Chẩn đoán virus lở mồm long móng bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

1 Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ môn Công nghệ sinh học Lớp DH06SH Bài tiểu luận: CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Nguyễn Duy Lan MSSV: 06126067 _Tháng 10/2009 2 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành chăn nuôi được coi là một trong những ngành hàng quan trọng để chuyển đổi cơ cấu và thúc đẩy tăng trưởng nông nghiệp. Tuy nhiên, điều quan trọng hàng đầu là trong quá trình chọn giống và nuôi dưỡng chăm sóc, đàn gia súc phải luôn luôn khỏe mạnh, sức đề kháng cao và thành phần các chất dinh dưỡng tích lũy vào thịt có chất lượng tốt và có giá trị sinh học. Bệnh lở mồm long móng (tiếng Anh: Foot-and-mouth disease, viết tắt FMD; tiếng Latin: Aphtae epizooticae), là một loại bệnh rất nguy hiểm do virus gây ra trên động vật móng guốc chẵn như heo, bò, trâu, hươu, dê... Bệnh này rất nguy hiểm vì bệnh lây lan rất nhanh trên diện rộng qua nhiều con đường khác nhau như tiếp xúc trực tiếp giữa động vật với nhau, truyền qua không khí... Mặc dù tỷ lệ gây chết chỉ cao trên heo con, bê nghé; còn trên các gia súc lứa và trưởng thành nếu được điều trị tốt thú có thể phục hồi sau 1-2 tuần, song thiệt hại về kinh tế rất lớn, do tính lây lan quá mạnh. (8) Chính vì vậy mà Tổ chức Y tế Thế giới xếp bệnh lở mồm long móng đứng đầu các bệnh truyền nhiễm của động vật trong danh mục kiểm dịch quốc tế. Vì hiện nay những nước đã khống chế được bệnh rất hạn chế nhập khẩu gia súc, hoặc các sản phẩm động vật từ các nước chưa khống chế được bệnh LMLM, đây chính là mối nguy hại cho đầu ra của ngành chăn nuôi, cũng như sự phát triển của nó. 3 2. TỔNG QUAN 2.1 Bệnh lở mồm long móng 2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh Mô tả đầu tiên bằng văn bản về dịch có lẽ vào năm 1514, khi Fracastorius mô tả một căn bệnh tương tự trên gia súc tại Italy. Gần 400 năm sau, vào năm 1897 Friedrich Loeffler và Frosch đã chứng minh được tác nhân gây nên bệnh lở mồm long móng có thể qua lọc. Hình: Friedrich Loeffler Đây là minh chứng đầu tiên cho thấy một bệnh trên động vật do tác nhân qua lọc gọi là virus gây ra, mở ra một kỷ nguyên mới cho ngành virus học (Virology). 1929: Những trường hợp cuối cùng ở Mỹ 1953: Những trường hợp cuối cùng ở Canada và Mexico 1993: Italy 1997: Đài Loan (Taiwan) 2001: Anh (United Kingdom) Vài đợt dịch khác trong những năm 1967-1968 and 1981. Dịch bệnh lở mồm long móng đã xảy ra ở nhiều châu lục như châu Á, châu Phi, châu Âu và Nam Mỹ. (7) Ở châu Âu, bệnh đã bùng phát tại Anh, Hà Lan và Pháp vào năm 2001. Hàng triệu gia súc bị thiêu hủy gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi nói riêng và nền kinh tế các quốc gia này nói chung. Cùng năm đó, dịch cũng đã xảy ra tại Hàn Quốc, Nhật Bản và Đài Loan. 4 Đến cuối năm 2003, dịch xảy ra ở vùng Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Myanma, Philippines và Việt Nam. Một năm sau, dịch lan tới Trung Quốc, Nga, Mông Cổ và tiếp tục ở Myanma. Hình: Các đợt dịch FMD năm 2003 Trong 2 năm 2005 và 2006, dịch tràn tới Nam Mỹ ở các quốc gia như Brasil, Argentina và Paraquay cũng như ở châu Phi (Nam Phi). (1) Việt Nam Năm 2006 là năm bệnh dịch lở mồm long móng xảy ra rất mạnh ở hầu hết các tỉnh thành của Việt Nam với hàng chục nghìn gia sục bị nhiễm bệnh. Tuy nhiên, do điều kiện cũng như ý thức của người dân, trình độ và sự thiếu trách nhiệm của cán bộ thú y và chính quyền địa phương mà dịch bệnh không thể khống chế dễ dàng. Một số nơi, còn sử dụng các con vật đã chết làm thức ăn. 2.1.2 Phân bố bệnh trên thế giới Các type huyết thanh có sự phân bố khác nhau trên thế giới. Type huyết thanh O, A được nhận biết ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới. Trái lại các type huyết thanh SAT1, SAT2, SAT3 được giới hạn ở một số nước thuộc châu Phi. Typ huyết thanh Asia 1 được tìm thấy ở nhiều nước thuộc châu Á. Riêng type huyết thanh C chỉ còn tồn tại một vài nước như Philippines. 