Chẩn đoán vi khuẩn Listeriabằng kỹ thuật gen

Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 1 Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Lớp DH06SH Tiểu luận: CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC GIA CẦM CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LISTERIA BẰNG KỸ THUẬT GEN GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Phạm Ngọc Hà MSSV: 06126033 Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 2 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong số sáu loại Listeria được biết đến thì Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii là những tác nhân gây bệnh. Nhưng Listeria ivanovii rất hiếm khi gây bệnh cho người và động vật, trái lại Listeria monocytogenes lại gây bệnh Listeriosis rất phổ biến ở cả người và động vật. Đây là một loại bệnh thực sự nguy hiểm vì nó có thể dẫn đến tử vong, đặc biệt là đối với những người có hệ miễn dịch yếu như phụ nữ có thai, trẻ sơ sinh, người già yếu. Mặc khác Listeria monocytogenes lại tồn tại trong thực phẩm nên rất dễ lây nhiễm cho người đòi hỏi phải có công tác kiểm nghiệm thực phẩm khắt khe đối với vi khuẩn này. Thông thường trong chuẩn đoán vi khuẩn thường áp dụng kỹ thuật nuôi cấy phân lập trên một số môi trường chuyên biệt và xác định vi khuẩn thông qua các phản ứng sinh hóa… Nhưng do đối tượng thao thác là trên thực phẩm nên sử dụng phương pháp truyền thống là rất khó khăn, tốn kém và mất thời gian. Nhờ vậy mà các kỹ thuật gene với những ưu điểm nổi trội như nhanh, nhạy, chính xác đã được sử dụng để chuẩn đoán Listeria monocytogenes. II. TỔNG QUAN: II.1. Đôi nét về Listeria: Giống vi khuẩn Listeria thuộc tộc Lactobacilleae gồm những trực khuẩn nhỏ, không sinh bào tử, có lông ở một đầu nên có thể di động, gam dương, có phản ứng catalase dương tính, oxydase âm tính. Hiếu khí hoặc yếm khí tùy ý và có khả năng lên men đường. Giống này gồm nhiều loài gây bệnh cho gia súc và người, trong đó có loài Listeria monocytogenes là loài gây bệnh sảy thai truyền nhiễm ở cừu và làm tăng số bạch cầu đơn nhân trong máu của nhiều loài động vật như bò, ngựa, dê, cừu, heo, chuột, kể cả người. II.1.1. Phân loại: giống Listeria bao gồm 6 loài 1. Listeria monocytogenes. 2. L. innocua. 3. L. ivanovii. 4. L. seeligeri. 5. L. welshimeri. 6. L. grayi. II.2. Giới thiệu chung về Listeria motocytogenes Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 3 II.2.1. Đồng nghĩa và lịch sử Listeria monocytogenes đã được phân lập từ mẫu bệnh phẩm động vật năm 1926 bởi Prior, nhưng lúc đó chưa có đủ đặc tính chính xác để xác định nó. Cũng trong năm đó L. monocytogenes đã được khám phá bởi E.G.D Murray, Wenn và Swam năm 1926 từ chuột lang và thỏ bị viêm gan hoại tử và có tên là Bacterium monocytogenes.Năm 1927, vi sinh vật này cũng được Pirie phân lập từ gan bi bệnh của chuột nhảy (tatera tobengulae) tại nam Châu Phi, và được đặt tên là Listeria hepalolytica. Khi sự tồn tại của vi sinh vật này được xác minh, L. monocytogenes chính thức được Bergay đặt tên vào năm 1957. II.2.2. Phân bố và cách lây lan L. monocytogenes được phân bố rất rộng rãi, nó có trong đất, nước, phân, dịch tiết đường sinh dục và niêm mạc mũi của động vật khỏe…Rau củ có thể nhiễm khuẩn từ đất hoặc từ phân bón. Súc vật ở nông trại có thể nhiễm khuẩn mà không có triệu chứng gì và thực phẩm từ động vật như thịt, thịt gia cầm và các sản phẩm sữa có thể bị nhiễm khuẩn. Theo Sở giám sát và an toàn thực phẩm thuộc Bộ nông nghiệp, những trường hợp bệnh Listeriosis ở Mĩ đều liên quan đến thực phẩm xúc xích nhỏ xông khói, thịt hộp tươi ngon, patê lạnh, xúc xích Ý, pho phát mềm của Pháp, pho mát mềm kiểu Mêhicô, tôm, bơ, rau quả tươi và sữa chưa tiệt trùng. Trận dịch bệnh bùng phát có thể liên quan đến sò hến tôm cua, cá tươi, thủy sản xông khói, lưỡi heo, kem, xà lách gạo, xà lách cải bắp và patê thịt. Do đó, con người có nguy cơ nhiễm khuẩn L. monocytogenes cực kỳ cao với các loại thực phẩm chưa nấu chín kỹ trước