Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nhiễm edwardsiella ictaluri

ác đặc điểm hình thái của khuẩn lạc sau 24-48 giờ: - Hình dạng và kích thước khuẩn lạc trên môi trường TSA/NA, màu sắc khuẩn lạc, điều kiện nhiệt độ vi khuẩn phát triển. Các chỉ tiêu về sinh lý, sinh hóa (phụ lục 2): - Nhuộm gram, kiểm tra tính di động, phản ứng oxidase, phản ứng catalase, khả năng lên men và oxi hóa đường glucose ( O-F test), khả năng sinh indole, khả năng sử dụng đường, sinh gar và H2S, phản ứng tạo nitrit từ nitrate. 3.6 Phương pháp lấy mẫu máu quan sát các chỉ tiêu huyết học 3.6.1 Phương pháp lấy mẫu máu, nhuộm và đếm hồng cầu Chuẩn bị 1990 µl dung dịch Natt & Herrick cho vào ống nghiệm, dùng ống tiêm tiệt trùng 1ml lấy máu cá (cuống đuôi) . Nhỏ máu xuống 1 tấm lame rồi dùng pipet hút 10 µl máu cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch Natt & Herrick, lắc nhẹ. Trữ lạnh và đếm mẫu trong vòng 24 giờ bằng buồng đếm hồng cầu. Quan sát dưới kính hiển vi quang học ( 40X) để xác định mật độ hồng cầu (2 lần lặp lại). Cách tính mật độ hồng cầu: HC = C x 10 x 5 x 200 (tb/mm3) Trong đó C là tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm. Hình 3.1 Buồng đếm hồng cầu PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 14 3.6.2 Phương pháp lấy mẫu máu, nhuộm và đếm bạch cầu Mẫu máu đếm bạch cầu được lấy cùng lúc với mẫu máu đếm hồng cầu. Sau khi cho giọt máu lên lame ( đếm hồng cầu) , tiếp tục nhỏ một giọt máu lên 1 lame khác ( lập lại 3 lần) và thực hiện thao tác trãi mẫu máu: cho lamelle chạm nhẹ vào giọt máu, đẩy lamelle ngược về phía trước. Chờ cho mẫu máu khô sau đó đem cố định trong dung dịch methanol 1-2 phút, để mẫu khô rồi trữ lạnh Nhuộm mẫu: Mẫu máu đã được cố định sẽ được nhuộm bằng dung dịch Wright & Giemsa. (Cách chuẩn bị hóa chất nhuộm mẫu được trình bày trong phụ lục 3) Nhuộm với dung dịch Wright trong 3-5 phút + Ngâm trong dung dịch pH 6,2 – 6,8 trong 5 -6 phút + Nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20 – 30 phút. + Ngâm trong dung dịch pH 6,2 trong 15 – 30 phút. + Rửa sạch lại bằng nước cất, để mẫu khô tự nhiên và đọc mẫu. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X. Phân loại các tế bào máu theo Chinabut & ctv (1991). Đếm bạch cầu: Đọc mẫu theo hình Z-Z: Hình 3.2 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 15 Tổng bạch cầu (TBC) + Đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu trên 1.500 tế bào trên mẫu nhuộm. TBC (tb/mm3) = (số bạch cầu x mật độ hồng cầu trên buồng đếm)/số hồng cầu trên mẫu Từng loại bạch cầu + Đếm tổng số bạch cầu bằng 200 tế bào. Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm3) = (số lượng mỗi loại BC x mật độ TBC)/200 3.7 Xử lý số liệu Các chỉ tiêu huyết học sẽ được xử lý bằng phép xử lý thống kê t-test ở mức ý nghĩa 5%. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 16 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Dấu hiệu bệnh lý Theo Từ Thanh Dung và ctv (2002) thì cá tra nhiễm E. ictaluri có biểu hiện lờ đờ, không có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn, cá kém ăn ở giai đoạn mới chớm bệnh. Ở cá thí nghiệm nhiễm bệnh có biểu hiện nổi đầu, bơi lờ đờ trên mặt nước. Quan sát nội tạng thấy có những đốm nhỏ màu trắng xuất hiện ở gan, thận và tỳ tạng đặc biệt là ở thận . Một vài con nhiễm bệnh nặng thận bị nhũng. Từ Thanh Dung và ctv (2002) cũng tìm thấy các dấu hiệu tương tự trong nội quan cá tra bệnh. 4.2 Kết quả thí nghiệm Qua phương pháp ngâm kháng sinh để điều trị cho cá tra nhiễm bệnh và qua 10 ngày theo dõi thí nghiệm để xác định ảnh hưởng của kháng sinh lên cá tra, kết quả cho thấy kháng sinh có ảnh hớn rất lớn đối với cá tra nhiễm bệnh. Ngày Tỉ lệ chết (%) Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ chết của các nghiệm thức trong quá trình thí nghiệm Chú thích: NT1: Amoxicillin, NT2: Flofenicol, NT3: Docycillin, NT4: Flofenicol+Amoxicilin, NT5: Flofenicol+Docycillin, NT6: Amoxicillin+Docycillin, NT7: Đối chứng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 17 Tỉ lệ chết ở nghiệm thức 1 (Amoxcilin) rất cao, 100% cá chết vào ngày thí nghiệm thứ 3. Vào ngày thứ 9 của thí nghiệm, nghiệm thức thứ 2 (Flofenicol) và đối chứng có tỉ lệ chết lần lượt là 93% và 93,33%, trong khi 4 nghiệm thức còn lại tỉ lệ chết rất thấp, nghiệm thức 3 (Doxycilin) là 47%, nghiệm thức 4 (Flofenicol+ Amoxicillin) – 43%, nghiệm thức 5 (Flofenicol+ Doxycilin) – 30% và nghiệm thức 6(Amoxicillin + Doxycilin) là 30%. Kết quả thí nghiệm cho thấy, sử dụng kháng sinh kết hợp cho hiệu quả điều trị cao hơn so với sử dụng kháng sinh đơn. Tuy nhiên, ở nghiệm thức sử 3 (Doxycilin) tỉ lệ chết cũng rất thấp. 4.3 Kết quả phân lập vi khuẩn Kết quả cho thấy: khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển chậm trên môi trường TSA (sau 48giờ), khuẩn lạc nhỏ, có màu trắng đục không đồng nhất. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa bằng phương pháp truyền thống cho kết quả vi khuẩn gram âm, hình que, di động yếu, cho kết quả dương tính với catalase, âm tính với oxidase,lên men và oxi hóa đường glucose (O/F). Khả năng sinh indole, phản ứng VP, khả năng sinh H2S, phản ứng urea và phản ứng tạo nitrit từ nitrate đều cho kết quả âm tính, kết quả kiểm tra các loại đường chỉ có đường manose, glucose, glycerol, galactose cho kết quả dương tính, các loại còn lại cho kết quả âm tính. Hình 4.2 Khuẩn lạc trên môi trường TSA PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 18 Chú thích: các loại đường theo thứ tự từ trái qua : Manose, sucrose, xylose, glucose, mannit, glycerol, mantose, rhamnoso, inositol, galactose, sorbitol, crystal violet Kết quả này cho thấy vi khuẩn gây bệnh là E. ictaluri . Từ Thanh Dung và ctv (2002), Hawke và ctv (1998) cũng phân lập được vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra với các đặc điểm tương tự. Kết quả phân lập vi khuẩn của Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) trên 31 mẫu cá bệnh có 23 chủng thuộc vi khuẩn E. ictaluri, Huỳnh Chí Thanh (2007) phân lập được 9 chủng E. ictaluri đều cho kết quả tương tự với kết quả thí nghiệm. 