5 Theo tài liệu của Cục Thú y, dòng virus gây bệnh LMLM trên gia súc ở Việt Nam thuộc type O, gần đây có xuất hiện virus type A ở miền Trung và virus type Asia 1 ở các tỉnh miền núi phía bắc. (5) 6 Hình: FMD type O virus từ phía Bắc Việt Nam Tính tới ngày 1/11/2009: Ở Tuyên Quang: Ngày 25/10/2009, dịch Lở mồm đã xảy ra trên địa bàn xã Công Đa của huyện Yên Sơn làm 17 con trâu mắc bệnh. Kết quả xét nghiệm bệnh phẩm dương tính với chủng vi rút Lở mồm long móng type O. Hiện tại, địa phương đang tiến hành các biện pháp phòng, chống dịch theo quy định. Hiện nay, cả nước còn 10 tỉnh là: Quảng Nam, Đăk Lăk, Yên Bái, Sơn La, Hà Giang, Quảng Ninh, Gia Lai, Hòa Bình, Lai Châu và Tuyên Quang có dịch LMLM chưa qua 21 ngày. 2.2 Giới thiệu về virus lở mồm long móng 2.2.1 Đặc điểm cấu trúc, hình thái Virus lở mồm long móng ( Foot and Mouth Desease Virus) được phát hiện bao gồm một sợi đơn RNA, kích thước khoảng 8500 base, được bao bọc bởi bốn protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3, VP4) tạo thành lớp vỏ capsid có 20 mặt (icosahedral). (1) VP1, VP2, VP3 tạo nên một bề mặt của khối 20 mặt đối xứng (phân tử 12S) còn VP4 là protein bên trong capside, kết dính ARN virus với mặt trong của capside. 7 Hình: Cấu trúc FMD Virus FMD Virus thuộc họ Picorna Viridae có 7 type (O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1, mỗi type còn có nhiều phụ type, thí dụ như các tiểu type O1, O2, O3 …, A1, A2, A3, C1, C2, C3 … căn cứ vào sự khác biệt về gen và cấu trúc kháng nguyên). Các type virus phân bố không đều nhau trên thế giới, type O là type phổ biến trên thế giới hơn cả. Các type khi giám định huyết thanh đều không có miễn dịch chéo, và trong các ổ dịch, động vật có thể mắc bệnh do một hoặc cùng một lúc nhiều type huyết thanh. Vì thế, nếu có sự biến đổi về mặt di truyền dẩn đến biến đổi về mặt kháng nguyên virus ở các ổ dịch thì việc kiểm soát bệnh bằng vaccine cũ sẽ không có hiệu quả. Virus type A là nhóm có tính đa dạng kháng nguyên cao nhất. Type A có đến 32 type phụ. Và hiện nay người ta vẫn chưa thống nhất được với nhau về số lượng kiểu di truyền của virus type A khi giải trình tự gen VP1. Với virus type C việc giải trình tự gen VP1 cho phép phân chúng thành 8 nhóm di truyền. Virus type Asia 1 có sự đa dạng di truyền ít nhất, chỉ có 1 nhóm di truyền. Giải trình tự gen VP1, type SAT1 có 3 nhóm, SAT2 có 2 nhóm và SAT3 có 3 nhóm di truyền phân bố theo khu vực địa lý rõ ràng. Sự biến đổi của các type huyết thanh cũng khá phức tạp, đôi khi còn những điều chưa được hiểu biết rõ. Do đó ngành thú y phải chọn vaccine đúng với type đang gây bệnh để tiêm phòng. 8 (15) Sức đề kháng của virus: Virus có sức đề kháng mạnh (8) + Ở 600C tồn tại 5-15 phút. + Ở 1000C virus chết ngay lập tức. + Từ 0-40C tồn tại 425 ngày. + Trong đất ẩm virus sống hàng năm, gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển và gây bệnh. + Trong thịt ướp lạnh virus tồn tại khá lâu. 9 + Trong phân ủ thành đống virus tồn tại 7 ngày. + Nước tiểu virus tồn tại 39 ngày. + Virus FMDV không có vỏ bọc, nên chúng có sức đề kháng cao đối với các dung môi hữu cơ ( cồn, ete…). + Mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, acid, formol, … + Virus bền vững trong khoảng pH = 7 – 7,7. Nhanh chóng bị vô hoạt ở độ pH cao hoặc thấp (pH 11). Ở pH = 6, virus mất khả năng gây nhiễm. 