khi ăn và các loại thức ăn làm sẵn. Bệnh thể hiện ở nhiều dạng và sự lây truyền của vi khuẩn có khác nhau. Nếu như ở dạng phủ tạng, sự lây nhiễm qua đường ăn uống. Nếu như ở dạng thần kinh chủ yếu lây nhiễm qua đường mắt và mũi. II.2.3. Hình thái và nhuộm màu L. monocytogenes gồm những trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, Gram dương. Trong môi trường nuôi cấy, khi tế bào còn non L.monocytogenes được tìm thấy ở dạng trực khuẩn. Nhưng trễ hơn dạng hình cầu (0,5µm×1-2 µm) lại chiếm ưu thế, đôi khi vi khuẩn xếp thành chuỗi ngắn(dễ nhầm với Streptococcus), lúc này chiêm mao dài 6-20 µm. Vi khuẩn không sinh bào tử, không tạo giáp mô, có khả năng di động. Ở 20-250C vi khuẩn di động mạnh nhất. Ở 370C vi khuẩn di động nhờ một chiêm mao ở đầu. Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 4 Khi nhuộm từ mô bệnh hoặc dịch nuôi cấy, đôi khi vi khuẩn có dạng hình cầu xếp chuỗi dễ nhầm với Streptococci. Trong trường hợp này có thể dùng phản ứng Catalase để phân biệt. Trong canh 3-6 giờ ở 370C vi khuẩn có dạng trực, nuôi cấy 3-5 ngày vi khuẩn có dạng dài 6-20 µm hay hơn(đặc biệt chủng R). Sự di động của Listeria dùng để phân biệt với Erysipelothrix. II.2.4. Đặc tính nuôi cấy và yêu cầu tăng trưởng Vi khuẩn có thể phát triển trong điều kiệm yếm khí. Nhiệt độ thích hợp 30-370C, pH 7,2-7,4 phát triển trên môi trường nhưng thường sử dụng môi trường thạch máu trong điều kiện 5-10% CO2 cho khuẩn lạc tròn bóng, màu trắng, đường kính 0,5-1mm và gây dung huyết. Trên môi trường Trytose agar tạo khóm sáng, trắng mờ và có màu xanh lam (màu blue- green) khi quan sát dưới ánh sáng nghiêng. Trên môi trường LSA (Listeria selective agar) tạo vòng đen quanh khóm do sự phân giải Esculin sau 24-48 giờ. Môi trường Gelatin không gây tan chảy. II.2.5. Đặc tính sinh hóa Lên men chậm các loại đường như glucose, rhamnose, salicin, levulose. Không lên men mannitol, xylose, lactose, saccarose. Phản ứng Catalaza dương tính. II.2.6. Sức đề kháng Khi tiến hành phân tích chẩn đoán Listeriosis và khảo sát nguồn nhiễm khuẩn thì thấy rằng vi khuẩn này có thể tồn tại trong thời gian dài lâu có thể là 90 ngày từ khi ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn và xuất hiện triệu chứng. Thời gian trung bình từ khi nhiễm khuẩn vào cơ thể đến khi phát bệnh khoảng 30 ngày. Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 5 Vi khuẩn này rất bền. Nó kháng nhiệt (mặc dầu nhiệt độ không cao, dưới 600C), muối, nitrite và acid, sống sót ở điều kiện lạnh đông và thậm chí có thể sinh sôi phát triển chậm chạp trong tủ lạnh(ở khoảng 40C). Vi khuẩn bị diệt ở 600C trong 30 phút và 720C trong 15 giây. Vi khuẩn đề kháng với sự khô hạn. Có thể sống sót trong thực phẩm và đất nhưng bị diệt bởi những chất sát trùng thông thường. Nhay cảm với nhiều loại kháng sinh nhưng tetracycline cho kết quả tốt nhất. Người ta có thể kết hợp giữa Trimethoprim với Sulphamethazol trong điều trị, vi khuẩn kháng lại với Quinolones. Erythromycine, ampicillin được dùng trong điều trị bệnh cho người. II.2.7. Cấu trúc kháng nguyên và độc tố Cấu trúc kháng nguyên của L.monocytogenes phức tạp, được chia thành 16 serotype căn bản dựa trên kháng nguyên O và H. Kháng nguyên O: Bền với nhiệt được chia thành 14 loại, ký hiệu 1-14. Kháng nguyên H: Không bền với nhiệt, chia làm 4 loại:a, b, c, d. Hiện nay có 3 chủng là nguyên nhân gây bệnh chính có cấu trúc kháng nguyên là: 1/2a; 1/2b; 4b ANTIGENS SEROTYPE O(HEAT STABLE) H(HEAT LABILE) 1a 1b I, II, (III) I, II, (III) A, B A, B, C 2 I, II, (III) B, D 3a 3b II, (III), IV II, (III), IV A, B A, B, C 4a 4b 4ab 4c 4d 4e (III), (V), VII, IX (III), V, VI (III), V, VI, VII, IX (III), V, VII (III), VI, VIII (III), V, VI, VIII, IX) A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C Độc tố Vi khuẩn sản sinh ra men hemolysinase có tính kháng nguyên protein. Cytolysin có tác dụng diệt tế bào. Trên bề mặt của tế bào vi khuẩn còn có lipo-polysaccharid độc đối với thỏ. II.2.8. Khả năng lây bệnh Trong tự nhiên vi khuẩn gây bệnh Listeriosis và ở dạng thần kinh đôi khi được gọi là bệnh quay mòng(circling disease) phổ biến nhất đối với động vật nhai lại như bò, cừu....