2.         + Các pic có ppm: 22,66; 21,2; 21,1; 21,03; 19,79; 19,38; 19,05; 18,98; 18,78; 14,06; 12,2; 12,05; 11,98; 11,85 là tín hiệu cacbon bậc 1. Biện luận cấu trúc của hợp chất MC5:         Hợp chất MC5 có dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 137-1400C, tương đương với nhiệt độ nóng chảy của -Sitosterol (136-1400C)[45]. SKBM hợp chất MC5 với hệ giải ly hexan:etyl axetat[7:3], hiện hình bằng H2SO4 đặc, cho một vết màu nâu tím Rf = 0,65. Những đặc điểm này gợi ý cho tôi hướng sự chú ý đến hợp chất steroid.         Thông tin từ phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất MC5 còn cho biết trong hợp chất MC5 có thể có các liên kết đôi C=C trong phân tử và có thể có nhóm –OH.         Kết quả phổ khối lượng MS cho thấy có các pic, m/z: 57, 81, 83, 95, 133, 145, 147, 253, 412 trùng với một số pic giá trị m/z khối phổ của -Sitosterol (m/z: 57, 81, 95, 133, 145, 157, 183, 211, 227, 253, 271, 341, 379, 414)  và giá trị m/z khối phổ của stigmasterol (m/z: 57, 81, 107, 145, 147, 159, 205, 257, 263, 315, 395, 412). [38], [39]         Đặc biệt giá trị m/z = 412 tương ứng với M+ của stigmasterol.          Dựa vào các thông tin trên, tôi dự đoán hợp chất MC5 có thể liên quan đến 2 hợp chất -Sitosterol và stigmasterol, từ đó tạo cơ sở cho việc so sánh độ chuyển dịch hóa học của các mũi cộng hưởng hạt nhân 13C của hợp chất MC5 với 2 chất trên.          Kết quả so sánh độ chuyển dịch hóa học của 13C (,ppm) rút ra từ bảng 5 thấy có sự tương đồng giữa hợp chất MC5 với -sitosterol và stigmasterol.          Từ kết quả trên cho tôi đưa ra dự đoán hợp chất MC5 thu được là hỗn hợp của 2 chất -sitosterol và stigmasterol.                                                                                                                             Bảng 5: So sánh phổ 13C-NMR của hợp chất MC5 với -sitosterol và stigmasterol Hợp chất MC5-SitosterolStigmasterolN13C-NMR (ppm)Loại cacbonN13C-NMR (ppm)Loại cacbonN13C-NMR (ppm)Loại cacbon1140,79Thơm/C=5140,76>C=5140,67>C=2138,23Thơm/C=   22138,25-CH=3129,34Thơm/C=   23129,19-CH=4121,69Thơm /C=6121,69-CH=6121,62-CH=577,24Ankin/C-O377,34-CH-O   671,82Ankin/C-O   371,72-CH-O756,8-CH2-O/>CH-/ >CCH-1456,83>CH-856,12-CH2-O/>CH-/ >CCH-   956,02-CH2-O/>CH-/ >CCH-1051,24-CH2-O/>CH-/ >CCH-1150,19-CH2-O/>CH-/ >CCH-950,12>CH-1245,91-CH2-/>CH-/ >CCH-   1342,35-CH2-/>CH-/ >CCCCH-/ >CCH-/ >CCH-/ >CCH-/ >CCH-/ >CCCCH-/-CH2-2036,16>CH-2040,45>CH-2033,76>CH-/-CH2-2233,96-CH2-731,61-CH2-2131,91>CH-/-CH2-831,92>CH-831,87>CH-2231,70>CH-/-CH2-731,92-CH2-2531,87>CH-2330,14>CH-/-CH2-231,64-CH2-   2429,24-CH2-/CH3-2829,18-CH2-   2528,87-CH2-/CH3-   228,92-CH2-2628,23-CH2-/CH3-1628,25-CH2-1628,20-CH2-2726,19-CH2-/CH3-2326,11-CH2-   2825,38-CH2-/CH3-   2825,4-CH2-2924,36-CH2-/CH3-   1524,35-CH2-3024,30-CH2-/CH3-1524,31-CH2-   3123,12-CH2-/CH3-2623,08CH3-   3221,2-CH2-/CH3-   2621,22CH3-3321,1-CH2-/CH3-1121,1-CH2-1121,06-CH2-3421,03CH3-   2121,09CH3-3519,79CH3-2919,82CH3-   3619,38CH3-1919,39CH3-1819,39CH3-3719,05CH3-2519,05>CH-   3818,98CH3-   2718,98CH3-3918,78CH3-2118,80CH3-   4012,2CH3-   2912,26CH3-4112,05CH3-2711,99CH3-1912,04CH3-4211,85CH3-1811,89CH3-          Ghi chú: Phổ 13C-NMR của -Sitosterol và sigmasterol [10],[38],[39].          