4.4 Kết quả phân tích huyết học 4.4.1 Hồng cầu Hồng cầu ở cá bệnh có sự biến đổi về số lượng, xuất hiện nhiều hồng cầu nhiều nhân và không nhân. Chúng có kích thước và bắt màu gần giống như hồng cầu thành thục nhưng nhân phân chia thành 2, 3 hoặc nhiều phần. Hình 4.6 Hồng cầu không nhân (100X) Hình 4.5 Hồng cầu nhiều nhân (100X) Hình 4.3 Kết quả nhuộm gram Hình 4.4 Kết quả kiểm tra các loai đường PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 19 Kết quả định lượng hồng cầu cho thấy mật độ hồng cầu trước khi trị bằng kháng sinh trung bình vào khoảng 1,8x106 tế bào/mm3, sau khi sử dụng kháng sinh mật độ hồng cầu trung bình của 6 nghiệm thức là 1,6 x106 tế bào/mm3 và nghiệm thức 7 là 0,77 x106 tế bào/mm3. Qua hình 4.4 cho thấy mật đồ hồng cầu ở nghiệm thức không sử dụng kháng sinh giảm rất nhiều so với trước khi sử dụng kháng sinh, sau khi sử dụng kháng sinh mật độ hồng còn tuy có giảm nhưng không đáng kể, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Qua phân tích thống kê cho thấy, mật độ hồng cầu ở các nghiệm thức 3, 4, 5 và 7 khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Nghiệm thức 1, 2 và 6 cho kết quả khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với trước khi sử dụng kháng sinh. Mật độ hồng cầu ở nghiệm thức 1 và 2 là 19,6x106 tế bào/mm3 và 22,9x106 tế bào/mm3 cao hơn trước khi sử dụng kháng sinh trong khi các nghiệm thức còn lại thấp, đặc biệt là nghiệm thức 7 (không sử dụng kháng sinh) mật độ hồng cầu chỉ còn 0,77x106 tế bào/mm3 . Phạm Thị Phương Tiến (2008) và Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) cũng tìm thấy được hồng cầu không nhân và hồng cầu nhiều nhân trên cá tra bệnh mủ gan. Kết quả định lượng hồng cầu của Liễu (2008) ở cá tra bệnh 0,75x106 tế bào/ mm3giảm đến 2,74 lần so với cá khỏe (2,05x106 tế bào/ mm3). Còn Phan Thị Hừng (2004) cho kết quả hồng cầu cá tra bệnh giảm 50% so với cá tra khỏe. Trước sử dụng KS Sau sử dụng KS Không sử dụng KS Mật độ (x106 tế bào/mm3) 1,8 1,6 0,77 0 0 0 .5 1 1.5 0 2 Hình 4.7 Biểu đồ mật độ hồng cầu trước khi sử dụng kháng sinh (KS), sau khi sử sụng KS và không sử dụng KS PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 20 4.4.2 Bạch cầu Các loại bạch cầu tìm thấy được khi quan sát trên kính hiển vi là: tế bào lympho, tiểu cầu, bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân. Giống như các loại bạch cầu ở cá khỏe, hình 4.8, 4.9, 4.10 và 4.11 thể hiện các loại bạch cầu ở cá bệnh. Tế bào lympho bắt màu xanh đậm, tế bào chất màu xanh nhạt, mỏng bao quanh nhân. Tiểu cầu dài, bắt màu xang đậm. Bạch cầu đơn nhân lớn, hình dạng nhân biến đổi. Bạch cầu trung tính có nhân nằm lệch vế một góc, bắt màu tím. Phạm Thị Phương Tiến (2008) và Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) cũng tìm thấy 4 loại bạch cầu này khi nghiên cứu về các chỉ tiêu huyết học trên cá tra Hình 4.8 Tế bào lympho (100X) Hình 4.9 Tiểu cầu (100X) Hình 4.10 Bạch cầu trung tính (100X) Hình 4.11 Bạch cầu đơn nhân (100X) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 21 Bảng 4.1 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu trước và sau sử dụng kháng sinh TBC (tổng bạch cầu) 73,2 ± 32,5a 68,4± 32,6a L (lympho) 49,8± 19,7a 33,2± 26b T (tiểu cầu) 11,4 ± 13a 11 ± 12,3a M (bạch cầu đơn nhân) 2,8 ± 2,7a 7,8 ± 6,9b N (bạch cầu trung tính) 9,2 ± 7a 13,9±12,7a Giá trị trên bảng thể hiện giá trị trung bình và độ lệch chuẩn. Các giá trị trong cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0.05), các chữ cái giống nhau thì khác biệ không có ý nghĩa thống kê (p<0.05). Phân tích thống kê cho thấy, lympho và bạch cầu đơn nhân sau khi sử dụng kháng sinh và trước khi sử dụng kháng sinh khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05), trong khi đó tổng bạch cầu, tiểu cầu và bạch cầu trung tính cho kết quả khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Số lượng các loại bạch cầu trước và sau khi sử dụng kháng sinh. Tổng bạch cầu sau sử dụng kháng sinh là 68,4x103 tế bào/mm3 thấp hơn so với trước khi sử dụng kháng sinh. Lympho sau sử dụng kháng sinh là 33,2x103 tế bào/mm3 giảm so với trước khi sử dụng kháng sinh (49,8x103 tế bào/mm3), bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính đều tăng, đặc biệt là bạch cầu đơn nhân tăng 2,8 lần so với trước khi sử dụng kháng sinh. Tiểu cầu sau sử dụng kháng sinh có giảm nhưng không đáng kể. Bảng 4.2 Số lượng các loại bạch cầu ở các nghiệm thức sau khi sử sụng kháng sinh NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 TBC 49±30 66,7±22.3 91,5±13,7 52,2±19,7 50,7±24,6 99,5±43,7 43,7±29,2 L 16,3±12,5 28 ±12 51,3±15,3 25,3±11,2 24,2±16,9 53,8±17,6 13,3±9,4 T 8,7±8,8 5,3±5,5 12,8±9,6 5,5±2,0 8,3±12.5 24,6±14,6 11,7±16,2 M 5,3±4,2 12,8±8,6 9,6±5,5 5,6±2,6 5,1±5,1 9,1±12 6,5±5,7 N 15,3±13,5 16,6±5,3 15,7±20,8 15,6±14,1 10,8±14,7 12±6,3 7,3±10,4 Loại tế bào (x103 tế bào/mm3) Trước sử dụng KS Sau sử dụng KS PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 22 Bảng 4.2 thể hiện số lượng các loại bạch cầu ở từng nghiệm thức sau khi sử dụng kháng sinh. Tổng bạch cầu ở nghiệm thức 7 là 43,7x103 tế bào/mm3, thấp nhất so với 6 nghiệm thức còn lại, tổng bạch cầu cao nhất ở nghiệm thức 6 với số lượng 99,5x103 tế bào/mm3. Các nghiệm thức còn lại có số lượng tổng bạch cầu dao động trong khoảng 49x103 tế bào/mm3 đến 92x103 tế bào/mm3. Tương tự như tổng