đặc biệt vào mùa đông và đầu mùa xuân với mọi lứa tuổi. Đối với dạng phủ tạng thường gặp ở động vật dạ dày đơn. Bệnh có thể gây sảy thai ở ngựa. Ngoài ra vi khuẩn còn gây bệnh cho gia cầm và cá. Ở người thường gặp sảy thai, thai chết và viêm não. Ở vài động vật thể hiện sự gia tăng bạch cầu đơn nhân. Trong phòng thí nghiệm: Dùng thỏ và chuột lang. Chuột nhạy cảm, chết sau khi tiêm nhiễm 48 giờ với bệnh tích hoại tử gan. Dùng test ANTON gây viêm kết mạc mắt. Một bệnh do L.monocytogenes Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 6 Viêm màng não mủ, hay viêm màng não nhiễm khuẩn, là hiện tượng viêm của các màng bao bọc quanh hệ thần kinh trung ương (não và tủy sống) do sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh trong khoang dịch não tủy. Sự viêm nhiễm này sẽ gây nên tình trạng sinh mủ bên trong hệ thống thần kinh trung ương. Những bệnh nhân suy giảm miễn dịch như người già, trẻ sơ sinh, bệnh nhân điều trị thuốc ức chế miễn dịch, AIDS thường có nguy cơ bị bệnh. Viêm màng não mủ sơ sinh do tác nhân này thường nằm trong bối cảnh nhiễm trùng huyết nặng. Các dấu hiệu nghi ngờ trên lâm sàng là: mẹ thường có sốt, sinh non không rõ nguyên nhân, nhau thai có tổn thương hạt... II.2.9. Cơ chế gây bệnh Từ lâu các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng vi khuẩn Listeria lây lan từ tế bào này sang tế bào khác trong cơ thể con người. Vi khuẩn lớn lên trong một tế bào và di chuyển nhanh chóng tạo thành một cấu trúc theo hình ngón tay nhô ra từ tế bào và đẩy sang tế bào liền kề. Khi đó vi khuẩn sẽ tiếp tục gây bệnh cho tế bào liền kề đó. Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 7 Hamon et al. Nature Reviews Microbiology 4, 423–434 (June 2006) | doi:10.1038/nrmicro1413 a | L. monocytogenes đi vào tế bào như thể thực bào. b | Vi khuẩn bên trong không bào (Được biết như là thể thực bào). c,d | Màng của không bào bị phá vỡ bởi sự tiết ra hai loại phospholipases: PlcA và PlcB, and độc tố listeriolysin O. Vi khuẩn được giải phóng trong tế bào chất, nơi chúng được nhân lên nhiều lần và bắt đầu với sự trùng hợp actin). e | Sự trùng hợp actin cho phép vi khuẩn tạo thành một cấu trúc theo hình ngón tay nhô ra từ tế bào và vào tế bào chất tế bào liền kề. f |Trong tế bào bên cạnh, vi khuẩn hiện diện ở màng kép không bào từ đó chúng có thể thoát khỏi sự duy trì của chu kỳ. Giáo sư Ireton và nhóm của ông đã phát hiện ra một quá trình thứ hai hỗ trợ việc lây lan của vi khuẩn sang những tế bào khỏe mạnh mà trước đây chưa từng được biết đến. Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 8 Quá trình này dần dần đã làm suy yếu khả năng tự vệ khỏi việc nhiễm bệnh của tế bào thứ hai và đã xuất hiện trong lần xuất bản tuần này của tạp chí khoa học Nature Cell Biology. Vi khuẩn Listeria di chuyển qua tế bào chất của tế bào trong cơ thể người sử dụng một phần của khung tế bào gọi là các sợi actin, Vi khuấn Listeria có mày xanh và sợi actin màu đỏ. Qua ảnh có thể nhận thấy rằng sợi actin hình thành một cấu trúc dạng đuôi phía sau vi khuẩn. Những sợi actin này có tác dụng đẩy Vi khuẩn Listeria qua tế bào chất của tế bào trong cơ thể người. Những mũi tên trong ảnh cho thấy một con vi khuẩn đang chuyển động trong tế bào chất. (Ảnh: Keith Ireton) Màng tế bào, hay lớp ngoài cùng của những tế bào khỏe mạnh thông thường căng ra. Tình trạng căng đó được kỳ vọng là có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn không lây lan sang những tế bào chưa nhiễm bệnh liền kề. Tuy nhiên, phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton phát hiện ra rằng một loại pro-tê-in trong vi khuẩn Listeria gọi là InIC xuất hiện làm giảm đi độ căng của màng tế bào ở những tế bào nhiễm bệnh, điều này sẽ làm cho việc di chuyển của vi khuẩn để xuyên thủng màng tế bào