PHẦN III     KẾT LUẬN VÀ                KIẾN NGHỊ I.KẾT LUẬN:         Qua quá trình tiến hành tìm kiếm thông tin về đề tài, tôi đã bước đầu cung cấp được những thông tin về nguồn gốc, đặc điểm, thành phần hoá học và một vài công dụng của cây Lược vàng tại An Giang.          Từ quá trình tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cây Lược vàng_Callisia Fragrands (Lindl) Woodson, thu hái tại Tri Tôn, An Giang chúng tôi đã có được những kết quả như sau:          - Điều chế được các loại cao (cao ete dầu hỏa 2,3 g ; cao clorofom 4,25 g; cao etyl axetat 3,65 g) để tiến hành khảo sát tiếp theo.         - Định tính với kết quả cho thấy có sự hiện diện của steroid, ankaloid, flavonoid, tanin trong cao trích etanol của cây lược vàng.         - Sắc kí cột cao clorofom và thu được 8 phân đoạn (hình 22).         - Sắc kí điều chế phân đoạn M3 thu được hợp chất có dạng tinh thể hình kim màu trắng (6 mg) lúc đầu tạm đặt tên là MC5, tiến hành SKBM hợp chất MC5 với hệ giải li hexan:etyl axetat[7:3] hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 đặc, cho một vết màu nâu tím Rf = 0,65. (hình 26)         - Ứng dụng các phương pháp vật lý hiện đại như: phổ 1H-NMR, 13C-NMR, MS để tiến hành xác định cấu trúc hóa học của hợp chất MC5, kết quả cho thấy có sự tương đồng với 2 chất là -sitosterol và stigmasterol.        Vậy hợp chất MC5 cô lập được từ cao clorofom có thể là hỗn hợp của -sitosterol và stigmasterol.                                         Đây là hợp chất Sterol đầu tiên được khảo sát trên cây Lược vàng tại An Giang.         Như vậy, các hợp chất sterol cô lập được từ cây Lược vàng là phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả trước đây.         Hỗn hợp Stigmasterol và -Sitosterol trong cây Lược vàng có một số tác dụng sinh học như: có tác dụng chống oxi hóa, giảm cholesterol trong máu và làm tăng hàm lượng chất HDL-C là thành phần quan trọng để bảo vệ tim mạch, phòng chống xơ vữa động mạch, tăng sức đề kháng cho cơ thể, các nghiên cứu về stigmasterol còn chỉ ra rằng chất này còn có tác dụng phòng chống ung thư nhất định như: ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, ruột già,…          Do thời gian có hạn việc khảo sát hợp chất ở phân đoạn M8 chưa được sạch, nên chúng tôi tạm ngừng khảo sát. II.KIẾN NGHỊ:          Qua quá trình thực nghiệm, trích ly và cô lập các chất hữu cơ trong phân đoạn cao trích clorofom cho thấy với lượng cao clorofom đem phân lập là 2 g thì lượng chất thu được trong các phân đoạn khảo sát còn ít (do hàm lượng chất béo cao), rất khó khăn cho việc xử lí tiếp theo. Nếu có điều kiện tiến hành khảo sát kĩ hơn thì tôi có thể sử dụng cột sắc kí có kích thước lớn hơn để dùng lượng cao phân lập nhiều hơn, lúc đó lượng chất thu được ở các phân đoạn sẽ có khối lượng đủ lớn, việc khảo sát dễ dàng hơn.          Hoặc nếu có nhiều thời gian hơn thì tôi sẽ sử dụng phương pháp chiết Soklet nguyên liệu bằng n-Hexan hoặc ete dầu hỏa trước khi tiến hành điều chế các loại cao để loại chất béo, dễ dàng cho việc phân lập các chất có độ phân cực lớn hơn.          Khi biện luận cấu trúc hóa học hợp chất cô lập được, tôi cũng gặp nhiều khó khăn do thời gian tiến hành quá ngắn, chưa đủ thời gian để tìm hiểu sâu sắc hơn về các phương pháp giải phổ, cũng như chưa đủ kinh nghiệm khi tiến hành khảo sát. Tuy đề nghị được cấu trúc hóa học của hợp chất cô lập được, nhưng nếu có thêm thời gian tôi có thể tiến hành khảo sát thêm một số loại phổ khác nữa như: phổ IR, phổ 13C-DEPT, lúc đó việc biện luận sẽ dễ dàng và tự tin hơn.         