2.2.2 Yếu tố độc tính (1) Function Viral factors Host factors Adsorption and penetration Capsid proteins (VP1 to 3) Integrins, other receptors (?), entry factors (?) Translation Lpro, IRES elements eIFs, PTBP, ITAF45 RNA replication S region, poly(C), cre, 2B, 2C, 3A, 3B, 3Cpro, 3Dpol Cellular membranes, PCBP, PABP Assembly and maturation Capsid proteins (VP0, VP1, and VP3), 3Cpro, 2A, viral RNA Cellular membranes (?) Bảng: Các yếu tố của virus và tế bào chủ có thể quyết định độc lực. Các nghiên cứu cho thấy virus có trình tự RGD của VP1 G-H loop thì hoặc sẽ đột biến hoặc không thể nhân lên trong nuôi cấy hoặc không thể gây bệnh ở gia súc được. (11) Các biến thể virus type O rất thích hợp với các thụ thể HS in vitro, cho thấy tầm quan trọng của sự tương tác virus-intergrin in vivo (Integrin là họ các protein xuyên màng có trong màng của tế bào động vật. Chức năng chính của nó là tạo liên kết với extracellular matrix (ECM) và truyền tín hiệu giữa ECM với tế bào). Lpro được cho thấy là một yếu tố quyết định độc lực virus, dựa trên cơ sở thí nghiệm trên động vật với các kỹ thuật di truyền, virus type A12 được xoá bỏ Lpro. Độc lực của virus yếu hơn so với virus hoang dại (wild virus) vì thiếu Lpro dẫn đến mất khả năng ngừng tổng hợp protein tế bào (cellular protein). Vai trò của protein 3A trong độc lực virus được chứng minh qua các nghiên cứu phân lập virus FMDV đáp ứng với dịch ở Đài Loan năm 1997 (designated O/Taw/97). Đó là đợt dịch chỉ có heo bị bệnh, gây nên tỷ lệ chết cao, ngoài ra các gia súc khác không bị ảnh hưởng. Nghiên cứu ở mức độ phân tử đã phát hiện được virus chứa codon 10 delection (10- codon deletion) ở nửa cuối đầu C của protein 3A. Vị trí đó tương tự với codon 19-20 delection (19- to 20-codon deletion) tìm thấy trên FMDV chuyển trong phôi gà (FMDV passaged in chicken embryos). Virus này cũng làm giảm độc tính trên bò (12). 10 2.3 Đặc điểm dịch tễ học 2.3.1. Động vật cảm nhiễm (5) Trong thiên nhiên: trâu bò mẫn cảm với bệnh nhất, rồi mới đến heo, dê, cừu, các loài dã thú như hươu, nai, heo rừng…Loài ăn thịt và người ít nhạy cảm với bệnh, loài một móng như ngựa, gia cầm, chim không mắc bệnh. Ở người, theo tài liệu của Chung Văn Lẫm, 1997 Học viện kỹ thuật quốc gia Bình Đông Đài Loan, thì người ăn thịt bò mắc bệnh đã nấu chín, công nhân giết mổ gia súc mắc bệnh lở mồm long móng đều không mắc bệnh. Tuy nhiên, theo tài liệu của BS Nguyễn Vĩnh Phước, người chăm sóc gia súc bệnh lở mồm long móng có thể mắc bệnh do virus xâm nhập qua vết thương ở da, đường tiêu hoá, hoặc hô hấp, thời gian nung bệnh khoảng 4-8 ngày, sau đó xuất hiện các triệu chứng: sốt, mụn nước mọc ở đầu ngón tay, bàn chân, cánh tay và các nơi khác. Đặc biệt, mụn gây ngứa, gây triệu chứng gãi nhiều, đôi khi mụn có thể mọc ở lợi răng, gây viêm miệng. Bệnh có thể kéo dài đến 10 ngày, sau đó sẽ hết bệnh. Chất chứa virus: - Mụn nước là nơi tập trung nhiều virus nhất, đặc biệt là mụn nước sơ phát mới hình thành. - Trên cơ thể thú ngoài mụn nước, các chất bài tiết như nước bọt, nước tiểu, phân, sữa, nước mắt, nước mũi cũng chưá nhiều virus. Số lượng virus trong chất thải này có thể thay đổi tuỳ thuộc vào thời gian mắc bệnh, thường rất cao trong ngày đầu và giảm dần. Sau 2 tuần hầu như không còn thấy virus trong các chất bài tiết. Trung bình 1 con heo mắc bệnh sẽ bài thải khoảng 4 tỉ virus mỗi ngày (gấp 3.000 lần trên bò). - Trên thú chết hoặc bị giết mổ, virus tập trung nhiều trong máu, bắp cơ và ở các nội tạng. Lượng virus trong bắp cơ cao hơn trong máu và có mặt đến ngày thứ 7 sau khi mắc bệnh. 2.3.2. Đường xâm nhập và cách truyền bệnh (5) Đường xâm nhập chính