và sau đó lây lan sang các tế bào khỏe mạnh liền kề dễ dàng hơn. Phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton cũng đưa ra bản báo cáo cho thấy cách mà InIC làm giảm độ căng là ngăn chặn chức năng của protein Tuba trong cơ thể người. Thông thường, chức năng của Tuba trong tế bào người không nhiễm bệnh là tạo ra độ căng của màng tế bào. Protein InIC trong vi khuẩn Listeria đã khống chế sự hoạt động của Tuba, làm giảm độ căng và giúp vi khuẩn lây lan sang các tế bào liền kề. II.2.10. Miễn dịch Cơ thể thú có thể hình thành miễn dịch sau khi nhiễm. Miễn dịch trung gian tế bào là chủ yếu. Hiện nay có hai loại vaccine chết và nhược độc có thể đem lại kết quả. Vaccine thường sử dụng: 1a và 4b đạt kết quả phòng bệnh trên cừu. Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 9 II.2.11. Chẩn đoán bằng phương pháp truyền thống Như chúng ta đã biết sử dụng phương pháp trên rất mất thời gian( ít nhất 10 ngày), đặc biệt đối với công tác phòng chống dịch bệnh hay trong xác định nguyên nhân gây bệnh ở người khi dịch bệnh bùng phát. Măc khác L. monocytogenes rất dễ nhầm lẫn với Erysipelothrix, do đó để xác đinh chính xác vi khuẩn này phải tiếp tục sử dung các phản ứng sinh hóa như: Đặc tính Listeria Erysipelothrix Di dộng Catalase Phân giải Exculin Sản sinh H2S Thạch máu Giết chết bồ câu + + + - + - - - - + - + II.2.12: Tình hình dịch bệnh Listeriosis Ca đầu tiên của bệnh Listeriosis đã được nói đến cách nay 70 năm, nhưng phải đợi đến những năm 1980 vi khuẩn L. monocytogenes mới được chính thức xác nhận là tác nhân gây ra bệnh ngộ độc từ thực phẩm. Từ tháng một đến tháng tám năm 1985, tại Mỹ có một đợt bùng phát khác với 142 ca nhiễm bệnh Listeriosis. Vào những năm 1990, Bộ Nông nghiệp Mĩ cho biết có một trận dịch bệnh này từ bánh mì kẹp xúc xích nóng và có thể là các cửa hàng bán thịt ngon dẫn đến ít nhất 101 người bị bệnh khiến 15 người lớn tử vong và 6 thai nhi bị sinh non. Năm 1999, loài L. monocytogenes đặc biệt cực độc đã tiến triển báo động các viên chức y tế và họ buộc những nhà sản xuất thực phẩm phải giải quyết vấn đề. Nuôi cấy trên môi trường LSA Bệnh phẩm: gan, lách, não, thai bi sảy… Nhuộm Gram Chọn khuẩn lạc Test ANTON Tiêm não thỏ (chết sau 2-3 ngày) Kiểm tra máu thỏ(Bạch cầu đơn nhân tăng 420-820/mm3) Thỏ bị nhiễm Listeria Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 10 Năm 2002, đợt bùng phát dịch bệnh Listeriosis ở nhiều bang ở Mỹ – một căn bệnh nguy hiểm do vi khuẩn Listeria gây ra -đã xác nhận có 46 ca nhiễm bệnh, 7 ca tử vong và 3 ca hỏng bào thai. Mặc dù “quy định tạm thời” đối với các sản phẩm thịt và thịt gia cầm chế biến sẵn phát hành năm 2003 giúp kiểm soát sự bùng phát vi khuẩn, nhưng rõ ràng đã không thể loại bỏ được bệnh hoàn toàn. Theo Trung tâm y tế dự phòng CDC, ước tính 2.500 người bị bệnh Listeriosis nặng mỗi năm, trong số đó có 500 người tử vong. Người có nguy cơ cao có thể mắc bệnh này sau khi ăn thực phẩm thậm chí chỉ nhiễm vài con vi khuẩn. Năm 2008 ổ dịch Listeriosis ở Canada nguyên nhân từ nhà máy Maple Leaf Foods ở Toronto, Ontario làm hai mươi hai người chết và có tổng số 57 trường hợp nhiễm bệnh. III. CÁC KỸ THUẬT THƯỜNG SỬ DỤNG ĐỂ CHUẨN ĐOÁN L.MONOCYTOGENES III.3.1. Giới thiệu kỹ thuật PCR , Real-Time PCR và Multiplex PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản trình tự DNA quan tâm trong test tube. K. Mullis đã phát minh ra PCR vào năm 1985  Ch 8 năm sau, K. Mullis đã nhân gii Noben cho phát minh này  Nguyên tắc: PCR là kỹ thuật invitro dùng để khuếch đại một trình tự DNA dựa trên nguyên tắc của một phản ứng sinh hóa nhờ hoạt động của enzyme polymerse. Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 11 Nguyên liệu:DNA quan tâm, enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt, 2 đoạn mồi nucleotide, 4 loại dNTP, dung dịch đệm cho phản ứng, Mg2+. Các bước thực hiện: - Giai đoạn 1: biến tính (denateration), nhiệt độ 94-950C trong 30-60s. - Giai đoạn 2: bắt cặp (annealation), nhiệt độ 40-700C - Giai đoạn 3: kéo dài (elongation), nhiệt độ 720C trong 1-2 phút. Qui trình thc hin xét nghim PCR  Chun b mu, ly trích DNA/RNA  Thc hin phn ng PCR trong máy luân nhit  ADN đích 1 Biến tính (94o C) 2 Bắt cặp (55-65o C) 3 Kéo dài (72o )C) 1 2 3 4 n Ly tâm và đun nóng Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 12 Phát hin sn phm khuch đi  Một phản ứng PCR bình thường không vượt quá 40 chu kỳ là tốt nhất. trong phản ứng PCR, sản phẩm được tạo ra theo cấp số nhân trên cơ sở những sản phẩm ban đầu nên nếu số chu kỳ khuếch đại quá lớn sẽ làm cho sản phẩm càng bị sai lệch so với sản phẩm ban đầu. Real Time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu trình nhiệt được theo dõi trực tiếp. Thực chất, hệ thống Real Time PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Real Time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành. Chọn chương trình chu kỳ nhiệt Điện di,quan sát và chụp ảnh Quang phổ huỳnh quang Máy luân nhiệt Máy vi tính Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 13 Qui trình thc hin Real‐ time PCR  Chn b mu, ly trích DNA/RNA  Thc hin phn ng PCR và phân tích báo cáo kt qu trên h thng real time PCR  iCycler iQ  Các khái niệm: Chu kỳ ngưỡng (Ct)là chu kỳ mà tại đó sản phẩm khuếch đại đã được tạo ra đủ để tín hiệu huỳnh quang có thể được phát hiện. Melt-curve: đường cong nóng chảy. Bằng cách nào để có tín hiệu Real- Time PCR, để biết phản ứng PCR đang xảy ra: Phẩm nhuộm khi chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang mạnh hơn khhi ở trạng thái tự do. Ethidium bromide –sáng gấp 25 lần SYBR green – sáng 200 lần Probe đặc hiệu có gắn chất phát huỳnh quang chỉ phát sang khi có bắt cặp với trình tự đích.: Beacon, Taqman…... Ly tâm và đun nóng Chọn chương trình real-time PCR Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 14 SYBR GREEN 1 Là thuốc nhuộm liên kết DNA được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay,liên kết không đặc hiệu với DNA mạch đôi. SYBR Green I chỉ phóng thích một lượng nhỏ tín hiệu huỳnh quang khi nó ở trong dung dịch, nhưng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng gấng 1000 lần khi nó liên kết với DNA mạch đôi. Như vậy, tín hiệu huỳnh quang tổng từ phản ứng sẽ tỷ lệ với lượng DNA mạch đôi hiện diện, và gia tăng khi trình tự mục tiêu được khuếch đại. Thuốc nhuộm liên kết DNA trong phản ứng Real-Time PCR. Tín hiệu huỳnh quang gia tăng rõ rệt khi phân tử thuốc nhuộm liên kết với DNA mạch đôi Những ưu điểm về khoa học và thực tiễn sẽ thúc đẩy bạn cố gắng thực hiện phản ứng multiplex, phản ứng khuếch đại nhiều hơn một mục tiêu trong ống phản ứng đơn. Hiện nay, ta có thể khuếch đại và định lượng nhiều nhất là 5 mục tiêu trong cùng 1 ống phản ứng với những ưu điểm là: 9 Giảm lượng mẫu cần thiết ban đầu, điều này quan trọng khi lượng mẫu ban đầu hạn chế. 9 Giảm hiện tượng âm tính giả, nếu một mẫu đối chứng được khuếch đại trong mỗi mẫu. 9 Gia tăng số lượng thí nghiệm thực hiện đồng thời giảm tiêu tốn hóa chất phản ứng. 9 Giảm đếm mức thấp nhất việc tác động đến mẫu và nguy cơ lây nhiễm trong phòng thí nghiệm. III.3.2. Giới thiệu về kỹ thuật miễn dịch từ phân tách (Immunomagnetic separation-IMS) Nguyên tắc của phương pháp IMS: Các hạt nhựa đồng dạng, siêu thuận từ, phân tán riêng rẽ được bao bọc với 1 phối tử đặc hiệu với 1 mục tiêu đặc biệt. Ví dụ như kháng thể với bề mặt kháng nguyên. Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 15 Các hạt di động sẽ gắn với mục tiêu, nhờ từ tính của chúng, tạo thành một phức hợp mục tiêu-hạt Mục tiêu sẽ dễ dàng phân lập từ mẫu khi sử dụng các hạt từ tính tập trung (MPC) Tính linh động: IMS có thể được biểu hiện trong hỗn hợp mẫu khi được cung cấp mẫu thích hợp được xử lý trước như: 9 Thực phẩm 9 Nước 9 Phân 9 Máu 9 Đất Tính linh hoạt:IMS được sử dụng với nhiều hệ thống xác định 9 Môi trường tế bào 9 PCR 9 ELISA 9 ATP 9 Luminometry(máy đọc huỳnh quang) 9 Microscopy(kính hiển vi) Các bước thực hiện IMS: 1. Chuẩn bị mẫu trước 2. Cho 1ml dung dịch mẫu và 20µl hạt từ vào ống ly tâm 3. Ủ 10 phút tại nhiệt độ phòng 5. Thực hiện phân tách miễn dịch với các hạt từ tính tập trung MPC-S 6. Rửa với dung dịch đệm PPS Tween 7. Thu hồi các hạt từ trong 100 µl dung dịch từ Ngoài ra ta có thể sử dụng AIMS, tất cả các bước đều tự động ta chỉ cần cho mẫu vào và cho máy hoạt động. III.4. Chuẩn đoán Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật gene Các loài Listeria đều có gene chung: gene DTH-18 ( Miêu tả bởi Wernars et al), gene listeriolysin O (hly A) và iap. Gen iap mã hóa cho protein p60, thường gặp ở tất cả loài Listeria, gene này được bảo tồn và đặc hiệu cho loài. P60 của Listeria monocytogenes, cần thiết cho sự bám chặt của sinh vật này vào tế bào eukaryotic và bảo vệ vi khuẩn này. Việc xác định sự hiện diện của vi khuẩn Listeria bằng kỹ thuật PCR vì vậy dựa trên sự nhân lên đặc hiệu của đoạn gene này. Phân lập L.monocytogenes từ phô mai: Sử dụng phương pháp Magnetic Immuno- Polymerase Chain Reaction (MIPA), kết hợp IMS và PCR. Dựa trên 2 gene DTH-18 và listeriolysinO. 25g phô mai đồng nhất với 225ml dung dịch tăng sinh Listeria(LEB)-làm giàu mẫu lần 1 => Lấy 0,1ml chuyển qua 10ml canh Fraser (Oxoid) và ủ 24 giờ ở 300C – làm giàu mẫu lần 2=>thu nhận tế bào bằng IMS => Lấy 10µl để thực hiện phản ứng PCR. Sử dụng primer được chọn từ một vị trí của gen listeriolysin O (gene này có một phần nhỏ trình tự trên Streptolysin và pneumolysin) Primer 1: 5’-CTAATCAAGACAATAAAATC-3’ Giữa vị trí 536bp và 555bp. Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 16 Primer 2: 5’-GTTAGTTCTACATCACCTGA-3’. Giữa vị trí 1037bp và 1056bp. Hỗn hợp phản ứng PCR 100µl bao gồm 10nM Tris HCl (pH=8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl, 0.001% (Wt/vol) gelatin, 100µM mỗi loại dNTP, 0.5µM mỗi primer và 1.25U Taq polymerase. Phản ứng PCR được thực hiện 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ bao gồm 3 bước biến tính ở 940C/1 phút, bắt cặp ở 500C/1 phút, kéo dài ở 720C/1 phút. Sản phẩm tạo thành được điện di trên gel agarose 1% nhuộm ethidium bromide hoặc được lọc bằng Z-probe(Bio-Rad) và lai với DNA probe mã hóa cho gene DTH-18. Probe listeriolysin O được đánh dấu sử dụng trong PCR. Điều kiện tương tự như miêu tả ở trên ngoại trừ 100µl thể tích phản ứng chứa 90µM dNTP và 10µM digoxigenin-dUTP. PCR dựa trên gene listeriolysin O dùng để xác định kiểu huyết thanh 4a. Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 17 Sản phẩm của phản ứng khuếch đại PCR từ mẫu phô mai có chứa Listeria monocytogenes sau khi đã làm giàu mẫu (A). 1µl mẫu (lane 1 đến lane 4), 2µl mẫu (lane 8 đến lane 11) từ dung dịch làm giàu mẫu. (B) kết quả PCR sau khi thực hiện miễn dịch từ phân tách(IMS) của 100µl mẫu Listeria (lane 1 đến lane 4). Trước khi làm giàu mẫu, 25g phô mai phân tích chứa 0 (Bảng A,lane 1 và 8. Bảng B, lane 1), 0.4 (Bảng A, lane 2 và 9. Bảng B, lane 2), 4 (Bảng A, lane 3 và 10. Bảng B, lane 3), 40 ( Bảng A, lane 4 và 11. Bảng B, lane 4) CFU/g phô mai. Lane 6 không chứa L. monocytogenes. Sự kiểm tra khẳng định chứa 0,05µg DNA L.monocytogenes tinh khiết (lane 5). Phage lambda DNA Pst I sử dụng làm chất chỉ thị phân tử (lane7). Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 18 Tuy nhiên, theo Wernors et al, trình tự 300bp của gene DTH-18 không xác định được L.monocytogenes kiểu huyết thanh 4a-kiểu huyết thanh không thường được phát hiện trong những trận dịch bệnh Listeriosis. Vậy phương pháp MIPA để xác định L.monocytogenes. Xác định L.monocytogenes bằng kỹ thuật lọc, IMS và Real-Time PCR Sử dụng hai dòng để nghiên cứu: dòng có độc lực cao có serotype 4b(CCUG 3998) được phân lập từ dịch thần kinh tủy sống của người và dòng có độc lực thấp hơn, được phân lập từ cá hồi xông khói. 9 Tế bào vi khuẩn được phát triển qua đêm trong canh brain heart infusion(BHI)(Oxoid, London, England) ở 300C. Thu nhận tế bào L.monocytogenes bằng ly tâm 7000vòng/phút Sản phẩm