bạch cầu, lympho và bạch cầu trung tính ở nghiệm thức 7 cũng thấp nhất với số lượng là 13,3x103 tế bào/mm3 và 7,3x103 tế bào/mm3. Trong khi đó số lượng lympho cao nhất ở nghiệm thức 6 với 53,8x103 tế bào/mm3 và bạch cầu trung tính cao nhất với số lượng 16,6x103 tế bào/mm3 ở nghiệm thức 2. Các nghiệm thức còn lại có số lượng lympho trong khoảng 24x103 ÷ 52x103 tế bào/mm3 và bạch cầu trung tính là 10x103 ÷ 16x103 tế bào/mm3. Đối với bạch cầu đơn nhân, số lượng cao nhất ở nghiệm thức 2 với 12,8x103 tế bào/mm3 và thấp nhất là 5,1x103 tế bào/mm3 ở nghiệm thức 5. Các nghiệm thức còn lại biến động trong khoảng 5,3x103 ÷ 9,6x103 tế bào/mm3. Nếu như bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân ở nghiệm thức 2 cao nhất thì tiểu cầu ở nghiệm thức 2 lại thấp nhất với số lượng là 5,3x103 tế bào/mm3. Số lượng tiểu cầu cao nhất ở nghiệm thức 6 (24,6x103 tế bào/mm3) và các nghiệm thức còn lại nằm trong khoảng 5,5x103 ÷ 12,8x103 tế bào/mm3. Theo Trần Hồng Ửng (2003), số lượng tổng bạch cầu tăng rất cao ở cá bệnh. Theo Romão (2006), sự nhiễm khuẩn có thể là nguyên nhân làm tăng số lượng các bạch cầu. Báo cáo của Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) thì cho rằng hồng cầu và tổng bạch cầu ở cá bệnh đều giảm. Nguyên nhân tổng bạch cầu giảm là do vi khuẩn xâm nhập quá nhiều gây ra tình trạng quá tải của các tế bào bạch cầu dẫn đến mất chức năng và thoái hóa. Khi bị nhiễm khuẩn hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá hoạt động làm cho số lượng các tế bào (bạch cầu trung tính và đại thực bào) tăng lên nhanh chóng. Nếu vi khuẩn tồn tại lâu thì hệ miễn dịch của cá sẽ bị tổn thương không thể chống lại mầm bệnh (Crumlish et al, 2002). Việc đưa kháng sinh vào điều trị có tác dụng diệt khuẩn ( hay kìm khuẩn), ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn bên trong cơ thể cá, giúp cho hệ miễn dịch của cá có thể chống lại vi khuẩn tạo sức đề kháng cho cá. Tuy nhiên cũng tùy loại kháng sinh mà hiệu quả điều trị khác nhau. Kết quả kháng sinh đồ của PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 23 Hawke (1979) trên 58 chủng E. ictaluri với 10 loại kháng sinh thì vi khuẩn E.ictaluri nhạy cảm với Amoxcilin chiếm 84,5%, Flofenicol là 74,1% và Docycilin là 68,9%. Kết quả kháng sinh đồ do Huỳnh Chí Thanh (2007) thực hiện cho thấy vi khuẩn E. ictaluri mẫn cảm cao với Doxycilin và đề kháng với Amoxicilin. Theo Trương Ngọc Loan và ctv (2007), trong 47 chủng vi khuẩn E. ictaluri thì có 20 chủng kháng với Florphenicol (42,5%), 19 chủng kháng với Amoxicilin (40,4%) và 13 chủng với Doxycilin là 27,7%. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 24 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Qua 10 ngày theo dõi thí nghiệm cho kết quả tỉ lệ chết ở nghiệm thức 1 (Amoxcilin) là 100% vào ngày thứ 3. Nghiệm thức 7 (không sử dụng kháng sinh) là 93,3%, nghiệm thức 2 (Flofenicol) là 93%, nghiệm thức 3 (Doxycillin) là 47%, nghiệm thức 4 (Flofenicol+Amoxicillin) là 43%, nghiệm thức 5 (Flofenicol+Doxycillin) và nghiệm thức 6 (Amoxicillin+Doxycillin) là 30%. Số lượng hồng cầu cá tra nhiễm E. ictaluri trước khi sử dụng kháng sinh là 1,8x106 tế bào/mm3, sau khi sử dụng kháng sinh hồng cầu trung bình của 6 nghiệm thức là 1,6x106 tế bào/mm3 và nghiệm thức không sử dụng kháng sinh là 0,77x106 tế bào/mm3. Số lượng tổng bạch cầu trước khi sử dụng kháng sinh là 73,2x103 tế bào/mm3, sau sử dụng kháng sinh tổng bạch cầu giảm chỉ còn 68,4x103 tế bào/mm3, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Đối với từng loại bạch cầu, lympho sau sử dụng kháng sinh là 33,2 x103 tế bào/mm3 thấp hơn trước khi sử dụng kháng sinh (49,8x103 tế bào/mm3), bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân sau sử dụng kháng sinh đều tăng. Lympho và bạch cầu đơn nhân cho kết quả khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Ở nghiệm thức 7 (không sử dụng kháng sinh), tổng bạch cầu là 43,7x103 tế bào/mm3 , lympho là 13,3x103 tế bào/mm3 và bạch cầu trung tính là 7,3x103 tế bào/mm3 thấp nhất so với các nghiệm thức sử dụng kháng sinh. Tiểu cầu và bạch cầu đơn nhân tuy không thấp nhất trong 7 nghiệm thức nhưng với số lượng tiểu cầu là 11,7x103 tế bào/mm3 và bạch cầu đơn nhân là 6,5x103 tế bào/mm3 vẫn thấp hơn nhiều so với số lượng tiểu cầu cao nhất ở nghiệm thức 6 (24,6x103 tế bào/mm3 ) và bạch cầu đơn nhân cao nhất ở nghiệm thức 2 (12,8x103 tế bào/mm3 ). 5.2 Đề xuất Gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri để đánh giá chính xác khả năng điều trị của kháng sinh. Kiểm tra kháng sinh đồ trước khi đưa kháng sinh vào điểu trị bệnh để biết được sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh điều trị PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Benli, C.K and H.Y Yildiz, 2004. Blood parameters in Nile tiapia (Oreochromis niloticus L.) Spontaneously infected with Edwardsiella tarda. Aquaculture Research, 35: 1888-1380 2. Chinabut S, P Kitsawat and C Limsuwan, 1991. Histology of the walking catfish, Clarias batrachus. International development research centre, Canada. 96 pages. 3. Crumlish M, TT Dung, J F Turnbull, N T N Ngoc, H W Ferguson, 2002. Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus ( Sauvage), culture in the Mekong Delta , Vietnam. Short communication. Journal of Fish Diseases. Volume 25 Issue 12 Page 733-736. 4. Dương Long Trì, 2008. Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch tháng 8 năm 2008 ngành Nông nghiệp và PTNT. Trung tâm tin học và thống kê, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn. 5. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004.Giáo trình bệnh học thủy sản, Khoa nuôi trồng thủy sản, Đại học Thủy sản Nha Trang. 