là tiêu hoá, virus có thể vào cơ thể qua niêm mạc miệng, và niêm mạc ống tiêu hoá. Ngoài ra, các vết trầy ở da, đầu vú cũng là nơi virus xâm nhập vào cơ thể. Đường sinh dục và hô hấp được coi là đường xâm nhập phụ. Quá trình lây lan bệnh diễn ra theo các cách thức sau: + Lây trực tiếp qua nước bọt hoặc các chất bài tiết do nhốt chung hoặc chăn thả chung gia súc bệnh với gia súc khoẻ mạnh. 11 + Lây gián tiếp qua thức ăn, nước uống, các dụng cụ chăn nuôi, chân tay, giầy dép của người chăn nuôi, người tham gia điều trị bệnh hoặc lây lan do việc bán chạy các gia súc mắc bệnh, mổ lậu gia súc mắc bệnh, không xử lý đúng mức thịt gia súc mắc bệnh hoặc vận chuyển gia súc mắc bệnh. + Virus có thể theo gió phát tán ra không khí trong cự ly 10km. 2.3.3. Cơ chế gây bệnh (5) - Thời gian nung bệnh trung bình 2-4 ngày, đôi khi kéo dài đến 7 ngày. - Đầu tiên virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc miệng, niêm mạc ống tiêu hoá, qua thức ăn, nước uống… hoặc các vết trầy ở bên ngoài cơ thể. Virus sẽ nhân lên tại các vị trí xâm nhập ở lớp thượng bì của miệng, niêm mạc ống tiêu hoá, da, tạo nên mụn nước sơ cấp, thường các mụn nước này ít và ở giai đoạn đó thú vẫn sinh hoạt bình thường, do đó dễ dàng bị bỏ qua không phát hiện được. Sau 1-2 ngày virus từ mụn nước sơ phát xâm nhập vào máu và phủ tạng, tạo nên triệu chứng sốt cao. Tuy nhiên, máu và phủ tạng không phải là nơi thích hợp cho sự phát triển, do đó virus quay ngược trở về các vị trí trên cơ thể có vùng thượng bì non như môi, nướu răng, lưỡi, gờ móng, đầu vú để phát triển, tạo các mụn nước thứ cấp. Đặc điểm mụn nước chỉ mọc ở phần thượng bì, không ăn sâu vào lớp trung bì và hạ bì, do đó sau khi mụn nước vở sẽ rất mau lành lại, và ít gây nhiễm trùng thành mụn mủ nếu được chăm sóc tốt. - Mụn mọc ở miệng, lưỡi gây cảm giác đau nhức làm thú không nuốt được, nước bọt bị kích thích chảy ra đầy ở miệng. Heo con, bê nghé bỏ bú do đó sẽ chết sau vài ngày mắc bệnh. - Mụn nước ở móng chân thường bị nhiễm trùng do thú đi đứng trong phân, đất, vi trùng phụ nhiễm sẽ tấn công sâu vào các lớp bên dưới gây hư hại nặng tổ chức da ở gờ móng, làm móng dễ bị bong tróc. 12 Móng bị bong tróc ra - Virus có thể tạo các mụn nước ở khí quản, phế quản hoặc tấn công vào cơ tim kéo theo sự phụ nhiễm của vi khuẩn Staphylococcus, tạo nên các thể viêm cơ tim, thoái hoá cơ tim làm gia súc chết ngộp. 2.3.4. Triệu chứng bệnh (8) Thời gian nung bệnh từ 2-7 ngày, trung bình là 3-4 ngày, gồm 3 thể bệnh Thể thông thường - Bệnh hay gặp ở vùng nhiệt đới, thú ủ rũ, lông dựng, da mũi khô, thú sốt cao 40-41 0C kéo dài 3 ngày. - Xuất hiện các mụn nước ở da, vành móng kẻ chân, lưỡi, vú làm thú kém ăn, nhai khó khăn. 13 Chảy nước bọt ở góc miệng Thương tổn lưỡi bò Hình thành mụn nước quanh đầu vú, đầu vú bị thương tổn - Ở miệng: lưỡi có mụn to ở đầu lưỡi gốc lưỡi ở hai bên lưỡi, xoang trong miệng trong má, lỗ chân răng, môi có mụn lấm tấm bằng hạt ké, hạt bắp. Sau đó mụn vỡ và tạo thành các vết loét đáy nhỏ và phủ màu xám. Nước dãi chảy nhiều như bọt xà phòng. Virus LMLM gây thương tổn vùng miệng và lưỡi - Ở mũi: niêm mạc có mụn nước, đặt biệt là vành mũi có mụn loét, nước mũi lúc đầu trong sau đục dần. 14 - Ở chân, kẽ móng có mụn nước từ trước ra sau, mụn vỡ làm long móng. - Ngoài da: xuất hiện các mụn loét ở vùng da mỏng như bụng, bẹn, vú, ở đầu núm vú … - Sau khi hàng loạt mụn nước vỡ dần sẽ dẫn đến nhiễm trùng máu, nhiễm trùng da, thú sốt cao, suy nhược dần rồi chết Thể biến chứng - Những biến chứng xảy ra khi điều kiện vệ sinh, chăm sóc kém làm mụn vỡ dẫn đến nhiễm trùng, chân bị long móng, thối móng, thối xương làm thú què. Vú thì bị viêm