của phản ứng khuếch đại PCR từ mẫu phô mai được làm giàu lần 1 và 2. (A) 1µl mẫu (lane 1 đến lane 4), 2µl mẫu (lane 8 đến lane 11) từ dung dịch làm giàu mẫu lần 2. (B) Kết quả thực hiện PCR sau IMS của 100µl mẫu Listeria (lane 1 đến 4) Trước khi làm giàu mẫu, 25g phô mai phân tích chứa 0 (Bảng A,lane 4 và 11. Bảng B, lane 4), 1 (Bảng A, lane 1 và 10. Bảng B, lane 1), 10 (Bảng A, lane 2 và 9. Bảng B, lane 2), 100 ( Bảng A, lane 3 và 8. Bảng B, lane 3) CFU/g phô mai. Lane 6 không chứa L. monocytogenes. Sự kiểm tra khẳng định chứa 0,05µg DNA L.monocytogenes tinh khiết (lane 5). Phage lambda DNA Pst I sử dụng làm chất chỉ thị phân tử (lane7). Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 19 và rửa bằng dung dịch phosphate buffer saline(PBS) có chứa 150mM NaCl và 10mM Na2SO4 pH=7.2=>Pha loãng 10 lần dung dịch NaCl 0.9%. Tế bào có thể đếm được khi trải 100µl trên đĩa chromogenic Listeria agar( môi trường hình thành sắc tố)(OCLA, Oxoid, Basingstoke, England) và ủ 48 giờ tại 370C. 9 Phân lập chọn lọc và tập trung L.monocytogenes trong môi trường tự nhiên sử dụng IMS. Trong môi trường BHI với nồng độ L.monocytogenes giảm dần (10^8, 10^7, 10^6, 10^5, 10^4, 10^3, 10^2, 10^1 CFU/ml) được thu nhận bằng hạt từ Dynabeads anti- Listeria (DynalBiotech, Oslo, Norway)(Uyttendaele et al, 2000). 20µl hạt Anti-Listeria được thêm vào 1ml dung dịch chứa tế bào vi khuẩn, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng có khuấy trộn nhẹ. Mẫu được đặt trong hỗn hợp hạt từ tập trung(Dynal MPC-M, Dynal Biotech) trong 3 phút=> rửa giải bằng non-bufferred peptone water (0,1% peptone-0,85%NaCl), không rửa chuyển qua môi trường OCLA để đếm khuẩn lạc L.monocytogenes. Hiệu quả IMS được tính bằng bằng so sánh số tế bào chứa sau IMS và tổng số tế bào bám vào hạt từ. 9 Lọc và thực hiện IMS L.monocytogenes trong cá hồi. Chia ra 3 túi cá hồi xông khói lấy vào 3 thời điểm khác nhau ở siêu thị và cắt miếng 5g(20-30 miếng/con). Mẫu cá được giữ trong đĩa petri đã khử trùng và trữ ở -200C cho đến khi sử dụng. 200µl L.momocytogenes phát triển qua đêm được lậy nhiễm vào những miếng cá, mức độ tập trung từ 8×10^0 đến 8×10^5 cfu/mẫu. Mẫu đối chứng không gây nhiễm được thêm vào non-buffer peptone water vô trùng. Cả mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm L. monocytogenes được ủ ở 40C trong 24 giờ hay 7 ngày để vi khuẩn phát triển trên bề mặt và giữ trong điều kiện lạnh. Sau khi ủ mẫu cá được(5g) được chuyển vào túi lọc của màng lọc(Interscience, Bois des Arpents, St Nom, France) và đồng nhất với 15ml non- buffered peptone water trong 1 phút, lọc qua màng lọc tiêu chuẩn(đường kính lỗ >20µm, dày 100m; Duni, Duni AB Helmstad,Sweden) Thu nhận L.monocytogenes trong mẫu lọc được ước lượng bằng phương pháp đếm đĩa OCLA và môi trường BHI agar. Sau khi qua lưới lọc, 2ml của phần lọc ra được ly tâm 10000 vòng/ phút ở 70C. Kết quả được thu nhận lại trong 1ml PBS vô trùng trong ống ly tâm vô trùng và sau đó thực hiện IMS để thu nhận tế bào vi khuẩn. 9 Ly giải tế bào vi khuẩn cho PCR. Dịch huyền phù L.monocytogenes trong môi trường tự nhiên hay lây nhiễm cho cá được ly tâm 13000 vòng/phút thu được cụm tế bào vi khuẩn=> cho vào 100µl proteinase K trộn với 100µl dung dịch ly giải Tz(Abolmaaty et al, 2000)( 2% TritonX-100 và 2,5mg/ml sodium ozide trong 0,1 Tris-HCl buffer tại pH=8) và 100µl saline magnesium sulphate solution(2×TZ và 0,85%NaCl, 0,001M MgSO4) trong ống ly tâm nhỏ 1,5ml. Tế bào vi khuẩn được ly giải bởi nhiệt do ống được nấu sôi trong 20 phút. Ống đã xử lý nhiệt được làm mát ở nhiệt độ phòng và ly tâm 10000 vòng/ 3 phút=>50µl dịch tan nguyên được chuyển đi và 9,5µl được sử dụng làm mẫu trong PCR. Sự định lượng L.monocytogenes với SYBR Green/Real-Time PCR Assay.Gen listeriolysin(hly A) được chọn làm mục tiêu để xác định L.monocytogenes. Mồi xuôi: 5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’ Mồi ngược: 5’-CACTGCATCTCCGTGGTACTAA-3’ Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 