6. Hawke, J.P, R.M Durborow, R.L Thune and A.C Camus, 1998. ESC – Enteric Septicemia of Catfish. SRAC Publication No.477. 7. Hawke, J P. 1979. A bacterium associated with disease of pond – cultured channel catfish. J. Fish. Res. Board Can. 8. Huỳnh Chí Thanh, 2007. Xác định đặc điểm sinh hóa và bước đầu thử nghiệm điều trị bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra ( Pangasius hypophthalmus) bằng kháng sinh. Luận văn tốt nghiệp Đại học, Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ. 44 trang. 9. Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc, 2006. Bài giảng thuốc, hóa chất dùng trong thủy sản. Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 26 10. Nguyễn Chính, 2005. Đánh giá tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra thâm canh tại An Giang và Cần Thơ. Luận văn cao học. Khoa Thủy Sản. 11. Nguyễn Đức Hiền, 2008. Giải pháp tăng hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trên cá tra ( Pangasianodon hypophthalmus). Tạp chí khoa học Thủy Sản, quyển 2, 2008. 12. Nguyễn Hoài Hương, 2009. Bài giảng thực hành sinh lý động, thực vật. Khoa môi trường và công nghệ Sinh học. Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM, 33 trang. 13. Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan, 2007. Phân lập và khảo sát đặc điểm kháng kháng sinh của Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Pangasius hypophthalmus nuôi thâm canh. Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, Khoa Thủy Sản, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Số 1&2, 2007. 14. Nguyễn Ngọc Hải, 2004. Điều tra kỹ thuật và tình hình sử dụng thuốc hóa chất trong ương cá tra giống (Pangasius hypophthalmus). Luận văn tốt nghiệp Đại học, Khoa thủy sản. 15. Nguyễn Khang, 2005. Kháng sinh học ứng dụng, nhà xuất bản y học, Hà Nội. 16. Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008. Điều tra hiện trạng nuôi, bệnh và tình hình sử dụng thuốc hóa chất trong nuôi thâm canh cá tra ao. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ.84 trang. 17. Nguyễn Thị Thúy Liễu, 2008. Đánh giá các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu trên cá tra nuôi trong ao bị bệnh mủ gan. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ. 49 trang. 18. Phạm Thị Phương Tiến, 2008. Xác định một số yếu tố huyết học trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) trắng gan trắng mang ở một số tỉnh nuôi cá tra tại Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ. 73 trang. 19. Phan Thị Hừng, 2004. Nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng tế bào hồng cầu trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn tốt nghiệp đại học. Khoa Thủy Sản. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 27 20. Silva Romão, Lucélia Donatti, Matheus O. Freitas, Josiane Teixeira and Josiana Kusma, 2006. Blood paremeter analysis and morphological alterations as biomarkers on the health of Hoplias malabaricus and Geophagus brasiliensis. Brazilian archives of biology and technology. 21. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa, 2005. Giáo trình Bệnh học thủy sản, 131 trang. 22. T T Dung, M Crumlish, H W Ferguson, N T N Ngoc, NQ Thịnh và D T M Thy, 2002. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm trắng trên gan cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi thâm canh ở đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí khoa học thủy sản, 2002. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 28 PHỤ LỤC Phụ lục1: danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản (Ban hành kèm theo Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24 tháng 2 năm 2005 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản) TT Tên hoá chất, kháng sinh Đối tượng áp dụng 1 Aristolochia spp và các chế phẩm từ chúng Thức ăn, thuốc thú y, hoá chất, chất xử lý môi trường, chất tẩy rửa khử trùng, chất bảo quản, kem bôi da tay trong tất cả các khâu sản xuất giống, nuôi trồng động thực vật dưới nước và lưỡng cư, dịch vụ nghề cá và bảo quản, chế biến. 2 Chloramphenicol 3 Chloroform 4 Chlorpromazine 5 Colchicine 6 Dapsone 7 Dimetridazole 8 Metronidazole 9 Nitrofuran (bao gồm cả Furazolidone) 10 Ronidazole 11 Green Malachite (Xanh Malachite) 12 Ipronidazole 13 Các Nitroimidazole khác 14 Clenbuterol 15 Diethylstibestrol (DES) 16 Glycopeptides 17 Trichlorfon (Dipterex) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 29 Phụ lục1: Danh mục hóa chất, kháng sinh hạn chế sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản (Ban hành kèm theo Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24 tháng 2 năm 2005 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản) TT Tên hoá chất, kháng sinh Dư lượng tối đa (ppb)* Mục đích sử dụng Thời gian dừng thuốc trước khi thu hoạch làm thực phẩm 1 Amoxicillin 50 Dùng làm nguyên liệu sản xuất thuốc thú y cho đông, thực vật thủy sản và lưỡng cư Cơ sở SXKD phải có đủ bằng chứng khoa học và thực tiễn về thời gian thải loại dư lượng thuốc trong động, thực vật dưới nước và lưỡng cư xuống dưới mức giới hạn cho phép cho từng đối tượng nuôi và phải ghi thời gian ngừng sử dụng thuốc trước khi thu hoạch trên nhãn sản phẩm 2 Ampicillin 50 3 Benzylpenicillin 50 4 Cloxacillin 300 5 Dicloxacillin 300 6 Oxacillin 300 7 Danofloxacin 100 8 Difloxacin 300 9 Enrofloxacin 100 10 Ciprofloxacin 100 11 Oxolinic Acid 100 12 Sarafloxacin 30 13 Flumepuine 600 14 Colistin 150 15 Cypermethrim 50 16 Deltamethrin 10 17 Diflubenzuron 1000 18 Teflubenzuron 500 19 Emamectin 100 20 Erythromycine 200 21 Tilmicosin 50 22 Tylosin 100 23 Florfenicol 1000 34 Lincomycine 100 25 Neomycine 500 26 Paromomycin 500 27 Spectinomycin 300 28 Chlortetracycline 100 29 Oxytetracycline 100 30 Tetracycline 100 31 Sulfonamide(các loại) 