Kết quả khảo sát cho thấy có sự hiện diện của -sitosterol và stigmasterol trong cây lược vàng là tín hiệu vui cho người sử dụng, tuy nhiên để có thể sử dụng một cách đúng đắn về cây Lược vàng cũng cần có những khảo sát nhiều hơn nữa.          Mặc dù có nhiều khó khăn và áp lực trong quá trình thực hiện đề tài, nhưng cũng thông qua đó mà tôi đã học được rất nhiều điều bổ ích, từ giáo viên hướng dẫn, từ bạn bè, từ các nguồn tài liệu tìm kiếm,…Những điều học được sẽ là hành trang quý báu giúp ích cho tôi rất nhiều trong tương lai.          Trong quá trình thực hiện đề tài, dù tôi đã luôn cố gắng và nỗ lực hết mình cho sự hoàn thiện, nhưng không thể nào tránh khỏi nhiều sai sót và hạn chế, rất mong được sự đóng góp và chỉ dẫn nhiệt tình của quý thầy cô, các độc giả để bài khóa luận hoàn thiện hơn.                                                                                                                      Chân thành cảm ơn và trân trọng kính chào! TÀI LIỆU THAM KHẢO   [1].Hóa học hữu cơ_Tập I,II,III_Đỗ Đình Rãng (chủ biên), Đặng Đình Bạch, Nguyễn Thị Thanh Phong_NXB Giáo dục. [2].Hóa học phân tích 1_Nguyễn Tinh Dung_NXB Đại học sư phạm 2005. [3].Cơ sở hóa học phân tích_Hoàng Minh Châu (chủ biên), Từ Văn Mặc, Từ Vọng Nghi_NXB khoa học và kĩ thuật 2006. [4].Một số vấn đề chọn lọc của hóa học_tập 3_Nguyễn Duy Ái, Nguyễn Tinh Dung, Trần Thành Huế, Trần Quốc Sơn, Nguyễn Văn Tòng_NXB Giáo dục 2005. [5].Thực hành hóa học hữu cơ_Lê Thị Anh Đào (chủ biên), Đặng Văn Liếu_NXB Đại học sư phạm 2007. [6].Phân loại học thực vật_Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến. [7].Hóa sinh học_Nguyễn Thị Hiền, Vũ Thy Thư_NXB Đại học sư phạm 2004. [8].Khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát thành phần hóa học của tinh dầu bạc hà”_Đỗ Phi Long_2010. [9].Các phương pháp nhận danh, trích ly, cô lập các hợp chất hữu cơ_Nguyễn Kim Phi Phụng_Học phần cao học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, 2000-2001. [10].Đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường: “Cô lập và xác định thành phần hóa học một số hợp chất hữu cơ có dược tính y học trên cây kim thất tai Gynura Auriculata Cass, học Cúc (Asteraceae)”_Phạm Thị Kim Phượng_Đại học An Giang_2008. [11].Khảo sát flavonoid từ vỏ quýt_Tạp chí dược học-số 5/2001. [12].Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hóa học_Nguyễn Đình Triệu_NXB Đại học quốc gia Hà Nội_1999. Các trang web: [13]. [14]. [15]. HYPERLINK ""  [16]. HYPERLINK ""  [17]. HYPERLINK ""  [18]. HYPERLINK "" www.callisia.org/properties.html [19]. HYPERLINK "" www.callisia.org [20]. HYPERLINK ""  [21]. HYPERLINK ""  [22]. HYPERLINK ""  [23]. HYPERLINK ""  [24]. HYPERLINK ""  [25]. HYPERLINK ""  [26]. HYPERLINK ""  [27]. HYPERLINK ""  [28]. [29]. PCO [30]. HYPERLINK ""  [31]. [32]. [33]. [34]. [35]. [36]. [37]. [38]. [39]. [40]. [41]. [42]. [43]. [44]. [45]. [46]. [47]. [48]. 

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docXác định thành phần hóa học trên cao clorofom của cây Lược vàng_Callisia fragrans (Lindl) Woodson.doc