20 Được sử dụng để khuếch đại đoạn 113bp của gene hly A(Nogva et al,2000). Định lượng Real-Time PCR được thực hiện bởi máy luân nhiệt M×3005(Stratagene, La Jolla, CA, USA) trong 25µl thể tích cuối chứa 9,5µl mẫu DNA, 300mM mồi xuôi và mồi ngược(DNA Technology, Arhus, Denmark) và 12,5µl 2×High power SWBR Green PCR Master M(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR bao gồm 45 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước biến tính ở 950C/15 giây,bắt cặp/ kéo dài ở 600C-60 giây. Phân tích melt-curve giữa 55-950C để kiểm tra sự đặc hiệu của phản ứng khuếch đại. Tất cả các mẫu được kiểm tra 3 lần. Đường cong chuẩn được xây dựng từ các nồng độ pha loãng của tế bào vi khuẩn và quan sát chu kỳ ngưỡng Ct. Xác định và phân tích sự khác nhau của các loài Listeria bằng Multiplex PCR. Sử dụng gen iap. Thiết kế 5 mồi khác nhau để xác định các loài Listeria bằng Multiplex PCR sau đó điện di trên gel.Xác định 1 mồi đặc hiệu cho loài Listeria và 4 mồi đặc hiệu cho L.monocytogenes, L.innocua, L.grayi, nhóm L.ivanovii, L.seeligeri và L.welshimeri. Các loại mồi sử dụng: Ino 2[5’-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3’] Lis 1B[5’-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3’] Khuếch đại đoạn gene của L.innocua dài 870bp Siwi 2[5’-TAACTGAGGTAGCGAGCGAA-3’] Lis 1B[5’-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3’] Khuếch đại đoạn gene của nhóm L.ivanovii, L.seeligeri và L.welshimeri dài 1,2kb. Mono A[5’-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3’] Lis 1B[5’-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3’] Khuếch đại đoạn gene của L.monocytogenes dài 660bp. Primer Mugrad và Lis 1B khuếch đại đoạn gene của L.gayi và L.murrayi dài 480bp. Các loài Listeria khác không có sản phẩm Dựa trên đó có thể thực hiện Multiplex PCR với các primer Ino 2, Lis 1B, Siwi 2, Mugrad, Mono A với tiến trình tương tự cho ra các đoạn có kích thước khac nhau và không có phản ứng chéo Sản phẩm PCR của L.monocytogenes với cặp mồi Mono A và Lis 1B trong 30 chu kỳ(950C/15 giây,580C/30 giây, 720C/45 giây) với lane 1 chuẩn Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens bằng kỹ thuật gene Phạm Ngọc Hà 21 VI: Kết luận Càng ngày có nhiều nguy cơ gây hại cho sức khỏe của con người và vật nuôi, Listeriosis là một trong những nguy cơ nguy hiểm và nó càng đáng quan tâm hơn khi nguyên nhân xảy ra hiện diện ở khắp mọi nơi đặc biệt là trong thức ăn của con người. Sử dụng phương pháp truyền thống để nhận biết sự tồn tại của Listeria đòi hỏi phải thực hiện các phản ứng sinh hóa như lên men đường, CAMP…trong phòng thí nghiệm và tiến trình này cần thời gian tối thiểu là 7 ngày theo International Dairy Federation (IDF) tiêu chuẩn 143:1995. Điều này không đáp ứng được yêu cầu trong chẩn đoán bệnh nhất là khi bộc phát dịch bệnh. Với sự ra đời và được cải tiến từng bước kỹ thuật PCR là phương pháp nhanh, nhạy, chính xác để xác định vi khuẩn Listeria nói chung và L.monocytogenes nói riêng. Mặt khác hiệu quả của PCR còn được tăng lên rất nhiều lần khi sử dụng kết hợp với phương pháp IMS. Thêm vào đó cải tiến PCR ta có được Multiplex PCR phương pháp này cho phép ta phân biệt rõ ràng giữa các loài Listeria, vì cho dù chỉ có L.monocytogenes là tác nhân gây bệnh thực sự nguy hiểm nhưng trên thực tế sự tồn tại của loài này không nhiều thì ít cũng có liên quan đến sự hiện diện của các loài Listeria khác. V. Tài liệu tham khảo 1. 2. Tô Minh Châu- Trần Thị Bích Liên(2001). Vi khuẩn và nấm gây bệnh trong thú y. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. William Burrows, Robert Murdoch Lewert, John Willarel Rippon(1968). Fex book of microbiology- The pathogenic Microorganisms. Xác đinh và phân biệt các loài Listeria dựa trên Multiplex PCR chứa 5 primers MugraI, MonoA, Ino2, and Siwi2, and Lis1B (Lis-Mix). Thực hiện phản ứng trong 30 chu kỳ (biến tính ở 95°C/15 giây, bắt cặp 58°C/30 giây, kéo dài 720C/45 giây) với lane 1 chuẩn