100 32 Trimethoprim 50 33 Ormetoprim 50 34 Tricaine methanesulfonate 15-330 * Tính trong động, thực vật dưới nước, lưỡng cư và sản phẩm động, thực vật dưới nước, lưỡng cư . PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 30 Phụ lục 2: Phương pháp xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn Y Nhuộm gram _ Sử dụng lame sạch, cho 1 ít nước muối sinh lý lên lame. _ Dùng que cấy tiệt trùng nhặt 1 ít vi khuẩn cho lên lame có nước muối sinh lý và trải đều. _ Để lame khô tự nhiên. _ Hơ lame qua đèn cồn để cố định vi khuẩn, để lame nguội và tiến hành nhuộm: + Nhuộm crytal violet ( dd1) khoảng 1 phút, rửa lame bằng nước. + Nhuộm iodine ( dd2) trong 1 phút, rửa lame bằng nước. + Rửa bằng dung dịch alcohol/acetone ( dd3) từ 2-3 giây. + Rửa lại bằng nước sạch. + Nhuộm safranin ( dd4) khoảng 2 phút, rửa bằng nước sạch và để khô. _ Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, vật kính 100X ( có giọt dầu). Kết quả: Gram dương – màu xanh/ tím. Gram âm – màu đỏ/ hồng. Y Tính di động Cho Vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lamelle trên bàn + Dùng pipet tiệt trùng nhỏ 1 giọt nước sinh lý ( 0.85%NaCl) lên lamelle. + Tiệt trùng que cấy , lấy 1 ít vi khuẩn hòa vào nước muối sinh lý trên lamelle. + Dùng lame đặt nhẹ lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước muối chúa vi khuẩn. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 31 + Cẩn thận lật thật nhẹ lamelle lên để giọt nước được treo ngược trên lamelle. + Đặt lame lên kính hiển vi và quan sát tính di động ở vật kính 40X. Y Phản ứng oxidase _ Chạm nhẹ que thử oxidase vào 1 khuẩn lạc trên đĩa agar hoặc dùng que cấy nhặt 1 khuẩn lạc cho tiếp xúc trên que thử oxidase. _ Quan sát que thử trong 30 giây và ghi nhận sự thay đổi màu sắc. _ Kết quả: Que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng oxidase dương tính và không chuyển màu là âm tính. Y Phản ứng catalase _ Nhỏ 1 giọt dung dịch 3% H2O2 lên lame. _ Dùng que cấy tiệt trùng lấy 1 ít vi khuẩn cho vào dung dịch 3% H2O2. _ Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng catalase dương tính (+) sẽ gây ra hiện tượng sủi bọt trong dung dịch 3% H2O2 và ngược lại. Y Khả năng lên men và oxi hóa đường glucose (O-F test) _ Đun và khuấy tan hoàn toàn môi trường O/F. _ Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội 45 phút. _ Thêm 1% glucose tiệt trùng. Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm. _ Dùng đầu que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn trên đĩa agar. _ Cấy thẳng vào 2 ống nghiệm chứa môi trường O/F. _ Phủ 0,5-1ml dầu paraffin tiệt trùng vào 1 ống nghiệm tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm ( khả năng lên men glucose:F). _ Ống còn lại sẽ kiểm tra tính hiếu khí của vi khuẩn ( khả năng oxy hóa : O). _ Ủ trong tủ ấm 28-300C . _ Đọc kết quả sau 1-7 ngày: PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 32 + Lên men (F) khi ống có phủ dầu paraffin chuyển sang màu vàng. + Oxidation (O) khi ống không phủ dầu paraffin chuyển sang màu vàng. + Không phản ứng khi cả 2 ống nghiệm đều màu xanh. Y Phản ứng decarboxylase _ Môi trường decarboxylase + 0.5% yeast extract. _ Thêm 1% amino acid (Arginine, Lysine, Ornithine) cho các phản ứng. Môi trường làm đối chứng không có amino acid. _ Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm, thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội. _ Dùng pipet tiệt trùng cho dung dịch vi khuẩn vào 4 ống nghiệm: 1 ống đối chứng không có acid amin, 3 ống còn lại chứa arginnine, lysine và ornithine( từ 2-3 giọt/mỗi ống nghiệm). _ Phủ lên mỗi ống 0,5-1ml dầu paraffin tiệt trùng. _ Ủ trong tủ ấm ở 28-300C. _ Đọc kết quả từ 1-4 ngày. Kết quả: Phản ứng (+) khi các ống nghiệm có acid amin chuyển màu khác với màu ống đối chứng và ngược lại. Y Khả năng sinh indole _ Môi trường nutrient broth. _ Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm, thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội. _ Dùng pipet tiệt trùng cho 2-3 giọt dung dịch vi khuẩn vào ống nghiệm. _ Ủ trong tủ ấm 28-300C. _ Sau 24 - 48h nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm và đọc kết quả. Kết quả: Phản ứng (+) sẽ có 1 vòng màu hồng đến đỏ sậm trên bề mặt của môi trường và ngược lại. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 33 Y Phản ứng voges-prokauer (VP) _ Môi trường MR-VP broth. _ Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm, thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội. _ Thuốc thử: A: hòa tan 5g α - napthol trong 100ml ethyl alcohol. B: hòa tan 40g KOH trong 100ml nước cất. _ Dùng pipet tiệt trùng cho 2-3 giọt dung dịch vi khuẩn vào ống nghiệm. _ Ủ trong tủ ấm 28-300C. _ Sau 1-5 ngày nhỏ 0,6ml thuốc thử A + 0.2ml thuốc thử B vào ống nghiệm. _ Lắc đều và để nghiêng ống nghiệm 15 phút đến 1h. _ Sau 10-15 phút đọc kết quả. Kết quả: Phản ứng (+) có màu hồng và ngược lại. Y Khả năng sử dụng đường, sinh gar và H2S _ Môi trường TSI. _ Đun khuấy cho tan hoàn toàn, thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội. _ Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm để nghiêng tạo mặt phẳng nghiêng và chừa lại khoảng 1-2cm thạch đứng trong ống nghiệm và để nguội. Cấy vi khuẩn trên mặt nghiêng và mặt đứng của ống nghiệm, ủ trong tủ ấm 28-300C. _ Đọc kết quả trong vòng 14-28 giờ. + Vi khuẩn chỉ lên men đường glucose cho màu đỏ ờ phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng. + Vi khuẩn lên men đường glucose, lactose hoặc sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng. + Vi khuẩn chỉ lên men đường lactose hoặc sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 34 + Vi khuẩn chỉ lên men đường glucose không lên men đường lactose hoặc sucrose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng. + Vi khuẩn sinh khí H2S cho màu đen trong ống nghiệm. + Vi khuẩn sinh gar tạo bọt khí trong ống nghiệm. Phụ lục 3:Phương pháp pha hóa chất ( Supranee Chinabut & ctv, 1991) Dung dịch Giemsa Giemsa 3,8 g Methyl alcohol 75 ml Glycerin 25 ml Trộn Giemsa trong glycerin, đặt trong tủ sấy 60°C khoảng 2 giờ sau đó thêm methyl alcohol. Dung dịch Wright Wright’s 1 g Methyl alcohol 600 ml Hòa tan Wright trong methyl alcohol. Khuấy qua đêm rồi lọc và trữ trong chai nâu. Dung dịch đếm hồng cầu NaCl 3,88g Na2SO4 2,5g Na2HPO4.12H2O 2,91g KH2PO4 0,25g Formaline(37%) 7,5ml Methyl violet 2B 0,1g Nước cất 1000ml Trộn tất cả các chất rồi thêm nước cất và khuấy qua đêm. Lọc và chuẩn độ khi pH bằng 7.3. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 35 Dung dịch pH 6.2- 6.8 1. Hòa tan 27.6g NaH2PO4 trong 1000ml nước cất. 2. Hòa tan 53.6g Na2HPO4.7H2O trong 1000ml nước cất. Trộn (1) và (2) theo tỉ lệ : pH Dung dịch NaH2PO4 ( ml) Dung dịch Na2HPO4 5.9 90 10 6.1 85 15 6.3 77 23 6.5 68 32 6.7 57 43 6.9 45 55 7.1 33 67 7.3 23 77 7.4 19 81 7.5 16 54 7.7 10 90 Dung dịch đệm pH 6.2 1. Hòa tan 19,212g acid citric 0,1M trong 1000 ml nước cất. 2. Hòa tan 28,396g Na2HPO4 trong 1000 ml nước cất. Trộn 6,78ml dung dịch (1) và 13,22ml dung dịch (2). Chuẩn độ đến khi được dung đọc pH 6,2. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 36 Phụ lục 4: ¬ Số lượng hồng cầu và bạch cầu cá tra trước khi sử dụng kháng sinh Con HC TBC L T M N 1 1165000 40172.41 33744.83 1205.172 200.8621 5021.552 2 2195000 131855.1 106802.7 5274.205 659.2756 19118.99 3 2245000 72618.72 47928.36 2904.749 1815.468 19970.15 4 2220000 79723.76 68562.43 4384.807 797.2376 5979.282 5 1175000 55796.09 26782.12 17296.79 1115.922 10601.26 6 2185000 87884.88 37351.07 41745.32 878.8488 7909.639 7 2340000 77355.37 64591.74 1933.884 1160.331 9669.421 8 2005000 101092.4 50546.22 34876.89 6065.546 9603.782 9 2830000 130251 94432.01 18235.15 3256.276 14327.62 10 2210000 74631.29 37315.64 16418.88 373.1564 20523.6 11 1580000 66977.07 48893.26 7702.363 8707.019 1674.427 12 740000 23411.28 16622.01 2575.241 3628.748 585.282 13 1730000 48615.49 39621.62 2187.697 6563.091 243.0775 14 985000 33965.52 23775.86 2717.241 3736.207 3736.207 TB 1828929 73189.3 49783.6 11382.7 2782.7 9211.7 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 37 ¬ Số lượng hồng cầu và bạch cầu cá tra sau khi sử dụng kháng sinh NT Stt HC TBC L T M N 1 (Amoxicilin) 1 335000 27815.88 16133.21 2086.191 3894.224 2364.35 2 2345000 28481.78 6978.036 2278.543 2848.178 8544.534 3 2965000 93803.3 37521.32 23450.83 2345.083 25795.91 4 1605000 28310.72 7077.68 9200.984 4954.376 6653.019 5 2570000 66798.91 13693.78 6345.896 12691.79 33399.45 TB 1964000 49042.1 16280.8 8672.5 5346.7 15351.5 2 (Flofenicol) 1 2975000 83601.78 33022.7 6270.134 20482.44 18810.4 2 2385000 87356.6 41494.38 12666.71 4367.83 20092.02 3 1845000 41503.07 13280.98 1037.577 6432.975 18883.9 4 1940000 54516.79 24259.97 1090.336 20171.21 8722.687 TB 2286250 66744.6 28014.5 5266.2 12863.6 16627.3 3 (Doxycilin) 1 970000 88951.97 58263.54 21348.47 7116.157 1334.279 2 1205000 70582.22 47290.08 5293.666 10940.24 1058.733 3 1580000 97282.38 38426.54 4377.707 1459.236 51559.66 4 1895000 108171.2 74638.16 8112.844 13521.41 10817.12 5 1350000 92307.69 38307.69 24923.08 15230.77 13846.15 TB 1400000 91459.1 51385.2 12811.2 9653.6 15723.2 4 (Flofenicol + Amoxicilin 1 785000 22613.17 15716.15 3165.844 2487.449 1130.658 2 1420000 55069.25 30288.09 7434.349 7434.349 9912.465 3 1740000 62486.19 42803.04 4686.464 4061.602 10935.08 4 895000 45784.86 18542.87 4578.486 5036.335 17627.17 5 1775000 75243.22 19187.02 7900.539 9029.187 38750.26 TB 1365000 52239.3 25307.4 5553.1 5609.8 15671.1 5 (Flofenicol + Doxycilin) 1 1220000 8187.919 4421.477 1842.282 40.9396 1473.826 2 1455000 54336.1 30971.58 2173.444 543.361 16844.19 3 1105000 57342.22 13762.13 3153.822 6307.644 34118.62 4 835000 70639.91 48741.54 3885.195 12715.18 353.1996 5 1140000 63377.9 23449.82 30738.28 6020.901 1267.558 TB 1151000 50776.8 24269.3 8358.6 5125.6 10811.5 6 (Amoxicilin +Doxycilin) 1 330000 49019.91 31127.64 6862.787 3431.394 4166.692 2 1510000 65104.31 41992.28 7812.517 1953.129 9765.647 3 2410000 137568.7 76350.63 37143.55 4127.061 19259.62 4 1725000 97183.1 57823.94 19436.62 5830.986 13605.63 5 1795000 149043.3 61852.98 52165.16 30553.88 4471.3 TB 1554000 99583.9 53829.5 24684.1 9179.3 10253.8 7 ( Đối chứng) 1 865000 70472.24 25722.37 35236.12 3171.251 1761.806 2 850000 33575.88 14773.39 1175.156 9737.006 2853.95 3 770000 63935.02 9270.578 9590.253 12787 23016.61 4 620000 7107.215 3589.144 817.3297 319.8247 1563.587 TB 776250 43772.6 13338.9 11704.7 6503.8 7299.0 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 38 tru oc N T1 tru oc N T2 tru oc N T3 tru oc N T4 tru oc N T5 tru oc N T6 tru oc N T7 M ea n 18 28 92 8. 57 19 64 00 0 18 28 92 8. 57 22 86 25 0 18 28 92 8. 57 14 00 00 0 18 28 92 8. 57 13 23 00 0 18 28 92 8. 57 11 51 00 0 18 28 92 8. 57 15 54 00 0 18 28 92 8. 57 77 62 50 V ar ia nc e 3. 74 19 7E +1 1 1. 07 42 3E +1 2 3. 74 19 7E +1 1 2. 66 24 E+ 11 3. 74 19 7E +1 1 1. 25 71 3E +1 1 3. 74 19 7E +1 1 2. 15 05 8E +1 1 3. 74 19 7E +1 1 49 81 75 00 00 0 3. 74 19 7E +1 1 5. 80 04 3E +1 1 3. 74 19 7E +1 1 12 58 95 83 33 3 O bs er va tio ns 14 5 14 4 14 5 14 5 14 5 14 5 14 4 df 5 6 13 9 17 6 15 t S ta t -0 .2 74 81 35 2 -1 .4 97 29 74 9 1. 88 33 16 5 1. 91 57 93 58 6 3. 53 91 51 53 5 0. 72 76 99 08 3 6. 09 02 68 43 7 P( T <= t) o ne -t ai l 6 12 0. 39 72 26 2. 16 03 68 65 2 2. 16 03 68 65 2 2. 16 03 68 65 2 2. 16 03 68 65 2 2. 16 03 68 65 2 2. 16 03 68 65 2 2. 16 03 68 65 2 2. 16 03 68 65 2 2. 