tắt sữa. Các mụn khác vỡ sẽ gây nhiễm vi khuẩn kế phát, bại huyết rồi chết. Viêm loét gây thối Mụn vỡ gây viêm loét giữa các kẽ móng chân Viêm loét gây thối móng và sứt móng - Bệnh lở mồm long móng ghép với các bệnh ký sinh trùng hay vi khuẩn khác có sẵn trong máu có thể làm con vật mau chóng chết. Thể ác tính 15 - Đối với heo con: sốt cao 40-41,5oC, trong những ngày đầu thấy toàn thân đỏ ửng cả da và niêm mạc. Chảy nước mắt và nước dãi, sau 3-4 ngày thấy da nhăn nheo nứt thành từng vết từ trên xuống và có nước chảy ra. Nhiều con miệng viêm loét không bú được và nhiễm trùng máu rồi chết. Tốc độ lây nhiễm trong đàn heo con là rất nhanh. Bệnh tích thường gặp ở bốn chân, mụn loét ở miệng và gây hiện tượng long móng, sau 7-10 ngày thì lây lan sang toàn đàn. - Đối với heo nái: bệnh biểu hiện nhẹ hơn, thấy mụn nước ở vú, kẽ móng chân, có con nhiễm trùng thì sưng móng viêm có mủ, đi cà nhắc, có con long móng. 2.3.5. Bệnh tích (8) - Chủ yếu ở đường tiêu hóa như miệng có các vết loét ở lưỡi, lỗ chân răng, hầu, thực quản, dạ dày… - Ở đường hô hấp gây viêm phế quản. Bên trong phủ tạng: tim bị viêm cấp, van tim bị sùi hoặc loét (TIM CỌP), lách bị sưng đen, niêm mạc ruột non ruột già xuất huyết điểm, long móng, thối móng, rụng xương bàn chân. Khi khỏi bệnh thì ở các vết loét sẽ để lại sẹo ở miệng. 2.4 Chẩn đoán virus lở mồm long móng 2.4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào a. Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào là là đơn vị nuôi cấy nhỏ nhất, là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào ngoài cơ thể sống, các tế bào trong điều kiện phòng thí nghiệm vẫn tự phân chia, thực hiện đầy đủ các chức năng biến dưỡng và các chức năng chuyên biệt của tế bào. Nuôi cấy tế bào Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được tiến hành lần đầu vào năm 1907 bởi Harrison với những tế bào thần kinh ếch. Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy tế bào được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thú y, nhân y, sinh học trong mục đích nghiên cứu tác động của các chất lên tế bào (dược học, độc tố học), chẩn đoán và điều trị ung thư (ung thư học), chẩn đoán các tác nhân gây bệnh, sản xuất kháng thể đơn dòng, sản xuất vaccine (miễn dịch học, virus học, vi khuẩn học), chẩn đoán biến đổi gen và sản xuất các sản phẩm sinh học như hormone, enzyme trị liệu (công nghệ gen, công nghệ sinh học). Việc nuôi cấy tế bào động vật đòi hỏi các điều kiện tiệt trùng nghiêm ngặt và môi trường nuôi cấy phức tạp, giàu chất dinh dưỡng. Các loại tế bào nuôi cấy 16 Trong nuôi cấy tế bào động vật, người ta phân biệt hai trường hợp: tế bào bậc một hay tế bào sơ cấp và tế bào bậc hai hay tế bào thứ cấp. - Tế bào bậc một (Primary cells) là những tế bào thu được trực tiếp từ các cơ quan hay mô động vật. - Khi nuôi cấy chuyển tiếp các tế bào này trong điều kiện phòng thí nghiệm sẽ thu được tế bào bậc hai (Secondary cells), những tế bào này có thể được nuôi chuyển tiếp nhiều lần, một số trong đó có khả năng duy trì sự phát triển trong vài tuần hoặc vài tháng, nhưng một số có thể duy trì sự phát triển không hạn định. Những tế bào này sẽ được giữ lại làm những dòng tế bào giống phục vụ cho các nghiên cứu trên tế bào. Các loại tế bào nuôi cấy - Tế bào biểu mô (Epithelial cells) - Nguyên sợi bào (Firoblast cells) - Tế bào cơ (Muscle cells) - Tế bào thần kinh (Nerve cells) - Tế bào lympho bào Tế bào động vật có thể được bảo quản trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196oC, ở nhiệt độ này, tế bào có thể giữ được khả năng sống không hạn định và phát triển trở lại trên môi trường nuôi cấy tế bào khi được rã đông. (3) Các loại tế bào khác nhau có khả năng phát triển khác nhau Dòng tế bào Nguồn gốc Loại tế bào nuôi cấy BHK Thận chuột Hamster nhỏ Nguyên sợi bào MDCK Thận chó Tế bào biểu mô Vero Thận khỉ Nguyên sợi bào CHO Buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc Tế bào biểu mô (Dòng tế bào: quần thể tế bào giống hệt nhau, bắt nguồn từ một tế bào ban đầu). Một số phương tiện cần thiết - Phòng thí nghiệm: sạch, chiếu sáng tốt, ít người qua lại - Tủ cấy vô trùng chuyên nuôi cấy tế bào (hệ thống vô trùng) - Tủ ấm thường và tủ ấm CO2 - Tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu - Bình nitơ lỏng để bảo quản tế bào 17 - Hệ thống cất nước hai lần hoặc hệ thống lọc loại trừ chất độc vô cơ và hữu cơ - Hệ thống lọc vô trùng và hệ thống trypsin hoá - Dụng cụ thuỷ tinh và nhựa: đựng môi trường và nước cất - Kính hiển vi soi ngược - Một số máy móc khác như : autoclave, máy đếm tế bào, máy chụp hình, máy ly tâm, ... Kỹ thuật vô trùng Có tầm quan trọng rất lớn trong nuôi cấy tế bào động vật. - Xử lý chai nhựa nuôi cấy tế bào - Xử lý chai thuỷ tinh - Vô trùng khu vực thao tác - Vô trùng bề mặt khu vực làm việc : dọn sạch bằng cồn 70o, lau cồn các dụng cụ, sắp xếp dụng cụ, làm xong dọn dẹp nơi thao tác, sát trùng buồng sấy vô trùng bằng tia cực tím trước mỗi lần thao tác. Môi trường và những yếu tố cần thiết cho nuôi cấy Yêu cầu: tế bào trong ống nghiệp gần giống trong động vật sống Các yếu tố quan trọng - Nền: tạo bề mặt đặc biệt để tế bào bám - Môi trường: đủ dưỡng chất cho tế bào phát triển (Carbonhydrate, Glucose, Amino acid, muối đẳng trương, Bicarbonate, Vitamin, Hormone, Phenol Red, ...). Chất bổ sung vào môi trường : huyết thanh 10% Điều kiện nuôi cấy - Nhiệt độ: 37oC. Nhiệt độ thấp hơn 37oC, tỷ lệ phát triển giảm, tế bào chưa bị tổn thương. Nhiệt độ từ 39-40oC, tế bào bị phá huỷ. - pH = 7,4 Sự cấy - Đưa tế bào vào môi trường nuôi cấy tiệt trùng. - Mật độ lúc cấy 104- 105 tế bào tb/ml. - Sau 3 – 4 ngày đạt 106 tế bào hoặc 105 tế bào/ cm2/bề mặt cứng 18 - Sự sinh trưởng ngừng lại do giới hạn chất dinh dưỡng, tích tụ sản phẩm độc, thiếu bề mặt tăng trưởng (bề mặt cứng). Lúc này ta cần thay thế môi trường hoàn toàn hay một phần sau 2 ngày để đạt mật độ tối đa cao hơn. Cách nhận biết sự phát triển của tế bào - Trực tiếp: đếm tế bào ít nhất một lần trong ngày, tại một thời điểm nhất định. Dùng buồng đếm hồng cầu, bổ sung Trypan Blue giúp đếm dễ dàng hơn. Ưu điểm : cùng lúc đếm được nhiều mẫu. Hạn chế : số mẫu ít, sai số khoảng 10%. - Gián tiếp: xác định một sản phẩm nào đó trong tế bào để xác định sự phát triển của tế bào. Ví dụ: xác định protein, xác định DNA, xác định Glucose, ... Cấy chuyển - Cấy một số tế bào vào môi trường mới ( khi tế bào ngừng tăng trưởng) - Ủ môi trường trong tủ ấm trước khi cấy chuyển: do môi trường ở nhiệt độ phòng không hẳn là nhiệt độ thích hợp cho tế bào - Tách tế bào khỏi bề mặt tăng trưởng bằng trypsin trong 15 phút, hút bỏ môi trường, rửa lớp tế bào bằng 5ml PBSA - Cho 3ml trypsin, để lọ tế bào trong tủ ấm 5 phút. Bất hoạt trypsin bằng 5ml môi trường phát triển, rút cho vào ống ly tâm - Ly tâm 2000vòng/phút trong 5 phút, đổ bỏ phần nước trên. Cho 3ml môi trường phát triển, trộn đều, hút vào lọ nuôi cấy đã có sẵn 4ml môi trường phát triển. - Đưa lọ vào tủ ấm 37oC / 5% CO2 Thu hoạch tế bào - Dùng trypsin ở 37oC - Để bình nuôi cấy vào tủ lạnh. - Cho trypsin ở 37oC vào, tế bào co tròn, bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy. b. Chẩn đoán virus lở mồm long móng bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào Chọn mẫu Lấy mẫu ở đường hô hấp, dịch họng, hay đường tiêu hoá, biểu mô nghi ngờ nhiễm virus. Thời gian