16 03 68 65 2 2. 16 03 68 65 2 2. 16 03 68 65 2 2. 16 03 68 65 2 t C ri tic al o ne -t ai l 2. 01 50 48 37 2 1. 94 31 80 27 4 1. 77 09 33 38 3 1. 83 31 12 92 3 1. 73 96 06 71 6 1. 94 31 80 27 4 1. 75 30 50 32 5 P( T <= t) tw o -t ai l 0. 79 44 53 22 4 0. 18 49 60 53 4 0. 08 22 22 07 8 0. 08 76 44 95 3 0. 00 25 20 67 8 0. 49 42 03 67 4 2. 06 78 1E -0 5 t C ri tic al tw o -t ai 2. 57 05 81 83 5 2. 44 69 11 84 6 2. 16 03 68 65 2 2. 26 21 57 15 8 2. 10 98 15 55 9 2. 44 69 11 84 6 2. 13 14 49 53 6 Ph ụ lụ c 5: T hố ng k ê hồ ng c ầu tr ướ c kh i s ử dụ ng k há ng si nh v à sa u kh i s ử dụ ng k há ng si nh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 39 tru oc N T1 tru oc N T2 tru oc N T3 tru oc N T4 tru oc N T5 tru oc N T6 tru oc N T7 M ea n 73 16 7. 89 17 49 04 2. 11 84 73 16 7. 89 17 66 74 4. 56 04 73 16 7. 89 17 91 45 9. 09 97 73 16 7. 89 17 52 23 9. 33 93 73 16 7. 89 17 50 77 6. 81 02 73 16 7. 89 17 99 58 3. 87 73 16 7. 89 17 77 62 50 V ar ia nc e 10 62 01 38 21 90 54 84 59 0. 4 10 62 01 38 21 49 85 57 78 9. 7 10 62 01 38 21 18 90 14 13 9. 3 10 62 01 38 21 39 03 88 82 1. 7 10 62 01 38 21 60 57 29 27 6. 8 10 62 01 38 21 19 10 10 08 29 10 62 01 38 21 12 58 95 83 33 3 O bs er va tio s 14 5 14 4 14 5 14 5 14 5 14 5 14 4 df 8 7 16 12 9 6 3 t St at 1. 50 50 56 02 1 0. 45 36 34 16 3 -1 .7 15 68 17 6 1. 68 68 21 93 4 1. 59 52 82 36 2 -1 .2 34 50 16 4 -1 2. 38 39 38 4 P( T <= t) o ne -t ai l 0. 08 53 62 81 9 0. 33 19 10 61 0. 05 27 58 41 7 0. 05 87 18 82 4 0. 07 25 56 73 4 0. 13 15 84 28 7 0. 00 05 67 23 5 t C ri tic al o ne -t ai l 1. 85 95 48 03 3 1. 89 45 78 60 4 1. 74 58 83 66 9 1. 78 22 87 54 8 1. 83 31 12 92 3 1. 94 31 80 27 4 2. 35 33 63 43 5 P( T <= t) tw o -t ai l 0. 17 07 25 63 8 0. 66 38 21 21 9 0. 10 55 16 83 5 0. 11 74 37 64 8 0. 14 51 13 46 7 0. 26 31 68 57 4 0. 00 11 34 46 9 t C ri tic al tw o -t ai l 2 .3 06 00 41 33 2. 36 46 24 25 1 2. 11 99 05 28 5 2. 17 88 12 82 7 2. 26 21 57 15 8 2. 44 69 11 84 6 3. 18 24 46 30 5 Ph ụ lụ c 5: T hố ng k ê tổ ng b ạc h cầ u tr ướ c kh i s ử dụ ng k há ng si nh v à sa u kh i s ử dụ ng k há ng si nh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 40 t ru oc N T1 tru oc N T2 tru oc N T3 tru oc N T4 tru oc N T5 tru oc N T6 tru oc N T7 M ea n 49 78 3. 55 87 16 28 0. 80 51 49 78 3. 55 87 28 01 4. 51 08 49 78 3. 55 87 51 38 5. 20 28 49 78 3. 55 87 25 30 7. 43 43 49 78 3. 55 87 24 26 9. 30 99 49 78 3. 55 87 53 82 9. 49 58 49 78 3. 55 87 13 33 8. 86 96 V ar ia nc e 67 66 98 55 1 15 72 78 25 5 67 66 98 55 1 14 59 87 48 2 67 66 98 55 1 23 59 32 44 2 67 66 98 55 1 12 65 28 64 0 67 66 98 55 1 28 72 04 81 8 67 66 98 55 1 31 07 56 85 0 67 66 98 55 1 89 00 56 81 .5 O bs er va tio ns 14 5 14 4 14 5 14 5 14 5 14 5 14 4 df 15 12 12 16 11 11 14 t S ta t 3. 75 06 18 03 6 2. 36 35 14 94 -0 .1 63 87 55 2 2. 85 22 12 08 2. 48 07 78 78 -0 .3 84 91 38 7 4. 33 78 22 64 9 P( T <= t) o ne -t ai l 0. 00 09 64 25 6 0. 01 79 10 79 7 0. 43 62 78 44 2 0. 00 57 64 04 0. 01 52 65 72 9 0. 35 38 19 74 3 0. 00 03 40 91 6 t C ri tic al o ne -t ai l 1. 75 30 50 32 5 1. 78 22 87 54 8 1. 78 22 87 54 8 1. 74 58 83 66 9 1. 79 58 84 81 4 1. 79 58 84 81 4 1. 76 13 10 11 5 P( T <= t) tw o- ta il 0. 00 19 28 51 2 0. 03 58 21 59 4 0. 87 25 56 88 3 0. 01 15 28 08 0. 03 05 31 45 8 0. 70 76 39 48 7 0. 00 06 81 83 3 t C ri tic al tw o- ta il 2. 13 14 49 53 6 2. 17 88 12 82 7 2. 17 88 12 82 7 2. 11 99 05 28 5 2. 20 09 85 15 9 2. 20 09 85 15 9 2. 14 47 86 68 1 Ph ụ lụ c 5: T hố ng k ê tế b ào ly m ph o tr ướ c kh i s ử dụ ng k há ng si nh v à sa u kh i s ử dụ ng k há ng si nh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 41 tru oc N T1 tru oc N T2 tru oc N T3 tru oc N T4 tru oc N T5 tru oc N T6 tru oc N T7 M ea n 11 38 9. 88 47 86 72 .4 87 78 11 38 9. 88 47 52 66 .1 88 29 11 38 9. 88 47 12 81 1. 15 31 11 38 9. 88 47 55 53 .1 36 33 11 38 9. 88 47 83 58 .6 05 17 11 38 9. 88 47 24 68 4. 12 77 11 38 9. 88 47 11 70 4. 71 49 V ar ia nc e 16 79 18 23 5 77 08 83 58 .6 16 79 18 23 5 30 36 48 27 .6 16 79 18 23 5 92 32 35 60 .3 16 79 18 23 5 41 12 37 2. 09 16 79 18 23 5 15 71 67 45 7 16 79 18 23 5 38 50 58 06 9 16 79 18 23 5 26 25 34 93 2 O bs er va tio ns 14 5 14 4 14 5 14 5 14 5 14 5 14 4 df 11 13 10 15 7 5 4 t S ta t 0. 51 90 19 96 1 1. 38 37 18 67 8 -0 .2 57 52 48 7 1. 63 03 61 76 7 0. 45 99 84 10 3 -1 .4 09 14 12 3 -0 .0 35 73 28 3 P( T <= t) o ne - ta il 0. 30 70 14 34 8 0. 09 48 71 74 0. 40 09 97 68 7 0. 06 19 19 42 4 0. 32 97 36 95 5 0. 10 89 22 48 5 0. 48 66 03 75 3 t C ri tic al o ne -t ai l 1. 79 58 84 81 4 1. 77 09 33 38 3 1. 81 24 61 10 2 1. 75 30 50 32 5 1. 89 45 78 60 4 2. 01 50 48 37 2 2. 13 18 46 78 2 P( T <= t) tw o- ta il 0. 61 40 28 69 6 0. 18 97 43 48 1 0. 80 19 95 37 5 0. 12 38 38 84 8 0. 65 94 73 90 9 0. 21 78 44 97 0. 97 32 07 50 5 t C ri tic al tw o- ta il 2. 20 09 85 15 9 2. 16 03 68 65 2 2. 22 81 38 84 2 2. 13 14 49 53 6 2. 36 46 24 25 1 2. 57 05 81 83 5 2. 77 64 45 10 5 Ph ụ lụ c 5: T hố ng k ê tiể u cầ u tr ướ c kh i s ử dụ ng k há ng si nh v à sa u kh i s ử dụ ng k há ng si nh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 42 tru oc N T1 tru oc N T2 tru oc N T3 tru oc N T4 tru oc N T5 tru oc N T6 tru oc N T7 M ea n 92 11 .7 34 73 15 35 1. 45 28 92 11 .7 34 73 16 62 7. 25 04 92 11 .7 34 73 15 72 3. 19 03 92 11 .7 34 73 15 67 1. 12 79 92 11 .7 34 73 10 81 1. 47 85 92 11 .7 34 73 10 25 3. 77 84 92 11 .7 34 73 72 98 .9 87 5 V ar ia nc e 49 35 91 19 .5 18 13 69 66 7 49 35 91 19 .5 28 11 51 11 .6 49 35 91 19 .5 43 34 83 09 6 49 35 91 19 .5 20 08 72 51 1 49 35 91 19 .5 21 68 17 54 3 49 35 91 19 .5 40 76 70 14 .8 49 35 91 19 .5 11 01 19 03 3 O bs er va tio ns 14 5 14 4 14 5 14 5 14 5 14 5 14 4 df 5 6 4 5 5 8 4 t S ta t -0 .9 73 21 58 2 -2 .2 82 56 93 2 -0 .6 85 52 17 -0 .9 77 12 52 6 -0 .2 33 62 22 5 -0 .3 04 91 73 0. 