lấy mẫu nên là lúc mới biểu hiện các triệu chứng, hay lúc mới chết, không nên lấy mẫu lúc con vật đã chết được một thời gian. Cách bảo quản 19 Xét nghiệm chẩn đoán nhiễm virut phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của bệnh phẩm, vì vậy công tác thu thập và bảo quản mẫu bệnh phẩm phải đảm bảo: + Đúng chủng loại + Đúng thời điểm + Đúng thao tác + Bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm đúng cách. Mẫu để trong bình, túi sạch, chuyển đến phòng thí nghiệm. Nếu nơi lấy mẫu ở xa thì phải bảo quản bằng đá khô, giữ ở -70oC. Dùng glycerol 50% (50%glycerol + 50% nước muối sinh lý) giữ trong tủ lạnh 4oC. Vật liệu và phương pháp Dòng tế bào: tế bào Baby hamster kidney (BHK), strain 21, clone 13 Mẫu bệnh phẩm Môi trường: • DMEM (4,500 mg/L D-glucose, L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate) bổ sung 5% foetal calf serum (FCS) • Penicillin G(100 U/ml) and streptomycin (100 μg/ml). • pH được điều chỉnh bằng lượng bicarbonate Vô trùng nơi thao tác, bàn làm việc, dụng cụ nuôi cấy. Cách xử lý mẫu - Lấy mẫu bệnh phẩm: cắt mô nghi ngờ, lấy tương ứng 2g (đủ để tạo huyễn dịch 10-20%). Lấy 1g huyễn dịch cho vào 9ml nước muối sinh lý - Nghiền mẫu, sử dụng cát hay mảnh thuỷ tinh để nghiền nhuyễn hơn, sau đó cho nước muối sinh lý vào, bảo quản trong tủ lạnh - Lọc lấy nước trong hay ly tâm, cho vào lọ, dùng kháng sinh (penicillin và streptomycin) để diệt khuẩn. Sau 30 phút – 1 giờ, lọc qua lưới có đường kính 0,2 μm. - Đưa vào môi trường nuôi cấy tế bào. Khi tế bào một lớp được tạo thành (phủ khoảng 70% là có thể nuôi cấy), đưa mẫu bệnh phẩm vào từ từ, tránh làm bong lớp tế bào ra. Thu hoạch tế bào. Kết quả 20 • Để xác định virus có gây bệnh tích tế bào hay không, dùng phương pháp nhuộm tế bào (dùng kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang) thực hiện trực tiếp trên môi trường tế bào. • Nếu có virus, khi quan sát trên kính hiển vi, do virus bắt màu sẽ thấy phát huỳnh quang màu xanh. 2.4.2 Các kỹ thuật chẩn đoán khác - Chẩn đoán bằng kỹ thuật gen. - Chẩn đoán bằng kỹ thuật Elisa. - Phương pháp xét nghiệm miễn dịch. - Phương pháp xét nghiệm trung hoà huyết thanh. - Chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR, RT-PCR, … 3. KẾT LUẬN Bệnh lở mồm long móng là một bệnh truyền nhiễm rất nguy hiểm, lây lan nhanh trên gia súc thuộc bộ guốc chẵn. Bệnh là mối nguy hại lớn đối với ngành chăn nuôi gia súc trong nước, ảnh hưởng lớn đến lợi ích kinh tế, xã hội, môi trường. Bệnh có triệu chứng lâm sàng khó phân biệt sớm được với các bệnh mụn nước khác như: Swine Vesicular Disease (SVD), Vesicular Stomatitis (VS), and Vesicular Exanthema (VE). (15). Do đó, việc chẩn đoán bệnh nhanh và chính xác là rất cần thiết, nhằm có biện pháp phòng trừ thích hợp, đồng thời giảm mức độ thiệt hại do lây nhiễm bệnh xuống mức thấp nhất. Nuôi cấy tế bào có độ chính xác cao, là phương pháp duy nhất thu nhận virus cho các nghiên cứu tiếp theo, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi người thao tác có chuyên môn cao, cần nhiều thiết bị hiện đại, ... 4. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Marvin J. Grubman* and Barry Baxt. Foot-and-Mouth Disease. Plum Island Animal Disease Center, USDA, Agricultural Research Service, North Atlantic Area, Greenport, New York. 2. Rueckert, R. R., and E. Wimmer. 1984. Systematic nomenclature of picornavirus proteins. J. Virol. 50:957-959. 3. Nguyễn Ngọc Hải. Công nghệ sinh học trong thú y. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 2007. 21 4. ang=vn 5. www.lrc.ctu.edu.vn/pdoc/35/37lomomlogmog.pdf 6. --- 7. Danelle Bickett-Weddle, DVM. Foot and Mouth Desease. Center for Food Security and Public Health Iowa State University – 2004. 8. 9. 10. DANIEL SA-CARVALHO, ELIZABETH RIEDER, BARRY BAXT,1 RENATO RODARTE, AMILCAR TANURI, AND PETER W. MASON. Tissue Culture Adaptation of Foot-and-Mouth Disease Virus Selects Viruses That Bind to Heparin and Are Attenuated in Cattle. Plum Island Animal Disease Center, Agricultural Research Service, North Atlantic Area, U.S. Department of Agriculture, Greenport, New York 11944,1 and Departmento de Genetica, Instituto de Biologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil. 11. Leippert, M., E. Beck, F. Weiland, and E. Pfaff. 1997. Point mutations within the ßG- ßH loop of foot-and-mouth disease virus O1K affect virus attachment to target cells. J. Virol. 71:1046-1051.[Abstract] 12. Giraudo, A. T., E. Beck, K. Strebel, P. A. de Mello, J. L. La Torre, E. A. Scodeller, and I. E. Bergmann. 1990. Identification of a nucleotide deletion in parts of polypeptide 3A in two independent attenuated aphthovirus strains. Virology 177:780-783 13. 14. Jae Ku Oem1,*, Kwang Nyeong Lee1, In Soo Cho1, Soo Jeong Kye1, Jee Yong Park1, Jong Hyeon Park1, Yong Joo Kim1, Yi Seok Joo1, Hee Jong Song2. Identification and antigenic site analysis of foot-and-mouth disease virus from pigs and cattle in Korea. J. Vet. Sci. (2005), 6(2), 117–124 15. fever-virus-csfv 22 1. MỤC LỤC 2. ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................3 3. TỔNG QUAN.....................................................................................................4 3.1. Bệnh lở mồm long móng.............................................................................4 3.1.1. Lịch sử phát hiện.................................................................................4 23 3.1.2. Phân bố bệnh trên thế giới ..................................................................5 3.2. Giới thiệu về virus lở mồm long móng......................................................7 3.2.1. Đặc điểm cấu trúc, hình thái ...............................................................7 3.2.2. Yêú tố độc tính....................................................................................9 3.3. Đặc điểm dịch tễ học .................................................................................10 3.3.1. Động vật cảm nhiễm.........................................................................10 3.3.2. Đường xâm nhập và cách truyền bệnh .............................................11 3.3.3. Cơ chế gây bệnh................................................................................11 3.3.4. Triệu chứng bệnh ..............................................................................12 3.3.5. Bệnh tích ...........................................................................................15 3.4. Chẩn đoán virus lở mồm long móng .......................................................15 3.4.1. Chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào .........................................15 • Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy tế bào ..............................................15 • Chẩn đoán virus lở mồm long móng bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 19 3.4.2. Các kỹ thuật chẩn đoán khác ............................................................20 4. KẾT LUẬN ......................................................................................................20 5. TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................................21 Phần tài liệu tham khảo được đánh số, trong bài tài liệu tham khảo được đặt trong dấu ngoặc đơn ngay sau mỗi phần được trích dẫn.