34 32 32 93 4 P( T <= t) on e- ta il 0. 18 75 71 70 1 0. 03 12 89 35 9 0. 26 53 40 07 7 0. 18 66 91 46 8 0. 41 22 70 98 3 0. 38 41 05 57 4 0. 37 43 51 99 8 t C ri tic al o ne -t ai l 2. 01 50 48 37 2 1. 94 31 80 27 4 2. 13 18 46 78 2 2. 01 50 48 37 2 2. 01 50 48 37 2 1. 85 95 48 03 3 2. 13 18 46 78 2 P( T <= t) tw o- ta il 0. 37 51 43 40 1 0. 06 25 78 71 8 0. 53 06 80 15 4 0. 37 33 82 93 6 0. 82 45 41 96 5 0. 76 82 11 14 9 0. 74 87 03 99 6 t C ri tic al tw o- ta il 2. 57 05 81 83 5 2. 44 69 11 84 6 2. 77 64 45 10 5 2. 57 05 81 83 5 2. 57 05 81 83 5 2. 30 60 04 13 3 2. 77 64 45 10 5 Ph ụ lụ c 5: T hố ng k ê bạ ch c ầu tr un g tín h tr ướ c kh i s ử dụ ng k há ng si nh v à sa u kh i s ử dụ ng k há ng si nh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 43 tru oc N T1 tru oc N T2 tru oc N T3 tru oc N T4 tru oc N T5 tru oc N T6 tru oc N T7 M ea n 27 82 .7 13 45 53 46 .7 30 48 27 82 .7 13 45 12 86 3. 61 38 27 82 .7 13 45 96 53 .5 62 3 27 82 .7 13 45 56 09 .7 84 34 27 82 .7 13 45 51 25 .6 05 9 27 82 .7 13 45 91 79 .2 90 2 27 82 .7 13 45 65 03 .7 71 36 V ar ia nc e 71 46 80 2. 73 17 86 65 75 .4 71 46 80 2. 73 74 99 29 73 .7 71 46 80 2. 73 30 32 66 03 .4 71 46 80 2. 73 68 74 01 0. 81 71 46 80 2. 73 26 66 28 16 .9 71 46 80 2. 73 14 47 16 25 0 71 46 80 2. 73 33 09 32 34 .8 O bs er va tio ns 14 5 14 4 14 5 14 5 14 5 14 5 14 4 df 5 3 5 7 5 4 3 t S ta t -1 .2 68 78 67 1 -2 .2 97 12 96 5 -2 .6 79 38 96 7 -2 .0 58 95 96 6 -0 .9 69 24 27 9 -1 .1 78 62 98 1 -1 .2 55 52 49 3 P( T< =t ) o ne -t ai l 0. 13 01 87 63 7 0. 05 26 32 56 3 0. 02 19 26 09 0. 03 92 42 76 5 0. 18 84 69 72 2 0. 15 19 34 98 9 0. 14 90 89 41 t C ri tic al o ne -t ai l 2. 01 50 48 37 2 2. 35 33 63 43 5 2. 01 50 48 37 2 1. 89 45 78 60 4 2. 01 50 48 37 2 2. 13 18 46 78 2 2. 35 33 63 43 5 P( T< =t ) t w o- ta il 0. 26 03 75 27 5 0. 10 52 65 12 5 0. 04 38 52 18 0. 07 84 85 53 1 0. 37 69 39 44 4 0. 30 38 69 97 8 0. 29 81 78 82 1 t C ri tic al tw o- ta il 2. 57 05 81 83 5 3. 18 24 46 30 5 2. 57 05 81 83 5 2. 36 46 24 25 1 2. 57 05 81 83 5 2. 77 64 45 10 5 3. 18 24 46 30 5 Ph ụ lụ c 5: T hố ng k ê bạ ch c ầu đ ơn n hâ n tr ướ c kh i s ử dụ ng k há ng si nh v à sa u kh i s ử dụ ng k há ng si nh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 44 N T 7 B 3 0 0 0 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 B 2 0 0 0 0 20 20 20 40 80 10 0 B 1 0 0 0 60 80 10 0 10 0 1 10 0 10 0 10 0 N T 6 B3 30 40 40 40 40 40 40 50 60 10 0 B 2 0 20 20 20 20 20 20 20 20 10 0 B 1 0 0 0 10 10 10 10 10 10 10 0 N T 5 B 3 10 10 10 10 10 20 20 20 20 10 0 B 2 10 40 40 40 50 50 50 50 50 10 0 B 1 0 20 20 20 20 20 20 20 20 10 0 N T 4 B 3 20 30 30 30 30 30 30 30 30 10 0 B 2 0 0 0 0 10 10 20 20 20 10 0 B 1 20 60 60 80 80 80 80 80 80 10 0 N T 3 B3 30 60 60 60 60 60 60 60 60 10 0 B 2 20 30 30 40 40 40 40 40 40 10 0 B1 10 30 30 40 40 40 40 40 40 10 0 N T 2 B3 30 50 70 70 70 70 70 80 80 10 0 B 2 20 40 50 50 60 60 70 10 0 10 0 10 0 B 1 30 60 90 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 N T 1 B3 40 70 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 B 2 30 80 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 B 1 40 60 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 N gà y 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ph ụ lụ c 6: T ỉ l ệ ch ết c ủa c ác n gh iệ m th ức tr on g 10 n gà y th í n gh iệ m PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 45 Phụ lục 7 : Các chỉ tiêu sinh hóa vi khuẩn chỉ tiêu kết quả Gram - Hình dạng que Di động + Catalase + Oxidase - O-F glucose +/+ Simmons’citrate - H2S - Urea - Nồng độ muối 0% + 0.5% + 1% + 1.5% - 2% - Nitrite - Indole - VP - MR - Gelatin - Thủy ngân starch - Tween 80 - Các loại đường Manose + Sucrose - Xylose - Glucose + Mannit - Glycerol + Mantose - Rhamnoso - Inositol - Galactose + Sorbitol - Crystal violet - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 46 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 47 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 48 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 49 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 50 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 51 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 52 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 53 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 54 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 55 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 56 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 57 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 58 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 59 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 60 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 61 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 62 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 63 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 64 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 65 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 66 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 67 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 68 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 69 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 70 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 71 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 72 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 73 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 74 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 75 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version